JOURNAL CLUB

Maria Elena Conidi

Molteplici funzioni:

1) metabolismo energetico con la produzione di ATP (ciclo di Krebs e Fosforilazione ossidativa (OXPHOS))

Danno mitocondriale:

Dismetabolismo energetico (necrosi)

Stress ossidativo

Apoptosi

Alterazioni metabolismo del calcio

Gli altri processi in cui il mitocondrio interviene sono:

2) Bilancio redox (specie reattive dell’ossigeno (ROS))

3) Regolazione del ciclo cellulare

4) Omeostasi del calcio

5) Termogenesi

MITOCONDRI

«organelli citoplasmatici presenti nelle cellule eucariotiche»

Il numero di mitocondri varia ampiamente da un tipo cellulare all’altro.

La modulazione della numerosità avviene attraverso biogenesi mitocondriale, mitofagia,

fissione e fusione !!

«Variabilità di numero» si ha in base al tipo di popolazione cellulare ed alle esigenze energetiche del tessuto:

- alcuni tipi cellulari hanno da pochi a 4 mitocondri «come piccoli organelli isolati», mentre

- popolazioni cellulari con alto bisogno energetico «oltre un centinaio di mitocondri» che agiscono come un network dinamico.

MITOCONDRI

matrix

inner membrane

outer membrane

inter- membrane

space

mitochondrion

cristae

La regolazione di questi processi è differente sia dentro le cellule che tra tipi cellulari diversi,

«variabilità di numero, dimensioni e forme» della popolazione mitocondriale!!

Il cervello, organo ad alta attività energetica, è fortemente dipendente dal

metabolismo ossidativo (OXPHOS)

- I mitocondri sono necessari per una corretta attività neuronale

- Nei neuroni «elevato numero di mitocondri» + «alto contenuto di mtDNA»

I mitocondri sono il principale sito responsabile della produzione

del 90% di radicali liberi.

Vengono prodotti quando gli elettroni fuoriescono dalla «catena di

trasporto degli elettroni (ETC)» e reagiscono con l’ossigeno.

Circa 1 e 5% di tutto l’ossigeno si liberano come

radicali superossidi (ROS).

In condizioni fisiologiche, i radicali liberi sono prodotti continuamente nelle cellule

devono essere bilanciati dalle «difese antiossidanti» «equilibrio di ossidoriduzione»

Sbilanciamento tra i ROS / difese antiossidanti «stress ossidativo» danno ossidativo

Mitocondri & Radicali liberi

La progressiva alterazione delle funzioni mitocondriali è coinvolta nei normali processi di invecchiamento ma anche in malattie neurodegenerative

(es. Alzheimer).

Significativa riduzione del contenuto proteico del complesso OXPHOS, della sua attività e della produzione di energia sono segni caratteristici

della riduzione del metabolismo energetico (aumento di ROS + disfunzione mitocondriale) associati alla malattia di Alzheimer e sono stati

osservati nel cervello post-mortem di pazienti con Alzheimer ad esordio tardivo (LOAD).

Mitocondri & Radicali liberi

Stress ossidativo cellulare

danno su componenti

cellulari e mitocondriali

Alterazioni mitocondriali aumento dei livelli di ROS

«ipotesi della cascata mitocondriale»:

(1) Dinamica mitocondriale & Stress ossidativo

Due importanti meccanismi:

1) FUSIONE_ consente ai mitocondri di combinarsi ed interagire tra loro

_ mantenimento di organelli funzionali.

2) FISSIONE_ facilita il riarrangiamento, rimodellamento e

proliferazione mitocondriale.

_ gioca un importante ruolo nel corretto

assemblaggio dei complessi di trasporto degli

elettroni transmembrana (ETCs).

Una eccessiva frammentazione, mediata da una eccessiva fissione e sbilanciamento dell’equilibrio fusione/fissione, può essere dovuta a stress

ossidativo ed eccessiva produzione di ROS, anche perché la fissione gioca un ruolo importante nell’assemblaggio dei complessi ETC.

(1) Dinamica mitocondriale & Stress ossidativo & malattia di Alzheimer

Alterazioni nell’espressione delle proteine di fissione-fusione possono risultare in una “distribuzione mitocondriale alterata”.

Cambiamenti nella dinamica mitocondriale ha un impatto significativo sulla funzionalità mitocondriale.

Nei cervelli post-mortem con AD è stata osservata “un’eccessiva frammentazione” in associazione ad una riduzione di proteine di fusione ed

aumento di proteine di fissione ( sbilanciamento fissione/fusione) mitocondri mal funzionanti nei neuroni danneggiati.

Le dinamiche mitocondriali sono critiche per l’integrità

mitocondriale e suoi cambiamenti hanno un impatto

negativo su tutte le funzioni mitocondriali:

- metabolismo energetico

- omeostasi del Ca++

- generazione di ROS

- regolazione dell’apoptosi

Distruzione delle dinamiche mitocondriali può essere considerato evento iniziale della morte cellulare ROS-mediata!!

