144

Kinh nghi m xây d ng và phát tri n PCR/real-time PCR và m t s

k thu t sinh h c phân t khác trong nghiên c u và ch n oán

T các yêu c u th c t ph i ti p c n n n y h c hi n i trong ch n oán và i u tr

1. C n m t gi i pháp toàn di n v ch n oán sinh h c phân t b nh viêm gan

virus B và viêm gan virus C m n tính

B nh viêm gan virus B và viêm gan virus C m n tính là h u qu c a tình tr ng

nhi m virus viêm gan B (HBV=Hepatitis B virus) và virus viêm gan C (HCV=hepatitis

C virus) gây ra. B nh nhân có th b nhi m HBV và HCV qua ng máu nh tiêm

chích, truy n máu, nh r ng, châm c u, làm móng, hay các th thu t xâm l n... b i các

d ng c b nhi m virus. Ngoài ra, nhi m trùng HBV và HCV còn có th xãy ra qua con

ng tình d c, m truy n qua con khi sinh n ...

Theo các thông tin t T Ch c Y T Th Gi i và m t s nhà nghiên c u trong và

ngoài n c, Vi t Nam là m t trong nh ng qu c gia ng hàng u v t n su t nhi m

HBV qua xét nghi m phát hi n kháng nguyên b m t c a virus (HBsAg) trong máu,

v i t l ng i bình th ng có HBsAg d ng tính là 10-30%. Th ng di n ti n t

nhiên c a m t ng i b nhi m HBV là a s t kh i do h th ng mi n d ch t o c

kháng th b o v là kháng th c hi u HBsAg. Ch có m t s ít, h th ng mi n d ch

c th c a h không th

nh n di n c kháng

nguyên b m t c a virus là

kháng nguyên l có th

t o c áp ng mi n d ch

do v y mà các ng i này b

mang HBV trong c th lâu

dài và lúc nào xét nghi m

phát hi n HBsAg c ng

d ng tính. N u không có

các tác nhân nguy c gây

t n h i t bào gan (nh u ng

r u, béo phì, gan nhi m

S 4: H ng d n các ch nh xét nghi m i u tr và theo dõi hi u qu i u tr c hi u b nh nhân b b nh viêm gan virus B m n tính

145

m , hay b các tác nhân lý hoá khác) thì HBV ch nhân b n thành các virus không hoàn

ch nh (ch có v capsid mà không có lõi DNA) và t o c m t s l ng r t gi i h n

các virus hoàn ch nh, do v y h ch là các ng i lành mang HBV mà thôi (carrier) ch

không phát tri n thành viêm gan m n tính. Tuy nhiên n u có các nguy c th ng t n t

bào gan xãy ra thì HBV s phát tri n nhi u h n trong t bào gan, do v y l ng virus

hoàn ch nh s c phóng thích nhi u h n vào trong máu ( 105 copies/1ml máu) ng

th i gây t n h i t bào gan tr thành b nh viêm gan m n tính. N u không ki m soát

c s nhân b n c a HBV thì viêm gan m n tính s d n n h u qu khó tránh kh i là

x gan r i có th d n n ung th gan hay i th ng n ung th gan.

Do v y, tr c m t ng i có xét nghi m HBsAg d ng tính thì các nhà lâm sàng

nh t thi t ph i cho ch nh làm th nghi m xác nh xem trong máu c a ng i nhi m

có mang HBV hoàn ch nh hay không b ng xét nghi m PCR phát hi n HBV-DNA, và

n u d ng tính thì ph i bi t s l ng HBV hoàn ch nh có trên 105 copies/1ml hay

không b ng xét nghi m qPCR nh l ng HBV-DNA. N u l ng HBV trong máu

d i 105 thì không c n thi t ph i i u tr vì HBV v n còn nhân b n r t gi i h n trong t

bào gan và ch a gây t n h i t bào gan. Nh ng n u l ng virus 105 thì c n ph i xem

xét gan có b t n th ng ch a thông qua xét nghi m men gan ALT. N u l ng ALT

v t quá bình th ng (1,5 hay t i a là 2 l n bình th ng, nam bình th ng là 33UI

còn n bình th ng là 19IU) thì ph i cho ch nh i u tr b ng thu c kháng virus

nh lamivudine, adefovir, entecavir, interferon.. hay s d ng ngay t ban u li u pháp

k t h p lamivudine v i adefovir, v i entecavir, hay v i interferon. N u l ng ALT v n

còn bình th ng thì ph i làm sinh thi t gan làm xét nghi m gi i ph u b nh xem gan

có b th ng t n mô h c không, hay n u không mu n làm sinh thi t gan thì có th làm

fibroscan gan c a b nh nhân và giá tr fibroscan c ng có th cho bi t tình tr ng t n h i

mô gan dù không chính xác b ng sinh thi t gan. Ngoài ra, c ng c n thi t ph i làm thêm

th nghi m nh l ng AFP (alpha foeto-protein) trên các b nh nhân này vì ch c n có

b ng ch ng mô h c có t n th ng gan hay l ng AFP v t quá gi i h n bình th ng

thì v n ph i cho ch nh i u tr b nh nhân b ng thu c kháng virus nh trên. Hi n nay

các nhà i u tr không còn o v ng tr s ch c HBV ra kh i c th b nh nhân vì

nhi m HBV r t d dàng b tái phát sau khi ng ng i u tr . Lý do chính y u là vì HBV

luôn t n t i trong nhân t bào gan d i d ng cccDNA (covalently closed circular

146

DNA) làm ngu n g c di truy n c a virus, và d ng này không h b tác ng b i các

thu c kháng virus là các nucleosides analogs hi n nay. Tuy nhiên vì có nhi u b ng

ch ng cho th y n u không ki m soát mà l ng HBV hoàn ch nh trong máu lên quá

cao thì b nh viêm gan m n tính s có nguy c di n ti n n suy gan m t bù, hay x gan

ti n tri n ho c ung th gan. Do v y, sau khi ã b t u i u tr b nh nhân b viêm gan

virus B m n tính, các nhà i u tr ph i th ng xuyên theo dõi hi u qu i u tr c hi u

mà h ã cho trên b nh nhân b ng cách ph i nh k m i 3 tháng cho b nh nhân làm

xét nghi m qPCR nh l ng HBV-DNA (n u l ng HBV-DNA v n còn nh l ng

c) hay PCR nh tính phát hi n HBV-DNA (n u HBV-DNA d i ng ng phát

hi n nh l ng) cho n khi nào l ng HBV-DNA d i ng ng phát hi n. Quan i m

c a các nhà i u tr hi n nay là ph i liên t c duy trì li u pháp kháng virus kh ng ch

l ng virus d i m c phát hi n do v y mà ph i luôn theo dõi s tái xu t hi n virus

b ng xét nghi m PCR phát hi n HBV-DNA trong máu c a b nh nhân nh k m i 3

tháng. N u sau m t th i gian i u tr c hi u (th ng là 3 tháng) mà l ng virus

không gi m quá 2 log (100 l n), hay không t n ng ng 103/ml, hay trong quá trình

i u tr , xét nghi m HBV-DNA d ng tính tr l i, bác s i u tr ph i ngh n kh

n ng virus kháng thu c, c bi t là kháng lamivudine. Lúc này xét nghi m sinh h c

phân t mà bác s nên ch nh th c hi n trên b nh nhân là xét nghi m nh genotype

và phát hi n các t bi n kháng lamivudine, adefovir và entecavir trên virus HBV c a

b nh nhân tu thu c

vào genotype t bi n

mà có th i u ch nh

li u pháp kháng virus

thích h p. Tr c ây,

các nhà lâm sàng

th ng ánh giá hi u

qu i u tr c hi u

qua xét nghi m mi n

d ch cho bi t có d u

hi u chuy n o huy t

thanh trên b nh nhân, S 5: S h ng d n ch nh và theo dõi hi u qu i u tr c hi u

b nh nhân viêm gan virus C m n tính

147

ngh a là HBeAg (kháng nguyên ti t c a HBV - m t thông s cho bi t có tình tr ng

virus nhân b n) tr nên âm tính và xu t hi n kháng th kháng HBe. Tuy nhiên vì HBV

có th có t bi n precore làm cho virus không th t o ra c kháng nguyên HBe mà

v n có c kháng th kháng HBe nên mu n xác nh c ch c ch n có chuy n o

huy t thanh th t s hay không thì các nhà lâm sàng ph i ch nh xét nghi m phát hi n

t bi n precore trên các b nh nhân HBeAg [-], có kháng th kháng HBeAg, mà HBV-

DNA v n còn [+]. Ngoài ra, các nghiên c u g n ây c ng cho bi t r ng t bi n

precore (v trí 1896) và c bi t là core-promoter (v trí 1762/64) có liên quan n di n

ti n viêm gan m n tính, x gan, và ung th gan trên b nh nhân. Do v y xét nghi m

sinh h c phân t phát hi n t bi n precore hi n nay c ng là m t yêu c u th c ti n t

các nhà i u tr . S 4 là m t tóm t t qui trình cho các ch nh xét nghi m i u tr

và theo dõi i u tr viêm gan B m n tính.

Ngoài viêm gan B, nhi m viêm gan virus C c ng là m t v n r t c n c quan

tâm hi n nay, c bi t t i Vi t Nam. Theo ghi nh n v tình hình nhi m viêm gan C thì

t l ng i bình th ng Vi t Nam nhi m virus viêm gan C là kho ng 2-10%, xem

nh là thu c nhóm các qu c gia có t l nhi m virus viêm gan C cao th nhì trên th

gi i. Khác v i nhi m viêm gan B v i a s các tr ng h p ng i nhi m t o c

kháng th b o v lo i tr c virus hay là m t s ít h n tr thành ng i lành mang

trùng; có n 85% ng i nhi m viêm gan virus C không có mi n d ch b o v , dù có

xu t hi n kháng th c hi u (anti-HCV [+]), b di n ti n n viêm gan m n tính r i

n x gan v i 20% trong s ó có nguy c di n ti n n ung th gan. Do v y mà dù

t l ng i nhi m viêm gan C t i Vi t Nam th p h n nhi m viêm gan B nh ng tình

tr ng b nh t t do nhi m virus viêm gan C mang l i là khá cao, không thua mà th m chí

còn h n viêm gan B. Nguy hi m nh v y nh ng b nh viêm gan C m n tính l i là m t

b nh mà d i ánh sáng c a y h c hi n i l i là m t b nh có th ch a kh i c hoàn

toàn v i xác su t thành công có th n 60%. Tuy nhiên, có th cho c ch nh

i u tr c hi u viêm gan C m n tính b ng interferon ph i h p v i ribavirin là phát

chu n nh t hi n nay, bác s c n ph i xác nh là b nh nhân ang mang virus viêm

gan C trong máu b ng xét nghi m nh tính HCV-RNA vì xét nghi m anti-HCV ch là

xét nghi m sàng l c trong cho và truy n máu ch không ph i là xét nghi m trong ch n

oán lâm sàng, h n n a m t ng i có k t qu anti-HCV [+] v n có th không mang

148

virus viêm gan C mà ch là k t qu c a tình tr ng nhi m m m b nh tr c ó và nay ã

kh i. Sau khi xác nh c ng i b nh d ng tính HCV-RNA, tr c khi cho ch nh

i u tr bác s c n ph i làm thêm hai xét nghi m n a là nh l ng HCV-RNA và nh

genotype c a virus. Lý do là vì bác s c n ph i ánh giá hi u qu i u tr mà mình ã

cho trên b nh nhân sau 1 tháng r i sau 3 tháng i u tr và ph ng pháp ánh giá là

nh l ng l i HCV-RNA. N u k t qu nh l ng cho th y virus bi n m t sau 1 tháng

i u tr thì ây là áp ng siêu vi nhanh v i d h u thành công trong i u tr r t t t.

