81

PCR và giải trình tự

Giải trình tự là gì?

DNA là cơ sở hóa học của gen. Phân tử DNA là một chuỗi xoắn kép của hai mạch đơn

được cấu tạo từ 4 loại nucleotide khác nhau nhờ các base của chúng, đó là: A (adenine),

C (cytosine), G (guanine) và T (thymine). Các nucleotide này nối kết liên tiếp với nhau

theo một thứ tự xác định. Giải trình tự của gen tức là phát hiện được thứ tự sắp xếp của 4

loại nucleotide này trên phân tử DNA.

Các phương pháp giải trình tự gene

1. Phương pháp hóa học giải trình tự DNA

Vào năm 1977, Maxam và Gilbert đã phát minh được một phương pháp hóa học

để có thể giải trình tự một đoạn DNA. Nguyên tắc của phương pháp này là: (1) Trước

hết là phải đánh dấu một đầu của đoạn DNA cần phải giải trình tự bằng một gốc

phospho đồng vị phóng xạ (32P); (2) Xử lý các đoạn DNA đã đánh dấu này với chất

hóa học có thể làm biến đổi đặc hiệu một hoặc hai loại base của nucleotide trên đoạn

DNA. Ví dụ, dimethylsulphate để biến đổi Guanine bằng các thêm một gốc methyl ở vị

trí nitrogen thứ 7 (N7), hydrazine làm biến đổi Thymine và Cytosine, hydrazine và

NaCl để làm biến đổi Cytosine, acid để làm biến đổi Guanine và Adenine, NaOH để

làm biến đổi Adenine và Cytosine với Adenine ưu tiên hơn Cytosine. Như vậy trong

giai đoạn này, phải dùng ít nhất 4 ống nghiệm và trong mỗi ống nghiệm, DNA được xử

lý với một lượng rất giới hạn của một trong các chất hóa học nêu trên để mỗi ống

nghiệm chỉ có chứa các đoạn DNA mà trên mỗi đoạn DNA này chỉ có một vị trí

nucleotide đặc hiệu với chất hóa học là bị biến đổi; (3) Các nucleotide bị biến đổi này

sẽ bị lấy ra khỏi mạch khung đường-phosphate (sugar-phosphate backbone) của đoạn

DNA và nhờ đó tách ra được các đoạn mạch đơn có một đầu đánh dấu 32P và một đầu

bị mất phân tử base vì phân tử này đã bị lấy ra khỏi mạch khung (hình 37). (4) Thực

hiện điện di mẫu DNA đã xử lý trong 4 ống nghiệm này trên 4 hàng của một gel

polyacrylamide biến tính để các mạch đơn trong mẫu di chuyển trong gel không bị biến

đổi trong quá trình điện di. Nhờ đó, sau khi hoàn tất điện di, các mạch đơn sẽ bị dừng

tại các vị trí khác nhau, tùy thuộc vào mạch đơn này dài ngắn khác nhau, theo hàng dọc

suốt chiều dài của gel. Áp gel đã điện di này trên một phim nhạy tia X, các vị trí dừng

82

lại của các mạch đơn trên gel điện di sẽ tạo thành các vạch trên phim vì các vị trí này

đều bị đánh dấu phóng xạ do các mạch đơn đều có một đầu được đánh dấu bằng 32P.

Từ các vạch trên phim xạ ký tự ghi này (autoradiography), có thể đọc được trình tự của

các nucleotide của đoạn DNA (hình 38).

Phương pháp hóa học xác định trình tự DNA của Maxam và Gilbert trên thực tế

không phải dễ thực hiện vì cần phải xác định khá nhiều thông số tối ưu cho thí nghiệm,

trong đó khó nhất là phải xác định được nồng độ giới hạn nhất của các chất hóa học sao

cho khi xử lý mẫu DNA thì trên mỗi đoạn DNA chỉ có một base bị biến đổi để ứng với

mỗi vị trí của base bị biến đổi thì sẽ có một mạch đơn có đầu đánh dấu 32P được tách ra.

Chính vì sự phức tạp này, phương pháp Maxam Gilbert hiện nay ít được sử dụng, mà

thay vào đó các nhà khoa học dùng phương pháp enzyme với nhiều ưu điểm vượt trội

hơn.

Mạch đơn DNA

32P A p G p C p T p T p T p G p A p G p G p A p C p G p A..

32P 32P 32P 32P 32P

Các mạch DNA đơn có đầu bị đánh dấu 32P

Hình 37: Các mạch đơn có một đầu đánh dấu với 32P và một đầu base Guanine bị lấy khỏi mạch khung do bị

biến đổi. Các mạch đơn này có chiều dài ngắn khác nhau tùy thuộc vào vị trí của Guanidine trên đoạn DNA.

