AG

TCA

AG

GTC

TTCG

AG

ATA

GTA

AC

GTTG

AG

TCA

AG

GTC

TTCG

AG

ATA

GTA

AC

GTTG

TTCC

AG

AA

GC

TCTA

TCA

TTGC

AA

CTTC

CA

GA

AG

CTC

TATC

ATTG

CA

AC

Julio MartJulio Martíínn

preimplantacional@iviomics.com

julio.martin@iviomics.com

DDiagnóstico GGenético PPreimplantacional

mailto:preimplantacional@ivi.esmailto:julio.martin@iviomics.com

Índice

Diagnóstico genético preimplantacional (DGP)

Definición y caracteristica principal

Contexto genética

Opciones reproductivas y cronología

Etapas ciclo y técnicas aplicadas en DGP

Indicaciones, resultados y limitaciones del DGP

Conclusiones

Diagnóstico genético in vitro

Ovocitos

Embriones

Muestra de análisis

Biopsia de corpúsculos polares

Biopsia de embrión (blastómero o trofoectodermo)

Transferencia embriones genéticamente normales*

Definición

DGP

Característica principal

Evita pasar por decisiones de interrupción

del embarazo, pero requiere técnicas de

reproducción asistida

• Multifactoriales

• Monogénicas

• Cromosómicas

• Mitocondriales

• Mutaciones somáticas (cáncer)*

Clasificación de enfermedades genéticas

+ factores ambientales

Varón

Opciones reproductivas

– Ruleta reproductiva

– Sin descendencia

– Adopción

– Donación de gametos

– Diagnóstico prenatal (IVE)

– DiagnDiagnóóstico preimplantacionalstico preimplantacional

Sano Fallecido

14 meses

Amnio

IVE (20 sem)

CVS

IVE (14 sem)

?

¿Cronología?

Antes GESTACIAntes GESTACIÓÓNN DespuDespuéés GESTACIs GESTACIÓÓNN

Índice

Diagnóstico genético preimplantacional (DGP)

Definición y caracteristica principal

Contexto genética

Opciones reproductivas y cronología

Etapas ciclo y técnicas aplicadas en DGP

Indicaciones, resultados y limitaciones del DGP

Conclusiones

ETAPAS

I.Técnicas Reproducción Asistida

-ICSI-Biopsia embrionaria

II.II.TTéécnicas Biologcnicas Biologíía Moleculara Molecular

--

PCR FluorescentePCR Fluorescente--

Genotipado: RFLP, A. Genotipado: RFLP, A.

fragmentos, MiniSeq.fragmentos, MiniSeq.

Clínica

Ginecología

EmbriologíaTubing

FIV

Estimulación ovárica Tratamiento Hormonal (10-14 días)

Punción (D0)Obtención de ovocitos y espermatozoides

Inseminación de ovocitos ICSI

(D1)

Valoración de fecundación (D2)

Cultivo embriones (D3-D5)

biopsia embrionaria (D3)

Transferencia / congelación

(D5)

Tratamiento de reproducción asistida

Núcleo

0+

-

0+

-

A C

Blastómeras

0+

-

0+

-

B

1 2 3

Núcleo: ADN

INCUBADOR

©2003

©2003 ©2003

-20°

C

Tubing (FIV)

http://www.efg2.com/Lab/ImageProcessing/Magnifier.ZIPhttp://www.efg2.com/Lab/ImageProcessing/Magnifier.ZIP

BBiología mmolecular

•• TubingTubing: lisis celular para liberar material gen: lisis celular para liberar material genéético accesible a la PCR.tico accesible a la PCR.

•• Tipos de anTipos de anáálisis genlisis genééticosticos–– DirectoDirecto: detecci: deteccióón mutacionesn mutaciones–– IndirectoIndirecto: an: anáálisis familiar mediante marcadores polimlisis familiar mediante marcadores polimóórficos rficos

(haplotipo a riesgo)(haplotipo a riesgo)

•• TTéécnicas molecularescnicas moleculares–– AnAnáálisis Fragmentoslisis Fragmentos–– AnAnáálisis de restriccionlisis de restriccion

o RFLP o RFLP

–– MinisecuenciaciMinisecuenciacióónn: extensi: extensióón de un n de un úúnico nuclenico nucleóótidotidoa partir del producto de PCRa partir del producto de PCR

–– AnAnáálisis de lisis de curvas de curvas de MeltingMelting..–– ArraysArrays–– UltrasecuenciaciUltrasecuenciacióónn

AGTCAAGGTCTTCGAGATAGTAACGTTGAAACTAAGGTCTTCGAGATAGTAACGTTGCGTG

Antecedentes EMG ¿Es posible un

DGP?

¿Mutaciones identificadas?

NO ¿¿Acceso Acceso ADNADN

Probandus?Probandus?

¿Acceso a ADN

familiares?