N u l ng virus gi m trên 100 l n (trên hay b ng 2 log) sau 3 tháng b t u i u tr thì

ây là áp ng siêu vi s m và có th ánh giá i u tr ã cho là hi u qu và có th ti p

t c. N u l ng virus không gi m quá 2 log thì có th ph ng pháp i u tr ã cho trên

b nh nhân là không hi u qu và c n ph i cân nh c i u ch nh (dùng lo i interferon

khác có d c ng và d c l c t t h n, b t bu c b nh nhân ph i tuân th h n...).

quy t nh th i gian i u tr là bao lâu thì bác s c n ph i bi t genotype c a HCV trên

b nh nhân, n u là genotype 1 thì c n ph i duy trì th i gian i u tr là 48 tu n hay h n,

còn n u thu c genotype khác thì th i gian i u tr có th ng n h n là 24 tu n. Sau khi

hoàn t t th i gian c n ph i i u tr trên b nh nhân, tr c khi quy t nh ng ng i u tr ,

bác s c n ph i xác nh xem b nh nhân ã s ch HCV-RNA ch a b ng xét nghi m

nh tính HCV-RNA và ch ng ng i u tr khi HCV-RNA hoàn toàn âm tính. Sau khi

ã ng ng i u tr vì b nh nhân ã s ch virus, bác s v n ph i khuy n cáo b nh nhân

làm xét nghi m nh ính HCV-RNA m i 3 tháng m t l n theo dõi xem b nh nhân

có b tái phát không. B t c lúc nào HCV-RNA d ng tính l i thì ó là d u hi u tái

phát và khi y có th bác s ph i xem xét i u tr l i cho b nh nhân và c ng ph i theo

th c hi n l i qui trình xét nghi m nh trên. S 5 tóm t t qui trình nêu trên.

2. C n xét nghi m k p th i và nh y c m h n ch n oán phát hi n các tác nhân

vi sinh gây b nh mà các ph ng tiên vi sinh hay mi n d ch không h u hi u

Bên c nh b nh viêm gan m n tính do virus B và virus C, y h c Vi t Nam c ng còn

ph i i phó v i các b nh nhi m trùng khác mà v n phát hi n các tác nhân vi sinh

gây b nh r t c n thi t ph i có ph ng ti n xét nghi m nh y c m h n, k p th i h n, và

an toàn h n.

Theo ánh giá c a t ch c y t th gi i, Vi t Nam chúng ta là m t trong 22 n c

mang gánh n ng nhi m lao cao nh t trên th gi i. Ngoài ra v i tình tr ng gia t ng t l

149

nhi m HIV/AIDS hi n nay t i Vi t Nam (có th quá 300.000 theo d oán c a B Y

T ) thì nguy c chúng ta ph i i phó v i tình tr ng nhi m lao t ng cao trong c ng

ng. Do v y mà v n nâng cao n ng l c c a các phòng thí nghi m lâm sàng trong

xét nghi m phát hi n lao là m t v n mà y h c Vi t Nam ph i t ra vì v i ph ng

pháp nhu m tìm tr c khu n kháng acid (AFB), nh y phát hi n ch t 64% trong lao

ph i, 27% trong lao ngoài ph i, và ch 9% trong lao màng não; h n n a nhu m kháng

acid b ph thu c khá nhi u vào k n ng c a ng i c lame và k t qu c ng không

th xác nh c b nh nhân có th t s nhi m lao hay không vì có th có nhi u tr c

khu n kháng acid khác không ph i vi khu n lao hi n di n trong b nh ph m. V i

ph ng pháp nuôi c y thì nh y có th cao h n là 77% trong lao ph i, 67% trong lao

ngoài ph i và 39% trong lao màng não nh ng th i gian có c k t qu không th

tr c 2 tu n n u chúng ta s d ng ph ng pháp c y nhanh v i môi tr ng MGITT hay

ph i trên 1 tháng n u chúng ta s d ng ph ng pháp c y v i môi tr ng Lowenstein

Jensen. Chính vì v y nên t i các b nh vi n hay phòng khám, có r t nhi u tr ng h p

b nh nhân có d u hi u lâm sàng và X-quang r t nghi ng lao ph i, và h u h t các

tr ng h p lâm sàng ch n oán nghi ng lao ngoài ph i hay lao màng não mà k t qu

xét nghi m bác s nh n c v n th ng là soi không th y, c y không ra. Th c t này

ã òi h i các nhà lâm sàng ph i yêu c u xét nghi m PCR phát hi n lao trong các b nh

ph m khác nhau vì theo nhi u nghiên c u trên th gi i, PCR ã c i thi n áng k

nh y phát hi n lao không ch trong lao ph i mà c trong lao ngoài ph i và lao màng

não. H n n a k t qu PCR c ng cho phép xác nh ngay là nhi m lao mà không c n

ph i làm thêm các xét nghi m vi sinh xác nh nh là i v i ph ng pháp nhu m

kháng acid hay nuôi c y, vì v i PCR ng i làm xét nghi m phát hi n o n DNA ích

là ch c hi u cho vi khu n lao ch không ph i cho các mycobacteria khác không ph i

lao.

M t b nh nhi m khác mà th c t òi h i ph i tri n khai xét nghi m khu ch i

nucleic acid trên c s c a k thu t PCR phát hi n tác nhân gây b nh, ó là b nh s t

Dengue gây s t xu t huy t. D nhiên vi c ch n oán lâm sàng m t b nh nhân có ph i

ang b s t Dengue gây s t xu t huy t hay không th t s không khó m y m t khi b nh

nhân ã xu t hi n các b t th ng v s l ng ti u c u (gi m ti u c u) và dung tích

h ng c u (t ng dung tích h ng c u) hay ã có các tri u ch ng i vào shock. Tuy nhiên

150

có th phát hi n c b nh nhân có ph i s t Dengue hay s t xu t huy t Dengue

trong nh ng ngày u c a b nh th t s là c m t v n nan gi i vì giai o n s m

này v m t lâm sàng hay c n lâm sàng, b nh nhân không có bi u hi n gì c hi u h n

là m t s t siêu vi. Th nghi m mi n d ch h c phát hi n kháng th c hi u Dengue,

th m chí là kháng th IgM, c ng ch có th b t u d ng tính vào ngày th 4 hay 5

c a b nh và lúc này thì k t qu xét nghi m không còn h u d ng lâm sàng n a vì các

bi u hi n lâm sàng c a s t Dengue hay s t xu t huy t Dengue ã khá rõ. Vì không th

ch n oán xác nh c s t Dengue hay s t xu t huy t Dengue trong nh ng ngày u

c a b nh nên có th có hai tình hu ng: (1) Ho c là b nh nhân không c theo dõi

i u tr k p th i và do v y khi vào n b nh vi n ã vào b nh c nh shock quá n ng và

bác s s ph i r t v t v m i c u c b nh nhân hay s tr tay không k p; (2) Ho c là

trong mùa d ch s t xu t huy t b nh vi n s b tràn ng p b nh nhân vì lâm sàng nghi

ng s t xu t huy t mà ch a có b ng c ch ng minh b nh nhân ang b s t Dengue hay

s t xu t huy t Dengue. Do v y th c t hi n nay òi h i các phòng thí nghi m lâm sàng

ph i có m t ph ng ti n s c có th ch n oán phát hi n Dengue s m trong

nh ng ngày u c a b nh, và ph ng ti n y không có gì khác h n là th nghi m RT-

PCR phát hi n RNA c a virus Dengue trong máu b nh nhân nh l ng virus xu t hi n

r t cao trong máu trong nh ng ngày u c a b nh, th m chí ngay trong ngày u tiên

c a b nh.

Trong s n ph khoa hi n nay, các nhà lâm sàng c ng nh nghiên c u y h c c ng

r t c n thi t ph i có k t qu phát hi n và xác nh c genotype HPV t các qu t hay

sinh thi t c t cung phát hi n s m nguy c sinh ung th c t cung trên ph n vì

khoa h c ã ch ng minh c tác nhân gây ung th c t cung trên ph n là m t s

genotype HPV nguy c cao (nh 16, 18...). Xét nghi m nh v y không th th c hi n

c b ng các ph ng pháp t bào h c hay mô h c mà ph i c th c hi n b ng k

thu t sinh h c phân t khu ch i m t o n DNA c hi u trên vùng gene L1 c a virus

và sau ó xác nh trình t c hi u genotype c a virus, ó chính là k thu t PCR theo

sau là lai phân t .

Hi n nay ngành y t c a chúng ta c ng còn ph i i phó thêm v i các b nh có

nguy c gây d ch cao nh cúm gà H5N1, và m t trong các bi n pháp i phó v i

d ch b nh này trên ng i là ph i làm sao phát hi n s m tác nhân H5N1 trên các m u

151

b nh l y t ng i nghi ng nhi m b nh b nh nhân s m c i u tr c hi u c ng

nh s m phát hi n c d ch lây cho ng i s m cách ly và i phó. Tuy nhiên

trong phát hi n H5N1, chúng ta không th xây d ng các ph ng pháp virus h c nh

nuôi c y t i các phòng thí nghi m lâm sàng vì i u này không h u d ng lâm sàng do

k t qu nuôi c y không th có nhanh c, và ng th i c ng không an toàn vì khó có

phòng thí nghi m lâm sàng nào t c c p 3 v an toàn sinh h c. Do v y xét

nghi m thích h p và h u d ng nh t có th th c hi n c t i các phòng thí nghi m

lâm sàng không có gì khác h n là xét nghi m RT-PCR phát hi n H5N1 vì xét nghi m

ch òi h i ph i th c hi n trong phòng thí nghi m có trang b an toàn sinh h c c p 2 và

k t qu xét nghi m không ch nh y c m mà còn có th n tay lâm sàng ch trong vòng

không quá 3 gi sau khi l y m u.

i phó v i i d ch HIV/AIDS, ngoài vi c ph bi n các ki n th c tránh lây

nhi m hay tránh các hành vi có nguy c cao b lây nhi m trong c ng ng, v n i u

tr c hi u và có hi u qu cho b nh nhân nhi m HIV/AIDS c ng là v n mà các nhà

qu n lý y t c n ph i th c hi n vì có c i u tr c hi u và hi u qu thì b nh nhân

nhi m HIV/AIDS m i có th tr l i v i c ng ng và s gi m thi u nguy c lây nhi m

nh l ng virus trong máu và d ch c th c a b nh nhân s b kh ng ch d i ng ng

phát hi n. có th i u tr c m t cách hi u qu cho b nh nhân nhi m HIV/AIDS,

các nhà y h c c n ph i có ph ng ti n xét nghi m nh l ng c virus trong máu

b nh nhân có th thay i ngay phát i u tr m i khi m t khi l ng virus t ng lên

hay xu t hi n tr l i trong quá trình i u tr . Do v y xét nghi m nh l ng virus HIV

là m t xét nghi m r t c n thi t ph i tri n khai và k thu t d ti p c n nh t hi n nay

th c hi n xét nghi m này là k thu t real-time PCR. Ngoài vi c theo dõi hi u qu i u

tr c hi u, xét nghi m phát hi n và nh l ng HIV còn có giá tr trong ch n oán

cho các tr s sinh phát hi n cháu có b nhi m b nh t m truy n qua không, m t

yêu c u mà ph ng pháp mi n d ch phát hi n kháng th c hi u HIV không th áp

ng c vì có th tr có k t qu HIV [+] qua mi n d ch nh ng kháng th c hi u

HIV phát hi n trong máu tr có th ch là kháng th t m truy n qua nhau trong th i

k bào thai.

