j. clin. microbiol.-1992-mérien-2219-24

7/29/2019 J. Clin. Microbiol.-1992-Mrien-2219-24

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1992, 30(9):2219.J. Clin. Microbiol.F Mrien, P Amouriaux, P Perolat, G Baranton and I Saint GironsLeptospira spp. in clinical samples.Polymerase chain reaction for detection of

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JOURNAL O F C L I N I C A L M I C R O B I O L O G Y , S e p t . 1 9 9 2 , p . 2 2 1 9 - 2 2 2 40 0 9 5 - 1 1 3 7 / 9 2 / 0 9 2 2 1 9 - 0 6 $ 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t 1 9 9 2 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

P o l y m e r a s e C h a i n R e a c t i o n f o r D e t e c t i o n o f L e p t o s p i r a spp.i n C l i n i c a l S a m p l e sF . MERIEN, P . AM O U RI A UX, P . PEROLAT, G . B A R A N T O N , AND I . SAI NT GIRONS*

U n i t e d e B a c t e r o l o g i e M o l e c u l a i r e e t M e d i c a l e , I n s t i t u t P a s t e u r , 2 8 ,Rue d u D o c t e u r R o u x , 7 5 7 2 4 P a r i s C e d e x 1 5 , F r a n c eR e c e i v e d 4 F e b r u a r y 1 9 9 2 / A c c e p t e d 1 J u n e 1 9 9 2

A s e n s i t i v e as s ay f o r L e p t o s p i r a spp., t h e c a u s a t i v e a g e n t o f l e p t o s p i r o s i s , was d e v e l o p e d on t h e b a s i s o f t h ep o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ( P C R ) . A 3 3 1 - b p sequence f r o m t h e L e p t o s p i r a i n t e r r o g a n s serovar c a n i c o l a r r s ( 1 6 S )gene was a m p l i f i e d , a n d t h e PCR p r o d u c t s were a n a l y z e d b y DNA-DNA h y b r i d i z a t i o n b y u s i n g a 2 8 9 - b pf r a g m e n t i n t e r n a l t o t h e a m p l i f i e d DNA. S p e c i f i c PCR p r o d u c t s a l s o w er e o b t a i n e d w i t h DNA from t h e c l o s e l yr e l a t e d n o n p a t h o g e n i c L e p t o s p i r a b i f l e x a b u t n o t w i t h DNA f r o m o t h e r s p i r o c h e t e s , s u c h as B o r r e l i a b u r g d o r f e r i ,B o r r e l i a h e r m s i i , T r e p o n e m a d e n t i c o l a , T r e p o n e m a p a U l i d u m , S p i r o c h a e t a a u r a n t i a , or more d i s t a n t o r g a n i s m ss u c h as E s c h e r i c h i a c o l i , S t a p h y l o c o c c u s aureus, M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s , and P r o t e u s m i r a b i l i s . Th e a s s a ywas a b l e t o d e t e c t as f e w as 1 0 b a c t e r i a . L e p t o s p i r a DNA was d e t e c t e d i n u r i n e from e x p e r i m e n t a l l y i n f e c t e dm i c e . I n a d d i t i o n , t h e t e s t was f o u n d t o b e s u i t a b l e f o r d i a g n o s i n g l e p t o s p i r o s i s i n humans. C e r e b r o s p i n a lf l u i d a n d u r i n e f r o m p a t i e n t s w i t h l e p t o s p i r o s i s w er e p o s i t i v e , w h e r e a s s a m p l e s f r o m c o n t r o l u n i n f e c t e dp a t i e n t s w er e n e g a t i v e .

Genomic DNA-DNA h y b r i d i z a t i o n h e l p e d t o d e f i n e n i n es p e c i e s ( 2 6 ) o f t h e genus L e p t o s p i r a , w h i c h i s c o m p o s e d o fmore t h a n 2 0 0 serovars. Th e n o n p a t h o g e n i c L e p t o s p i r a spp.c o n s i s t o f t h r e e s p e c i e s , L . b i f l e x a , L . m e y e r i , a n d L .w o l b a c h i . Th e p a t h o g e n i c L e p t o s p i r a spp. c o n s i s t o f s i xs p e c i e s , L . i n t e r r o g a n s , L . s a n t a r o s a i , L . b o r g p e t e r s e n i i , L .n o g u c h i , L . w e i l i i , a n d L . i n a d a i ( 2 6 ) . L e p t o s p i r o s i s i s aw o r l d w i d e d i s e a s e w h i c h a f f e c t s w i l d a n d d o m e s t i c a n i m a l sa n d humans ( 2 ) . I n a d d i t i o n , some i n f e c t e d a n i m a l s p e c i e sd e v e l o p p e r s i s t e n t r e n a l i n f e c t i o n s a n d s h e d l e p t o s p i r e s i nt h e i r u r i n e ( 2 1 ) . B e c a u s e o f t h e v a r i e t y o f c l i n i c a l symptoms,l e p t o s p i r o s i s a t i t s o n s e t i s o f t e n m i s d i a g n o s e d as a s e p t i cm e n i n g i t i s , i n f l u e n z a , h e p a t i c d i s e a s e , or f e v e r o f unknowno r i g i n ( 7 ) . T h e r e f o r e , d i ag n o s i s i s b a s e d on l a b o r a t o r y t e s t sr a t h e r t h a n on c l i n i c a l symptoms a l o n e . The m e t h o d cur-r e n t l y u s e d i s b a s e d on t h e s e r o l o g i c a l r e s p o n s e o f t h e h o s t t ot h e i n f e c t i n g o r g a n i s m ( e n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s say[ E L I S A ] or m i c r o s c o p i c a g g l u t i n a t i o n t e s t ) . T h e p r es ence o fl e p t o s p i r e s c an b e a s s e s s e d b y c u l t u r e ; h o w e v e r , t h e p roces si s v e r y l a b o r i o u s a n d c an t a k e up t o 2 m o n t h s ( 7 ) . T h e r e f o r e ,i s o l a t i o n a n d c u l t u r e ar e p r i m a r i l y u s e d f o r r e t r o s p e c t i v ed i a g n o s i s . To c u l t u r e t h e o r g a n i s m f r o m t i s s u e s or b o d yf l u i d s , k n o w l e d g e o f t h e s t a g e o f t h e i n f e c t i o n i s c r i t i c a l . I nt h e a c u t e p h a s e , w h i c h l a s t s f o r a b o u t 1 0 d a y s , t h e l e p t o -s p i r e s can o f t e n b e c u l t u r e d f r o m b l o o d or c e r e b r o s p i n a l f l u i d( C S F ) . U s u a l l y , when a s p e c i f i c a n t i b o d y r e s p o n s e i s d e -t e c t e d ( a t a p p r o x i m a t e l y 1 0 d a y s ) , l e p t o s p i r e s d i s a p p e a rf r o m t h e b l o o d . D u r i n g t h e s e c o n d p h a s e , w h i c h may l a s t upt o s e v e r a l m o n t h s , b a c t e r i u r i a i s o f t e n i n t e r m i t t e n t .Th e p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ( P C R ) i s a n i n v i t r o m e t h o df o r s e l e c t i v e l y a m p l i f y i n g s p e c i f i c t a r g e t DNA sequences b ymore t h a n 1 0 6 f o l d ( 2 0 ) . I t h a s b e e n u s e d t o d i a g n o s ei n f e c t i o u s d i s e a s e s c a u s e d by f a s t i d i o u s or s l o w l y g r o w i n gb a c t e r i a s u c h as M y c o b a c t e r i u m l e p r a e ( 2 5 ) , M y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s ( 5 ) , T r e p o n e m a p a l l i d u m ( 1 0 ) , a n d B o r r e l i ab u r g d o r f e r i ( 1 9 ) . Two g r o u p s d e t e c t e d L . i n t e r r o g a n s s e ro -v ar h a r d j o i n c a t t l e u r i n e by u s i n g t h e PCR ( 9 , 2 2 ) .

