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生理氨基酸的质谱分析---Kairos kit

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¡ 介绍及背景

¡ 市面主流氨基酸分析方法

¡ Kairos kit 配置

¡ Kairos kit 工作流程

¡ Kairos 优势

¡ Q&A¡ 总结

Outline

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什么是氨基酸?

羧基基团氨基基团

区分基团

Ø 22种氨基酸用于组成蛋白质

Ø 根据不同的侧链-R来区分

必需和非必需氨基酸

a) 不能被生物体自身合成的氨基酸——必需氨基酸

b) 其他——非必需氨基酸

必需 非必需

Histidine (H) Alanine (A)

Isoleucine (I) Arginine* (R)

Leucine (L) Aspartic acid (D)

Lysine (K) Cysteine* (C)

Methionine (M) Glutamic acid (E)

Phenylalanine (F) Glutamine* (Q)

Threonine (T) Glycine* (G)

Tryptophan (W) Proline* (P)

Valine (V) Serine* (S)

Tyrosine* (Y)

Asparagine* (N)

Selenocysteine (U)

Pyrrolysine** (O)

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什么是氨基酸

§ 侧链赋予氨基酸多种特性

§ 正电荷

§ 负电荷

§ 极性

§ 疏水性

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肽-键形成

肽键形成

Ø 氨基和羧基相互作用

Ø 丢失水分子

Ø 形成肽键

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氨基酸在正常状态和疾病中的作用?

生理作用

Ø 制造蛋白质

Ø 在各种疾病状态中发挥作用

代谢: 糖尿病, 心血管疾病, 炎症性肠病癌症: 胃, 结肠直肠, 肾细胞神经系统: 肌萎缩侧索硬化症（ALS）, 亨廷顿病, 阿尔兹海默症, 自闭症

氨基酸起重要作用的疾病

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¡ 多种疾病受氨基酸影响

o 瓦博格效应

o 枫糖浆尿症

o 苯酮尿

o 高胱氨酸尿症

o 瓜氨酸血症

o 精氨酰琥珀酸尿症

¡ 新筛后确诊

典型研究领域

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为什么需求做氨基酸分析

Ø 验证正常生理状态

Ø 基线和控制数据

Ø 疾病严重程度评估

Ø 作为生物标志物来了解疾病状况

生理分析

Ø 作为药物开发的目标

Ø 作为诊断机制的潜在用途

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u客户希望与他们的分析保持一致，而ELISA由于其固有的变异特性而无法提供这种

一致性。

u客户正在寻找分析物的特异性，从而得出精确、准确和定量的答案。

u在大量的分析物分析中，他们正在寻找可以通过复合实现成本降低的途径。 

生物医学研究市场现状

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¡ 氨基酸是小分子化合物（每个约110道尔顿）

¡ 并非所有的氨基酸都能在天然状态下有紫外吸收或荧光。

¡ 衍生化为氨基酸添加了一个化学标记。这可以通过柱前或柱

后衍生来实现。

目前是怎么做的

衍生化

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柱前柱后衍生的差异

氨基酸专用柱

柱前衍生 柱后衍生

q 衍生在柱前完成

q 典型的反相分离

q 衍生产物是稳定的能够重新测试的

Waters method

q 衍生在柱后完成

q 典型的IEX分离

q 九氢萘检测

q 衍生试剂对基质不敏感

q 衍生产物寿命短——必须立即进行检测

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氨基酸柱后衍生化及茚三酮检测 

Moore and Stein awarded Nobel prize 

优点 缺点

ü 已经确立的方法

ü 处理生理样本

û 分析时间长û 生理氨基酸需120 min

û 低灵敏度û 生理学测定LOQ 50+pmol

û 专用仪器

û 每个样品的成本

û 衍生产物寿命短必须立即检测

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柱前衍生可用的各种方法

¡ 异硫氰酸苯酯Phenylisothiocyanate (PITC) (Waters PicoTag)¡ 二甲氨基偶氮苄基磺酰氯Dimethylamino-azobenzyl sulfonyl chloride (Dabsyl-Cl)¡ 氟壬基甲基邻氯甲酸酯Fluorenylmethyl-o-chloroformate (FMOC-Cl)¡ OPA + FMOC-Cl (AminoQuant)¡ 6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺氨基甲酸酯6-Aminoquinolyl-N-

hydroxysuccinimidyl carbamate (Waters AccQ-Tag)