V i ti n b hi n nay v ghép t ng t i Vi t Nam, xét nghi m phát hi n CMV là m t

xét nghi m r t c n thi t ph i th c hi n trên ng i cho c quan tránh nguy c ng i

152

nh n b nhi m r i bùng phát b nh ang ph i nh n li u pháp c ch mi n d ch sau ghép.

N u ch d a vào xét nghi m phát hi n kháng th c hi u CMV trong huy t thanh c a

ng i cho t ng thì k t qu ch c ch n s không c hi u nói lên c ng i cho

hãy còn mang CMV và s truy n tác nhân gây b nh sang ng i nh n vì kháng th có

th t n t i r t lâu sau khi b nh nhên kh i b nh. Do v y c n ph i có m t xét nghi m

phát hi n tr c ti p tác nhân CMV trong b ch c u c a máu ng i cho, và xét nghi m

áp ng c yêu c u này chính là xét nghi m PCR/real-time phát hi n/ nh l ng

CMV-DNA.

Ngoài ra, th c t c a n n y h c hi n i mà chúng ta ang ti p c n hi n nay c ng

òi h i các nhà lâm sàng c ph c v các yêu c u xét nghi m phát hi n và/hay nh

l ng nhi u tác nhân gây b nh khác b ng ph ng pháp khu ch i nucleic acid trên c

s c a k thu t PCR và real-time PCR. Ví d phát hi n nguyên do hi m mu n trên

ph n , nhà lâm sàng c n ph i có xét nghi m PCR phát hi n C. trachomatis và N.

gonorrhoeae trong các m u qu t c t cung và n c ti u. phát hi n tác nhân viêm

não màng não do virus, xét nghi m PCR phát hi n HSV hay RT-PCR phát hi n

Enterovirus 71 trong d ch não tu r t c n c tri n khai. phát hi n H. pylori trong

các m u sinh ti t v t loét d dày tá tràng thì xét nghi m PCR phát hi n tác nhân này

c ng là xét nghi m không th thi u c. Hay ngay c trong giám sát nhi m khu n

b nh vi n, xét nghi m PCR phát hi n S. aureus kháng methicillin (MRSA) t tay và

qu t m i tr c c a nhân viên y t và ng i ch m sóc b nh nhân c ng là xét nghi m r t

c n thi t ph i c th c hi n do nh y c m cao và qui trình th c hi n khá n gi n

c ng nh k t qu có c nhanh h n nhi u so v i xét nghi m vi sinh truy n th ng.

n th c t tri n khai k thu t PCR, real-time PCR

1. Các rào c n

V y là th c t ã òi h i các nhà khoa h c, c bi t là các nhà y h c ph i nhanh

chóng phát tri n và ng d ng các k thu t sinh h c phân t hi n i, nh t là PCR và

real-time PCR vào ch n oán và h tr cho theo dõi i u tr b nh nhân t i Vi t Nam.

Tuy nhiên cho n hi n nay nhi u nhà khoa h c c ng nh qu n lý y t trong n c hãy

còn khá ng n ng i v i kh n ng này. Các lý do h cho là: (1) các th nghi m này r t

khó th c hi n c m t cách chu n m c t i các phòng thí nghi m lâm sàng; (2) giá

153

thành th nghi m có th khá cao v t ngoài kh n ng c a ng i b nh. Chúng ta hãy

th phân tích có úng nh v y không?

2. Th nghi m PCR và real-time PCR có th t s khó th c hi n c m t cách

chu n m c t i các phòng thí nghi m lâm sàng?

PCR và real-time PCR là k thu t nhân b n DNA trong ng nghi m d a vào các

chu k nhi t nh nguyên li u là các dNTP, enzyme polymerase ch u nhi t, và m t

c p m i là các o n oligonucleotide n dài kho ng 20-25 base có trình t b sung c

hi u v i hai u c a o n DNA ích c n nhân b n. Nh các chu k nhi t này mà o n

DNA ích c nhân b n theo c p s nhân sau 30 n 40 chu k , o n DNA ích

c nhân b n thành hàng t b n sao d dàng c phát hi n. V i ph ng pháp PCR

(ngày nay c g i là PCR kinh i n), k t qu PCR c phát hi n d a vào i n di

xác nh kích th c và/hay d a vào lai v i dò c hi u xác nh trình t c hi u

c a s n ph m khu ch i xem có trùng kh p v i kích th c và/hay trình t o n DNA

ích không. V i ph ng pháp real-time PCR thì k t qu PCR c c ngay trong quá

trình ch y PCR mà không c n ph i th c hi n giai o n phân tích sau PCR nh kh

n ng phát hu nh quang c a ng ph n ng trong quá trình ch y PCR m t khi có s n

ph m khu ch i xu t hi n trong PCR mix. Hu nh quang s càng s m xu t hi n khi s

l ng o n DNA ích ban u trong m u th cho vào PCR mix càng nhi u, chính nh

nguyên lý này mà real-time PCR không ch c dùng phát hi n mà còn nh

l ng c DNA ích ban u có trong m u th .

Nh khu ch i r i m i phát hi n nên PCR và real-time PCR t c nh y có

th nói cho n nay ch a có m t k thu t nào có th so sánh n i: Gi i h n th p nh t có

th phát hi n c là m t phân t . Chính vì v y, PCR và real-time PCR là m t công c

r t h u d ng trong phát hi n các tác nhân vi sinh v t gây b nh. Tuy nhiên m t câu h i

c nhi u ng i t ra là li u PCR và real-time PCR có c hi u không m t khi t

c nh y quá cao nh v y? Vì theo lý lu n th ng kê thông th ng thì xét nghi m

m t khi t nh y cao thì c hi u s th p xu ng. tr l i c câu h i này,

chúng ta ph i so sánh c hi u c a PCR so v i nuôi c y trong phát hi n tác nhân vi

sinh v t gây b nh. Nuôi c y là xét nghi m c hi u nh t phát hi n tác nhân vi sinh

v t gây b nh vì ch có nuôi c y chúng ta m i xác nh c s hi n di n tác nhân vi

sinh v t gây b nh có m t trong m u th . Qua cái nhìn phân t thì chúng ta s th y nuôi

154

c y ch ng qua là phân l p r i khu ch i b gen c a vi sinh v t gây b nh t m t thành

hàng t b n sao r i sau ó xác nh b gen c khu ch i là c a vi sinh v t nào d a

vào các ki u hình sinh v t hoá h c mà b gen ó qui nh. Xét nghi m PCR và real-

time PCR phát hi n tác nhân vi sinh v t gây b nh c ng không khác gì nuôi c y, nh ng

không ph i là nuôi c y b gen mà ch là m t o n gen c hi u c a vi sinh v t gây

b nh (không ph i trong các môi tr ng phân l p và nuôi c y vi sinh ph c t p và khác

nhau mà ch n gi n trong m t ng ph n ng ch a PCR mix) thành hàng t b n sao

r i sau ó nh danh các b n sao này xem có úng c a vi sinh v t mu n tìm không d a

vào kích th c và/hay trình t các nucleotide trên các b n sao này. Do ó, n u chúng ta

ã th a nh n nuôi c y là c hi u nh t thì chúng ta c ng ph i th a nh n PCR c hi u

ch ng khác gì nuôi c y mà l i nh y c m h n nuôi c y r t nhi u vì nuôi c y b ph

thu c r t nhi u trong các khâu l y m u, chuyên ch m u, th i gian trì hoãn t khi l y

m u n khi b t u ti n hành nuôi c y, và c bi t nh t là ph i ch n l a cho úng môi

tr ng thích h p cho khâu phân l p; mà các y u t này l i th ng hi m khi c th c

hi n m t cách chu n m c t i các phòng thí nghi m lâm sàng t i các qu c gia có thu

nh p th p nh chúng ta.

V y thì t i sao chúng ta l i ng n ng i khi phát tri n và ng d ng xét nghi m PCR

và real-time t i các phòng thí nghi m lâm sàng phát hi n tác nhân vi sinh v t gây

b nh vì cho r ng khó có th th c hi n c các xét nghi m này m t cách chu n m c?

Trong khi xét nghi m PCR và real-time PCR l i d th c hi n chu n m c h n xét

nghi m vi sinh r t nhi u vì: (1) Khi không làm xét nghi m ngay thì không c n ph i

c gi trong môi tr ng chuyên ch trong th i gian có h n nh vi sinh, b nh ph m

xét nghi m PCR có th gi i u ki n l nh 2-8oC hay gi ông trong th i gian chuyên

ch n phòng thí nghi m, và n u gi d i -70oC thì m u th v n còn nguyên giá tr

làm xét nghi m PCR sau nhi u n m. (2) N u các thu c th u c cung c p hay

c pha ch d i d ng kit thì các b c làm xét nghi m PCR r t n gi n và d chu n

hoá: Tr c h t tách chi t nucleic acid t m u th b ng các kit tách chi t thích h p; sau

ó cho tách chi t này vào các ng ph n ng ch a PCR mix thích h p th c hi n các

chu k nhi t cho khu ch i nucleic acid ích; và cu i cùng là phát hi n s n ph m

khu ch i c a nucleic acid ích (n u là real-time PCR thì b c n y c th c hi n

trong quá trình ch y PCR). Trong khi ó, quá trình làm xét nghi m vi sinh ph c t p và

155

khó chu n hóa h n nhi u vì òi h i ng i làm xét nghi m ph i có ki n th c

chu n b , l a ch n qui trình v i thu c th và môi tr ng nuôi c y thích h p cho t ng vi

sinh v t ích, c bi t là ph i có ki n th c và kinh nghi m có th b t c vi sinh

v t ích hi n di n trong b nh ph m.

PCR và real-time PCR còn có nhi u u i m v t tr i khác so v i xét nghi m vi

sinh nh : (1) K t qu chung cu c s n tay bác s lâm sàng nhanh h n xét nghi m vi

sinh, không quá 5 gi k t khi b t u làm xét nghi m. (2) Phát hi n c các tác

nhân vi sinh v t gây b nh mà phòng thí nghi m lâm sàng không có kh n ng phát hi n

v i các xét nghi m vi sinh hay mi n d ch truy n th ng nh các tác nhân virus (HCV,

HBV, HPV...), tác nhân vi sinh không th tri n khai nuôi c y c t i phòng thí

nghi m lâm sàng vì kh n ng gây d ch cao (H5N1) hay khó nuôi c y (C. trachomatis,

L. pneumophila), hay có m t r t ít trong b nh ph m (M. tuberculosis trong lao ngoài

ph i, tác nhân viêm màng não m c t u...), hay là các tác nhân có th nuôi c y c

nh ng th i gian có k t qu chung cu c quá lâu (M. tuberculosis).