* C o r r e s p o n d i n g a u t h o r .

r R N A genes ar e v e r y c o n s e r v e d t h r o u g h o u t t h e b a c t e r i a lk i n g d o m ( 2 3 ) . P a r t i a l r R N A sequences h a v e b e e n a n a l y z e di n t e r m s o f o l i g o n u c l e o t i d e " s i g n a t u r e s " ( 2 4 ) , w h i c h a l l o wt h e d e f i n i t i o n o f t h e m a j o r s u b d i v i s i o n s o f t h e e u b a c t e r i a a n damong t h e m t h e s p i r o c h e t e "phylum" ( 1 6 , 1 7 ) . T h e s e d a t aa l l o w e d t h e u n e q u i v o c a l s e l e c t i o n o f a s e t o f o l i g o n u c l e o -t i d e s w i t h i n t h e p r i m a r y s t r u c t u r e o f t h e L e p t o s p i r a rr s ( 1 6 S )gene ( 8 ) . We r e p o r t h e r e t h e d e v e l o p m e n t o f a s e n s i t i v ea s say f o r L e p t o s p i r a DNA t h a t i s b a s e d upon a m p l i f i c a t i o no f t h e L e p t o s p i r a r r s ( 1 6 S ) gene. Th e d a t a s u g g e s t t h a t t h ePCR a s s a y c an b e u s e d on b i o l o g i c a l s a m p l e s s u c h as CSF,u r i n e , or b l o o d as a d i a g n o s t i c t o o l f o r cases o f s u s p e c t e dl e p t o s p i r o s i s .

M A T E R I A L S AND METHODSO r g a n i s m s a n d g r o w t h c o n d i t i o n s . S p i r o c h e t e numbers

were d e t e r m i n e d b y u s i n g a P e t r o f f - H a u s s e r c h a m b e r . B .b u r g d o r f e n i B3 1 a n d B o r r e l i a h e r m s i i were grown a t 3 0 C i nBSK II med ium ( 3 ) , w h i l e T r e p o n e m a d e n t i c o l a ATCC3 3 5 2 0 was grown a t 3 7 C i n p r e r e d u c e d T . d en t i c o l a b r o t h( 1 2 ) a n d S p i r o c h a e t a a u r a n t i a Ml was grown a t 3 0 C i n TGYmedium ( 3 0 g o f t r y p t i c a s e p e r l i t e r , 2 0 g o f y e a s t e x t r a c t p erl i t e r , 5 g o f g l u c o s e p er l i t e r [pH 7 . 4 ] ) . L e p t o s p i r e s ( P a s t e u rI n s t i t u t e C o l l e c t i o n , N a t i o n a l R e f e r e n c e C e n t e r , P a r i s ,F r a n c e ) were c u l t i v a t e d i n EMJH medium ( 6 , 1 3 ) . S t o c kl a b o r a t o r y c u l t u r e s were m a i n t a i n e d b y r e g u l a r s u b c u l t u r ei n t o f r e s h m e d i u m , a n d p r i m a r y i s o l a t i o n f r o m c l i n i c a l s p e c -i m e n s was as d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 7 ) . L . i n t e r r o g a n s sero-v a r i c t e r o h a e m o r r h a g i a e s t r a i n 1 4 0 i s a v i r u l e n t s t r a i n m a i n -t a i n e d b y s e r i a l pa s sage i n g u i n e a p i g s . A l l o t h e r b a c t e r i a( o b t a i n e d f r o m P a s t e u r I n s t i t u t e H o s p i t a l , P a r i s , F r a n c e )were grown i n L B b r o t h ( 1 5 ) .S w i s s m i c e were o b t a i n e d f r o m R . J a n v i e r , C e n t r ed ' E l e v a g e , Le G e n e s t , S a i n t B e r t h ev i n, F r a n c e . Two m i c ewere i n f e c t e d a t e a c h i n o c u l a t i o n . U r i n e s a m p l e s f r o m b o t hm i c e ( m e a n v al u e , 2 5 [ L e a c h ) were p o o l e d .E n z y m a t i c a m p l i f i c a t i o n . F o u r o l i g o n u c l e o t i d e p r i m e r swere s y n t h e s i z e d on an A p p l i e d B i o s y s t e m s DNA s y n t h e -s i z e r ( m o d e l 3 9 1 ) w i t h t h e f o l l o w i n g s e q u e n c e s : A , 5 ' -

2219

V o l . 3 0 , N o . 9


3/7

2 2 2 0 MERIEN ET A L .GGCGGCGCGTCTITAAACATG-3'; B , 5'-TTCCCCCCATTGAGCAAGATT-3'; C , 5'-CAAGTCAAGCGGAGTAGCAA - 3 ' ; a n d D , 5'-CTTAACCTGCTGCCTCCCGTA-3'.