Hình 38: Hình xạ ký tự ghi trên phim nhạy tia X một gel polyacrylamide sau khi đã điện di. Các vạch là vị trí các mạch đơn bị dừng lại sau điện di. Các vị trí này gần hay xa khởi điểm là tuỳ kích thước của mạch đơn dài hay ngắn khác nhau. Từ các vạch này, đọc trình tự của đoạn DNA trong mẫu.

C T+G G

A>C

3’ 5’ G C C C A C T T C A G A A G A A A A A G G

83

2. Phương pháp enzyme giải trình tự DNA

Phương pháp enzyme được Sanger và các cộng sự phát minh cũng vào năm 1977,

và ngày hôm nay phương pháp này càng ngày càng được hoàn thiện và thực hiện dễ

dàng tại các phòng thí nghiệm. Nguyên tắc chung của phương pháp này có thể tóm tắt

như sau:

thêm d*NTP, DNA polymerase, ddATP

GGAATGC

CCTTACG CATACGTGG

mồi GGAATGC

CCTTACG CATACGTGG

CGTAAGG*C*CdA CGTAAGG*C*C*A*C*G*TdA

CGTAAGGdC CGTAAGG*CdC CGTAAGG*C*C*AdC

CGTAAGG*C*C*A*CdG CGTAAGG*C*C*A*C*G*T*A *TdG

CGTAAGG*C*C*A*C*GdT CGTAAGG*C*C*A*C*G*T*AdT

CGTAAGG*C*C*A*C*G*T*A *TdG CGTAAGG*C*C*A*C*G*T*AdT CGTAAGG*C*C*A*C*G*TdA CGTAAGG*C*C*A*C*GdT CGTAAGG*C*C*A*CdG CGTAAGG*C*C*AdC CGTAAGG*C*CdA CGTAAGG*CdC CGTAAGGdC

điện di trên gel

Chiều điện di

thêm d*NTP, DNA polymerase, ddCTP

thêm d*NTP, DNA polymerase, ddGTP

thêm d*NTP, DNA polymerase, ddTTP

Hình 39: Phương pháp Enzyme giải trình tự DNA. Đoạn DNA được chèn vào một vector tại một vị trí biết rõ

trình tự, nhờ đó có thể tổng hợp được các mạch đơn có một đầu là mồi, một đầu là các nucleotide tận. Trong hình các nucleotide đánh dấu * là các nucleotide được dánh dấu 35S, nhờ vậy các mạch đơn được đánh dấu.

84

Trước hết chèn các đoạn DNA cần phải xác định trình tự vào một vector là phage

hay plasmid tại một vị trí mà trình tự chuỗi của vị trí này đã được xác định rõ. Chuyển

thể tức là đưa các vector mang đoạn chèn DNA này vào tế bào vi khuẩn để nhân bản

các vector này thành nhiều bản sao, sau đó tách chiết và tinh khiết các vector từ vi

khuẩn để thành các vector tự do.

Dùng các đoạn mồi bổ sung một cách đặc hiệu với trình tự của vector tại vị trí

chèn đoạn DNA. Thêm vào ống phản ứng men DNA polymerase và 4 loại nucleotide

tự do (gọi là dNTP: deoxynucleotide triphosphate) và một lượng rất giới hạn các

nucleotide tận (terminator, là ddNTP: dideoxynucleotide triphosphate, cũng như dNTP,

có 4 loại ddNTP tương ứng với 4 base A, T, C và G). Phản ứng được thực hiện trong 4

ống, và mỗi ống cho một loại ddNTP khác nhau. Bắt đầu từ đoạn mồi, men DNA

polymerase sẽ kéo các dNTP vào để tổng hợp mạch đơn bổ sung với mạch DNA chèn

trên vector, và sự tổng hợp mạch đơn sẽ bị dừng

lại tại vị trí mà ddNTP được kéo vào thay vì

dNTP. Lý do sự tổng hợp bị dừng lại là vì

ddNTP có cấu trúc hóa học bị mất đi gốc OH tại

vị trí carbon thứ 3 của đường deoxyribose, mà

gốc OH tại vị trí này chính là nơi để dNTP kế

tiếp được gắn vào. Nhờ vậy trong ống phản ứng

có các mạch đơn DNA có các chiều dài khác

nhau tương ứng với các vị trí trình tự các

nucleotide trên đoạn DNA gốc (hình 39).