Ngoài ra, m t m i lo ng i n a mà nhi u ng i quan tâm, ó là v n ngo i nhi m

s n ph m khu ch i, r t d xãy ra trong phòng xét nghi m lâm sàng vì nguy c tích t

và d dàng d n n ngo i nhi m vào các thu c th và b nh ph m qua d ng c và qua

tay ng i làm xét nghi m. Ngày nay, nh s d ng h th ng ch ng ngo i nhi m s n

ph m khu ch i b ng men UNG và dUTP cho vào các PCR mix ( làm cho s n

ph m khu ch i có nhi u v trí T b thay th b ng U nh v y mà b khác bi t v i các

DNA nguyên thu r i s b men UNG phá hu tr c khi i vào quá trình khu ch

i) mà th nghi m PCR và real-time PCR r t d dàng tri n khai th c hi n c t i các

phòng thí nghi m lâm sàng ch c n b trí các vùng làm vi c tách bi t, không c n ph i

trong các phòng tách bi t nh tr c ây.

3. Th nghi m PCR và real-time PCR có th t s t ti n không?

Trang b t ti n nh t cho m t phòng thí nghi m lâm sàng làm c xét nghi m

PCR và real-time PCR là máy PCR và máy real-time PCR. Tuy nhiên nh công ngh

ngày càng ti n b và ngày càng có nhi u công ty cung c p máy nên các thi t b này

ngày càng có nhi u tính n ng h n c ng nh ho t ng h u hi u h n mà giá thành l i

càng ngày càng r h n, không h v t quá kh n ng trang b c a nhi u phòng thí

156

nghi m lâm sàng. N u tính kh u hao các thi t b này trong giá thành xét nghi m thì

m i tháng ch kho ng 800USD v i th i gian s d ng thi t b là 5 n m.

V y thì t i sao xét nghi m PCR và real-time PCR hi n nay t i các qu c gia tiên

ti n l i quá t, b nh nhân ph i tr ti n cho m i xét nghi m không d i 100USD? Lý

do ch y u là vì các phòng thí nghi m lâm sàng t i các n i này th ng ph i mua các

kit xét nghi m PCR và real-time PCR t các công ty s n xu t kit ch n oán (nh

Roche Diagnostic) v i giá thành r t t m b o xét nghi m c th c hi n m t

cách chu n m c. T i các qu c gia thu nh p th p nh Vi t Nam chúng ta, n u làm nh

v y thì ch c ch n xét nghi m PCR và real-time PCR s ch ng th nào áp d ng c dù

th c t r t c n ph i có các xét nghi m này.

Chúng ta c ng bi t PCR và real-time PCR là m t k thu t hoàn toàn m cho phép

nhà nghiên c u có th ti p c n t pha các thu c th th c hi n xét nghi m và ch u

trách nhi m v k t qu xét nghi m mà mình th c hi n (th ng g i là homebrew). Tuy

nhiên n u làm nh v y thì ch c ch n chúng ta s i phó v i v n ch t l ng c a xét

nghi m PCR và real-time PCR s r t khác bi t gi a các phòng thí nghi m lâm sàng v i

nhau. Do v y gi i pháp hay nh t ó là ph i có kit PCR và realtime PCR s n xu t trong

n c cung c p n các phòng thí nghi m lâm sàng. Các kit không ch t c nh y

và c hi u cao, mà còn ph i có y các chu n m c ng i làm xét nghi m có

th ki m soát c các s sót xãy ra trong quá trình làm xét nghi m. Nh v y, ch t

l ng xét nghi m PCR và real-time PCR c chu n m c, t m c cao m t cách ng

u trong các phòng thí nghi m lâm sàng, và ng th i giá thành xét nghi m là hoàn

toàn có th ch p nh n.

4. Th c t tri n khai PCR và real-time PCR

Xu t phát t các nh n nh trên, trong th i gian qua chúng tôi ã liên t c phát tri n

và hoàn thi n các kit PCR và real-time PCR a vào ng d ng t i nhi u phòng thí

nghi m lâm sàng có trang b PCR t i Vi t Nam. Nh ã nói trên, m b o c

ch t l ng cao m t các ng u c a xét nghi m PCR và real-time PCR th c hi n

c t i phòng thí nghi m lâm sàng áp d ng cho ch n oán, th nghi m c ng nh các

kit do chúng tôi cung c p làm th nghi m ph i luôn luôn có y các chu n m c

sau: (1) Kit khu ch i t c nh y cao và có b ng ch ng xác nh nh y

thông qua ch ng [+] c cung c p v i s copies xác nh ng i s d ng có th

157

ki m tra c. (2) Có ch ng n i t i s d ng chung m i v i nucleic acid ích c

cung c p v i hàm l ng copies t i thi u ng i th c hi n thí nghi m có th cho vào

m u ch ng âm [-] là m u th t và th t s âm tính r i th c hi n xét nghi m cùng v i các

m u th nh v y mà ki m tra c quá trình xét nghi m có b ngo i nhi m không

trong su t quá trình thao tác xét nghi m c ng nh ch ng minh c nh y c a kit

tách chi t c ng nh kit khu ch i. (3) Ng i th c hi n thí nghi m còn có th cho

ch ng n i t i vào PCR mix cùng v i tách chi t c a m u th có th xác nh c

m u âm tính là âm tính th t s mà không ph i âm tính vì PCR b c ch . (4) Có h

th ng ch ng ngo i nhi m b ng dUTP và UNG c pha chung vào PCR mix s n

ph m khu ch i b phá hu không cho tham gia vào quá trình khu ch i. (5) Trong

PCR nh l ng, ngoài các chu n trên, m b o xét nghi m nh l ng, các m u

chu n bi t rõ hàm l ng copies DNA ích c ng c cung c p d ng b n v ng v i

yêu c u ng i làm xét nghi m ph i t cho vào các PCR mix nh m ánh giá c thao

tác pipetting khi làm nh l ng c ng nh xây d ng c ng chu n trong m i l n

làm xét nhi m t o c x nh l nh chính xác.

Cho n hi n nay, chúng tôi ã tri n khai th c hi n các xét nghi m PCR và real-

time PCR c ng nh s n xu t c các kit t ng ng t c t t c các chu n m c

trên, ó là:

(1) Xét nghi m và kit PCR phát hi n HBV-DNA (hình 69) d a trên khu ch i

ích 259bp trên gen S, t nh y 10 copies/ml huy t thanh. Có ch ng âm là huy t

t ng ng i bình th ng, và

ch ng d ng 100 copies/ml là

plasmid chèn úng o n DNA

ích ch ng minh c

nh y c a ph n ng úng nh

khai báo. Có ch ng n i t i là

plasmid chèn DNA tái t h p

s d ng cùng m i nh ng cho

s n ph m khu ch i khác bi t DNA ích v i kích th c 195bp, c cung c p

l ng t i thi u ki m soát nh y c a tách chi t, khu ch i c ng nh ki m tra

ngo i nhi m, và xác nh m u có b âm tính vì c ch không.

Hình 69: K t qu xét nghi m PCR phát hi n HBV-DNA cth c hi n v i NKHBV-PCR kit

158

(2) Xét nghi m và kit RT-PCR phát hi n HCV-RNA (hình 70) d a trên khu ch

i m t o n 240bp trên vùng 5�NC, t nh y 50 copies/ml huy t thanh mà ng i

s d ng có th ki m ch ng nh

ch ng [+] ch a 200copies/ml là

plasmid chèn DNA ích. Có

ch ng n i t i là RNA phiên mã

t plasmid chèn DNA tái t h p

kích th c 195bp khác bi t v i

DNA ích nh ng s d ng cùng

m i. Ch ng n i t i c cung

c p n ng t i thi u ng i làm thí nghi m cho vào cùng v i m u th c

tách chi t RNA cùng v i m u th nh v y ki m tra c hi u qu tách chi t RNA trên

t ng m u th và phát hi n c c ch trên các m u th k t qu âm tính. Ch ng âm là

m u huy t thanh th t s âm tính c ng c cung c p ki m tra nguy c ngo i nhi m khi

thao tác xét nghi m.

(3) Xét nghi m và kit PCR phát hi n MTB-DNA (hình 71) dùng trong ch n oán

lao d a trên khu ch i o n DNA ích 249bp trên o n chèn IS6110 hi n di n t 16

n 30 copies trên genome

c a vi khu n M. tuberculosis,

nh v y nh y c a xét

nghi m có th t n m c

phát hi n 1fg (1/10 genome vi

khu n) trong th tích m u th

cho vào ng ph n ng. C ng

nh các xét nghi m PCR khác,

có ch ng âm là huy t t ng

ng i bình th ng, và có ch ng d ng ch a 100 copies/ml plasmid chèn úng o n

DNA ích nh v y ng i làm xét nghi m có th ki m ch ng c c nh y c a

PCR mix. Có ch ng n i t i là plasmid chèn DNA tái t h p s d ng cùng m i nh ng

cho s n ph m khu ch i khác bi t DNA ích v i kích th c 195bp c cung c p

l ng t i thi u ki m tra c hi u qu tách chi t DNA c a kít tách chi t DNA,

Hình 70: K t qu xét nghi m RT-PCR phát hi n HCV-RNA cth c hi n v i NKHCV-RTPCR kit

Hình 71: K t qu xét nghi m PCR phát hi n MTB-DNA c th chi n v i NKMTB-PCR kit

159

ch ng minh m u âm tính là không b c ch , c ng nh ch ng minh nh y c a PCR

mix.

(4) Xét nghi m và kit RT-PCR phát hi n và nh type virus Dengue (hình 72) hay

s t Dengue và s t xu t huy t Dengue. Xét nghi m và kit này c ng ch a y các

ch ng d ng, ch ng n i t i t các chu n m c c a xét nghi m PCR dùng trong ch n

oán nh các xét nghi m và

kit mà chúng tôi phát tri n.

ây là xét nghi m và kit

RT-PCR duy nh t hi n nay

có kh n ng v a phát hi n

v a nh c type virus

Dengue ch qua m t vòng

PCR a m i mà k t qu t

c luôn nh y h n các ph ng pháp d a trên qui trình kinh i n c a Lanciotti c n

ph i qua hai vòng PCR v i vòng 2 làm t bên trong vòng 1 m i có th nh c type

virus. Áp d ng trên th c t lâm sàng, xét nghi m và kít này ã ch ng t có kh n ng

phát hi n và nh type Dengue r t s m, ngay trong nh ng ngày u c a b nh, tr c khi

có d u hi u gi m ti u c u.

(5) Xét nghi m và kit PCR-ELISA phát hi n và nh type HPV (hình 73) trong

các mãnh sinh thi t hay qu t

c t cung. ây là xét

nghi m và kit do chúng tôi

phát tri n d a trên nguyên

t c s d ng m i c hi u

gen L1 c a virus khu ch

i m t o n DNA dài

450bp b ánh d u b i

digoxygenine nh s d ng

PCR mix có thêm dig-dUTP.