O l i g o n u c l e o t i d e s A a n d B c o r r e s p o n d t o n u c l e o t i d e s 3 8 t o5 7 a n d 3 4 8 t o 3 6 8 i n t h e p r i m a r y s t r u c t u r e o f t h e L .i n t e r r o g a n s r r s ( 1 6 S ) g e n e , r e s p e c t i v e l y . O l i g o n u c l e o t i d e s Ca n d D c o r r e s p o n d t o n u c l e o t i d e s 5 8 t o 7 7 a n d 3 2 8 t o 3 4 7 ,r e s p e c t i v e l y .A mp l i f i c at i o n o f DNA w a s p e r f o r m e d i n a t o t a l v o l u m e o f5 0 R u I 1 . T h e r e a c t i o n m i x t u r e c o ns i st e d o f 5 0 mM K C l , 1 0 mMT r i s h y d r o c h l o r i d e ( p H 8 . 4 ) , 2 mM M g C l 2 , 1 m g o f g e l a t i np e r m l , 1 , u M e a c h o l i g o n u c l e o t i d e p r i m e r , a n d 2 0 0 ,M e a c hd A T P , d T T P , d C T P , a n d d G T P . One u n i t o f T a q DNAp o l y m e r a s e ( B e c k m a n I n s t r u m e n t s , I n c . , F u l l e r t o n , C a l i f . )w a s u s e d . A 1 / 1 0 - v o l u m e s a m p l e w a s t h e n a d d ed , a n d t h er e a c t i o n m i x t u r e w a s o v e r l a i d w i t h 5 0 R I o f m i n e r a l o i l( S i g m a ) .PCR w a s p e r f o r m e d i n a DNA t h e r m a l c y c l e r ( G e n eA T A Q C o n t r o l l e r ; P h a r m a c i a L K B ) . T h e f i r s t c y c l e c o n -s i s t e d o f d e n a t u r a t i o n a t 9 4 C f o r 3 m i n , a n n e a l i n g a t 6 3 C f o r1 . 5 m i n , a n d e x t e n s i o n a t 7 2 C f o r 2 m i n . T h e n e xt 2 9 c y c l e sc o ns i st e d o f d e n a t u r a t i o n a t 9 4 C f o r 1 m i n , p r i m e r a n n e a l i n ga t 6 3 C f o r 1 . 5 m i n , a n d e x t e n s i o n a t 7 2 C f o r 2 m i n ( a na d d i t i o n a l 1 0 m i n w a s i n c l u d e d a t t h e e n d o f t h e c y c l e s t oc o m p l e t e e xt e ns i on o f t h e p r i m e r s ) .P r e p a r a t i o n o f s a m p l e s f o r PCR a n a l y s i s . ( i ) P u r e l e p t o -s p i r e s . C u l t u r e d l e p t o s p i r e s f r o m t h e P a s t e u r I n s t i t u t e C o l -l e c t i o n w e r e t e s t e d b y P C R . S e r i a l 1 0 - f o l d d i l u t i o n s o fl e p t o s p i r e s i n s t e r i l e d i s t i l l e d w a t e r w e r e c o l l e c t e d b y c e n -t r i f u g a t i o n a t 1 3 , 0 0 0 x g f o r 1 5 m i n a t 4 C . T h e p e l l e t s ,w a s h e d t w i c e w i t h 1 0 0 , u l o f w a t e r , w e r e r e s u s p e n d e d i n 1 0R I o f TE b u f f e r a n d h e a t e d a t 9 6 C f o r 1 0 m i n .( i i ) P u r i f i e d L e p t o s p i r a DNA. T h e L e p t o s p i r a DNA wase x t r a c t e d a n d p u r i f i e d a s d e s c r i b e d b y B r e n n e r e t a l . ( 4 ) .( i i i ) R e c o n s t i t u t i o n e x p e r i m e n t s w i t h b i o l o g i c a l s a m p l e s . Toe v a l u a t e t h e m e t h o d o f s a m p l e p r e p a r a t i o n , a r t i f i c i a l i n o c u -l a t i o n o f b i o l o g i c a l s a m p l e s was p e r f o r m e d b e f o r e PCRa s s a y . T h e m e t h o d f o r p r e p a r i n g t h e s a m p l e s was a s f o l l o w s .CSF s a m p l e s f r o m p a t i e n t s w i t h d i s e a s e s o t h e r t h a nl e p t o s p i r o s i s w e r e s e e d e d w i t h l e p t o s p i r e s a n d u s e d f o rP C R . S a m p l e s w e r e c e n t r i f u g e d a n d w a s h e d a s d e s c r i b e da b o v e e x c e p t t h a t a s i n g l e w a s h was u s e d . C o n c e n t r a t i o na n d h e a t t r e a t m e n t w e r e a s d es cr i b e d a b o v e . Two b a t c h e s o fC S F , s e e d e d w i t h s e r i a l l y d i l u t e d L . i n t e r r o g a n s , w e r es t o r e d f o r 4 8 h a t 4 C ( f i r s t b a t c h ) o r a t room t e m p e r a t u r e( s e c o n d b a t c h ) .L e p t o s p i r e s w e r e m i x e d w i t h u r i n e f r o m a h e a l t h y humana n d t e s t e d b y P C R . T h e s e s a m p l e s w e r e f i r s t c e n t r i f u g e d a t8 0 0 x g f o r 1 0 m i n a t room t e m p e r a t u r e t o e l i m i n a t e l a r g ep a r t i c l e s ( b l a d d e r c e l l s a n d u r i n a r y c r y s t a l s a n d c y l i n d e r s ,e t c . ) a n d t h e n w a s h e d , c o n c e n t r a t e d , a n d h e a t t r e a t e d a sd e s c r i b e d a b o v e . T h e f i r s t t w o b a t c h e s were s t o r e d f o r 4 8 ha t e i t h e r 4 C o r room t e m p e r a t u r e . F o r m a l d e h y d e ( f i n a lc o n c e n t r a t i o n , 0 . 5 % ) was a d d e d t o t h e t h i r d b a t c h b e f o r e t h eb a t c h was s t o r e d f o r 4 8 h a t room t e m p e r a t u r e .L e p t o s p i r e s w e r e m i x e d w i t h h e p a r i n - a n t i c o a g u l a t e dw h o l e b l o o d f r o m a h e a l t h y human a n d t e s t e d f o r P C R . T h et u b e s c o n t a i n i n g 1 m l o f b l o o d w e r e c e n t r i f u g e d a t 8 0 0 x gf o r 1 5 m i n a t room t e m p e r a t u r e , a n d 0 . 5 m l o f p l a s m a wa sr e m o v e d . A f t e r c e n t r i f u g a t i o n o f t h e p l a s m a a t 1 3 , 0 0 0 x g f o r1 0 m i n a t 4 C , t h e p e l l e t s w e r e w a s h e d t w i c e i n 1 0 0 p 1 o fs t e r i l e d i s t i l l e d w a t e r , s u s p e n d e d i n 1 0 p l o f s t e r i l e f i l t e r e dTE b u f f e r , a n d h e a t e d a t 9 6 C f o r 1 0 m i n .( i v ) S h e d d i n g s t a t e o f m i c e . Th e p r e c o c i t y o f t h e s h e d d i n gs t a t e o f m i c e e x p e r i m e n t a l l y i n f e c t e d b y i n t r a p e r i t o n e a li n f e c t i o n w i t h 1 0 3 t o 1 0 6 L . i n t e r r o g a n s s e r o v a r i c t e r o h a e m -

o r r h a g i a e s t r a i n 1 4 0 o r g a n i s m s was a s s a y e d b y P C R . U r i n ew a s c o l l e c t e d 4 t o 1 0 d a y s a f t e r i n f e c t i o n . When m i c e a r ep i c k e d b y t h e e xp e r i m e nt e r , t h e y p a ss d r o p s o f u r i n e w h i c hr e m a i n o n t h e h a i r a n d c a n b e c o l l e c t e d w i t h a n a u t o m a t i cp i p e t t e .( v ) B i o l o g i c a l s a m p l e s f r o m p a t i e n t s . U r i n e , C S F , o r b l o o d( 1 0 0 p d o f e a c h ) f r o m 2 8 p a t i e n t s w e r e t e s t e d b y P C R . T h es a m p l e s w e r e r e c e i v e d b y t h e l a b o r a t o r y t o b e t e s t e d f o rd i v e r s e i n f e c t i o u s d i s e a s e s i n c l u d i n g l e p t o s p i r o s i s . S i x p a -t i e n t s w e r e c l e a r l y s e r o p o s i t i v e a s d e t e r m i n e d b y m i c r o -s c o p i c a g g l u t i n a t i o n t e s t o r ELISA ( e i t h e r a r i s e i n t h ea n t i b o d y l e v e l s i n a s e r i e s o f s p e c i m e n s f r o m o n e p a t i e n t o ra u n i q u e t i t e r l o w e r t h a n 1 / 8 0 0 ) . T w e n t y - t w o n e g a t i v e c o n -t r o l s a m p l e s ( 1 3 C S F , 2 b l o o d , a n d 7 u r i n e s a m p l e s ) w e r es e r o n e g a t i v e ( r e p e a t e d r e s u l t s ) a n d c u l t u r e n e g a t i v e , a n d t h ef i n a l b i o l o g i c a l d i a g n o s i s e x c l u d e d l e p t o s p i r o s i s . T h e b i o l o g -i c a l s a m p l e s w e r e t r e a t e d a s d e s c r i b e d a b o v e f o r t h e r e c o n -s t i t u t i o n e x p e r i m e n t s .D e t e c t i o n o f PCR p r o d u c t s . T h e a m p l i f i c a t i o n p r o d u c t s ( 1 0p t l o r o n e - f i f t h o f t h e r e a c t i o n m i x t u r e ) w e r e a n a l y z e d b ye l e c t r o p h o r e s i s i n a 1 . 5 % a g a r o s e g e l ( s t a i n e d w i t h e t h i d i u mb r o m i d e ) . T h e m o l e c u l a r s i z e m a r k e r s w e r e p B R 3 2 8 d i g e s t e db y B g l I a n d H i n f l ( B o e h r i n g e r , M a n n h e i m , G e r m a n y ) o f t h ef o l l o w i n g s i z e s : 1 7 6 6 , 1 2 3 0 , 1 0 3 3 , 6 5 3 , 5 1 7 , 4 5 3 , 3 9 4 , 2 9 8 ,2 3 4 , 2 2 0 , a n d 1 5 4 b p .F o r g r e a t e r s e n s i t i v i t y a s w e l l a s s p e c i f i c i t y , a n a l y s i s o f t h ePCR p r o d u c t s w a s r o u t i n e l y p e r f o r m e d b y h y b r i d i z a t i o nw i t h a p r o b e s p e c i f i c f o r L e p t o s p i r a 1 6 S RNA. T h e C a n d Dp r i m e r s i n t e r n a l t o o l i g o n u c l e o t i d e s A a n d B u s e d f o r t h eo r i g i n a l a m p l i f i c a t i o n w e r e u s e d t o s y n t h e s i z e t h i s p r o b e ( 2 8 9b p ) w h i c h was s y n t h e s i z e d i n a PCR w h e r e dTTP w a sr e p l a c e d b y d i g o x y g e n i n - 1 1 - d U T P ( B o e h r i n g e r ) .PCR p r o d u c t s ( 1 0 , u l ) w e r e a d d e d t o 4 0 p l o f TE b u f f e r a n db o i l e d f o r 1 0 m i n . T h e s a m p l e s w e r e i m m e d i a t e l y p u t o n i c ea n d t h e n a p p l i e d t o a n y l o n membrane ( H y b o n d - N , A m e r -s h a m ) b y u s i n g vacuum s u c t i o n . T h e f i l t e r s w e r e d r i e d ,b a k e d f o r 2 h a t 8 0 C , a n d h y b r i d i z e d w i t h t h e L . i n t e r r o g a n sp r o b e a s d e s c r i b e d i n t h e B o e h r i n g e r m a n u a l . D e t e c t i o n o ft h e d i g o x y g e n i n - l a b e l e d p r o b e was b y u s e o f a n t i - d i g o x y g e -n i n - a l k a l i n e p h o s p h a t a s e a s s u b s t r a t e .