Để giải trình tự, người ta dùng phương pháp

điện di trên gel polyacrylamide biến tính. Với

phương pháp đánh dấu mồi hay các dNTP bằng

đồng vị phóng xạ 32P hay 35S thì sau khi điện di,

cũng giống như phương pháp của Maxam và Gilbert, người ta phát hiện các vạch điện

di bằng kỹ thuật xạ ký tự ghi, và từ các vạch này giải được trình tự của đoạn DNA

(hình 40).

T 3’ C G C A G T C C T A G C T T A G C G G 5’

A C G T

Hình 40: Hình xạ ký tự ghi một kết quả giải trình tự DNA trên gel polyacrylamide. Từ kết quả này, đọc được trình tự DNA

85

3. Giải trình tự bằng máy tự động (automated sequencer)

Các phòng thí nghiệm hiện nay đều dùng phản ứng giải trình tự bằng phương pháp

enzyme, nhưng khi làm giải trình tự thì thường dùng các máy tự động chứ không dùng

kỹ thuật xạ ký tự ghi như trước đây. Để thực hiện được giải trình tự bằng máy tự động

thì các mạch DNA đơn sản sinh trong ống phản ứng giải trình tự phải được đánh dấu

huỳnh quang để các vạch điện di của các mạch đơn này phát sáng khi đi qua một chùm

tia sáng laser. Cấu tạo của một máy tự động giải trình tự gồm hai phần chính yếu, đó

là: phần điện di với gel polyacrylamide và phần phát hiện các vạch điện di. Phần điện

Hình 41: Sơ đồ khối một máy tự động giải trình tư dùng bản gel polyacrylamide. Máy gồm hai phần: phần điện di gel polyacrylamide, phần phát hiện các vạch điện di. Các vạch điện di được các con mắt cảm quang phát hiện khi đi qua chùm tia laser và phát sáng lên. Tín hiệu được mắt cảm quang truyền về máy tính để hiển thị thành các đỉnh cường độ sáng

A G C T T A C G G A C T A A T G C

Màu 1

Màu 2

Màu 3

Màu 4

Tia LASER

Máy tính

Th i gian

Mắt cảm quang

A G C T T A C G G A C T A A T G C

Màu 1

Màu 2

Màu 3

Màu 4

Tia LASER

Máy tính

Th i gian

Mắt cảm quang

86

di polyacrylamide có thể là một bản gel hay là một ống mao quản chứa gel. Phần phát

hiện vạch điện di là những con mắt cảm quang và một chùm tia laser đi qua trước nó.

Nguyên tắc hoạt động của máy là trong suốt quá trình điện di, mỗi khi có một vạch

điện di đi qua chùm tia laser thì vạch điện di sẽ phát sáng lên và sự phát sáng này sẽ

được con mắt cảm quang

ghi nhận và lưu lại thành

một đỉnh cường độ sáng

trong biểu đồ. Từ biểu đồ

của các đỉnh cường độ

sáng này, máy sẽ so dòng

của các đỉnh tương ứng

với các màu để cuối cùng

phân tích thành trình tự

của đoạn DNA (hình 41).

Với các máy thế hệ

mới sau này, người ta có

thể dùng 4 màu huỳnh

quang khác nhau để đánh

dấu 4 loại ddNTP, nhờ vậy

phản ứng giải trình tự có

thể thực hiện được chỉ

trong một ống nghiệm và

khi giải trình tự chỉ cần điện di trên một hàng mà không cần phải trên 4 hàng khác nhau

như trước đây (hình 42). Nếu dùng diện di mao quản thì tùy thuộc vào số mao quản có

thể chạy một lần mà người làm thí nghiệm có thể có số mẫu cho mỗi lần chạy nhiều

hay ít. Hình 43 là sơ đồ khối minh họa cho một giải trình tự 8 mao quản (CEQ8000,

hay CEQ8800). Tùy thuộc vào qui mô của phòng thí nghiệm cùng với số mẫu giải

trình tự mà phòng thí nghiệm có thể trang bị giải trình tự ít hay nhiều mao quản. Ví dụ

với ABI thì có nhiều loại: chỉ 1 mao quản, 4 mao quản, 16 mao quản, 48 mao quản, rồi