Sau ó nh genotype c a

HPV b ng cách lai s n ph m khu ch i trên các gi ng ELISA có các dò c hi u

Hình 72: K t qu xét nghi m RT-PCR phát hi n và nh type virus Dengue gây s t Dengue và s t xu t huy t Dengue

Hình 73: Nguyên t c c a xét nghi m và kit NKHPV-PCR-ELISA phát hi n và nh type HPV

160

genotype g n trên gi ng qua n i hoá h c streptavidine-biotin (streptavidine ph trên

gi ng n i v i các dò c hi u ã g ng biotin u 5�). S n ph m lai �probe-s n

ph m khu ch i� s c phát hi n b ng c ng h p là kháng th n dòng c hi u

digoxygenine ánh d u men peroxidase và tá ch t TMB. Xét nghi m và kit PCR-

ELISA này c a chúng tôi có kh n ng phát hi n và sau ó nh c genotype c a 10

genotype th ng g p nh t c a HPV là: 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, và 58. Hi n xét

nghi m và kit này c b nh vi n Ph S n T D s d ng thành xét nghi m dùng t m

soát và sàng l c ung th s m c t cung trên ph n .

(6) Các xét nghi m và kit PCR phát hi n các tác nhân vi sinh v t gây b nh khác

nh PCR phát hi n HSV, CMV, multiplex PCR phát hi n ng th i N. gonorrhoeae và

C. trachomatis, L. monocytogenes,

nonstop nested PCR phát hi n H5....

T t c u t các chu n m c PCR

dùng trong ch n oán (hình 74).

(7) Xét nghi m và kit real-

time PCR phát hi n và nh l ng

HBV-DNA trong huy t thanh b nh

nhân nhi m HBV d a trên PCR

khu ch i m t o n c hi u dài

kh ang 190bp t gene polymerase

c a HBV-DNA. Xét nghi m và kit

này t nh y 10 copies/ml huy t

thanh. Có ch ng n i t i là plasmid

chèn DNA tái t h p s d ng cùng

m i nh ng cho s n ph m khu ch

i có trình t khác bi t DNA ích

nh v y s c phát hi n v i dò

taqman g n màu hu nh quang

TexasRed, Hex, hay Joe khác bi t v i dò taqman g n màu FAM phát hi n s n ph m

khu ch i c a DNA ích. Ch ng n i t i c cung c p l ng t i thi u cho vào

PCR mix cùng v i tách chi t c a m u th nh ó ki m tra c c c ch n u có

Hình 74: K t qu các xét nghi m PCR v i các kit NKHSV-PCR phát hi n Herpes simplex virus (trên), NKCMV-PCR phát hi n cytomegalo virus (gi a), và NKNGRCHL-multiplex PCR phát hi n N. gonorrhoeae và C.trachomatis (d i)

161

trên các m u âm tính. Có ch ng âm là huy t t ng ng i bình th ng, và ch ng d ng

ch a 100 copies/ml plasmid chèn úng o n DNA ích nh v y ch ng minh c

nh y c a ph n ng úng nh khai báo. Các n ng DNA ích chu n c ng c cung

c p d ng b n v ng nh v y mà ng chu n luôn c xây d ng t R 0.990 và

PCR efficiency luôn t 90-105%.

(8) Xét nghi m và kit RT real-time PCR phát hi n và nh l ng HCV-RNA trong

huy t thanh b nh nhân nhi m HCV d a trên PCR khu ch i m t o n c hi u

vùng 5�-NC c a genome c a HCV. Xét nghi m và kit này t nh y 50 copies/ml

huy t thanh. Có ch ng n i t i là RNA phiên mã t plasmid chèn DNA tái t h p s

d ng cùng m i nh ng cho s n ph m khu ch i có trình t khác bi t cDNA ích nh

v y s c phát hi n và phân bi t v i s n ph m khu ch i t DNA ích v i cùng

nguyên t c kit real-time PCR phát hi n HBV. Ch ng n i t i này c cung c p

l ng t i thi u cho vào cùng v i m u th nh ó ki m tra c hi u qu tách chi t

RNA và phát hi n c c ch . Ch ng âm là huy t t ng ng i bình th ng, và có

ch ng d ng ch a 100 copies/ml plasmid chèn úng o n DNA ích nh v y ch ng

minh c nh y c a ph n ng úng nh khai báo. Các n ng DNA ích chu n

c ng c cung c p d ng

b n v ng nh v y mà ng

chu n luôn c xây d ng t

R 0.990 và PCR efficiency

luôn t 90-105%

(9) Xét nghi m và kit RT

real-time PCR nh l ng

HIV1-RNA trong huy t thanh

b nh nhân nhi m HIV/AIDS

dùng trong theo dõi hi u qu

i u tr c hi u. Xét nghi m

d a trên PCR khu ch i m t

o n c hi u vùng gag

gene c a genome c a HIV1. Xét nghi m và kit này t nh y 100 copies/ml huy t

thanh. Có ch ng n i t i là RNA phiên mã t plasmid chèn DNA tái t h p s d ng

A

B

C

Hình 75: K t qu xét nghi m nh genotype HBV v i kit NKHBV genotype-PCR (A), xét nghi m phát hi n t bi n YMDD kháng lamivudine c a HBV v i kit NKHBVlamiR-PCR (B), xét nghi m nh genotype HCV v i kit NKHCVinoLIPA genotype-core PCR (C).

162

cùng m i nh ng cho s n

ph m khu ch i có trình t

khác bi t cDNA ích nh v y

s c phát hi n và phân bi t

v i s n ph m khu ch i t

DNA ích v i cùng nguyên

t c kit real-time PCR phát

hi n HBV. Ch ng n i t i này

c cung c p l ng t i

thi u cho vào cùng v i

m u th nh ó ki m tra c

hi u qu tách chi t RNA và

phát hi n c c ch . Ch ng

âm là huy t t ng ng i bình

th ng, và có ch ng d ng

ch a 100 copies/ml plasmid

chèn úng o n DNA ích

nh v y ch ng minh c

nh y c a ph n ng úng nh

khai báo. Các n ng DNA

ích chu n c ng c cung

c p d ng b n v ng nh v y

mà ng chu n luôn c

xây d ng t R 0.990 và

PCR efficiency luôn t 90-

105%.

(10) Ngoài ra, có th cung c p thêm gi i pháp toàn di n v các xét nghi m sinh

h c phân t dùng trong ch n oán và theo dõi hi u qu i u tr viêm gan virus B và

viêm gan virus C m n tính, chúng tôi c ng ã phát tri n các xét nghi m và kit nh :

Nested multiplex PCR nh genotype HBV, PCR-RFLP phát hi n t bi n YMDD t i

v trí 204 và 180 kháng lamivudine c a HBV, PCR core kit nh genotype HCV

Hình 76: M t s các b xét nghi m PCR và RT-PCR phát hi n các tác nhân virus gây b nh trên tôm. Các b xèt nghi m này

t y các chu n m c k thu t cho xét nghi m PCR và RT-PCR dành cho ch n oán

163

b ng ph ng pháp lai v i các dò trên thanh inoLIPA (hình 75). Các xét nghi m và kit

này hoàn toàn có th tri n khai c t i các phòng thí nghi m có trang b ph ng ti n

PCR.

(11) Trong l nh v c th y s n, công ty Nam Khoa c ng là m t công ty u tiên và

hàng u phát tri n c các b xét nghi m PCR và realtime PCR phát hi n và xác

nh t l tôm nhi m virus WSSV, MBV, HPV, IHHNV, GAV, YHV, TSV, và MrNV

v i y các chu n m c dành cho ch n oán. Công ty là nhà tiên phong trong phát

tri n ph ng pháp xác nh t l tôm nhi m b nh b ng ph ng pháp real-time b ng k

thu t nh l ng t ng i. Hình 76 minh h a m t s kit PCR và RT-PCR do công ty

Nam Khoa phat tri n phát hi n các virus gây b nh cho tôm.

Và th c t tri n khai k thu t các k thu t sinh h c phân t khác

Th t s cho n hi n nay, nhu c u n t các nhà lâm sàng và nghiên c u y h c không

ch òi h i ph i phát tri n và ng d ng các k thu t PCR và real-time PCR, mà còn òi

h i các nhà khoa h c ph i s m a các k thu t sinh h c phân t hi n i khác vào ng

d ng. M t trong các k thu t mà chúng tôi nh n th y r t c n ph i th c hi n c ó là k

thu t gi i trình t . Quan i m c a chúng tôi là ng d ng k thu t này không ch trong

nghiên c u mà ph i ph c v cho ch n oán lâm sàng. Chính vì v y mà trong n m 2005,

chúng tôi ã u t máy gi i trình t CEQ8000 có 3 ch c n ng: gi i trình t , phân tích

o n, và phát hi n SNP. N m 2007 chúng tôi ã nâng c p thêm ch c n ng th c hi n

nghiên c u bi u hi n gen và ng th i u t thêm thi t b gi i trình t ABI 3130XL có

16 capillaries. V i ch c n ng gi i trình t , chúng tôi ã thành công trong tri n khai các

xét nghi m: (1) nh genotype HCV b ng k thu t gi i trình t tr c ti p s n ph m PCR

thu nh n c t xét nghi m nh l ng HCV-RNA b ng kit NKHCV RT realtime

TQPCR; (2) nh genotype và phát hi n các t bi n kháng lamivudine, adefovir và

entecavir b ng k thu t gi i trình t tr c ti p s n ph m PCR khu ch i t gene rt c a

HBV; (3) Phát hi n t bi n precore c a HBV tiên oán d h u viêm gan virus B m n

tính; (4) Phát hi n M. tuberculosis kháng rifampicine, INH, và ethambutol tr c ti p t

các b nh ph m v i k t qu ch trong vòng 72 gi ... Ngoài ra, các ch c n ng khác c a

CEQ8000 nh ch c n ng phân tích o n c ng ã c chúng tôi tri n khai trong xét

nghi m xác nh quan h huy t th ng, ch c n ng phát hi n SNP c ng ang c tri n

164

khai phát hi n tính a d ng loài và t bi n, ch c n ng bi u hi n gene trong nghiên

c u ung th và hi u qu i u tr các thu c tr ung th ..

K t lu n

ã là m t nhà khoa h c, chúng ta ai c ng có nh ng tri th c nh t nh. Các tri th c này

n t các sách v hay các ph ng ti n tra c u mà ngày hôm nay chúng ta r t d dàng

ti p c n. ã là nhà nghiên c u trong l nh v c y h c thì chúng ta ai c ng có mong mu n

làm c m t i u gì ó t các ki n th c mà mình ang có có th ng d ng c vào

trong gi i quy t m t s nh ng th c t òi h i c a ch n oán và nghiên c u y h c trong

n c. V n chính y u là làm sao tri th c mà chúng ta có không ch là tri th c suông

mà ph i bi n thành s n ph m? ây là câu h i mà tôi ngh chúng ta r t nhi u ng i mu n

bi t làm sao tr l i. Chúng tôi ngh có 2 câu th c a Goethe có l s giúp chúng ta có

m t kim ch nam tr l i câu h i trên:

�Knowing is not enough, we must apply

Willing is not enough, we must do�

V i l i phóng d ch c a m t ng i b n c a chúng tôi:

�Tri th c s ch ng bao gi

N u không em trãi nghi m v i i

c v ng c ng tr thành vô ngh a

N u c ng i ôm m ng gi a ch i v i�

Ngoài ra, tránh b các nhà s n xu t n c ngoài chê bai v m t ch t l ng, chúng tôi

cho là ng có t thua cu c vì cho là TI N NÀO C A Ó, mà ph i tr l i b ng trau d i

tri th c v n n các nh cao khoa h c vì TRI TH C N ÂU CH T L NG

N Ó.