TRABiopsia (D3)Transfer (D5-

6)

Prueba de informatividad

positiva

NO

¿Protocolo DGP disponible

?

NO

NO

Programaciónciclo RA + DGP

NO

¿Mutaciones identificadas?

NO

¿Haplotipo identificado?

NO

¿Nuevo protocolo

DGP?

NOGESTACIGESTACIÓÓNN

NO

NO

DGP inviable

DGP inviable

DGP inviable

DGP inviable

DPNI

Diagrama de flujo

DIAGRAMA. REPRODUCCIÓN ASISTIDA CON DGP

ESTIMULACIÓN OVÁRICA, PUNCIÓN

1

FECUNDACIÓN IN VITRO

2

Núcleo: ADN

Blastómeras

3

BIOPSIA EMBRIONARIA

0 +-

0 +-

©2003

-20°

C

MANIPULACIÓN BLASTÓMERO

4

TRANSFER DE EMBRIONES SANOS

EMBRIONES EN CULTIVO

5 6

PCRY ANÁLISIS GENÉTICO

Índice

Diagnóstico genético preimplantacional (DGP)

Definición y caracteristica principal

Perspectiva histórica

Contexto genética

Opciones reproductivas y cronología

Etapas ciclo y técnicas aplicadas en DGP

Indicaciones,resultados y limitaciones del DGP

Conclusiones

RResultados GGenerales

•• Indicaciones principales de DGPIndicaciones principales de DGP--PCRPCR–– AR: bAR: b--talasemia/A.falciforme (82 cicleo); FQ (78); talasemia/A.falciforme (82 cicleo); FQ (78); AME AME (56).(56).–– AD: AD: DM1DM1

(98), HD (98), neurofibromatosis (21), (98), HD (98), neurofibromatosis (21), CMT1ACMT1A

(14).(14).

–– XX--l: X Fragil (75 ciclos), l: X Fragil (75 ciclos), DMD/BDMD/B

(43), Hemophilia A/B (11).(43), Hemophilia A/B (11).

•• Tasa de transferencia Embrionaria: 78% de ciclos con punciTasa de transferencia Embrionaria: 78% de ciclos con puncióón.n.

•• GestaciGestacióón : 26% por Puncin : 26% por Puncióón (33% por transferencia)n (33% por transferencia)

Año ’02 ’03 ‘04 ‘05 ’06 ’07 ’08 ’09 ‘10

DGP (N)DGP (N) 22 1111 3232 6161 105105 126126 130130 149149 147147

Enfermedad(nueva/año)

2 6 (4)

16 (10)

25 (9)

39(14)

57 (18)

71 (14)

87 (16)

102(15)

Primeros RNV en España tras DGP para:FQ, Atrofia muscular espinal, distrofia miotónica, X frágil, Poliquistosis renal AD & AR, Hemofilia A & B(varónes),

Neurofibromatosis 1, Esclerosis tuberosa 1 & 2, Neoplasia endocrina múltiple (MEN2A), etc.

Primeros RNV en EspaPrimeros RNV en Españña tras DGP para:a tras DGP para:FQ, Atrofia muscular espinal, distrofia miotónica, X frágil, Poliquistosis renal AD & AR, Hemofilia A & B(varHemofilia A & B(varóónes),nes),

Neurofibromatosis 1, Esclerosis tuberosa 1 & 2, Neoplasia endocrina múltiple (MEN2A), etc.

Resultados

DGP MonogDGP Monogéénicas nicas ––

NEUROMUSCULARESNEUROMUSCULARES

FSHD

SMN1

DM1DMD

ATXN1

CMT1A

ATXN3

DGPmonogenicas

Distrofia miotónica 1Atrofia Muscular EspinalCharcot –Marie-Tooth 1ADMDuchenne / BeckerDistrofia Facioescapulohumeral

Representan ~30% de demandas de DGP

Programa clínico DGP: ENFERMEDADES

63; 41%

35; 22%

19; 12%

10; 6%

8; 5%6; 4%

15; 10%

DM1AMEDMD/BCMT1ASCAsFSHDOTRAS

PunciPuncióónn DGPsDGPs(%)(%)

TrnsferTrnsfer(%) (%)

GestaciGestacióónn(%)(%)

AbortoAborto(%)(%)

ENM*ENM* 284284 171171(60)(60)

140140(82)(82)

5555(39)(39)

88(14,5)(14,5)

OtherOther 821821 480480(58,5)(58,5)

391391(81,5)(81,5)

138138(35)(35)

2929(21)(21)

Resultados DGP-PCR

*DM1, AME, DMD, CMT1A, SCA, FSHD*DM1, AME, DMD, CMT1A, SCA, FSHD

% TRANSFER

86

91

8490

87,5

67DM1AMEDMD/BCMT1ASCAsFSHD

145 TRANSFER / 156 DIAGN145 TRANSFER / 156 DIAGNÓÓSTICOS (86%)STICOS (86%)

Proced. Punción Bp/DGP Tf G + Aborto

8989 7878(87%)(87%)