柱前衍生和AccQ-Tag

AccQ-Tag的优点: 在高水含量下反应，可以直接进样

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AccQ-Tag 衍生化反应

Ø 更快的反应时间

Ø PH 8.2 - 10Ø 桌面反应

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AccQ-Tag 试剂的主要优点

Ø 一步衍生

Ø 直接进样

Ø 与普通盐和洗涤剂相溶

Ø 优异的定量结果

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综合解决方案

Kairos 氨基酸包

优化方法

校准

色谱柱

流动相添加剂

重组试剂

样品制备消耗品

自动化运行程序

衍生化试剂

内标

QC试剂

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Kairos方法包的配置

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试剂

校准品

QC标准品

内标

衍生化试剂

试剂盒内容

色谱柱CORTECSTM UPLC C18 1.6µ 2.1x150mm Column

样品前处理包

其他试剂

流动相添加剂

重组试剂

自动化运行程序专业服务

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试剂盒内容

A：标准品C：内标套装D：CORTECS色谱柱E：AccQ•Tag™ Ultra“3X”衍生化 试剂盒F：Kairos氨基酸复溶试剂G：甲酸H：TruView LCMS样品瓶I：Kairos氨基酸试剂盒自动化脚本J：Kairos氨基酸样品制备试剂盒F：手册

* 标准品中9种氨基酸可溯源至日本国家计量院（NMIJ CRM 6011a-6018a,6022a),另外8种可溯源至美国国家标准技术研究所（NIST SRM 2389a),其余氨基酸使用购自Sigma-Aldrich的TraceCERT标准品（如果适用），通过重量法制得。

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试剂盒内容

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Kairos开展条件

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Kairos 应用文献

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实验开始前需要注意

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Kairos实验流程

注意点：1.如需制备空白样品，将第1步中的样品替换为50µL 0.1M HCl。

2.如需制备双空白样品，将第1步中的样品替换为50µL 0.1M HCl，并将第2步的内标替换为10%磺基水杨酸。

3.内标中的磺基水杨酸可使样品中的蛋白质沉淀。

4.如果系统灵敏度较高，则需要稀释浓度超过500 µM的校准品、QC标准品和样品，避免出现与检测器相关的线性问题。

第1步：添加内标和蛋白沉淀在可盛装1-2 mL液体并且可以离心的实验室器皿中（例如1.5 mL微量离心管）执行以下步骤。

1.加入50 μL校准品、QC标准品或样品

2.加入50 μL内标

3.涡旋混合5 s

4.加入50 µL水

5.涡旋混合5 s

6.如有必要，用1 mL的0.1 M HCl稀释高浓度样品

7. 在9000 g下离心15 min

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Kairos实验流程

第2步：氨基酸衍生化将第1步处理得到的样品转移至1 mL TrueView最大回收样品瓶中。在执行后面的步骤之前应短时加热AccQ•Tag试剂，确保试剂充分溶解。

1.将70 μL硼酸盐缓冲液加入TrueView最大回收样品瓶中

2.加入10 μL第1步获得的上清液，并用移液器吸打混合

3.加入20 µL AccQ•Tag试剂

4.涡旋混合5 s，然后在室温下静置1 min

5.在55 ℃下加热10 min

注意点：1.天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)和赖氨酸(Lys)对衍生化试剂不足非常敏感。

2.如果加入上清液之后溶液变为黄色，表明缓冲样品的pH值不正确，酸度过高。确保使用的是正确的硼酸盐缓冲液（加NaOH），并在加入AccQ•Tag前充分混合样品。

3.由于上清液中含有样品，先加入上清液可使AccQ•Tag试剂先与样品反应。将10 µL上清液直接加入70 μL硼酸盐缓冲液中至关重要。

4.该试剂只与未质子化的胺反应，因此必须保证pH值在8到10之间。如果pH值过低，将无法保证所有的胺都处于未质子化的状态，pH值过高则可能破坏试剂。

5.涡旋混合非常重要，因为该操作可确保试剂抢在与水反应之前与氨基酸反应。试剂与氨基酸反应的速率比水快，因此充分混合至关重要。所以，请勿在自动进样器中进行衍生化处理。

6.加热至55 ℃可确保酪氨酸转换为稳定的衍生物。

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Kairos仪器条件

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Kairos色谱分离效果

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Kairos实验结果

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Kairos实验结果

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Kairos实验结果

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Kairos实验结果

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¡ 9 min 运行时间

¡ >40 种氨基酸(20 种在QDa上单针能出)¡ 台式，非专用系统(TQS-Micro & Qda)¡ 所有分析物>94% 准确度 and <2.6% 精密度 ¡ 能够轻松地重新测试样品(由于柱前衍生)¡ 全自动

¡ 有竞争力的定价(针对试剂盒及 仪器 - QDa)¡ 灵活的配件选项

¡ 简单易用，培训成本低

Kairos与其他方法相比如何？

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多种试剂盒配置

此外，试剂盒中配件也可以单独提供，

  产品说明

  

