ISTRUZIONI PER L'USO DEL MICROSCOPIO OTTICO.

I) collocare il vetrino sul tavolino portavetrini; 2) inserire l'obbiettivo 10 X (piccolo); 3) centrare la sezione affinché sia in asse con l'obbiettivo; 4) mettere a fuoco muovendo lentamente la vite macrometrica,

aggiustando poi con la micrometrica; 5) cambiare obbiettivo (medio 20 X o grande 40 X) mettendo a fuoco

solamente con la vite micrometrica; 6) ruotando la vite dei condensatore si può aumentare la luminosità o il contrasto; 7) accertarsi che la fonte luminosa sia nella giusta posizione (e non sia

ruotata lateralmente). N.B. L'ingrandimento totale si calcola moltiplicando l'ingrandimento

scritto sull'oculare per quello scritto sull'obbiettivo.

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SCHEMA DI INCLUSIONE IN PARAFFINA DI UN FRAMMENTO D'ORGANO O DI TESSUTO.

N.B.: i tempi qui sotto riportati sono puramente indicativi e in ogni caso, va tenuto ben presente che essi possono variare in funzione delle dimensioni dei pezzi trattati.

1) PRELIEVO DEL FRAMMENTO D'ORGANO O DI TESSUTO. 2) FISSAZIONE: in formalina al 10% tamponata (concentrazione pari a13,7%) 10 min. 3)LAVAGGIO: in acqua corrente alcuni min.

4) DISIDRATAZIONE : Serie ascendente degli alcoli

etanolo 70 1 min.

etanolo 80 1 min.

etanolo 90 10 min.,

etanolo assoluto I 5 min.

etanolo assoluto II 10 min

xilolo I 7 min.

xilolo II 7 min.

5) INFILTRAZIONE: in paraffina liquida, a 60°C 15 min. X 2 6) INCLUSIONE: confezione del blocchetto di paraffina solidificata.

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SCHEMA DI ESECUZIONE DI COLORAZIONI ISTOLOGICHE.

1) Ematossilina-Eosina

2) Blu di Toluidina.

Sparaffinazione e reidratazione delle sezioni.

Xilolo I 7 min. Xilolo II 7 min. Etanolo assoluto I 5 min. Etanolo assoluto II 5 min.Etanolo 90 °C 5 min. Etanolo 80 °C 5 min.Etanolo 70 °C 5 min.H20 distillata Lavaggio

1) Ematossilina-Eosina

Ematossilina 10 min. H20 di fonte 10Eosina 2-4 min.H20 distillata Lavaggio

Disidratazione Etanolo 70°C 5 min.Etanolo 80 °C 5 min. Etanolo 90 °C 5 min. Etanolo assoluto I 5 min.Etanolo assoluto II 5 min.Xilolo I 7 min. Xilolo II 7 min. Montaggio in balsamo del Canada o resine sintetiche. 2) Blu di Toluidina

Porre i vetrini reidratati alcuni minuti nel tampone al pH prescelto (buffer Mc Ilvaine = acido citrico 0,1 M, Na2HPO4 0,2 M, pH 4). In Blu di Toluidina per 10 min. Lavare in tampone a pH prescelto. Differenziare in alcol isopropilico (o isobutilico) per 1 min. alzando e abbassando il vetrino per evitare la formazione di bolle d'aria. In xilolo per 1 min. (alzando e abbassando il vetrino). Montare direttamente in balsamo del Canada.

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MALLORY Sparaffinazione: Xilolo............................................15 min. X 2 Alcol assoluto .....................……10 min. X 2 Alcol 90 ...................................... 5 min. Alcol 80 ...................................….5 min. Alcol 70:..................................…..5 min. Alcol 50:..................................…..5 min. Acqua distillata..........:.................…5 min. X 2

Mettere in stufa (a 60°C) il colorante azocarminio. Acidificare al momento con acido acetico 1%. Mettere i vetrini a colorare a temperatura ambiente per 10 min. ed osservare 1'andamento della colorazione al microscopio ottico. Gettare il colorante e lavare in acqua distillata per qualche minuto. In olio di anilina 0,1% in alcol 95% per 30 sec. a differenziare, controllare a1 microscopio ottico ed eventualmente proseguire. Passare in alcol acidulato al 95% + acido acetico 1%. Immergere nell'acido fosfotungstico al 5% (30 min. possono bastare). Lavare velocemente in acqua distillata. Aggiungere la miscela colorante di Mallory per 2 min. (si può riutilizzare). Lavaggio in acqua distillata. Differenziare in alcol al 95% controllando il colore del connettivo al microscopio ottico. Disidratare in alcol assoluto (5 min X 2), xilolo (5 min. X 2). Montare in balsamo o resine sintetiche.

