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1
細胞がん化の原理に基づいた 真にがん細胞特異的アプローチ法
関西学院大学 理工学部 生命科学科
教授 大谷 清
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2
がん細胞特異的アプローチの必要性
・ 外科的切除不能のがんには、放射線や抗がん剤療法などが用いられている。
・ これらの治療法は、増殖している細胞を優先的に傷害
する。
・ 従って、がん細胞だけでなく正常な増殖細胞も傷害し、
副作用を生じうる。
・ 副作用を生じない程度に治療を控える必要があり、根
治治療が困難となることが多い。
・ 副作用を防ぐためには、正常な細胞に影響を及ぼさな
いよう、がん細胞特異的にアプローチする必要がある。
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従来技術とその問題点
【免疫療法】がん細胞は自己の細胞由来であり、かつ既に免疫監 視機構をかいくぐって生じているため、再度免疫反応を誘導するこ とが難しい。
【分子標的療法】特殊ながんに限られ、普遍的ではない正常細胞 にも多少発現しているものが多い。
【テロメラーゼ発現に基づくhTERTプロモーター】幹細胞にもテロメ ラーゼが発現しているため、幹細胞に影響を及ぼす可能性がある。
【亢進したE2F活性】正常な増殖細胞でもE2Fは活性化されている ため、正常な増殖細胞に影響を及ぼす可能性がある。
【CDK阻害剤】正常な増殖細胞でもCDKは活性化されているため、 正常な増殖細胞に影響を及ぼす可能性がある。
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4
新技術の特徴
・ 細胞がん化のメカニズムに基づく。
・ 原理的に、真にがん細胞特異的と考えられる。
・ 原理的に、がんの臓器の由来を問わず、普遍的に機能する
と考えられる。
・ 制御された増殖をする正常な細胞と異常な増殖をするがん
細胞を識別できる。
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5
新技術の原理
・ 細胞がん化の抑制には、2大がん抑制経路であるRB経路とp53経路が主要な役割を果たしている。
・ ほぼ全てのがんでRB経路とp53経路が傷害されている。
・ その結果として、がん細胞にはRBの制御を外れた特異E2F
活性がある(増強しているだけではない!)。
・ この特異なE2F活性は、がん細胞で単に亢進しているE2F
活性とは機能が異なる。
・ この特異なE2F活性は、がん化の原理に基づくため、正常
な細胞には存在しない。
・ この特異なE2F活性に基づけば、真にがん細胞特異的にア
プローチできると考えられる。
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6
RB経路
・ RB経路は、転写因子E2Fを主な標的としている。
・ E2Fは、細胞増殖に必要な一連の増殖関連遺伝子の発現
を制御している。
・ RBは転写因子E2Fと結合し、E2Fの標的遺伝子発現を
抑を抑制することによってがん化を抑制している(次頁図左)。
・ ほぼ全てのがんでRB経路に異常があり、E2Fの活性が
亢進し細胞増殖が促進されている(次頁図右)。
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7
RB経路
サイクリン/CDK
RB
CDKインヒビター
増殖関連遺伝子
転写活性化E2F
増殖関連遺伝子
転写抑制E2F
サイクリン/CDK
CDKインヒビター
RB
増殖抑制
がん化抑制
増殖促進
がん化
正常状態 がん性変化
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8
p53経路
・ p53は、細胞にがん性変化が生じた時に、アポトーシス
(細胞死)または細胞老化を誘導することによりがん化を
抑制している。
・ p53ががん性変化を感知する機構は、p53の上流の活性
化因子であるARFをコードしているARF遺伝子ががん性
変化を特異的に感知することによる(次頁図左)。
・ ほぼ全てのがんでp53経路に異常があり、アポトーシス
および細胞老化が起こらなくなっている(次頁図右)。
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9
p53経路
がん化抑制
ARF
Mdm2
p53
アポトーシス・細胞老化
がん性変化
正常細胞 がん細胞
がん化
ARF
Mdm2
p53
アポトーシス・細胞老化