RESULTSS p e c i f i c i t y a n d s e n s i t i v i t y o f PCR a m p l i f i c a t i o n . PCR wasu s e d t o d e t e c t L e p t o s p i r a DNA b y u s i n g t h e r r s ( 1 6 S ) g e n e a sa t a r g e t s e q u e n c e . We f i r s t a n a l y z e d b y PCR t h e 2 0 s e r o -t y p e s t h a t a r e u s e d r o u t i n e l y i n o u r d i a g n o s t i c l a b o r a t o r y a st h e a n t i g e n s e n c o m p a s s i n g m o s t o f t h e known c r o s s - r e a c -t i o n s o f l e p t o s p i r e s f o r t h e m i c r o s c o p i c a g g l u t i n a t i o n t e s t( t h e f i r s t 2 0 L e p t o s p i r a s t r a i n s s h o w n i n T a b l e 1 ) . E a c hs e r o t y p e p r o d u c e d a p o s i t i v e s i g n a l ( a 3 3 1 - b p b a n d i n a g a r -o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s ) . An e x a m p l e o f f i v e d i f f e r e n t s e r o -v a r s i s g i v e n i n F i g . 1 . O n e r e p r e s e n t a t i v e o f e a c h a v a i l a b l e

p a t h o g e n i c s p e c i e s a s d e f i n e d b y Y a s u d a e t a l . ( 2 6 ) a n d t h en o n p a t h o g e n i c L . b i f l e x a s e r o v a r p a t o c a l s o p r o d u c e d t h es a m e - s i z e DNA p r o d u c t ( T a b l e 1 ) . T h e s e n s i t i v i t y o f t h er e a c t i o n was d e t e r m i n e d f o r L e p t o s p i r a DNA r a n g i n g f r o m 1n g t o 1 0 f g i n a m o u n t . T h e l o w e r l i m i t o f d e t e c t i o n o fL e p t o s p i r a DNA i n t h e a s s a y was 1 p g b y a g a r o s e g e le l e c t r o p h o r e s i s a n d 1 0 f g b y DNA h y b r i d i z a t i o n ( w h i c hc o r r e s p o n d t h e o r e t i c a l l y t o two b a c t e r i a ) ( F i g . 2 ) .To d e t e r m i n e t h e s p e c i f i c i t y o f t h e o l i g o n u c l e o t i d e p r i m e r sf o r L e p t o s p i r a s p p . , a n u m b e r o f p a t h o g e n i c o r g a n i s m s weret e s t e d b y u s i n g t h e s e p r i m e r s a n d t h e same h y b r i d i z a t i o nc o n d i t i o n s f o r PCR. B . b u r g d o r f e r i , B . h e r m s i i , T . d e n t i c o l a ,T r e p o n e m a p a l l i d u m , S . a u r a n t i a , E s c h e r i c h i a c o l i , S h i g e l l a

J . C L I N . M I C R O B I O L .


4/7

PCR FO R LEPTOSPIRA SPECIES IDENTIFICATION 2 2 2 1TABLE 1 . L i s t o f L e p t o s p i r a s t r a i n s u s e d f o r PCR

S e r o g r o u p S e r o v a r S t r a i n S p e c i e s aA u s t r a l i s a u s t r a l i s B a l l i c o L . i n t e r r o g a n sA u t u m n a l i s a u t u m n a l i s A k i y a m i A L . i n t e r r o g a n sB a l l u m c a s t e l l o n i s C a s t e l l o n 3 L . b o r g p e t e r s e n i iB a t a v i a e b a t a v i a e Van T i e n e n L . i n t e r r o g a n sC a n i c o l a c a n i c o l a Hond U t r e c h t I V L . i n t e r r o g a n s

c a n i c o l a C h i f f o n L . i n t e r r o g a n sC y n o p t e r i c y n o p t e r i 3 5 2 2 C L . a l s t o n iG r i p p o t y p h o s a g r i p p o t y p h o s a Moskva V L . a l s t o n i bH e b d o m a d i s h e b d o m a d i s H e b d o m a d i s L . i n t e r r o g a n sI c t e r o h a e m o r r h a g i a e c o p e n h a g e n i W i j n b e r g L . i n t e r r o g a n si c t e r o h a e m o r r h a g i a e V e r d u n L . i n t e r r o g a n sJ a v a n i c a j a v a n i c a V e l d r a t B a t a v i a 4 6 L . b o r g p e t e r s e n i iP a n a m a p a n a m a C Z 2 1 4 L . n o g u c h iPomona pomona Pomona L . i n t e r r o g a n sP y r o g e n e s p y r o g e n e s S a l i n e m L . i n t e r r o g a n sS e j r o e h a r d j o H a r d j o p r a j i t n o L . b o r g p e t e r s e n i is e r o e M8 4 L . b o r g p e t e r s e n i iw o l f f i 3 7 0 5 L . b o r g p e t e r s e n i iS e m a r a n g a p a t o c P a t o c I L . b i f l e x aT a r a s s o v i t a r a s s o v i M i t i s J o h n s o n L . b o r g p e t e r s e n i iS a r m i n s a r m i n S a r m i n L . w e i l i iS h e r m a n i s h e r m a n i 1 3 4 2 K L . s a n t a r o s a ia A s d e f i n e d b y Y a s u d a e t a l . ( 2 6 ) .b R e p o r t e d b y K a u f m a n n ( 1 4 ) .

f l e x n e r i , S a l m o n e l l a e n t e n t i d i s , P r o t e u s m i r a b i l i s , K l e b s i e l l ap n e u m o n i a e , S t r e p t o c o c c u s g r o u p D , S t a p h y l o c o c c u s a u -r e u s , a n d M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s w e r e a l l n e g a t i v e . N oa m p l i f i c a t i o n p r o d u c t s w e r e d e t e c t e d w i t h n o n - L e p t o s p i r aDNA b y e i t h e r a g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s o r DNA h y b r i d -i z a t i o n ( d a t a n o t s h o w n ) .P r e c o c i t y o f t h e s h e d d i n g s t a t e o f m i c e e x p e r i m e n t a l l yi n f e c t e d w i t h L . i n t e r r o g a n s . U r i n e f r o m S w i s s m i c e t h a t w e r ee x p e r i m e n t a l l y i n f e c t e d w i t h 1 0 3 t o 1 0 6 c e l l s o f L . i n t e r r o -g a n s s e r o v a r i c t e r o h a e m o r r h a g i a e s t r a i n 1 4 0 was a n a l y z e db y b o t h c l a s s i c a l d a r k - f i e l d m i c r o s c o p y a n d P C R . C u l t u r e i nEMJH m e d i u m was n o t a t t e m p t e d b e c a u s e o f t h e c o n t a m i -n a t i o n o f u r i n e s a m p l e s b y common m i c r o o r g a n i s m s a n d t h et i n y v o l u m e s o f t h e s p e c i m e n s . S a m p l e s o b t ai n e d b ef o r ei n f e c t i o n o r 4 t o 1 0 d a y s a f t e r i n f e c t i o n w e r e a m p l i f i e d , a n dt h e p r o d u c t s o f a m p l i f i c a t i o n w e r e a n a l y z e d b y h y b r i d i z a t i o n