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ALLESTIMENTO DI PREPARATI ISTOLOGICI

La preparazione di una sezione istologica richiede diverse tappe: FISSAZIONE del pezzo, appena prelevato dall'organo che si desidera esaminare, mediante liquido fissativo (i più usati sono la formalina, la miscela di Bouin (soluzione di formalina, acido picrico e acido acetico glaciale), e di. Carnoy (soluzione di alcol assoluto, acido acetico glaciale e cloroformio). La fissazione serve a bloccare le attività vitali della cellula, rendendo insolubili i componenti strutturali, stabilizzando le proteine e inattivando gli enzimi idrolitici. LAVAGGIO, per togliere il fissativo in eccesso. DISIDRATAZIONE, mediante la scala ascendente degli alcoli (70°-80°-90°-100°) per eliminare la componente acquosa, che non permetterebbe l'entrata della paraffina nel tessuto (l'acqua non é un solvente della paraffina). DIAFANIZZAZIONE in solventi della paraffina (ad esempio toluolo, benzolo, xilolo) che rendono il pezzo, già privato dell'acqua, diafano (trasparente) e penetrabile da parte della paraffina, INCUBAZIONE a caldo in paraffina (in stufa, tarata secondo il punto di fusione della paraffina, fra i 50°C e i 60°C) per permetterle di sostituirsi al solvente, all'interno del pezzo istologico. INCLUSIONE in paraffina all'aria, in modo che questa solidifichi -intorno al pezzo. Il tutto é poi montato su supporto solido per permettere l’affettatura. TAGLIO al microtomo in fettine sottili di 6-8 µm, che vengono fatte aderire al vetrino portaoggetti.

Le sezioni su vetrini, perché possano essere colorate (in coloranti acquosi), debbono prima subire i seguenti passaggi: DEPARAFFINAZIONE con toluolo, xilolo; REIDRATAZIONE con scala discendente degli alcoli; LAVAGGIO con acqua distillata. COLORAZIONE: viene eseguita la colorazione desiderata (vedi pag. 1-2).

Eseguita l'operazione di colorazione dei preparati, le sezioni sono sottoposte a DISIDRATAZIONE, CHIARIFICAZIONE in solventi organici (toluolo, benzolo, xilolo) e poi MONTAGGIO con un vetrino coprioggetto con interposta una goccia di alcune resine naturali (ad es. Balsamo del Canadà), o sintetiche (Eukitt), che hanno lo stesso indice di rifrazione del vetro. ------------------------------------------------------

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Allestimento di preparati con uso del CRIOSTATO (microtomo congelatore) che lavora alla temperatura da -5°C fino a -60°C.

La metodica dell’inclusione in paraffina, sopra descritta, in alcuni casi non è applicabile, ad es. quando si vogliono studiare i lipidi, perché le componenti lipidiche vengono disciolte durante i processi di fissazione e inclusione in paraffina. Il preparato al congelatore risolve anche problemi diagnostici per pezzi operatori (è molto veloce), per lo studio di particolari enzimi o per alcune tecniche ímmunocitochimiche.

Il pezzo appena prelevato viene fissato per immersione in azoto liquido o con un getto di CO2 compressa che lo raffredda molto rapidamente, senza farlo cristallizzare, quindi viene tagliato al criostato. Le sezioni cosi ottenute sono pronte per le colorazioni sia istologiche che istochimiche.

Colorazioni per i grassi. Le sezioni ottenute al criostato si colorano con i variSUDAN (Sudan III, Sudan IV per i grassi neutri; SUDAN NERO B per i lipidi in genere).

I nuclei vengono colorati con ematossilina. Le sezioni, infine, vengono montate in gelatina glicerinata.

COLORAZIONI ISTOLOGICHE 1) EMATOSSILINA-EOSINA (E.E.):

Ematossilina (emallume, colorante basico) si lega con legame non ben precisato a strutture con. radicali liberi acidi. Colora perciò in viola i nuclei (presenza di DNA), la sostanza fondamentale della cartilagine (presenza di mucopolisaccaridi fortemente acidi, contenenti radicali liberi carbossilici e solforici) e a volte la mucina delle ghiandole esocrine (per la presenza di mucopolisaccaridi acidi). Eosina: (colorante acido) colora le strutture. basiche in rosa. Evidenzia il citoplasma delle cellule (per prevalente presenza di proteine basiche) e le fibre collagene.

2) AZAN-MALLORY (A. M.):

Colorazione elettiva per evidenziare le fibre collagene del connettivo. I coloranti usati in sequenza sono: a) Azocarminio: colora in rosso i nuclei delle cellule e gli eritrociti, in rosso tenue il citoplasma; b) Miscela di Mallory (Blu di anilina, Orange G e acido ossalico): colora in bleu forte le fibre collagene e in azzurro le mucine; le cellule del sangue e le fibre muscolari in arancio.,

3) MAY-GRÜNWALD-GIEMSA (M.G.G.): utilizzata normalmente per colorare strisci di sangue.