がん性変化
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10
E2FによるRB経路とp53経路のリンク
RB経路の異常によってE2Fが活性化されると、
ARF遺伝子を活性化することによりp53を活性化する。
RB経路
サイクリン/CDK
pRb
p53経路
ARF
Mdm2
p53
CDKインヒビター
E2F
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11
E2FによるARF遺伝子の制御の特殊性
・ 増殖刺激によってRBが生理的に不活性化されることで誘導
された生理的なE2FはARF遺伝子を全く活性化しない。
・ がん性変化に伴うRBの強制的な不活性化によって誘導された
RBの制御を外れたE2Fが特異的にARF遺伝子を活性化する
がん性変化増殖刺激
P P
P P
RB RB RBの機能欠損
E2F
RB
生理的な
増殖関連遺伝子
E2F
RBの制御を外れた
E2F
ARF遺伝子
Komori H, EMBO J, 24, 3724, 2005
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12
ARF遺伝子は、RBの制御を外れたE2Fで 特異的に活性化される
10
血清刺激後
0 4 8 12 16 20 24 28 (hr)
ARF
CDC6
GAPDH
G0/G1 90 - - 87 84 49 35 44 (%)S 2 - - 2 8 40 50 17
G2/M 8 - - 11 8 11 15 39
ARF
CDC6
GAPDH
Ad-Con
Ad-E2
F1
Ad-E2
F1
Ad-Con
血清 (-) 血清 (+)
0
30
10
20
Rela
tive
lucifera
seac
tivi
ty
CDC6
血清 (-) 血清 (+)
Contro
l
E2F1
E2F1
Contro
l
x9.8 x1.9
血清(-) 血清(+)
0
10
20
30
40ARF
Contro
l
E2F1
E2F1
Contro
l
x14.2 x16.8
Komori H, EMBO J, 24, 3724, 2005ヒト正常線維芽細胞 WI-38
0 4 8 12 16 20 24 28 (hr)0
2
4
6
8
Fold
activa
tion
ARF
CDC6
血清刺激後
増殖刺激(生理的に活性化されたE2F) E2F1過剰発現(RBの制御を外れたE2F)
RT-PCR
レポーターアッセイ
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13
ARFプロモーターのE2F反応性エレメントEREAは、 制御を外れたE2F活性を特異的に感知する
-230 CTGAGCCGCCCGCGCGCGCGCCTCC -206
E2F結合配列: TTT(C/G)(G/C)CGC
LUC
+1 +49-736
LUC
LUC
LUC
LUC
LUC
LUC
LUC
Fold activation
0 10 20 30 増殖刺激E2F1
過剰発現
1.7
1.4
1.5
1.8
4.8
2.0
1.2
6.7
12.3
2.2
0.9
6.5
3.4
1.1
24.1
9.1
血清刺激
E2F1
SV40
-66
EREA
E2F site E2F-like site
Komori H, EMBO J, 24, 3724, 2005ヒト正常繊維芽細胞 WI-38
E2E2 E2 E2
E2E2 E2 E2
EREAEREA EREA
EREAEREA EREA
SV40
SV40
ARFプロモーター
E2: 典型的なE2F標的配列
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RB経路の異常によって生じたRBの制御を外れたE2Fは p53経路にも異常を伴うことにより許容されている
E2F
RB経路の欠陥
細胞増殖 p53経路の欠陥
アポトーシス細胞老化
増殖関連遺伝子
癌細胞特異的活性
癌化
E2F
p53
生理的な 制御を外れた
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15
RBの制御を外れたE2Fは、がん細胞株特異的に存在する
Komori H, EMBO J, 24, 3724, 2005
RB/p53欠損癌細胞株 (5637, C-33A, Saos-2)
正常増殖細胞 (WI-38, HFF)
Rela
tive
lucifera
seac
tivi
ty
EREAx3 ARF(-66)
RB
Con
2
1
5
0CDC6 CDC6
mut
12
4
2