96 mao quản. Phòng thí nghiệm R&D của công ty Nam Khoa trước đây nhu cầu giải

trình tự không nhiều nên chỉ trang bị CEQ8000 có 8 mao quản (hình 44). Nhưng nay

GGAATGCCCTTACGCATACGTGG

CGTAAGGCCdACGTAAGGCdCCGTAAGGCCACdGCGTAAGGCCACGTdACGTAAGGdCCGTAAGGCCACGTA TdGCGTAAGGCCAdCCGTAAGGCCACGdTCGTAAGGCCACGTAdT

*CGTAAGGCCACGTA TdG*CGTAAGGCCACGTAdT*CGTAAGGCCACGTdA*CGTAAGGCCACGdT*CGTAAGGCCACdG

*CGTAAGGCCAdC*CGTAAGGCCdA*CGTAAGGCdC

*CGTAAGGdC

thêmdNTP, DNA polymerase, ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP

Chiều điện di

GGAATGCCCTTACGCATACGTGG

CGTAAGGCCdACGTAAGGCdCCGTAAGGCCACdGCGTAAGGCCACGTdACGTAAGGdCCGTAAGGCCACGTA TdGCGTAAGGCCAdCCGTAAGGCCACGdTCGTAAGGCCACGTAdT

*CGTAAGGCCACGTA TdG*CGTAAGGCCACGTAdT*CGTAAGGCCACGTdA*CGTAAGGCCACGdT*CGTAAGGCCACdG

*CGTAAGGCCAdC*CGTAAGGCCdA*CGTAAGGCdC

*CGTAAGGdC

thêmdNTP, DNA polymerase, ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP

thêmdNTP, DNA polymerase, ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP

Chiều điện di

Hình 42: Với các ddNTP đánh dấu hùynh quang khác nhau, các đọan

trình tự tận cùng ở đầu 5’ sẽ được đánh dấu bằng 4 màu hùynh quang khác nhau tương ứng với nuleotide tận là A, hay T, hay C hay G. Chính nhờ vậy không cần phải thực hiện phản ứng giải trình tự trong 4 ống phản ứng.

87

do nhu cầu nghiên cứu và dịch vụ ngày càng nhiều nên đã trang bị thêm ABI 3130XL

có đến 16 mao quản (hình 44).

Các thế hệ máy về sau ngày càng có những chương trình đi kèm để chẳng những

có thể hiển thị tự động các ký tự hoá học của trình tự DNA mà còn giúp các nhà nghiên

cứu có thể: (1) Phát hiện các chi tiết cần thiết trên trình tự như mã khởi đầu, mã kết

thúc, vùng đọc mở (ORF: Open Reading Frame), trình tự đặc hiệu cho các enzyme cắt

giới hạn (restriction enzyme), các dấu ấn di truyền...mà các chi tiết này rất cần thiết để

lập bản đồ gen...(2) Phiên dịch trình tự trong vùng đọc mở (tức là vùng trình tự có ý

nghĩa) thành trình tự acid amin của một protein, nhờ đó có thể xác định, phỏng đoán,

hay làm cơ sở ban đầu để hiểu được chức năng của gen...(3) Tự động so sánh trình tự

DNA trong thí nghiệm hay

một trình tự DNA nạp vào

máy, hay có thể trình tự acid

amin của protein, với các

trình tự khác đã có trong ngân

hàng dữ liệu để phát hiện

được sự tương đồng với trình

tự đã biết, nhờ đó làm cơ sở

để xác định gen và chức năng

gen...

Hình 44: Máy giải trình tự CEQ8000 có 8 mao quản của Beckman Coulter và ABI 3130XL có 16 mao quản của Applied Biosystem được trang bị tại phòng thí nghiệm R&D của công ty Nam Khoa

Cực [-]

Cự

c[+

]

Laser

Cảmquang

Điện thế cao

Mao quản

Cực [-]

Cự

c[+

]

Laser

Cảmquang

Điện thế cao

Cực [-]

Cự

c[+

]

Laser

Cảmquang

Điện thế cao

Mao quản

Hình 43: Sơ đồ khối một máy diện di mao quản dùng giải trình tự DNA

88

PCR là công cụ giúp hoàn thiện và mở rộng phổ áp dụng kỹ thuật giải trình tự

PCR đã đóng góp rất nhiều vào công nghệ giải trình tự làm cho công nghệ giải trình tự

ngày càng dễ dàng hơn và thuận tiện hơn. Không chỉ vậy PCR còn làm cho giải trình tự

có nhiều ứng dụng hơn không chỉ trong nghiên cứu mà cả trong chẩn đoán nữa.

Trước khi có PCR thì người ta chỉ có thể giải trình tự các đoạn gene được cô lập và

chèn vào plasmid vì chỉ có như vậy thì mới có thể nhân bản được đoạn gene muốn giải

trình tự thành nhiều bản sao với số lượng đủ để chạy được phản ứng giải trình tự. Ngoài

ra, enzyme polymerase cũng là loại enzyme không chịu nhiệt nên phản ứng giải trình tự

chỉ thực hiện ở 37oC, do vậy mà vấn đề tối ưu các thành phần của phản ứng rất là khó

đồng thời hiệu quả của phản ứng giải trình tự cũng không cao.