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I1 sangue viene strisciato su un vetrino portaoggetto, fissato per almeno 30' min. all'aria e in luogo privo di vapori acidi; viene poi colorato prima con la miscela May- Grünwald (Bleu di metilene, colorante basico, Eosina, colorante acido che formeranno un sale). Quando si aggiunge una piccola quantità d'acqua, i due coloranti di cui è composto l’eosinato si separano e colorano le strutture acidofile e quelle basofile. Segue, poi, un lavaggio ed una colorazione con 1'eosinato di azzurro (colorante di Giemsa) composto da eosina giallastra, blu di metilene, azzurro A e B e violetto di metilene. Risultati: gli eritrociti appaiono di un colore rosa arancio, i nuclei dei leucociti bleu porpora, il citoplasma nei neutrofili marrone leggero con granuli violetto rosa e lillà, mentre i granuli eosinofili avranno un colore arancio-rosso brillante ed, infine, i granuli basofili mostreranno un colore blu oltremarino. 4) WEIGERT-VAN GIESON ( W.-V.G.): Sono due colorazioni abbinate (Weigert-Van Gieson). Mediante la miscela di Weigert, contenente fucsina basica e resorcina, vengono colorate in nero le fibre elastiche; con la miscela di Van Gieson, contenente fucsina acida e acido picrico, vengono colorate le fibre collagene in rosso magenta, mentre altre cellule (ad es.: cellule muscolari o del sangue) divengono giallo-arancio. Come colorante di contrasto per il nucleo è impiegata 1'ematossilina ferrica, che colora i nuclei in marrone-nero. 5) IMPREGNAZIONE ARGENTICA (I.A.), secondo James, per il tessuto reticolare. In questa colorazione si usa un sale di un metallo pesante (ad esempio nitrato di argento) che viene depositato su alcuni componenti tissutali allo stato colloidale. In seguito il tessuto è sottoposto all'azione di una soluzione riducente ed il metallo viene ridotto allo stato elementare. Si evidenziano così le fibre reticolari in marrone scuro o nero.

COLORAZIONI ISTOCHIMICHE 1) BLEU di TOLUIDINA (B.T.):

Essendo un colorante basico, si lega a strutture con radicali acidi liberi (elettricamente negativi, quindi anionici). Quando la densità di tali gruppi anionici fortemente dissociati è elevata come nei polianioni, si ha il fenomeno della metacromasia, cioè il colorante vira da celeste (colore ortocromatico) al verde Indaco, al violetto, al rosso porpora (colori metacromatici). Pertanto possono essere evidenziati: gli acidi nucleici (DNA: - nucleo;- -RNA: nucleolare e citoplasmatico, ad es. sostanza tigroide delle cellule nervose), ma soprattutto i mucopolisaccaridi acidi

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(presenti nella sostanza fondamentale della cartilagine, nel muco delle ghiandole mucipare e mucose). 2) PAS (Periodic Acid Schiff) per le glicoproteine ed il glicogeno:

L'ossidazione con acido periodico opera la rottura di un legame tra due atomi di Carbonio adiacenti della molecola del carboidrato e liberazione di un gruppo aldeidico che, mediante formazione di una base di Schiff, viene rivelato dal reattivo di Schiff, in presenza di anidride solforosa, in ambiente acido. Strutture contenenti le molecole in oggetto si colorano in varie gradazioni, di rosso-violetto (magenta). 3)ALCIAN BLEU, (A.B.) (ftalocianina rameica) per i mucopolisaccaridi acidi (GAG). E' un colorante specifico per le macromolecole sopradette, ma più in generale si lega, in quanto colorante carico positivamente, a tutti i composti aventi radicali acidi liberi (carbossilici, solforici, fosforici) cioè ai polianioni. Pertanto, in determinate condizioni tecniche (pH acidi diversi, o in presenza di diverse concentrazioni di MgCl2), mediante uso di Alcian bleu vengono evidenziate in blu strutture contenenti DNA, RNA e GAG o solo GAG. Da ricordare che i GAG sono molecole a peso molecolare molto elevato, costituite, da unità disaccaridiche ripetitive, formate da derivati carbossilici e amminici di zuccheri a 6 atomi di C (acido uronico+esosamina), contenenti quantità variabili di gruppi acidi solforici legati alle esosamine. I GAG (acido ialuronico, condroitin solfati A, B, C, eparansolfato, eparina, cheratosolfato) costituiscono, associati alle proteine. i proteoglicani che insieme alle glicoproteine (GP) sono parte fondamentale della sostanza anista dei connettivi, della sostanza cementante le cellule epiteliali, delle secrezioni mucose. 4) Colorazione sequenziale ALCIAN BLEU-PAS:

Con tale colorazione, possono essere messi in evidenza GAG in bleu e GP in rosso magenta contemporaneamente.

E S A M E A L MICROSCOPIO Tale esame va iniziato col più piccolo degli ingrandimenti disponibili.

Gli ingrandimenti maggiori servono per precisare aspetti minuti della morfologia delle singole cellule o di gruppi di cellule; vanno utilizzati pertanto a tale scopo, ma è consigliabile tornare poi ai mlnori ingrandimenti, perchè essi consentono la visione d'insieme dei preparati, al fine della diagnosi di tessuti e di organo. Dopo aver messo a fuoco il preparato è bene spostare lentamente il vetrino per osservare tutto il campo della sezione, compresi i margini.

Dopo questo esame preliminare si dovranno riconoscere i tessuti presenti e la loro "distribuzione topografica" nel preparato.