( F i g . 3 ) . N o a m p l i f i c a t i o n p r o d u c t s w e r e d e t e c t e d i n s a m p l e sf r o m t h e u n i n f ec t e d m i c e . I n m i c e t h a t were i n o c u l a t e d w i t h1 0 3 p a t h o g e n i c l e p t o s p i r e s , a p o s i t i v e s i g n a l i n a d o t b l o t waso b t a i n e d a f t e r 8 d a y s . I n m i c e t h a t w e r e i n o c u l a t e d w i t h 1 0 6l e p t o s p i r e s , a p o s i t i v e s i g n a l i n a d o t b l o t was o b t a i n e d o n l y4 d a y s a f t e r i n o c u l a t i o n . T h u s , t h e o n s et o f s h e d d i n g o fl e p t o s p i r e s s e e m s t o b e c h r o n o l o g i c a l l y r e l a t e d t o t h e s i z e o ft h e i n o c u l u m .X A ' o Ac C L i_ CDCD

w-

Co _ Co co __ - Co _

A331 b P . . -

S 1 2 3 4 5 N C

3 94 bp a298 bp

F I G . 1 . E x a m p l e o f PCR a m p l i f i c a t i o n o f f i v e L . i n t e r r o g a n sserovars d e m o n s t r a t e d b y agarose g e l e l e c t r o p h o r e s i s a f t e r e t h i d i u mb r o m i d e s t a i n i n g . One nanogram o f t e m p l a t e DNAwas u s e d i n t h ePCR ( 3 0 c y c l e s w i t h p r i m e r s A a n d B ) . L a n e s : 1 t o 5 , L . i n t e r r o g a n sserovar c a s t e l l o n i s s t r a i n C a s t e l l o n 3 , serovar a u s t r a l i s s t r a i n B a l -l i c o , serovar t a r a s s o v i s t r a i n M i t i s J o h n s o n , serovar b a t a v i a e s t r a i nVan T i e n e n , serovar s e j r o e s t r a i n M 8 4 , r e s p e c t i v e l y ; NC, n e g a t i v ec o n t r o l w i t h o u t DNA; 5 , p B R 3 2 8 c l e a v e d w i t h B g l l a n d H i n f l u s e das a DNA s i z e m a r k e r ( i n b a s e p a i r s ) .

B **a .0 f i_ - 0T -

VA01 1 - _ - 001-

VD. -0 ' 4 - =

F I G . 2 . C o m p a r i s o n o f s e n s i t i v i t y o f t h e PCR a s s a y ( 3 0 c y c l e sw i t h p r i m e r s A a n d B ) f o r p u r i f i e d L . i n t e r r o g a n s s e r o v a r i c t e r o -h a e m o r r h a g i a e s t r a i n 1 4 0 DNA a f t e r a g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i ss t a i n e d w i t h e t h i d i u m b r o m i d e ( A ) a n d d o t b l o t h y b r i d i z a t i o n w i t h ad i g o x y g e n i n - l a b e l e d p r o b e ( B ) . T h e a m o u n t s o f DNA u s e d i n e a c hPCR a r e s h o w n a b o v e a nd b e l o w t h e l a n e s . N C , n e g a t i v e c o n t r o lw i t h o u t DNA.

V O L . 3 0 , 1 9 9 2


5/7

2 2 2 2 M E ' R I E N ET A L .3 4 5 6

10 10 10 10

4 -5 ~ g_ 8 * . < * , *8

F I G . 3 . D o t b l o t h y b r i d i z a t i o n w i t h a d i g o x y g e n i n - l a b e l e d p r o b eo f u r i n e s p e c i m e n s o f S w i s s m i c e i n t r a p e r i t o n e a l l y i n f e c t e d w i t h ap a t h o g e n i c L . i n t e r r o g a n s s e r o v a r i c t e r o h a e m o r r h a g i a e s t r a i n 1 4 0 .S p e c i m e n s w e r e p r e p a r e d a n d s u b j e c t e d t o a m p l i f i c a t i o n a s d e -s c r i b e d i n t h e t e x t b y u s i n g p r i m e r s A a n d B f o r 3 0 c y c l e s . D a y s a f t e ri n f e c t i o n a n d n u m b e r s o f i n o c u l a t e d p a t h o g e n i c l e p t o s p i r e s a r ei n d i c a t e d t o t h e l e f t a n d a t t h e t o p o f t h e f i g u r e , r e s p e c t i v e l y .

I n c o m p a r i s o n , d e t e c t i o n o f PCR p r o d u c t s b y d i r e c t a g a -r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s was p o s s i b l e f r o m d a y 8 w i t h a l li n o c u l a a n d f r o m d a y 5 w i t h t h e l a r g e s t i n o c u l u m . W i t hd a r k - f i e l d m i c r o s c o p y , l e p t o s p i r e s c o u l d b e d e t e c t e d o n l yf r o m d a y 8 w i t h a n i n o c u l u m o f 1 0 6 b a c t e r i a . T h e s e r e s u l t si n d i c a t e t h a t PCR i s more s e n s i t i v e t h a n d a r k - f i e l d m i c r o s -c o p y i n d e t e c t i n g i n f e c t i o n .B i o l o g i c a l s a m p l e s m i x e d w i t h l e p t o s p i r e s . To e va l ua t e t h es e n s i t i v i t y o f t h e PCR f o r b i o l o g i c a l s a m p l e s , human b l o o d ,C S F , a n d u r i n e s p e c i m e n s were s e e d e d w i t h L . i n t e r r o g a n ss e r o v a r i c t e r o h a e m o r r h a g i a e s t r a i n 1 4 0 a n d s u b j e c t e d t oa m p l i f i c a t i o n a f t e r b e i n g p r e p a r e d a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l sa n d M e t h o d s .( i ) U r i n e m i x e d w i t h l e p t o s p i r e s . T h r e e b a t c h e s o f h u m a nu r i n e w e r e s e e d e d w i t h s e r i a l l y d i l u t e d c u l t i v a t e d L . i n t e r r o -g a n s t o d e t e r m i n e t h e e f f e c t s o f t e m p e r a t u r e a n d t i m e o fi n c u b a t i o n o n t h e p r e s e r v a t i o n o f l e p t o s p i r e s i n u r i n e s a m -p l e s . F o r t h e t h r e e u r i n e b a t c h e s , a f t e r P C R , 1 0 0 m i c r o o r -g a n i s m s c o u l d b e d e t e c t e d w i t h a g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i sa n d 1 0 m i c r o o r g a n i s m s c o u l d b e d e t e c t e d w i t h d o t o r S o u t h -e r n h y b r i d i z a t i o n d e t e c t i o n . A n e x a m p l e i s g i v e n i n F i g . 4 .F o r m a l d e h y d e i n t e n s i f i e d t h e s i g n a l i n u r i n e k e p t a t roomt e m p e r a t u r e ( d a t a n o t s h o w n ) .( i i ) CSF m i x e d w i t h l e p t o s p i r e s . Two b a t c h e s o f CSF weres e e d e d w i t h s e r i a l l y d i l u t e d L . i n t e r r o g a n s . A g a r o s e g e le l e c t r o p h o r e s i s o f t h e PCR p r o d u c t s r e v e a l e d t h e p r e d i c t e db a n d f o r s a m p l e s c o n t a i n i n g 1 0 2 t o 1 0 5 l e p t o s p i r e s . G r e a t e rs e n s i t i v i t y was o b t a i n e d when d o t h y b r i d i z a t i o n wa s u s e d ;d e t e c t i o n o f a s f e w a s 1 0 l e p t o s p i r e s wa s p o s s i b l e .( i i i ) B l o o d m i x e d w i t h l e p t o s p i r e s . T h e h e p a r i n - a n t i c o a g u -l a t e d w h o l e b l o o d s e e d e d w i t h L . i n t e r r o g a n s wa s s u b j e c t e dt o PCR i m m e d i a t e l y a f t e r t r e a t m e n t ( s e e M a t e r i a l s a n dM e t h o d s ) . One h u n d r e d l e p t o s p i r e s c o u l d b e d e t e c t e d b y av i s i b l e b a n d o n t h e a g a r o s e g e l c o m p a r e d w i t h 1 0 l e p t o s p i r e sb y h y b r i d i z a t i o n .A m p l i f i c a t i o n o f l e p t o s p i r a l DNA i n b i o l o g i c a l s a m p l e s f r o mp a t i e n t s w i t h l e p t o s p i r o s i s . A t o t a l o f 2 8 s a m p l e s ( u r i n e , C S F ,