165

ng d ng sinh h c phân t trong ch n óan viêm gan siêu vi

Các câu h i th ng g p

Viêm gan siêu vi B

Tôi i th máu có k t qu d ng tính HBsAg, v y là có b gì không?

HBsAg là kháng nguyên b m t c a virus viêm gan B. M t ng i th máu th y

HBsAg d ng tính t c là ng i ó ang b nhi m virus viêm gan B

Nh v y là có b nguy hi m không? có c n ph i i u tr hay không?

a s ng i b nhi m virít viêm gan B thì s có c áp ng mi n d ch b o v , t c là

s t o c kháng th ch ng HBsAg (g i là anhti-HBsAg) và tiêu di t c virus viêm

gan B. Ng i ó khi th máu s d ng tính anti-HBsAg. Tuy nhiên có m t s ng i h

mi n d ch l i không th t o ra c kháng th b o v này nên th máu lúc nào c ng

d ng tính v i HBsAg. Trong c th c a ng i ó có m t s u tranh qua l i gi a h

mi n d ch và virus. N u h mi n d ch cân b ng c hay u th h n thì s ki m hãm

không cho virus nhân b n c thành các virus hoàn ch nh do v y mà s không có hay s

có r t ít virus hoàn ch nh vào trong máu. Nh ng tr ng h p này c g i là ng i lành

mang virus, n u th máu s th y HBsAg d ng tính nh ng d u hi u cho th y có virus

hoàn ch nh là HBV-DNA, t c là acid nhân c a virus, th ng âm tính hay d ng tính v i

s l ng (s copies) r t th p (<105/ml). Nh ng n u h mi n d ch không ki m hãm c

mà virus th ng th thì chúng s nhân b n c nhi u trong t bào gan t o ra c

nhi u virus hoàn ch nh vào máu c a b nh nhân và lúc này th máu s th y HBsAg d ng

tính ng th i có virus hoàn ch nh hi n di n trong máu v i s l ng cao phát hi n thông

qua xét nghi m HBV-DNA cho k t qu d ng tính và s l ng v t trên 105 copies/ml.

Trong tr ng h p này c n ph i xác nh gan ng i b nh có b t n h i không, t c là ng i

ó có b viêm gan m n tính không? N u xác nh là b viêm gan m n tính thì ph i c

i u tr c hi u. Do v y, n u m t ng i b HBsAg d ng tính, chúng ta c n ph i c n

ph i th máu xem HBV-DNA có b d ng tính không và s l ng bao nhiêu? N u HBV-

DNA d ng tính v i s l ng quá 105/ml thì ph i ti p t c xem men gan (là th nghi m

ALT hay SGPT) c a h có cao không? N u cao v t ng ng 2 l n bình th ng (ALT

bình th ng là 19 IU n và 33 IU nam) thì c coi là viêm gan m n tính và ph i

i u tr . N u men gan bình th ng thì c n ph i ch c ch n là t bào gan có b th ng t n

166

không thông qua xét nghi m v hình thái t bào gan nh sinh thi t gan hay fibroscan.

N u k t qu cho th y có th ng t n thì h c ng ph i c xem là ang b viêm gan m n

tính và ph i c n i u tr c hi u cho b nh nhân dù men gan bình th ng.

Nh v y là n u b HBsAg d ng tính thì c n ph i làm xét nghi m HBV-DNA. V y thì

xét nghi m HBV-DNA là gì? Làm sao th c hi n c?

Virus viêm gan B có ph n lõi c a nó là DNA t c là acid nhân ch a ng các thông tin

di truy n c a virus. Virus viêm gan B m t khi nhân b n hoàn ch nh thì s t o c m t

virus hoàn ch nh t c là bên trong ph n v c a nó ( ó là kháng nguyên v hay kháng

nguyên b m t HBsAg) có ch a c ph n lõi HBV-DNA. Xét nghi m HBV-DNA t c

là xét nghi m tìm xem trong máu c a b nh nhân có mang virus hoàn ch nh hay không.

ây là xét nghi m sinh h c phân t , thông th ng c th c hi n b ng k thu t PCR

(polymerase chain reaction) là k thu t nhân b n DNA trong ng nghi m qua các chu k

nhi t . Trong xét nghi m này, máu c a b nh nhân sau khi l y s c tách huy t thanh

hay huy t t ng và sau ó phòng thí nghi m s tách chi t DNA c a virus trong các m u

huy t t ng và huy t thanh này a vào m t ng nghi m r i nhân b n các DNA này

trong ng nghi m thành hàng t b n sao phát hi n. Nh nhân b n lên t m t b n g c

thành hàng t b n sao r i m i phát hi n nên xét nghi m này có nh y c m c c k cao

s c phát hi n DNA c a virus có trong m u th dù v i s l ng r t th p. Ngoài ra,

ngày hôm nay v i xét nghi m PCR ng i ta còn có th m c s l ng b n g c DNA

ban u có trong m u th là bao nhiêu d a vào k thu t PCR nh l ng, c g i là

qPCR hay real-time PCR. V m t nguyên t c qPCR c ng gi ng nh PCR nh ng có thêm

m t tính n ng n a là có th m c có bao nhiêu b n g c DNA tr c khi c nhân

b n nh m t h th ng quang h c có kh n ng phát hi n c ph n ng xãy ra trong ng

nghi m trong khi nhân b n xãy ra.

Tôi bi t c là hi n nay có nhi u n i làm xét nghi m phát hi n và nh l ng HBV-

DNA nh ng k t qu có khi l i khác nhau dù th trên cùng m t b nh nhân!! Do v y làm

th nào tin t ng c m t k t qu xét nghi m HBV-DNA vì ây là m t xét nghi m mà

chi phí b nh nhân ph i tr c ng không ph i là ít?

úng là nh v y. Xét nghi m HBV-DNA là xét nghi m d a trên k thu t PCR là m t

k thu t hoàn toàn m nên ng i làm xét nghi m có th t pha thu c th làm xét

nghi m mà không ph i b l thu c và các kit xét nghi m mua t các hãng n c ngoài r t

167

t ti n. Tuy nhiên vì là h th ng m nên mu n k t qu xét nghi m c chính xác thì

ng i làm xét nghi m ph i th c hi n các ch ng ki m soát không cho các s sót xãy

ra trong quá trình làm xét nghi m và các ch ng này ph i hi n th trên k t qu xét nghi m.

V i m t xét nghi m phát hi n HBV-DNA, k t qu ph i hi n th : (1) m t ch ng d ng

ch ng minh khâu khu ch i trong quá trình xét nghi m nh y c m, (2) m t ch ng âm

ch ng minh quá trình thao tác xét nghi m không b ngo i nhi m gây ra k t qu d ng

tính gi , (3) m t ch ng n i t i trong ch ng âm ch ng minh khâu tách chi t DNA t

m u th t nh y, (4) và ng th i m u âm tính ph i có chúng n i t i ch ng minh

âm tính là th t s âm tính ch không ph i là âm tính gi . i v i xét nghi m nh l ng

HBV-DNA thì trong k t qu ph i hi n th c ng bi u di n chu n ch ng minh

thao tác nh l ng t chu n thông qua h s t ng quan (R) c a các m u chu n ph i

t trên 0.990 và hi u qu ph n ng (E) ph i t 90-105% và ng th i ch ng minh k t

qu nh l ng là c tính toán t k t qu c a các m u chu n c ch y song hành

cùng v i m u th ch không ph i là c tính toán t m t công th c có s n. Ngoài ra,

n u mu n k t lu n m t k t qu âm tính thì trong k t qu nh l ng ph i hi n th c

m u ó d ng tính c v i ch ng n i t i m b o âm tính này là âm tính th t s ch

không ph i âm tính gi vì ph n ng khu ch i b c ch .

N u tôi b xác nh là viêm gan virus B m n tính thì có nh t thi t ph i i u tr không?

N u không i u tr thì có b sao không?

M t ng i ã b xác nh là b viêm gan virus B m n tính n u không c i u tr c

hi u thì virus s không b kh ng ch mà s liên t c nhân b n trong t bào gan và s tàn

phá t bào gan v i h u qu s d n n x gan và t th ng t n x gan, b nh nhân có th

b i d n n tình tr ng x gan m t bù r i ch t, hay t x gan có th b d n n ung th

gan. C ng có tr ng h p b nh nhân b ung th gan mà không c n thi t ph i b qua giai

o n x gan, ây chính là nh ng tr ng h p b nh nhân tình c qua khám s c kho th y

b kh i u trong gan (qua siêu âm ch n oán) r i sau ó b xác nh là ung th gan, xét

nghi m máu cho th y HBV-DNA d ng tính v i s copies cao (>105). Chính vì v y mà

n u ã b ch n oán là b viêm gan B m n tính (tiêu chu n ch n oán là HBV-DNA trên

105 copies/ml, ALT cao g p 2 l n bình th ng hay xét nghi m sinh thi t ho c fibroscan

th y t ch c gan b t n th ng) thì nh t thi t ph i c i u tr c hi u ki m ch

không cho virus nhân b n gây t n th ng gan. Nhi u nghiên c u ã cho th y n u

168

không c i u tr kh ng ch s l ng virus hoàn ch nh trong máu b nh nhân luôn

d i ng ng phát hi n thì nguy c x gan hay ung th gan nh ng ng i này s r t cao.

V y thì làm th nào có th bi t tôi c i u tr có hi u qu ? và tôi c n ph i c

i u tr trong bao lâu?

Sau khi b t u i u tr c hi u kho ng 3 tháng, bác s s cho xét nghi m l i máu c a

b nh nhân m s l ng virus viêm gan B (xét nghi m nh l ng HBV-DNA) có

trong máu là bao nhiêu. N u l ng HBV-DNA trong máu gi m h n tr c khi i u tr

trên 100 l n thì có ngh a là i u tr có hi u qu , và xét nghi m này ph i c làm liên t c

c m i 3 tháng m t l n cho n khi xét nghi m nh l ng HBV-DNA cho k t qu d i

ng ng phát hi n. K t bây gi tr i thì bác s ch c n cho xét nghi m phát hi n HBV-

DNA mà không c n ph i nh l ng n a và c ng c m i 3 tháng 1 l n theo dõi xem

có tái phát không. Th i gian i u tr c hi u có th s kéo dài trong nhi u n m vì cho

n nay các nhà y h c ch t n thành công là kh ng ch c virus không cho nhân

b n ch r t hi m khi lo i tr c virus vì chúng t n t i trong t bào gan d ng cccDNA

(covalently closed circular DNA) không b tác ng b i thu c kháng virus. M t i u

ch c ch n là n u virus viêm gan B trong b nh nhân ngay t tr c khi i u tr hay trong

quá trình i u tr mà DNA c a chúng b t bi n vùng gen ti n lõi (precore mutation),

và t bi t là khi có t bi n vùng kh i ng (promoter mutation), thì nguy c b nh

nhân s b x gan và/hay ung th gan r t cao, nên trên nh ng b nh nhân này, bác s ph i

i u tr c hi u cho h su t i mà không c phép ng ng i u tr .