3838(49%)(49%)

2727(71%)(71%)

1111(41%)(41%)(14%)(14%)

��

33(27%)(27%)

Proced. Punción Bp/DGP Tf G + Aborto

5252 4545(86,5%)(86,5%)

3333(73%)(73%)

2929(88%)(88%)

99(31%)(31%)(20%)(20%)

��

11(11%)(11%)

Ciclos DGP en FRESCOFRESCO: Distrofia Miotónica

Parejas DM1 : 63 [VarParejas DM1 : 63 [Varóón=20 (32%); Mujer=43 (68%)] n=20 (32%); Mujer=43 (68%)]

DM1

DNA WT / exp CTG

DNA WT / WT

EMB. WT / MT

EMB WT / WT

EMB WT / WT

DM1

DNA WT / exp CTG

DNA WT / WT

EMB. WT

EMB.ANORMAL

EMB. ANORMAL

DMD con deleción

CMT1A

NORMAL

x2x2

ANORMAL

SCA1-TP-PCR

afecto

sano

*

**

*WT

WT

WT

WT

FSHD

ANORMAL

NORMAL

LLimitaciones en DGPDGP

••

Assisted reproduction techniquesAssisted reproduction techniques– COH (female age, analysed condition), quality and number of

embryos– Cleavage stage mosaicism

••

Genetics and PGDGenetics and PGD– Informativity (mutations, STR markers)

– Single-cell PCR methods– PCR (Allele Dropout, amplification failure, amplification efficiency)

ADO

EMBRYOS: quality and number

females ≤

37 (2003-2004)

Blastocyst Morula Blastocyst + Morula

G+ Impl 2 sac ≥3 sac G+ Impl 2 sac ≥3 sac G+ Impl 2 sac ≥3 sac

1 EMBRYO 30 32.6 7.7 - 8 7.1 - - - - - - -

2 EMBRYOS 63 43.9 41.1 - 11 5.2 - - 1m+1b 41 27.3 26.9 -

3 EMBRYOS 60.0 37.8 83.3 66.7 - - - - 2m+1b 50 33.3 100 -

1m+2b 80 33.3 25 -

EVOLUCIÓN tipo CASO DGP -

PCR

Día 1

10 ovocitos

Día 3

6 embriones (8 céls.)

Análisis de 2 céls.

Día 4

Diagnóstico

Embarazo (30-65 %)

Día 5-6

Transfer Embriones sanos

Día 2

8 ovocitos F!

No resultado

Libre de Mutacion

Libre de Mutación

Mutación

presente

Mutación

presente

Buena

Morfología

Buena

Morfología

Libre de Mutación

Mala

Morfología

Índice

Diagnóstico genético preimplantacional (DGP)

Definición y caracteristica principal

Perspectiva histórica

Contexto genética

Opciones reproductivas y cronología

Etapas ciclo y técnicas aplicadas en DGP

Indicaciones,resultados y limitaciones del DGP

Conclusiones

Conclusiones I

El diagnóstico preimplantacional

permite una detección muy precoz de herencia de

enfermedades hereditarias.

Evita pasar por decisiones de interrupción de

embarazo, pero son necesarias técnicas de

reproducción asistida.

Conclusiones II

DGP para ENM es alternativa real a diagnóstico

prenatal con nº

creciente de patologías en “cartera”

Se trata de una técnica especializada que requiere

colaboración multidisciplinar (ginecología,

embriología y genética).

Cada caso debe evaluarse de forma

individualizada

AG

TCA

AG

GTC

TTCG

AG

ATA

GTA

AC

GTTG

AA

AC

AG

TCA

AG

GTC

TTCG

AG

ATA

GTA

AC

GTTG

AA

AC

Gracias

por su atención

ParcParc

CientCientííficfic

UniversitatUniversitat

de de ValValèèncianciaC\ Catedrático Agustín Escardino, 9. Paterna (Valencia) Spain. +34 963905310 – Fax: +34 963902522

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Slide Number 1Slide Number 2Slide Number 3Slide Number 4Slide Number 5Slide Number 6Slide Number 7Slide Number 8Slide Number 13Slide Number 14Slide Number 15Slide Number 16Slide Number 17Slide Number 18Biología molecularSlide Number 20Slide Number 21Slide Number 22Resultados GeneralesSlide Number 24DGP Monogénicas – NEUROMUSCULARESDGPmonogenicasSlide Number 27Slide Number 28Slide Number 29Slide Number 30Slide Number 31Slide Number 32Slide Number 33Slide Number 34Slide Number 35Slide Number 36Limitaciones en DGPEMBRYOS: quality and numberSlide Number 39Slide Number 40Slide Number 41Slide Number 42Slide Number 43