A questo punto è opportuno che ognuno di voi abbia in mente una classificazione schematica dei tessuti stessi. I tessuti del corpo, infatti, non

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sono molti, ma si presentano in diverse varietà in dipendenza della posizione, dei rapporti e della funzione che assumono nei vari organi. Ricordate che avrete a che fare col tessuto epiteliale (di rivestimento e ghiandolare), coi tessuti a funzione trofica e di sostegno (connettivi propriamente detti, cartilagine , ed osso), coi tessuti muscolari (liscio e striato) e col tessuto nervoso. Considerate la possibile esistenza, nel preparato, degli elementi del sangue. Può trattarsi di uno striscio di sangue o di accumuli e infiltrazioni di cellule (normalmente i linfociti) del sangue in altri tessuti. Fra l'altro, in ogni organo è possibile notare la presenza di vasi contenenti globuli rossi. La presenza dei globuli rossi, specialmente di quelli osservati a piatto, è utile poichè il diametro di ogni globulo rosso si aggira sui 78 µm e questo serve come riferimento utile a farsi una opinione della grandezza degli elementi cellulari presenti.

P IANI DI SEZIONE

E S A M E D E I T E S S U T I

A) Trattasi di TESSUTO EPITELIALE? Il tessuto epiteliale è riconoscibile perché gli elementi cellulari che lo costituiscono sono tutti a reciproco contatto tra loro, con interposizione di minima sostanza intercellulare. Le sezioni dei preparati che vi sono presentati alle esercitazioni hanno spessore (6-8µm), tale da consentire la evidenziazione -del nucleo in tutte le cellule epiteliali (specialmente fochettando con la vite micrometrica, allo scopo di esaminare i vari piani ottici della sezione), a meno che non si tratti della superficie libera di pieghe della mucosa le quali, diversamente orientate o inclinate nel pezzo incluso, sono state poi interessate tangenzialmente al taglio (vedi piani di sezione). Con l'epitelio potrebbero confondersi a) il tessuto muscolare liscio (vedi oltre), quando i suoi elementi siano stati sezionati trasversalmente alla lunghezza delle fibre. In questo caso, però, ogni cellula muscolare è circondata da una trama di fibre reticolari, mentre per le cellule epiteliali il connettivo è presente solo in un versante (basale); b) il tessuto adiposo, le cui cellule, però, sono molto più grandi (circa 5 volte), hanno un citoplasma "vuoto”, nucleo periferico e sono anch’esse, una ad una, circondate da tessuto connettivo reticolare.

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Riconoscere le varietà di epitelio presenti nel preparato. -Trattasi d i E P I T E L I O D I R I V E S T I M E N T O ?

Le cellule epiteliali, in tal caso, disposte a reciproco contatto, dovranno formare una membrana cellulare, estesa in senso bidimensionale (larghezza-lunghezza). Il terzo parametro (spessore dell'epitelio) è meno sviluppato degli altri e dipende dai numero degli strati degli elementi cellulari presenti. Trattasi di epitelio di rivestimento semplice oppure stratificato? Se trattasi di epitelio stratificato: a) la stratificazione è reale, ossia dovuta a diverse file di cellule epiteliali (in tal caso, alcune cellule toccheranno la membrana basale, ma non raggiungeranno la superficie libera dell' epitelio, altre raggiungeranno la superficie libera ma non la membrana basale, altre avranno posizione intermedia alle due file precedentemente indicate); b) oppure è fittizia? In quest' ultimo caso, tutte le cellule toccano la membrana basale, ma solo alcune, le più alte, raggiungono la superficie libera; i nuclei, avendo le cellule altezza differente, saranno situati a livelli differenti e daranno 1' impressione, a piccolo ingrandimento, di un epitelio stratificato, mentre si tratta,in effetti, di un epitelio semplice, ma a più file di nuclei (epitelio pseudostratificato: trachea, bronchi, ecc.. ). Le cellule dell’epitelio di rivestimento potranno risultare fortemente appiattite e disposte in unico strato (epitelio pavimentoso semplice: alveoli dei polmoni, mesoteli, ed endoteli), oppure appariranno poligonali per reciproca compressione nei vari strati (epitelio pavimentoso composto). Nel caso dell' epitelio pavimentoso composto, le cellule più superficiali subiranno l'azione delle forze elastiche di superficie e quindi appariranno più appiattite rispetto alle cellule profonde che risulteranno più precisamente poligonali; tra l'altro,procedendo dalla profondità verso la superficie, le cellule costitutive presenteranno una tendenza alla corneificazione. Tale processo di corneificazione non è completo nelle cellule dell' epitelio pavimentoso composto che tappezza superfici costantemente umidificate dal secreto delle ghiandole (ep. del cavo orale e dell' esofago, ep. dell' ultimo segmento dell’intestino retto, ep. della vagina). Metodo di riconoscimento: presenza di cellule nucleate fino all'ultimo strato. Un tipico epitelio pavimentoso composto completamente corneificato, è quello dell' epidermide, idoneo a vivere a contatto dell' aria. Metodo di riconoscimento: presenza di lamine cornee sopra l'epitelio. Nel caso dell'epitelio polimorfo, tipico delle vie urinarie, si ha una modifica dello spessore in base al, diverso stato di distensione della vescica. Diverso è, quindi,nelle varie situazioni fisiologiche, il numero di file di nuclei, ma un criterio per riconoscerlo sempre è notare sulla superficie la presenza di cellule cupoliformi, grandi, con asse longitudinale parallelo alla superficie e, a volte, binucleate (X). Tra gli epiteli semplici si potranno riconoscere, a seconda dell'altezza delle cellule, l’epitelio cubico (es. la superficie dell'ovaio), cilindrico (es. intestino). In quest'ultimo si potrà rilevare che esistono, nella sua compagine, cellule: caliciformi mucipare (ghiandole unicellulari) (Y).