Xin c t ngh a cho tôi rõ h n t bi n precore/core promoter là gì? Làm sao bi t

c tôi có mang virus viêm gan B b t bi n precore/core promoter? Tr c khi b t u

i u tr c hi u, tôi có c n làm xét nghi m bi t mình có mang virus viêm gan B b t

bi n precore/core promoter không?

Trong b gen (DNA) c a virus viêm gan B có m t gene c g i là gene ti n lõi, mã

hoá thông tin di truy n giúp virus sinh ra c kháng nguyên e (HBeAg) và kháng

nguyên này c virus ti t ra ngoài khi nó nhân b n. Do v y n u trong máu b nh nhân có

s xu t hi n HBeAg thì có ngh a là có s nhân b n c a virus trong c th . N u h th ng

mi n d ch c a b nh nhân th ng th thì virus s b ch n l i và không nhân b n c ng

th i trong máu b nh nhân xu t hi n c kháng th ch ng HBeAg (g i là anti-HBeAg).

Tr ng h p này y h c g i là có chuy n i huy t thanh ch ng minh c h mi n d ch

169

th ng th v i các k t qu xét nghi m cho th y HBeAg tr nên âm tính, anti-HBeAg

d ng tính, và HBV-DNA không phát hi n c hay phát hi n c nh s l ng r t

th p. C ng trong quá trình d u tranh gi a virus v i h mi n d ch c a c th , có nh ng

ch ng virus viêm gan B b t bi n precore/core promoter t o nên m t mã k t thúc trên

gene này do v y mà virus không th t ng h p c kháng nguyên HBeAg, lúc này virus

c g i là b t bi n precore v i k t qu xét nghi m cho th y HBeAg âm tính,

AntiHBeAg d ng tính, và HBV-DNA d ng tính v i s l ng cao, ng th i men gan

tr i s t th t th ng ph n nh tình tr ng m t cân b ng gi a h mi n d ch i v i kh n ng

nhân b n và phá hu t bào gan c a virus.

Tr ng h p c a b n thì ch c n làm xét nghi m phát hi n t bi n precore khi th

nghi m cho k t qu HBV-DNA d ng tính trên 105 copies/ml, HBeAg âm tính và anti

HBeAg d ng tính. T i sao ph i làm xét nghi m phát hi n t bi n precore trong tr ng

h p này? ó là vì bác s ph i phân bi t nó v i tình tr ng chuy n i huy t thanh. N u

không ph i là t bi n precore mà là do chuy n i huy t thanh thì bác s có th xem xét

ng ng i u tr cho b n sau m t th i gian i u tr mà bác s cho là c n thi t. Còn n u là

t bi n precore thì ch c ch n là bác s s không th nào ng ng mà ph i i u tr cho b n

su t i. Xét nghi m phát hi n t bi n precore hi n nay ã c công ty Nam Khoa

th c hi n b ng gi i trình t v i nguyên t c là dùng PCR khu ch i m t o n dài 250

bases trên vùng gene preS ch a i m b t bi n r i gi i trình t tr c ti p phát hi n

xem có t bi n t i i m này (và c t i hai v trí r t quan tr ng liên quan n kh n ng

sinh ung th là v trí promoter) hay không. Ngoài ra, i v i các b nh nhân trong quá

trình i u tr mà HBV-DNA t nhiên d ng tính tr l i và HBeAg âm tính mà anti-

HBeAg d ng tính thì c ng ph i c ch nh làm t bi n precore xem có ph i t

bi n xãy ra trên b nh nhân ang i u tr này hay không?. N u có t bi n precore thì

c ng không th ng ng i u tr trên b nh nhân này mà h ph i c i u tr su t i.

Ch c là tôi ph i c i u tr b ng thu c kháng virus m t th i gian dài r i!!...Các

thu c này có hi u qu không và có th b virus d kháng không? và làm th nào bi t

c thu c tôi ang s d ng là b kháng?

Do ph i i u tr thu c kháng virus m t th i gian dài nên virus có c h i ti p xúc v i

thu c kháng virus và nh v y là chúng có c h i b t bi n kháng thu c. Do v y n u

trong th i gian i u tr , xét nghi m theo dõi virus là HBV-DNA b ng nhiên b tr l i

170

d ng tính và l ng HBV-DNA b t ng lên d n thì ây chính là d u hi u cho bi t virus

có kh n ng kháng l i thu c ang i u tr . Lúc này c n ph i xét nghi m phát hi n xem

thu c có b virus kháng không?. Hi n nay công ty Nam Khoa ã phát tri n c

ph ng pháp gi i trình t m t o n gen 550bases vùng gene preS c a virus có th

phát hi n c r t nhi u i m t bi n gây nên tình tr ng virus viêm gan B kháng

c lamivudine và adefovir là hai thu c kháng virus hi n ang c s d ng t i Vi t

Nam. K thu t này v t tr i h n nhi u k thu t khác là nh kh n ng phát hi n c

nhi u v trí t bi n do v y s cung c p cho bác s nhi u thông tin h n cho quy t nh

chính xác h n là li u có nên thay i thu c không.

Nói tóm l i, t l nhi m virus viêm gan B t i Vi t Nam trong dân s khá cao (>15%).

Tuy nhiên không ph i ai b nhi m virus viêm gan B u c n ph i c i u tr mà c n

ph i phân bi t h có ph i là ng i lành mang virus hay là ng i ang b viên gan virus B

m n tính. Bác s ch nên i u tr cho ng i ã xác nh là b viêm gan virus B m n tính

mà thôi, và xét nghi m sinh h c phân t r t c n thi t ch nh trên b nh nhân là xét

nghi m phát hi n và nh l ng HBV-DNA. Khi ã i u tr cho b nh nhân thì ngoài xét

nghi m nh l ng HBV-DNA theo dõi hi u qu i u tr thì các xét nghi m sinh h c

phân t khác c ng r t c n thi t ph i ch nh trên b nh nhân, ví d xét nghi m phát hi n

t bi n precore c ng r t c n ph i cho trên b nh nhân HBeAg âm tính, anti-HBeAb

d ng tính mà HBV-DNA v n còn d ng tính xác nh b nh nhân có b t bi n

precore hay không mà quy t nh xem li u có ph i i u tr su t i cho b nh nhân không.

Ngoài ra xét nghi m phát hi n các t bi n gây ra kháng thu c c ng r t c n thi t ph i

c ch nh n u trong quá trình i u tr b ng nhiên HBV-DNA c a b nh nhân d ng

tính v i s l ng t ng lên tr l i.

Tôi ang c i u tr b ng thu c kháng virus cách ây 3 tháng, cách ây vài ngày tôi

có làm xét nghi m HBV-DNA k t qu âm tính, nh ng t i sao HbeAg c a tôi v n còn [+]

v i tr s OD khá cao. Tôi nghe nói là HbeAg [+] thì HBV-DNA ph i [+], sao trong

tr ng h p này c a tôi HbeAg [+] mà HBV-DNA l i [-]?

úng nh v y, HbeAg [+] thì ch ng minh là HBV trong c th b nh nhân ang h at

ng và ang nhân b n, chính vì v y mà s có virus hòan ch nh trong máu, s có HBV-

DNA [+]. Tuy nhiên trong tr ng h p c a b n, ang c i u tr thu c kháng virus

(hi n nay có khá nhi u thu c kháng virus dành cho nhi m HBV r t hi u qu ), nên virus

171

b ng n ch n không cho nhân b n, chính vì v y HBV-DNA bi n m t kh i máu s m h n

là HbeAg, s bi n m t kh i máu ch n h n. Chính vì HBV-DNA là m t d u n r t t t

theo dõi c áp ng khá s m c a i u tr nên hi n nay các nhà y h c th ng nh t s

d ng HBV-DNA làm ch s theo dõi áp ng i u tr h n là HbeAg.

Viêm gan siêu vi C

Tôi i th máu có k t qu d ng tính anti-HCV, v y là có b gì không?

Anti-HCV là kháng th c hi u virus viêm gan C (HCV). B n d ng tính anti-HCV

t c là trong máu c a b n có kháng th c hi u HCV và có ngh a là b n có th ang b

nhi m virus viêm gan C hay là ã b nhi m virus này nh ng nay ã kh i.

Nh v ythì làm th nào có th bi t c tôi ang b nhi m HCV?

M t ng i b nhi m virus viêm gan C thì th ng h mi n d ch c a ng i ó ít khi t o

c mi n d ch b o v ch ng c virus, do v y s xu t hi n kháng th c hi u HCV

(anti-HCV) không có ý ngh a là c th ã có c mi n d ch b o v lo i tr c virus.

Ch có m t s ít may m n s kh i c nh các h th ng ch ng không c hi u khác

c a c th lo i tr c virus, còn l i trong a s các tr ng h p, virus v n t n t i, nhân

b n trong t bào gan và phóng thích virus vào trong náu. Do v y có th xác nh m t

ng i có ang b nhi m HCV, bác s ph i ch nh làm xét nghi m phát hi n HCV-RNA,

t c là tìm thành ph n acid nhân c a virus viêm gan C trong máu. N u xét nghi m này cho

k t qu HCV-RNA d ng tính thì có ngh a là trong máu c a b nh nhân có hi n di n

virus viêm gan C, t c là b nh nhân ang b nhi m HCV.

Xét nghi m HCV-RNA là xét nghi m thu c lo i gì, làm sao th c hi n c?

M c dù c khoa h c lôi ra ánh sáng t n m 1985 nh ng cho n ngày hôm nay v n

ch a có ai nhìn th y c virus viêm gan C qua kính hi n vi i n t hay nuôi c y c

virus. Tuy nhiên nh bi t rõ c b gene c a virus nên ng i ta ã có th gi nh c

c u t o c a virus. Có th tóm t t ây là m t lo i virus có lõi, hay g i nôm na là nhân c a

virus có c u t o là RNA. Xét nghi m phát hi n HCV-RNA chính là xét nghi m tìm trong

máu c a b nh nhân s hi n di n RNA c a virus. ây là m t xét nghi m sinh h c phân t ,

thông th ng c th c hi n b ng k thu t PCR (polymerase chain reaction) là k thu t

nhân b n DNA trong ng nghi m qua các chu k nhi t . làm xét nghi m, máu c a

b nh nhân sau khi l y s c tách huy t thanh hay huy t t ng và sau ó phòng thí

172

nghi m s tách chi t RNA c a virus trong các m u huy t t ng và huy t thanh này

a vào m t ng nghi m. Trong ng nghi m này, RNA c a virus s c phiên mã

ng c thành DNA b sung, g i là cDNA, r i các cDNA s c nhân b n thành hàng t

b n sao phát hi n. Nh nhân b n lên t m t b n g c thành hàng t b n sao r i m i

phát hi n, nên xét nghi m có nh y c m c c k cao s c phát hi n RNA c a virus

có trong m u th dù v i s l ng r t th p. Ngoài ra, ngày nay ng i ta còn có th m

c s l ng b n g c RNA c a HCV có t ban u trong m u th là bao nhiêu d a vào

k thu t PCR nh l ng, c g i là qPCR hay real-time PCR. V m t nguyên t c

qPCR c ng gi ng nh PCR nh ng có thêm m t tính n ng n a giúp có th nh l ng

c s l ng b n g c ban u có trong m u th nh m t h th ng quang h c có kh

n ng phát hi n c ph n ng xãy ra trong ng nghi m trong khi nhân b n xãy ra.