Evidenze sperimentali:

Saggi di immunoblotting hanno evidenziato che la presenza di APP altera il rapporto

fusione/fissione, con riduzione di Mfn1 e 2, DRP1 e OPA1 e aumento di hFis1.

Studi su fibroblasti umani da pazienti con AD sporadici hanno messo in luce

un’alterata distribuzione dei mitocondri e dimostrato che elevato stress ossidativo ed

elevata produzione di Aβ sono fattori che causano riduzione di Drp1.

pTau e Aβ stimolano la nitrosilazione di Drp1 con conseguente aumento della

fissione e neurodegenerazione.

Cellule con deficit di fusione mitocondriale mostrano riduzione del potenziale di

membrana mitocondriale e ridotta respirazione. Infatti la diminuzione di OPA1 induce

il rilascio di cyt c e lo accelera tramite stimoli apoptotici.

Aumento del processo di fissione + riduzione della fusione + aumento delle interazioni di pTau e Aβ con

Drp1 eccessiva frammentazione mitocondriale + alterato trasporto assonale dei mitocondri +

conseguente degenerazione sinaptica nei neuroni affetti da AD.

(1) Dinamica mitocondriale & Alzheimer

(2) ROS mit + Apoptosi & malattia di Alzheimer

Stress Ossidativo è legato al processo di invecchiamento e neurodegenerazione.

Nel cervello, alterata respirazione mitocondriale + aumento di ROS = cambiamenti funzionali e

danno cellulare.

Mitocondri difettosi rilasciano grandi quantità di ROS

Declino dell’attività degli enzimi antiossidanti (es nella senilità) incrementano la formazione degli

stessi con conseguente danno alla catena respiratoria, in particolare dei complessi I e III e COX.

Nella malattia di Alzheimer

Alterazioni della OXPHOS (per inibizione da parte di Aβ)

Modificazione del metabolismo energetico +

riduzione di ATP + aumento di ROS.

Sono stati osservati:

- stress ossidativo associato alla membrane (riduzione della dpm)+ aumentata produzione di ROS + perturbazione dell’omeostasi del Ca++.

- aumentata permeabilità di membrana e rilascio di cyt c e fattori proapoptotici, indotti da oligomerizzazione e polimerizzazione di Aβ, portano

all’apertura dei pori MPTP con conseguente apoptosi.

Inoltre l’attività della citocromo ossidasi (COX) è ridotta e i neuroni mostrano danno mitocondriale ed apoptosi !!

Sbilanciamento radicali liberi / meccanismi di difese antiossidanti «stress ossidativo» danno ossidativo

necrosi cellulare ed apoptosi.

(3) Complesso di trasporto degli Elettroni (ETC) + stress ossidativo & Alzheimer

Riduzione significativa dell’attività della citocromo ossidasi (cyt c e complesso IV) è stata osservata

nelle piastrine, nella corteccia ed ippocampo di pazienti con Alzheimer.

Nelle piastrine è stato osservato un deficit mitocondriale che sta ad indicare una alterazione

dell’attività del complesso III e COX.

Alterazioni a livello dei complessi ETC culminano nello stress ossidativo con sovrapproduzione

di ROS, alterazione dell’energia, omeostasi aberrante del Ca++, riduzione del dpm, alterazione

della permeabilità dei pori MPTP morte cellulare per necrosi o apoptosi.

La riduzione del trasferimento di elettroni = meccanismo di disfunzione mitocondriale

caratteristico dell’invecchiamento.

I complessi I COX sono ridotti nell’invecchiamento

(4) DNA mitocondriale (mtDNA)

Struttura circolare a doppio filamento; circa 16,6kb

13 geni codificanti proteine del complrsso OXPHOS:

7subunità del complesso I; 1 del complesso III; 3 del

complesso IV; 2 del complesso V;

22 geni per i tRNAs; 2 geni per rRNAs; una regione

di controllo non codificante (CR)

(4) Caratteristiche del mtDNA

ETEROPLASMIA: Nel caso di una mutazione del mtDNA questa può

colpire tutte le copie, poiché può essere ereditata a livello della linea

germinale oppure essere presente solo in una percentuale di genomi come

mutazione de novo a livello delle cellule somatiche.

POLIPLASMIA: ogni cellula presenta molti mitocondri ed ogni mitocondrio

contiene multiple copia del suo genoma (eccetto piastrine e ovulo non

fertilizzato) migliaia di copie mtDNA / cell.

Durante la divisione cellulare i mitocondri vengono distribuiti casualmente alle

cellule figlie e quindi la genetica mitocondriale è più simile alla genetica di

popolazione che alla genetica mendeliana.