(X) (Y)

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Esse sono riconoscibili per la forma a calice, nucleo basale e regione sopranucleare spanciata poco colorabile dopo E.E., a volte celeste dopo A.M., blu dopo Alcian e rosso magenta dopo PAS. -Trattasi di EPITELIO GHIANDOLARE ? Le cellule epiteliali non sono organizzate in lamine cellulari che rivestono una qualsiasi superficie, ma sono disposte in gruppi cellulari circondati dal tessuto connettivo, con interposta sempre una membrana basale. A questo punto si tratterà di stabilire dapprima se trattasi di ghiandola esocrina o di ghiandola endocrina. Nella GHIANDOLA ESOCRINA, tra il tessuto connettivo che forma la capsula e l'impalcatura di sostegno dell' organo saranno presenti, oltre a sezioni di vasi e* di nervi, anche sezioni di canali tappezzati da un epitelio di rivestimento, i condotti escretori delle ghiandole e soprattutto unità secernenti, gli adenomeri; sarà possibile, a volte, notare anche il punto di raccordo fra tale adenomero (acino, tubulo o alveolo che sia) e il condotto escretore. Se trattasi di ghiandola esocrina si dovranno rilevare i seguenti dati: i) in base alla forma del (o dei) canale escretore stabilire se trattasi di ghiandola semplice, ghiandola glomerulare, ghiandola ramificata, ghiandola composta. Le prime tre sono riconoscibili in sezione longitudinale, l'ultima anche in sezione trasversale (presenza di tanti adenomeri e pochi dotti). Comunque le cellule della parete del dotto hanno il nucleo in posizione centrale (1)

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2) riconoscere, in base alla forma degli adenomeri, se trattasi di ghiandola tubulare, alveolare o acinosa o se sono rappresentati più tipi di adenomeri (tubulo-alveolare o tubuloacinoso). Nell'adenomero, omunque le cellule hanno il nucleo spostato verso la base (2). 3) riconoscere se la secrezione é di tipo sieroso (X) (il secreto appare accumulato nel segmento distale di ogni cellula in forma di minutissimi granuli colorati, il nucleo sferico è eccentrico verso il polo basale) o di tipo mucoso (Y): in tal caso, il citoplasma appare vacuolare e semivuoto, il nucleo è appiattito e fortemente spostato alla base.

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L'aspetto vacuolare del citoplasma è conseguenza delle tecniche utilizzate per allestire normalmente le sezioni, per cui il muco, originariamente distribuito in gocciole nel citoplasma, viene in genere disciolto; 4) in base alle modalità con cui il secreto viene eliminato dalle cellule precisare se trattasi di uno dei seguenti tipi di secrezione: - secrezione merocrina (o eccrina)al secreto viene elaborato dalle cellule ed eliminato con ritmo costante, tale che il citoplasma non risulti mai privo del secreto medesimo. Le cellule secernenti con queste 'modalità hanno tutte la stessa altezza e gli stessi caratteri morfologici al microscopio luce (acino pancreatico). - secrezione apocrina: il secreto si accumula nella parte distale della cellula, poi viene versato tutto all'esterno in un unico atto. Le cellule che si sono svuotate del secreto appariranno di minor altezza rispetto a quelle in cui il secreto risulta ancora accumulato nel citoplasma. E' evidente la differente altezza degli elementi epiteliali secernenti (gh. mammaria). - secrezione olocrina: il secreto si accumula in tutta la cellula; l'eliminazione di esso avverrà con distruzione totale dell'elemento cellulare stesso (osservare, nelle diverse cellule, . le varie fasi della progressiva alterazione dei nuclei fino a scomparire), tipica modalità secretiva delle ghiandole sebacee della pelle. Nella GHIANDOLA ENDOCRINA mancheranno, .evidentemente, i canali escretori. Le cellule potranno organizzarsi in nidi o più frequentemente in cordoni, avviluppati da vasi capillari, oppure si disporranno a formare uno strato epiteliale semplice di elementi a varia altezza (a seconda della quantità del secreto contenuto nel loro citoplasma) che delimita cavità chiuse i (follicoli). Una ghiandola di tipo follicolare, ad esempio, è la tiroide;- 1'adenoipofisi, per la gran parte fatta da nidi e cordoni di cellule, è provvista anch'essa di una parte a struttura follicolare. Trattasi della zona addossata all'ipofisi intermedia. In questo caso, saranno, però, anche le altre parti della ghiandola ad orientare l'osservatore nel riconoscimento del preparato; tenete presente che qui i follicoli sono considerevolmente più piccoli rispetto a quelli della tiroide. (Eventuali colorazioni istochimiche metterebbero in evidenza che la colloide ipofisaria non contiene iodio). Nidi (Ni) e cordoni (Co) (tipici anche del surrene, delle paratiroidi, oltre che dell'adenoipofisi) sono un diverso modo di disporsi nello spazio di cellule secernenti che non evidenziano più una cavità piccola o grande che sia (lume dell°adenomero), ma sono comunque inglobate in una calzamaglia di connettivo che le circonda (vedi a lato). Il fegato è una ghiandola detta labirintica ed è riconoscibile in quanto i cordoni si dispongono radialmente come una ruota di carro rispetto ad un vaso (vena centrolobulare), che fa da perno, delimitando lateralmente spazi occupati da vasi capillari (sinusoidi).