Tôi bi t c là hi n nay có nhi u n i làm xét nghi m phát hi n và nh l ng HCV-

RNA nh ng k t qu có khi l i khác nhau dù th trên cùng m t b nh nhân!! Do v y làm

th nào tin t ng c m t k t qu xét nghi m HCV-RNA vì ây là m t xét nghi m mà

chi phí b nh nhân ph i tr c ng không ph i là ít?

úng là nh v y. Xét nghi m HCV-RNA là xét nghi m d a trên k thu t PCR là m t

k thu t hoàn toàn m nên ng i làm xét nghi m có th t pha thu c th làm xét

nghi m mà không ph i b l thu c và các kit xét nghi m mua t các hãng n c ngoài r t

t ti n. Tuy nhiên vì là h th ng m nên mu n k t qu xét nghi m c chính xác thì

ng i làm xét nghi m ph i th c hi n các ch ng ki m soát không có các s sót xãy

ra trong quá trình làm xét nghi m và các ch ng này ph i hi n th trên k t qu xét nghi m.

V i m t xét nghi m phát hi n HCV-RNA, k t qu ph i hi n th : (1) m t ch ng d ng

ch ng minh khâu khu ch i trong quá trình xét nghi m nh y c m, (2) m t ch ng âm

chúng minh quá trình thao tác xét nghi m không b ngo i nhi m gây ra k t qu d ng

tính gi , (3) m t ch ng n i t i trong ch ng âm ch ng minh khâu tách chi t RNA t

m u th t nh y, (4) và ng th i m u âm tính ph i có chúng n i t i ch ng minh

âm tính là th t s âm tính ch không ph i là âm tính gi . i v i xét nghi m nh l ng

HCV-RNA thì trong k t qu ph i hi n th c ng bi u di n chu n ch ng minh

thao tác nh l ng t chu n thông qua h s t ng quan (R) c a các m u chu n ph i

t trên 0.990 và hi u qu ph n ng (E) ph i t 90-105% và ng th i ch ng minh k t

qu nh l ng là c tính toán t k t qu c a các m u chu n c ch y song hành

173

cùng v i m u th ch không ph i là c tính toán t m t công th c có s n. Ngoài ra,

n u mu n k t lu n m t k t qu âm tính thì trong k t qu nh l ng ph i hi n th c

m u ó d ng tính c v i ch ng n i t i m b o âm tính này là âm tính th t s ch

không ph i âm tính gi vì ph n ng khu ch i b c ch .

N u k t qu xét nghi m HCV-RNA c a tôi d ng tính thì tôi có c n thi t ph i c

i u tr c hi u không? Và n u c n ph i c i u tr c hi u thì th i gian ph i i u

tr là bao lâu?

M t ng i sau khi nhi m virus viêm gan C thì th ng không có tri u ch ng hay ch có

m t ít tri u ch ng không c hi u và m h . Tuy nhiên virus s âm th m xâm nh p và

nhân b n trong t bào gan và quá trình này di n ti n r t lâu có th trên hàng ch c n m

d n n t bào gan b tàn phá d n gây h u qu viêm gan m n tính r i i n x gan, và có

th t x gan d n n ung th gan. Nguy c c a ng i ang b nhi m HCV d n n viêm

gan m n tính r i x gan r i n ung th gan là khá cao (có th 17-20%). Do v y, khác

v i nhi m virus viêm gan B c n ph i xác nh là ang b viêm gan B m n tính (ALT t ng

cao hay có b t th ng t ch c gan phát hi n qua sinh thi t hay fibroscan) m i c n ph i

i u tr c hi u; m t ng i b xác nh là ang nhi m virus viêm gan thì nên c ch

nh i u tr c hi u mà không c n ph i có các d u hi u ch ng minh gan ã b th ng

t n vì viêm gan m n tính. Do v y trong tr ng h p c a b n thì nên c i u tr c hi u

ch không c n ph i i n lúc men gan ALT cao g p ôi bình th ng hay sinh thi t

ho c fibroscan th y có th ng t n t bào gan m i i u tr . Tuy nhiên tr c khi c i u

tr , b n ph i nh t thi t c ch nh làm hai xét nghi m: nh l ng HCV-RNA và nh

genotype HCV bác s có th theo dõi c hi u qu i u tr c ng nh quy t nh c

th i gian i u tr c hi u trên b n. có th xác nh i u tr c hi u mà bác s cho ch

nh trên b n là có hi u qu , sau 3 tháng i u tr bác s s ph i ch nh xét nghi m nh

l ng HCV-RNA m t l n n a. N u k t qu nh l ng cho th y l ng virus không gi m

hay gi m d i 100 l n thì bác s ph i cân nh c thay i ph ng th c i u tr hay có th

ph i ng ng i u tr vì b nh không áp ng v i i u tr c hi u. N u k t qu nh l ng

cho th y l ng virus gi m h n 100 l n (chuyên môn g i là gi m h n 2 log) thì bác s có

th ánh giá là phát i u tr c hi u trên b n là hi u qu . Lúc này bác s s ph i quy t

nh th i gian i u tr cho b n là bao lâu, quy t nh này r t tu thu c vào genotype HCV

mà b n b nhi m là lo i nào, và thông tin này bác s s l y t l n xét nghi m u tiên ã

174

ch nh tr c khi quy t nh i u tr cho b n. N u không may mà b n b nhi m genotype

HCV type 1 thì bác s s ph i i u tr cho b n thêm 9 tháng n a t c là t ng th i gian i u

tr ph i 12 tháng. N u b n b nhi m genotype HCV không ph i 1, mà là 2 hay 6 (t i Vi t

Nam, r t ít khi phát hi n c genotype HCV 3, 4, và 5) thì bác s ch c n i u tr cho

b n thêm 3 tháng n a t c là t ng th i gian i u tr 6 tháng. Tr c khi quy t nh ch m

d t i u tr cho b n thì bác s s ph i ch nh xét nghi m phát hi n HCV-RNA xem có

còn trong máu c a b n hay không. N u xét nghi m này v n cho k t qu d ng tính thì

bác s v n ch a th ng ng i u tr mà ph i ti p t c thêm 3 tháng n a cho n khi k t qu

tr nên âm tính. Sau khi ch m d t i u tr , bác s c ng s th ng xuyên theo dõi xem b n

có b tái phát hay tái nhi m không b ng xét nghi m phát hi n HCV-RNA trong máu c a

b n m i 3 tháng m t l n. B t c lúc nào xét nghi m tr nên d ng tính thì bác s s ph i

xem nh b n b tái phát hay tái nhi m và ph i tr l i i u tr c hi u nh ban u.

Genotype là gì? Xét nghi m xác nh genotype HCV là xét nghi m nh th nào? Làm

th nào th c hi n c và giá thành có cao không?

Genotype là các ki u khác bi t c a vi sinh v t cùng loài d a vào s khác bi t các d u

n trên b gene c a vi sinh v t ó. Cho n hi n nay y h c ã xác nh là HCV có th

c phân làm 11 genotype là 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 và 11. V i t ng genotype, HCV

l i c phân thành các d i type nh 1a, 1b, 1c 2a, 2b, 2c 3a, 3b 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 5a,

6a, 7a, 7b, 8a, 8b, 9a, 10a, và 11a. Xét nghi m xác nh genotype HCV là m t lo i xét

nghi m sinh h c phân t . T i Vi t Nam, công ty Nam Khoa ã phát tri n k thu t v a

nh l ng HCV-RNA v a xác nh c genotype c a HCV. Nguyên t c c a k thu t

này là nh l ng HCV-RNA tr c b ng k thu t qPCR r i sau ó gi i trình t s n ph m

qPCR này xác nh genotype HCV b ng cách so chu i v i th vi n genotype HCV

c a NCBI. Nh phát tri n c k thu t này, v i ch nh v a nh genotype HCV, v a

nh l ng HCV-RNA mà bác s ph i cho trên b nh nhân tr c khi quy t nh i u tr

c hi u, b nh nhân ch ph i tr chi phí cho xét nghi m xác nh genotype HCV mà v n

có c k t qu nh l ng HCV-RNA. Ngoài ra, k thu t nh genotype do công ty

Nam Khoa phát tri n còn có l i th h n các k thu t khác hi n ang c s d ng trong

và ngoài n c là k t qu genotype HCV luôn phân bi t n d i type ch không bao gi

ch có k t qu n type hay không th phân bi t các d i type v i nhau. Hi n m t s c

s xét nghi m trong n c có tri n khai xét nghi m nh ki u gene HCV b ng k thu t

175

real-time PCR mà theo báo cáo c a các tác gi thì xét nghi m này phân bi t c ng

nhi m các genotype. Tuy nhiên theo chúng tôi thì nh n nh này th t s quá v i vàng và

thi u lu n c khoa h c vì ng nhi m r t hi m xãy ra (kinh nghi m c a chúng tôi là

không quá 1 cas trong 1000 cas) trong khi ó xét nghi m này l i cho k t qu ng nhi m

n 2 cas trong 10 cas th nghi m. i u này ch ng t k thu t ch a t nh ng ã v i

vàng a ra áp d ng cho ch n oán, và nh v y thì th t là nguy hi m vì s làm l ch

h ng i u tr c a Bác S .

Nói tóm l i, t l nhi m virus viêm gan C, qua xét nghi m anti-HCV trong máu d ng

tính, t i Vi t Nam trong dân s là thu c nhóm các qu c gia có t l nhi m cao trên th

gi i (2-8%). N u phát hi n anti-HCV b d ng tính, b n nên i làm xét nghi m phát hi n

HCV-RNA xem có th t s ang b nhi m HCV hay không. N u d ng tính, thì b n

nên c i u tr c hi u vì nguy c d n n x gan r i ung th gan trên ng i nhi m

HCV là khá cao, và h n n a, y h c hi n nay có th ch a lành ng i b nhi m HCV v i t

l thành công t 60% n 100%. Tuy nhiên tr c khi c ch nh i u tr c hi u, b n

c n ph i c ch nh làm xét nghi m nh l ng HCV-RNA và nh ki u gen HCV

c n c vào ó mà bác s có th ánh giá c hi u qu i u tr và quy t nh c th i

gian i u tr . Tr c khi ch m d t i u tr , b n nh t thi t ph i c ch nh làm xét

nghi m phát hi n HCV-RNA xem máu ã h t s ch virus không, và sau khi ch m d t

i u tr xét nghi m này c ng ph i c th ng xuyên ch nh th c hi n trên b n m i 3

tháng m t l n theo dõi b nh có tái phát không hay b n có b tái nhi m không.