4 3 2l o l o 1 0 l o i o . r N CA

F I G . 4 . S o u t h e r n b l o t h y b r i d i z a t i o n w i t h a d i g o x y g e n i n - l a b e l e dp r o b e o f PCR p r o d u c t s ( 3 0 c y c l e s w i t h p r i m e r s A a n d B ) o f u r i n es p e c i m en s s e e de d w i t h s e r i a l l y d i l u t e d L . i n t er r o g an s s e r ov a r i c t -e r o h a e m o r r h a g i a e s t r a i n 1 4 0 . U r i n e w a s s t o r e d f o r 4 8 h a t r o o mt e m p e r a t u r e . T h e n u m b e r o f o r g a n i s m s p e r m i l l i l i t e r i s i n d i c a t e d .NC, n e g a t i v e c o n t r o l w i t h o u t DNA.o r b l o o d ) w e r e t e s t e d f o r t h e p r e s e n c e o f L e p t o s p i r a DNA.T h e s a m p l e s o r i g i n a t e d f r o m s i x p a t i e n t s w i t h s u s p e c t e dl e p t o s p i r o s i s a n d 2 2 n e g a t i v e c o n t r o l s . T h e 2 2 n e g a t i v ec o n t r o l s a m p l e s w e r e PCR n e g a t i v e .T h e c l i n i c a l c h a r a c t e r i s t i c s a n d s e r o l o g i c a l a n d PCR r e -s u l t s o f t h e s i x p a t i e n t s ( A t o F ) w i t h s u s p e c t e d l e p t o s p i r o s i sa r e s h o w n i n T a b l e 2 . F o u r o f t h e s e s i x w e r e PCR p o s i t i v e b yh y b r i d i z a t i o n . T h e e x p e r i m e n t was r e p e a t e d , w i t h i d e n t i c a lr e s u l t s .Among t h e P C R - n e g a t i v e c a s e s , o n e p a t i e n t ( p a t i e n t E )h a d a l o w b u t s i g n i f i c a t i v e a n t i b o d y t i t e r b y t h e m i c r o s c o p i ca g g l u t i n a t i o n a s s a y ( 1 / 8 0 0 ) , w h i c h c o u l d r e f l e c t a l e p t o s p i r o -s i s i n i t i a t e d more t h a n 1 m o n t h e a r l i e r . T h i s h y p o t h e s i s c o u l de x p l a i n a n e g a t i v e PCR r e s u l t a s a c o n s e q u e n c e o f a na b s e n c e o f l e p t o s p i r e s i n t h e CSF s a m p l e . P a t i e n t F d i e d , nod o u b t f r o m i c t e r o h a e m o r r h a g i c l e p t o s p i r o s i s . T h e n e g a t i v ePCR r e s u l t i n t h i s c a s e c o u l d b e e x p l a i n e d b y a b l o o ds p e c i m e n t a k e n l a t e i n i n f e c t i o n ( d a y 1 4 a f t e r t h e o n s e t o f t h ei n f e c t i o n ) a n d h e a v y a n t i b i o t i c t r e a t m e n t .I s o l a t i o n o f L e p t o s p i r a s p p . f r o m t h e c l i n i c a l s p e c i m e n s o ft h e s i x s e r o p o s i t i v e p a t i e n t s wa s a t t e m p t e d . F o r p a t i e n t Co n l y , l e p t o s p i r e s were i s o l a t e d a n d i d e n t i f i e d a s L . i n t e r r o -g a n s s e r o v a r i c t e r o h a e m o r r h a g i a e . T h i s i d e n t i f i c a t i o n wasmade b y u s e o f p u l s e d - f i e l d a g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s ( 1 1 ) .

DISCUSSIOND e t ec t i o n o f p a t h o g e n i c L e p t o s p i r a s p p . i n b o d y f l u i d s a n d

t i s s u e s i s i m p o r t a n t f o r d i a g n o s i n g l e p t o s p i r o s i s b e c a u s e i tp r o v i d e s u n e q u i v o c a l e v i d e n c e o f a c t i v e i n f e c t i o n . W i d e -s p r e a d a p p l i c a t i o n o f t h i s s t r a t e g y i s h i n d e r e d , h o w e v e r , b yt h e l i m i t a t i o n o f c o n v e n t i o n a l m e t h o d s f o r d i r e c t d e t e c t i o n o fp a t h o g e n i c l e p t o s p i r e s i n c l i n i c a l s p e c i m e n s . As a c o n s e -q u e n c e , c l i n i c a l d e c i s i o n m a k i n g i s o f t e n b a s e d u p o n s e r o -l o g i c a l t e s t s d e s p i t e t h e f a c t t h a t a n t i b o d i e s b e g i n t o a p p e a r8 t o 1 0 d a y s a f t e r t h e o n s e t o f t h e i l l n e s s . We u s e d PCR t od e v e l o p a h i g h l y s e n s i t i v e a n d s p e c i f i c a s s a y f o r L e p t o s p i r as p p . t o h e l p i n t h e d e t e c t i o n a n d t r e a t m e n t o f i n f e c t i o n a t ane a r l y s t a g e .DNA-DNA h y b r i d i z a t i o n w i t h t h e r r s ( 1 6 S ) - s p e c i f i c p r o b ewas u s e d r o u t i n e l y a s a means o f e n h a n c i n g s p e c i f i c i t y a s

J . C L I N . M I C R O B I O L .


6/7

PCR FO R LEPTOSPIRA SPECIES IDENTIFICATION 2 2 2 3TABLE 2 . C o m p a r i s o n o f m e t h o d s f o r t h e d e t e c t i o n o f l e p t o s p i r e s i n h u m a n p a t i e n t s w i t h c l i n i c a l a n d e p i d e m i o l o g i c a l h i s t o r y

P a t i e n t A g e ( y r ) S e x C l i n i c a l a n d e p i d e m i o l o g i c a l h i s t o r y S e r o l o g i c C u l t u r e P C R r e s u l t sr e s u l t s r e s u l t s ( s a m p l e )A 1 7 M F e v e r ( 4 0 C ) , c o m a ; e x p o s u r e t o d o m e s t i c + - + ( C S F )a n i m a l ( d o g ) , f i s h i n g i n l a k eB 2 4 M F e v e r ( 3 8 . 5 ' C ) , m e n i n g i t i s ; b a t h i n g i n r i v e r , + - + ( u r i n e )t r a v e l t o T h a i l a n dC 1 8 M F e v e r ( 3 9 - 4 0 ' C ) , a l g i a , s t i f f n e c k , i c t e r u s ; + + + ( C S F )b a t h i n g i n r i v e rD 6 8 F N o f e v e r , m e n i n g i t i s ; g a r d e n i n g + - + ( C S F )E 5 7 M E p i s t a x i s , r e n a l i n s u f f i c i e n c y , r e s p i r a t o r y + - - ( C S F )i n s u f f i c i e n c y , h e p a t i c c i r r h o s i s , c h r o n i ca l c o h o l i s mF 4 0 M F e v e r ( 3 9 C ) , r e s p i r a t o r y i n s u f f i c i e n c y , + - - ( b l o o d )i c t e r u s , t h r o m b o p e n i a , r e n a li n s u f f i c i e n c y , i n t e n s i v e p u r p u r a ; d i v i n g