Ni Co Labirintica

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B) Trattasi di TESSUTI CONNETTIVI? I tessuti connettivi (t.c. propriamente detto, cartilagine e osso) sono tutti riconoscibili per la presenza della matrice intercellulare che circonda i vari tipi di cellule, proprie di ogni connettivo. Il CONNETTIVO PROPRIAMENTE DETTO è sempre presente sotto gli epiteli di rivestimento, attorno agii epiteli ghiandolari, tra epiteli e tessuto muscolare, o cartilagine, o osso; contiene vasi arteriosi, venosi e linfatici, nervi e gangli nervosi. E' riconoscibile per la presenza di cellule di aspetto solitamente irregolare circondate da una sostanza amorfa. Questa sostanza è formata in prevalenza da mucopolisaccaridi acidi (GAG) basofili, metacromatici e alcian positivi. In questa matríce amorfa sono contenuti elementi filamentosi (fibre collagene, fibre reticolari, fibre elastiche). Dalla proporzione di fibre rispetto alla matrice amorfa (e delle fibre collagene in particolare) dipende la consistenza del tessuto. Si distinguono pertanto diverse varietà di connettivo: 1) tessuto reticolare - le fibre reticolari sono costituite da un tipo di collagene molto sottile e non si organizzano in fasci, ma formano reticoli; si colorano con la reazione PAS e 1'impregnazione argentica; sono negative alle colorazioni con E.E., con la A.M. ed alla V.G. Il tessuto reticolare forma la minuta trama di sostegno delle parti più molli dell'organismo (midollo osseo, timo, milza, linfonodi, tonsille e avvolge strutture ghiandolari, fibre muscolari, fibre nervose e gangli periferici) e costituisce la parte inferiore della membrana basale. 2) Tessuto connettivo lasso: ricco in cellule (alle cellule del connettivo si aggiungono - cellule adipose isolate o riunite in globuletti, macrofagi e monocití, plasmacellule, linfociti; particolarmente abbondante è l'infiltrazione dei linfociti nella tonaca propria delle mucose). Ampi sono gli spazi extracellulari per la presenza di fibre collagene (eosinofile, cioè rosa, dopo E.E., blu dopo A.M., rosso magenta dopo V.G.), organizzate in piccoli fasci. 3)Tessuto connettivo denso: percorso da grossi fasci di fibre collagene che delimitano ridotti spazi .in cui sono inseriti essenzialmente fibroblasti.

a) varietà a fasci paralleli (tendini); b) varietà a fasci intrecciati (membrane del corpo: aponeurosi, fasce muscolari,

derma della pelle, sottomucose, sclera); c) varietà a fasci incrociati (cornea). 4) Il Tessuto elastico ricco in fibre elastiche (sotto cute, parete dei vasi, etc,) è evidenziabile dopo colorazione con il metodo di W., mentre non è colorabile con le colorazioni standard (E.E., A.M.). 5) I1 Tessuto adiposo è riconoscibile per la presenza dì cellule molto grosse (più di 10 volte un globulo rosso,e più, di 5 volte una cellula epiteliale ) addossate tra dì loro ma separate da una trama di fibre reticolari e collagene. Il nucleo è schiacciato alla periferia ed il citoplasma è vuoto (vacuolo unico, grasso bianco). , Il grasso bruno è riconoscibile dal nucleo centrale e possiede numerosi vacuoli, anch'essi vuoti. Ciò si spiega perché i grassi contenuti all' interno sono eliminati dalle normali tecniche utilizzate (vedi sezioni al criostato pag. 1). E' presente TESSUTO CARTILAGINEO ? Perchè si possa fare diagnosi di Tessuto cartilagineo debbono essere presenti grosse cellule (condroblasti, condrociti e condroclastl) di forma ovoidale, turgide, spesso appaiate, circondate da un alone dì sostanza fondamentale, la condromucoide (GAG), che costituisce la capsula, fortemente basofila e scarsamente positiva alla