EFFETTO SOGLIA: espressione clinica delle mutazioni del mtDNA è determinata

dalla relativa proporzione wild type/mutato in un determinato tessuto;

E’ necessario un numero minimo di copie per danneggiare il metabolismo

energetico di un determinato organo o tessuto (valore relativo e non assoluto)

(SNC, cuore, muscolo, rene e ghiandole esocrine) (bilancio energetico).

(4) Caratteristiche del mtDNA

EREDITA’ MATERNA: tutti i mitocondri dello zigote derivano dall’oocita e

perciò la modalità di trasmissione delle mutazioni mtDNA differisce dalla

trasmissione mendeliana classica:

madre portatrice trasmissione a tutta la progenie, ma solo le figlie femmine

possono trasmettere la mutazione ai loro figli.

Eteroplasmia + effetto dose eccezioni fenotipiche all’eredità matrilineare.

DNA mitocondriale + stress ossidativo & malattia di Alzheimer

Le mutazioni a livello del mtDNA si possono propagare per espansione clonale

Mutazioni somatiche nel mtDNA possono così influenzare il fenotipo (effetto soglia)

Accumulo graduale di mutazioni somatiche del mtDNA possono implementare il loro effetto deleterio nel tempo

Difetti nel mtDNA sono stati trovati anche in soggetti anziani non affetti da demenza

Numerosi studi hanno dimostrato che mutazioni nel mtDNA si accumulano progressivamente con l’età in vari tessuti, in

particolare nei tessuti ad elevata attività metabolica (cervello) si accumulano livelli più elevati di mtDNA mutato durante il

processo di invecchiamento!!

L’ipotesi della cascata mitocondriale ha dato il via a numerosi studi sulle alterazione del DNA mitocondriale associate

ad eccessivo stress ossidativo

Vulnerabilità del mtDNA al danno ossidativo:

È localizzato in regioni prossime ad alte

concentrazioni di ROS;

Assenza di efficienti meccanismi di riparazione del

DNA;

Assenza di istoni protettivi della struttura del DNA;

L’età è da considerare il principale fattore di rischio per l’Alzheimer e altre malattie neurodegenerative

DNA mitocondriale + stress ossidativo & malattia di Alzheimer

Nella CR: T414G,

T414C,T477C

5-kb mtDNA

Nel cervello post-mortem di pazienti AD è stato osservato un maggior danno ossidativo a livello del mtDNA, rispetto all’età, che porta ad un

maggior numero di mutazioni/delezioni e problemi post genomici di regolazione dell’espressione.

Cambiamenti dell'espressione di geni mitocondriali e nucleari, codificanti le proteine dei complessi OXPHOS contribuiscono ad alterare il

metabolismo ossidativo nell’Alzheimer!!

Comunque il mtDNA non gioca un ruolo primario nella patogenesi dell’Alzheimer ma è coinvolto successivamente!!

Dati sperimentali:

ridotta attività del complesso I, in particolare della subunità ND4 nella corteccia temporale;

Espressione differente dei geni mitocondriali codificanti il complesso I, COX e complesso V;

Lo studio dell’espressione dei geni mitocondriali e nucleari in aree differenti del cervello ha altresì mostrato una diversa proporzione tra i vari

componenti, contribuendo così a perturbazioni del metabolismo ossidativo.

Accumulo

mutazioni mtDNA

riduzione

dell’efficienza

dell’ETC

Riduzione ATP +

aumento di ROS

accumulo

mutazioni

mtDNA

morte

cellulare

ANELLO A

FEEDBACK

POSITIVO

DNA mitocondriale + stress ossidativo & malattia di Alzheimer

1) La patologia mitocondriale può essere considerata un importante fattore nella manifestazione dei sintomi

clinici delle neurodegenerative;

2) Alterazioni mitocondriali, coinvolte nella patofisiologia di diverse malattie neurodegenerative, includono:

- alterazioni del OXPHOS;

- aumento del numero di mutazioni, delezioni o polimorfismi,

-alterazioni dell’omeostasi del calcio,

- alterazione del metabolismo energetico così come l’interazione con proteine malattia-specifiche (Aβ amiloide)

3) Approcci terapeutici finalizzati al rafforzamento delle funzioni mitocondriali potrebbero avere un significato

per la cura o il contenimento delle malattie neurodegenerative !!

CONCLUSIONI (1)

CONCLUSIONI (2)

1) Nella malattia di Alzheimer abbiamo visto che l’alterazione della dinamica mitocondriale (shift verso la

fissione) impatta negativamente su tutta l’attività mitocondriale punto critico nella patogenesi

dell’Alzheimer.

2) Strategie in grado di modificare l’anormale dinamica mitocondriale potrebbero essere un interessante

intervento terapeutico per l’Alzheimer.

3) Farmaci mirati a ridurre l’espressione delle proteine di fissione mitocondriale (Drp1, Aβ e pTau) potrebbero

proteggere i neuroni dall’effetto tossico di questi fattori e dalle loro interazioni.