w e l l a s s e n s i t i v i t y . R e c o g n i t i o n o f p a t h o g e n i c a n d n o n p a t h -o g e n i c L e p t o s p i r a s p p . i r r e s p e c t i v e o f s e r o v a r was o b t a i n e d .T h e i n a b i l i t y t o d i s t i n g u i s h b e t w e e n t h e s a p r o p h y t i c L .b i f l e x a a n d p a t h o g e n i c L e p t o s p i r a s p p . b y a m p l i f i c a t i o n o ft h e L . i n t e r r o g a n s r r s ( 1 6 S ) g e n e , a s p e r f o r m e d i n t h i s s t u d y ,i s n o t o f p r a c t i c a l c o n s e q u e n c e s i n c e L . b i f l e x a was u s u a l l yn o t f o u n d i n human s a m p l e s ( 7 ; a l s o o u r u n p u b l i s h e d r e -s u l t s ) . I t i s n o t e w o r t h y t h a t t h e PCR a s s a y d e v e l o p e d b y u sc a n r e a d i l y d i s t i n g u i s h b e t w e e n L . i n t e r r o g a n s a n d B . b u r g -d o r f e r i ; c r o s s - r e a c t i v i t y b e t w e e n t h e t w o s p i r o c h e t e s h a sb e e n r e p o r t e d i n s e r o d i a g n o s t i c t e s t s f o r l e p t o s p i r o s i s a n dLyme d i s e a s e ( 1 8 ) .T h e t w o o t h e r r e p o r t s o f d e t e c t i o n o f L e p t o s p i r a s p p .c o n c e r n e d t h e s p e c i f i c i d e n t i f i c a t i o n o f s e r o v a r h a r d j o i nb o v i n e u r i n e ( 9 , 2 2 ) , w h e r e a s o u r s t u d y r e p o r t s t h e d e t e c t i o no f L e p t o s p i r a s p p . i n c l i n i c a l s a m p l e s i r r e s p e c t i v e o f s e r o -v a r .T h e i s o l a t i o n o f L e p t o s p i r a s p p . was s u c c e s s f u l i n o n e o fs i x c l i n i c a l s p e c i m e n s , w h i l e f o u r o f t h e s i x w e r e p o s i t i v e b yP C R . T h e d a t a p r e s e n t e d h e r e i n d i c a t e t h a t t h e PCR p r o -v i d e s a t e c h n i q u e t h a t c o u l d s u r p a s s c u l t u r i n g i n s e n s i t i v i t yo f d e t e c t i o n . E x p e r i m e n t s w i t h p u r i f i e d DNA i n d i c a t e d t h a ta v e r y s m a l l n u m b e r o f l e p t o s p i r e s c a n b e d e t e c t e d b y t h eP C R . I n b l o o d , C S F , a n d u r i n e s e e d e d w i t h l e p t o s p i r e s , t h es e n s i t i v i t y was v e r y h i g h s i n c e a s f e w a s 1 0 b a c t e r i a g a v e ac l e a r s i g n a l d e t e c t a b l e b y h y b r i d i z a t i o n . T h i s h i g h s e n s i t i v i t ywas c o n f i r m e d b y t h e r e s u l t s o f t h e c o m p a r a t i v e s t u d y o ft h r e e d i f f e r e n t t e c h n i q u e s . O u r r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e PCRi s f a s t e r t h a n c u l t u r i n g f o r i s o l a t i n g L . i n t e r r o g a n s ( 1 d a yv e r s u s 1 t o 8 w e e k s ) . T h e r a p i d d e t e c t i o n o f l e p t o s p i r e s a t a ne a r l y s t a g e o f t h e d i s e a s e may f a v o r a b l y i n f l u e n c e t h e c o u r s eo f t h e d i s e a s e .

ACKNOWLEDGMENTSWe g r a t e f u l l y a c k n o w l e d g e A r i e l B l o c k e r f o r p r e l i m i n a r y e x p e r i -m e n t s . W e t h a n k C . W. P e n n , P . G r e e n b e r g , a n d V e r o n i q u e V i n c e n tf o r k i n d l y p r o v i d i n g T . p a l l i d u m DNA, S . a u r a n t i a M l , a n d M.t u b e r c u l o s i s DNA, r e s p e c t i v e l y . W e t h a n k N y l e s C h a r o n a n d J a n eM a c D o u g a l l f o r p r o v i d i n g v a l u a b l e c r i t i c a l a d v i c e p e r t a i n i n g t o t h em a n u s c r i p t . F . M . t h a n k s G e n e v i e v e A n d r e - F o n t a i n e f o r h e r c o n -s t a n t i n t e r e s t i n t h i s w o r k .T h i s work was s u p p o r t e d b y P a s t e u r I n s t i t u t e , C e n t r e N a t i o n a l d el a R e c h e r c h e S c i e n t i f i q u e ( U A 1 1 2 9 ) , a n d INSERM ( 9 1 0 6 0 1 ) .

REFERENCES1 . A d l e r , B . , a n d F . F a i n e . 1 9 7 7 . H o s t i m m u n o l o g i c a l m e c h a n i s m si n t h e r e s i s t a n c e o f m i c e t o l e p t o s p i r a l i n f e c t i o n s . I n f e c t . I m -m u n . 1 7 : 6 7 - 7 2 .