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miscela di Mallory. Tali cellule sono riunite, a volte, in gruppi (gruppi isogeni) circondati da un’ alone basofilo di sostanza fondamentale, l'area territoriale interna, con basofilia meno accentuata, però, della capsula. Quest'area è circondata a sua volta da una zona di sostanza fondamentale acidofila, l'area territorìale esterna, ricca di fibre collagene e quindi eosinofila e positiva alla miscela di Mallory; infine vi è la sostanza fondamentale delle zone interterritoriali, leggermente basofila. Attenzione: 1'eosina dopo E.E. e 1a miscela di Mallory dopo A.M. colorano solo le fibre collagene e non i GAG, i quali sarebbero colorabili con Alcian Blu. Se sono evidenti fasci grossolani di fibre collagene, ben visibili nelle comuni colorazioni per il loro elevato indice di rifrazione, trattasi allora di cartilagine fibrosa. Se dopo colorazione con il metodo di Weigert sano evidenti fasci di fibre elastiche, decorrenti nella sostanza intercellulare tra i gruppi isogeni (2 0 3 condrociti), trattasi di cartilagine elastica. Se i fascetti delle fibre collagene sono molto sottili e il suo indice di rìfrazione uguale a quello del condromucoìde si tratterà di cartilagine íalina; in tal caso, per mettere in evidenza le fibre collagene è necessario ricorrere a metodi specifici di colorazione. E' presente TESSUTO OSSEO?

Nell'uomo adulto l'osso più diffuso è. quello lamellare (tipico di tutte le ossa del nostro scheletro); è riconoscibile per l'organizzazione in lamelle della sostanza intercellulare (comprendente la matrice amorfa e le fibre collagene, oltre la componente inorganica prevalente). Le cellule ossee sono comprese nell'intercapedine fra le lamelle adiacenti (lacune) e sono fornite di numerosi prolungamenti contenuti in canalicoli (ben evidenti in sezioni di osso non decalcificato), cui si deve la porosità dell'osso lamellare. Nei preparati notare se trattasi di tessuto osseo lamellare spugnoso (trabecolato) o dì tessuto osseo lamellare compatto. In questo secondo caso, rilevare l'esistenza e la posizione dei: i) sistemi fondamentali esterno ed interno (a largo raggio di curvatura);

2) sistemi osteonici, con lamelle concentriche delimitanti il canale di Havers, i canali di Volkmann attraversano trasversalmente gli osteoni; 3) sistemi interstiziali residui di sistemi preesistenti. Notare se è presente il connettivo periostale od endostale. Dopo colorazione con B.T., la cartilagine è viola-rosso magenta (metacromatica), l'osso rimane poco colorabile e verde bluastro. Dopo E.E., la cartilagine è - viola (basofila) mentre l'osso è rosa (eosinofilo). Nei processi di ossificazione, nel caso di ossa lunghe verificarne la natura endocondrale o pericondrale. Nel primo caso è presente cartilagine (a riposo, ipertrofica, calcificata, in fase di rimozione) basofila ed osso neoformato in trabecole eosinofile, che a volte contengono residui cartilaginei (basofilo). Nel secondo caso, il processo è diretto, e le trabecole ossee (eosinofile) sono in posizione subperiostale.

C) Trattasi di TESSUTO MUSCOLARE? I1 tessuto muscolare si riconosce per la presenza di cellule che appaiono affusate (fibre), se la sezione le ha colpite parallelamente al loro asse longitudinale. In tal caso è possibile notare la sede dei nuclei. I nuclei sono centrali nelle cellule del TESSUTO MUSCOLARE LISCIO e ve n'è uno per ogni cellula. Ogni cellula presenta la semplice striatura longitudinale (la sì può notare fochettando con la vite micrometrica) , dipendente: dalla presenza delle miofibrille, la cui struttura appare

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omogenea su tutta la loro estensione. Il tessuto MUSCOLARE STRIATO SCHELETRICO è formato da elementi polinucleati, con nuclei subsarcolemmali nella muscolatura scheletrica, ma a sede centrale, invece, nella muscolatura cardiaca. Alla striatura longitudinale delle fibre, dipendente dalla presenza delle miofibrille, si aggiunge - ed è l'elemento più caratteristico di distinzione per il tessuto muscolare striato - la striatura trasversale dovuta all'alternarsi, nelle miofibrille stesse, dopo osservazione al Microscopio Ottico, di bande più colorabili e di bande più chiare la cui peculiarità è di avere il medesimo periodo nelle diverse miofibrille d'una stessa fibra muscolare, sicché la bandeggiatura percorre trasversalmente tutta la fibra muscolare da un lato all'altro. Il tessuto MUSCOLARE STRIATO MIOCARDICO, in particolare, si presenta come una rete a plesso, ove i cardiociti, in sequenza, evidenziano delle "strie scalariformi" corrispondenti all'accollarsi delle membrane di due cellule contigue. E' presente un solo nucleo per cellula ed ha una bandeggiatura longitudinale e trasversale. In sezione trasversale le fibre muscolari potrebbero simulare a prima vista un epitelio (vedi epiteli pag. ), ma in realtà sono ben diverse: gli elementi cellulari in ogni caso sono circondati uno ad uno da una trama connettivale collagenoreticolare (leggermente blu dopo colorazione con A.M., nera dopo impregnazione argentica), che nei tessuto muscolare striato scheletrico va a formare 1'endomisio (vedi testo). - per la muscolatura striata scheletrica valgono, a precisare la diagnosi, il numero dei nuclei, la loro sede, la disposizione delle miofibrille che in queste sezioni appaiono puntiformi, ma ordinate in campi fibrillari, colonnari o seriali (vedi un testo di Istologia). - per la muscolatura liscia, considerare il fatto, che trattandosi di elementi affusati, disposti sfasati di qualche u l'uno rispetto all'altro, il taglio non può colpirli tutti alla stessa altezza; nelle sezioni appariranno, allora, elementi tondeggianti di diverso diametro, alcuni nucleati altri no, a seconda che siano stati sezionati al centro . o verso una delle estremità. Lo stesso vale per la muscolatura striata cardiaca.