0
EREAx3 ARF(-66)
15
6
3
0CDC6 CDC6
mut
Rela
tive
lucifera
seac
tivi
ty
3
4
6
8
10
2
1
5
0
3
4
9
12
LUC
LUC
-66
mutLUC
+98-570
LUC
E2F sites
EREAEREAx3
ARF(-66)
CDC6mut
CDC6
*
癌細胞株特異的活性
E2F
E2F(+ )E2F
E2F
EREA EREA
*
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16
RBの制御を外れたE2Fは、がん細胞株特異的に存在する
TAp73
GAPDH
RBCon
5637 C-33 ASaos-2 HFFs
RB欠損がん細胞株
U-2 OS H1299
RB陽性がん細胞株
正常線維芽細胞
x 0.7
8
x 0.1
3
x 0.2
4
x 1.0
0
x 0.1
6
x 0.3
5
Cdc6
RBCon
RBCon
RBCon
RBCon
RBCon
・ TAp73遺伝子は、RBの制御を外れたE2Fで特異的に活性化される。
・ TAp73遺伝子は、がん細胞株で特異的に活性化されている。
Ozono E, Genes Cells, 17, 660, 2012
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17
想定される用途 (1)
1. ARFプロモーターに細胞傷害性遺伝子を接続して、がん
細胞特異的に発現させる。
2. ウイルスの複製に必要な遺伝子のプロモーターをARFプ
ロモーターに置き換えて、RBの制御を外れたE2F依存的
に増殖するがん細胞溶解性組換えウイルスを作成する。
RBの制御を外れたE2Fの転写活性を利用する。
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18
想定される用途 (2)
1. がんの診断に応用する。
∵正常な増殖と異常な増殖を識別できる。
2. 治療におけるがん特異的なマーカー (分子標的)として
用いる。
RBの制御を外れたE2Fの実態を明らかにし、 がん細胞特異的なマーカーとして利用する。
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19
想定される用途 (3)
RBの制御を外れたE2Fが生成されるメカニズム を明らかにし、その活性を増強させてがん細胞に アポトーシスを誘導することを試みる。
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20
実用化に向けた課題
1. RBの制御を外れたE2F活性をより効率良く
利用するための人工プロモーターの改良。
2. RBの制御を外れたE2Fの生化学的な実態の
解明。
3. RBの制御を外れたE2Fが生じるメカニズムの
解明。
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21
企業への期待 (1)
1. RBの制御を外れたE2F活性を効率良く利用し、がん細胞特異的に傷害する技術開発の共同 研究を希望。
例)人工プロモーターの改良
細胞傷害性遺伝子の選択遺伝子導入法の開発(ウイルスベクターその他)
etc
2. RBの制御を外れたE2Fの実態解明の共同研究 を希望。
→がん細胞特異的なマーカーとして診断や治療への
応用の可能性を探索する。
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企業への期待 (2)
3. RBの制御を外れたE2Fが生じるメカニズムの解明の共同研究を希望。
∵メカニズムが明らかとなれば、その活性を増強させて
がん細胞にアポトーシスを誘導する可能性が生じる。
付)メカニズムが分からない段階でも、既存の薬剤の中からRBの制御を外れたE2F活性を増強する薬剤をスクリーニングすることは可能である。
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産学連携の経歴
2012年-2013年
JST研究成果展開事業
研究成果最適支援プログラムA-STEP
FSステージ探索タイプ
研究課題名;
『がん細胞特異性のより高いがん細胞傷害性
組換えアデノウイルスの開発』
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24
お問い合わせ先
関西学院大学
研究推進社会連携機構
TEL : 079-565 - 9052
FAX : 079-565 - 7910
e-mail: ip.renkei@kwansei.ac.jp