2 . A l e x a n d e r , A . D . 1 9 7 4 . L e p t o s p i r a , p . 3 4 7 - 3 5 4 . I n E . H .L e n n e t t e , E . H . S p a u l d i n g , a n d J . P . T r u a n t ( e d . ) , M a n u a l o fc l i n i c a l m i c r o b i o l o g y , 2 n d e d . A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l -o g y , W a s h i n g t o n , D . C . p 3 4 7 - 3 5 4 .3 . B a r b o u r , A . G . 1 9 8 4 . I s o l a t i o n a n d c u l t i v a t i o n o f Lyme d i s e a s es p i r o c h e t e s . Y a l e J . B i o l . M e d . 5 7 : 5 2 1 - 5 2 5 .4 . B r e n n e r , D . J . , A . C . M c W h o r t e r , J . K . L . K n u t s o n , a n d A . G .S t e i g e r w a l t . 1 9 8 2 . E s c h e r i c h i a v u l n e r i s : a ne w s p e c i e s o f E n t e r o -b a c t e r i a c e a e a s s o c i a t e d w i t h human w o u n d s . J . C l i n . M i c r o -b i o l . 1 5 : 1 1 3 3 - 1 1 4 1 .5 . D e W i t , D . , L . S t e y n , S . S h o e m a k e r , a n d M. S o g i n . 1 9 9 0 . D i r e c td et e ct i o n o f M y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s i n c l i n i c a l s p e c i m e n sb y DNA a m p l i f i c a t i o n . J . C l i n . M i c r o b i o l . 2 8 : 2 4 3 7 - 2 4 4 1 .6 . E l l i n g h a u s e n , H . C . , a n d W. G . M c C u l l o u g h . 1 9 6 5 . N u t r i t i o n o fL e p t o s p i r a pomona a n d g r o w t h o f 1 3 o t h e r s e r o t y p e s : f r a c t i o n -a t i o n o f o l e i c a l b u m i n c o m p l e x a n d a m e d i u m o f b o v i n e a l b u -m i n e a n d p o l y s o r b a t e 8 0 . Am . J . V e t . R e s . 2 6 : 4 5 - 5 1 .7 . F a i n e , S . 1 9 8 2 . G u i d e l i n e s f o r l e p t o s p i r o s i s c o n t r o l . W o r l dH e a l t h O r g a n i z a t i o n , G e n e v a .8 . F u k u n a g a , M . , I . H o r i e , N . O k u z a k o , a n d I . M i f u c h i . 1 9 9 0 .N u c l e o t i d e s e q u e n c e o f a 1 6 S r R N A g e n e f o r L e p t o s p i r a i n t e r -r o g a n s s e r o v a r c a n i c o l a s t r a i n M o u l t o n . N u c l e i c A c i d s R e s .1 8 : 3 6 6 .9 . G e r r i t s e n , M. J . , T . O l y h o e k , M. A . S m i t s , a n d B . A . B o k h o u t .1 9 9 1 . S a m p l e p r e p a r a t i o n m e t h o d f o r p o l y m e r a s e c h a i n r e a c -t i o n - b a s e d s e m i q u a n t i t a t i v e d e t e c t i o n o f L e p t o s p i r a i n t e r r o g a n ss e r o v a r h a r d j o s u b t y p e h a r d j o b o v i s i n b o v i n e u r i n e . J . C l i n .M i c r o b i o l . 2 9 : 2 8 0 5 - 2 8 0 8 .1 0 . H a y , P . E . , J . R . C l a r k e , A . R . S t r u g n e l l , D . T a y l o r - R o b i n s o n ,a n d D . G o l d m e i e r . 1 9 9 0 . Use o f t h e p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n t od e t e c t DNA s e q u e n c e s s p e c i f i c t o p a t h o g e n i c t r e p o n e m e s i nc e r e b r o s p i n a l f l u i d . FEMS M i c r o b i o l . L e t t . 6 8 : 2 3 3 - 2 3 8 .1 1 . H e r r m a n n , J . L . , C . B a r i l , E . B e l l e n g e r , P . P e r o l a t , G . B a r a n t o n ,a n d I . S a i n t G i r o n s . 1 9 9 1 . Genome c o n s e r v a t i o n i n i s o l a t e s o fL e p t o s p i r a i n t e r r o g a n s . J . B a c t e r i o l . 1 7 3 : 7 5 8 2 - 7 5 8 8 .1 2 . I v i c , A . , J . M a c D o u g a l l , R . R . B . R u s s e l l , a n d C . W . P e n n . 1 9 9 1 .I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a p l a s m i d f r o m T r e p o n e m ad e n t i c o l a . FEMS M i c r o b i o l . L e t t . 7 8 : 1 8 9 - 1 9 4 .1 3 . J o h n s o n , R . C . , a n d V . G . H a r r i s . 1 9 6 7 . D i f f e r e n t i a t i o n o fp a t h o g e n i c a n d s a p r o p h y t i c l e p t o s p i r e s . I . G r o w t h a t l o w t e m -p e r a t u r e s . J . B a c t e r i o l . 9 4 : 2 7 - 3 1 .1 4 . K a u f m a n n , A . F . P e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n .1 5 . M i l l e r , J . H . 1 9 7 2 . E x p e r i m e n t s i n m o l e c u l a r g e n e t i c s , p . 3 1 - 3 6 .C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y , C o l d S p r i n g H a r b o r , N . Y .1 6 . P a s t e r , B . J . , F . E . D e w h i r s t , W . G . W e i s b u r g , L . A . T o r d o f f ,G . J . F r a s e r , R . B . H e s p e l l , T . B . S t a n t o n , L . Z a b l e n , L .M a n d e l c o , a n d C . R . W o e s e . 1 9 9 1 . P h y l o g e n e t i c a n a l y s i s o f t h es p i r o c h e t e s . J . B a c t e r i o l . 1 7 3 : 6 1 0 1 - 6 1 0 9 .1 7 . P a s t e r , B . J . , E . S t a c k e b r a n d t , R . B . H e s p e l l , C . M. H a h n , a n dC . R . W o e s e . 1 9 8 4 . T h e p h y l o g e n y o f t h e S pi r o ch e t e s. S y s t .A p p l . M i c r o b i o l . 5 : 3 3 7 - 3 5 1 .1 8 . R a o u l t , D . , K . E . H e c h e m y , a n d G . B a r a n t o n . 1 9 8 9 . C r o s s -r e a c t i o n w i t h B o r r e l i a b u r g d o r f e r i a n t i g e n o f s e r a f r o m p a t i e n t s

V O L . 3 0 , 1 9 9 2


7/7

J . C L I N . M I C R O B I O L .w i t h human i m m u n o d e f i c i e n c y v i r u s i n f e c t i o n , s y p h i l i s , a n dl e p t o s p i r o s i s . J . C l i n . M i c r o b i o l . 2 7 : 2 1 5 2 - 2 1 5 5 .1 9 . R o s a , P . , a n d T . G . S c h w a n n . 1 9 8 9 . A s p e c i f i c a n d s e n s i t i v eassay f o r t h e Lyme d i s e a s e s p i r o c h e t e B o r r e l i a b u r g d o r f e r iu s i n g t h e p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n . J . I n f e c t . D i s . 1 6 0 : 1 0 1 8 -1 0 2 9 .2 0 . S a i k i , R . K . , D . H . G e l f a n d , S . S t o f f e l , S . J . S c h a r f , R . H i g u c h i ,G . T . H o r n , K . B . M u l l i s , a n d H . A . E h r l i c h . 1 9 8 8 . P r i m e r -d i r e c t e d e n z y m a t i c a m p l i f i c a t i o n o f DNA w i t h a t h e r m o s t a b l eDNA p o l y m e r a s e . S c i e n ce 2 3 9 : 4 8 7 - 4 9 1 .2 1 . Van d e r H o e d e n , J . 1 9 5 4 . T h e p a t h o g e n i c i t y o f l e p t o s p i r e s t of i e l d r o d e n t s i n I s r a e l ( a new t e s t a n i m a l f o r u s e i n L e p t o s p i r ar e s e a r c h ) . J . I n f e c t . D i s . 9 5 : 2 1 3 - 2 1 9 .2 2 . Van E y s , G . J . J . M . , C . G r a v e k a m p , M. J . G e r r i t s e n , W. Q u i n t ,M. T . E . C o r n e l i s s e n , J . T e r S c h e g g e t , a n d W. J . T e r p s t r a . 1 9 8 9 .D e t e c t i o n o f l e p t o s p i r e s i n u r i n e b y p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n .

J . C l i n . M i c r o b i o l . 2 7 : 2 2 5 8 - 2 2 6 2 .2 3 . W o e s e , C . R . 1 9 8 7 . B a c t e r i a l e v o l u t i o n . M i c r o b i o l . R e v . 5 1 : 2 2 1 -2 7 1 .2 4 . W o e s e , C . R . , E . S t a ck e b r an dt , T . J . M a c k e , a n d G . E . F o x.1 9 8 5 . A p h y l o g e n e t i c d e f i n i t i o n o f t h e m a j o r e u b a c t e r i a l t a x a .S y s t . A p p l . M i c r o b i o l . 6 : 1 4 3 - 1 5 1 .2 5 . W o o d s , S . A . , a n d S . T . C o l e . 1 9 8 9 . A r a p i d m e t h o d f o r t h ed e t e c t i o n o f p o t e n t i a l l y v i a b l e M y c o b a c t e r i u m l e p r a e i n humanb i o p s i e s : a n o v e l a p p l i c a t i o n o f PCR. FEMS M i c r o b i o l . L e t t .6 5 : 3 0 5 - 3 1 0 .2 6 . Y a s u d a , P . H . , A . G . S t e i g e r w a l t , K . R . S u l z e r , A . F . K a u f m a n n ,F . R o g e r s , a n d D . J . B r e n n e r . 1 9 8 7 . D e o x y r i b o n u c l e i c a c i dr e l a t e d n e s s b e t w e e n serogroups a n d s e rovars i n t h e f a m i l yL e p t o s p i r a c e a e w i t h p r o p o s a l s f o r s e v e n new L e p t o s p i r a spe-c i e s . I n t . J . S y s t . B a c t e r i o l . 3 7 : 4 0 7 - 4 1 5 .

2 2 2 4 MERIEN ET A L .

j. clin. microbiol.-1992-mérien-2219-24

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