D) Trattasi di TESSUTO NERVOSO?

I1 tessuto nervoso si distinguerà anch'esso per il fatto che gli elementi cellulari non risultano a mutuo contatto. La sostanza intercellulare, però, è rappresentato dalla glia, dai vasi, dalle fibre nervose. Le cellule nervose saranno riconoscibili e classificabili in base al numero dei prolungamenti dendritici e assonali che da essa hanno origine (neuroni pseudounipolari, neuroni bipolari, neuroni multipolari). Nella sostanza grigia del Sistema Nervoso Centrale le cellule nervose sono distribuite senza ordine fra gli elementi intercellulari, tranne che nelle cortecce (corteccia cerebrale, corteccia cerebellare) e nel corpo quadrigemello superiore del mesencefalo, ove è tipica la struttura "a lamine" per disposizione dei neuroni in più strati. Nella corteccia cerebrale sono riconoscibili strati di cellule piramidali (*) grandi e piccole; nella corteccia cerebellare sono, invece, riconoscibili le cellule del Purkinje (#), piriformi con un prolungamento dendritico che si ramifica.

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- Criteri da utilizzare: a) verificare il tipo di colorazione; ad es.: con B.T, o E.E. si evidenziano prevalentemente i corpi cellulari, non i prolungamenti; invece, con 1'impregnazione argentica, metodo di Cajal, (simile a quello utilizzato per le fibre reticolari), viene messo in evidenza il neuropilo, cioè tutto l'intreccio di prolungamenti dendritici ed assonici, in marrone-nero. Attenzione: la cellula nervosa è in attiva proteosintesi; dopo Bleu di Toluidina è fortemente basofila e metacromatica nel nucleolo e nelle zolle di Nissl, mentre il cono di emergenza è poco colorato (assenza di ribosomi). Nella compagine dei vari organi (e con le colorazioni dei preparati che osservate durante le vostre esercitazioni) è sempre possibile distinguere, fra gli elementi del tessuto connettivo interstiziale, eventuali sezioni di nervi. Il nervo è riconoscibile per la presenza di guaine connettivali (endonervio e perinervio, avvolgenti rispettivamente ogni singola fibra e gruppi di esse, ed epinervio esterno); le fibre nervose sono costituite dall'assone (colorabile) circondato da una guaina mielinica (comunemente estratta, in quanto lipidica, durante le fasi dell'allestimento del preparato) riconoscibile in quanto si presenta come un anello non colorabile attorno all'assone (@). La presenza di nuclei colorati esternamente ad ogni fibra (visibile soprattutto nelle sezioni longitudinali di un nervo)(§) è riferibile a cellule di Schwann.

@ § Fare attenzione al riconoscimento di eventuali cellule gangliari: esse presentano dopo una normale colorazione tipo E.E. o A.M., forma ovalare e sono circondate ciascuna da due capsule, una interna costituita da piccole cellule disposte a catenella, le cellule satelliti, l'altra esterna connettivale. E) Trattasi di SANGUE? Per riconoscere il sangue:

a) vedi colorazioni istologiche, paragrafo 3; b) utilizza le informazioni dei testi di base. In ogni modo, criterio fondamentale per discernere le singole forme eritrociti, leucociti (granulociti basofili, eosinofili, neutrofili, linfociti, monociti) e piastrine],sono i seguenti: concentrazione percentuale, grandezza, forma esterna, forma del nucleo, rapporto nucleo-citoplasma, tipo di granulazione.

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GIUDIZIO CONCLUSIVO Una volta analizzato il preparato microscopico sulla base della traccia fornitavi da questi appunti (poiché soltanto di una traccia si tratta), avrete tutti gli elementi per procedere ad un confronto critico dei vari tessuti fra loro. Ciò che avete osservato ed analizzato corrisponde ai dati istologici teorici di vostra conoscenza? Se la risposta è sì, chiedetevi il perché e poi confermate la diagnosi di tessuto. Se è no, chiedetevi perché e discutete gli elementi di giudizio contrastanti con la diagnosi; giungerete a precisare quest'ultima. Può sembrare un lungo processo di analisi quello proposto su questi fogli. In realtà, una volta che l'avrete studiato ed acquisito, sarà poi sempre il medesimo tipo di ragionamento che dovrete impostare e vi risulterà così congeniale da farlo con naturalezza, senza sforzo e con molta rapidità. Buon lavoro!

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