组件

  

部件号  Kairos氨基酸

（自动）首次订购

Kairos氨基酸校准品套装(500+)、Kairos氨基酸质量控制标准品套装(500+)、Kairos氨基酸内标套装(500+)、CORTECS UPLC C18, 1.6 µm, 2.1 x 150 mm色谱柱、3 x AccQ•Tag Ultra“3X”衍生化试剂盒、Kairos氨基酸复溶试剂、3 x 甲酸、Kairos™氨基酸试剂盒自动化脚本、Kairos氨基酸样品制备试剂盒、Kairos氨基酸试剂盒内容物指南

   

176004377（500+）

 Kairos氨基酸

（自动）再次订购

Kairos氨基酸校准品套装(500+)、Kairos氨基酸质量控制标准品套装(500+)、Kairos氨基酸内标套装(500+)、3 x AccQ•Tag Ultra“3X”衍生化试剂盒、Kairos氨基酸复溶试剂、3 x 甲酸、Kairos氨基酸试剂盒自动化脚本、Kairos氨基酸样品制备试剂盒、Kairos氨基酸试剂盒内容

物指南

  

176004378（500+）

 Kairos氨基酸

（手动）首次订购

Kairos氨基酸校准品套装(500+)、Kairos氨基酸质量控制标准品套装(500+)、Kairos氨基酸内标套装(500+)、CORTECS UPLC C18, 1.6 µm, 2.1 x 150 mm色谱柱、3 x AccQ•Tag Ultra“3X”衍生化试剂盒、Kairos氨基酸复溶试剂、3 x 甲酸、10 x TruView LCMS样品瓶、Kairos氨基酸试剂盒内容物指南

  

176004379（500+）

 Kairos氨基酸

（手动）再次订购

Kairos氨基酸校准品套装(500+)、Kairos氨基酸质量控制标准品套装(500+)、Kairos氨基酸内标套装(500+)、3 x AccQ•Tag Ultra“3X”衍生化试剂盒、Kairos氨基酸复溶试剂、3 x 甲酸、10 x TruView LCMS样品瓶、Kairos氨基酸试剂盒内容物指南

  

176004380（500+）

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Kairos如何与Waters AAA组合相匹配？

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何时何地推荐Kairos kit vs MetaboQuan-R

Kairos Amino Acid Kit

Multiple classes of analytes

Qtof

Discovery Omics

1. 靶向2. 单四极杆或串联四极杆3. 大量样品

MetaboQuan-R

# of analytes

Kairos Amino Acid Kit

MetaboQuan-R

# of samples

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如果您有下列需求或者困扰

¡ 有大量氨基酸样品需要处理 ，且目前方法

速度有限

¡ 为当前氨基酸检测的精确性和准确性而苦苦

挣扎

¡ 正在寻找一种稳健且易于使用的生理氨基酸

分析方法的

¡ 安装了Waters 仪器

Kairos能解决哪些困扰？

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Q&A

Question Answer

我已经有一套LC-MS系统了 您可以是用Kairos试剂盒，只需要输

入对应的LC-MS参数。

运行完氨基酸后，准备仪器分析其他

化合物时可能会有些困难

不会，操作过程和您从其他分析方法

转换过来一样。

如果我没有很多的样品要处理呢?  你可以购买为低通量实验室涉及的

100+ 试剂盒 (Q1发布)

我们从未储存过衍生样品进行重新测

试。你确定这不会影响结果吗？

当然。衍生样品在室温下可保存1周。

如果在色谱柱报废之前试剂用完怎么

办？

我们单独销售组件。您可以单独购买。

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Q&A

Question Answer

我不需要测试40种氨基酸 您可以测试少量的氨基酸，并且可以

把时间缩短至9分钟以内。

配制流动相感觉很麻烦 我们销售的甲酸浓缩液可直接滴入1升的LCMS级水中进行流动相配制。

我们没有在实验室建立LC-MS分析方

法的知识

我们提供专业的服务，可以在协助您

的实验室建立方法。

我们要做40种以上的氨基酸 尽管我们只验证了42种氨基酸的方法，

但可以通过运行更长的方法来覆盖更

多的氨基酸。

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¡ 客户进行氨基酸定量以了解生理和疾病状态，包括用作生物标志物。

¡ 当前的方法是耗时的，而且不容易自动化

¡ Kairos氨基酸试剂盒是一种快速的方法，它能带来可靠的结果，并且易于自动化。

¡ 该试剂盒提供灵活的规格和专业的服务

总结

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www.waters.com/Kairos

了解更多详细信息

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Thank you!