Từ khi có sự ra đời của kỹ thuật PCR thì kỹ thuật giải trình tự cũng có những tiến bộ

rất vượt bực. Chỉ cần dùng PCR là có thể nhân bản đoạn gene muốn giải trình tự thành

hàng tỷ bản sao hoàn toàn giống hệt nhau và sản phẩm khuếch đại này có thể đưa vào

giải trình tự trực tiếp mà không cần phải chèn vào một plasmid giải trình tự nữa. Sự phát

minh ra kỹ thuật nhân bản DNA trong ống nghiệm bằng PCR cũng giúp cho việc cải tiến

phản ứng giải trình tự kém hiệu quả trước đây trở nên hiệu quả hơn nhờ áp dụng enzyme

polymerase giải trình tự bền với nhiệt độ để phản ứng giải trình tự được thực hiện qua các

chu kỳ nhiệt giống hệt PCR, mà ngày nay chúng ta gọi là phản ứng chu kỳ nhiệt giải trình

tự. Với phản ứng chu kỳ nhiệt giải trình tự thì hiệu quả phản ứng tốt hơn rất nhiều, đồng

thời tối ưu hóa các thành phần của phản ứng cũng dễ dàng hơn rất nhiều. Có thể nói

chính sự ra đời và hoàn thiện kỹ thuật PCR đã giúp tăng tốc kỹ thuật giải trình tự không

những trong vấn đề hoàn thiện nó, mà cả trong vấn đề phạm vi áp dụng.

Giải trình tự bộ gene người

1. Làm thế nào giải trình tự bộ gene người

Giải trình tự bộ gen người tức là giải trình tự toàn bộ thứ tự sắp xếp các nucleotide

A, T, C, và G của DNA trong 23 cặp nhiễm sắc thể tế bào người. Dự án giải trình tự bộ

gen người được Tiến Sĩ James Watson, cha đẻ của phát hiện cấu trúc DNA, đề ra từ

giữa thập niên 1980. Đến tháng 10 năm 1990, dự án được ra đời với kinh phí 3 tỷ Mỹ

kim do HGP (Human Genome Project) của Viện Quốc Gia Y Tế Hoa Kỳ lãnh đạo

cùng với sự tham gia của nhiều trung tâm nghiên cứu bộ gen người của nhiều quốc gia

89

trên thế giới. Do tiên đoán giá trị kinh tế mang lại từ việc giải mã thành công bộ gen

người sẽ rất lớn, nên đã có một số công ty sinh học chuyên về bộ gen người đã được

hình thành. Sự nhập cuộc của các công ty tư nhân này đã tạo nên một bầu không khí thi

đua cho việc khai phá bí mật về bộ gen của loài người chúng ta, càng gần đến những

ngày đến đích càng cực kỳ ngoạn mục. Trong cuộc chạy đua này, nhờ đã áp dụng một

phương pháp cực kỳ độc đáo kết hợp giữa công nghệ PCR, công nghệ giải trình tự

DNA với công nghệ tin học, nên chỉ với kinh phí khoảng 200 triệu mỹ kim, Tiến Sĩ

Crag Venter của Celera Genomics trở thành người dẫn đầu thành công nhất trong việc

giải trình tự được gần như hoàn toàn bộ gen người.

Cái khó khăn của việc giải trình tự bộ gene người là không thể nào tách từng đại

phân tử DNA của từng nhiễm sắc thể rồi đem giải trình tự đại phân tử DNA nguyên

vẹn này. Các nhà khoa học của HGP cũng như các trung tâm khác trên thế giới nghiên

cứu về bộ gen người thường cắt các đại phân tử DNA của nhiễm sắc thể một cách định

hướng theo bản đồ di truyền, rồi đem giải trình tự các đoạn cắt DNA này, và cuối cùng

tìm cách ghép nối chúng lại với nhau cho đúng vị trí của chúng trên đại phân tử DNA.

Phương pháp này đòi hỏi phải tốn nhiều thời gian và công sức vì có nhiều khi các đoạn

cắt DNA quá lớn, rất khó giải trình tự cũng như khó cho kết quả giải trình tự chính xác.

Do đó, với mỗi một đoạn DNA các nhà khoa học phải thực hiện giải trình tự ít nhất là

7 lần để đảm bảo độ lặp lại. Chính vì vậy, với cách tiếp cận này, nhiều vị trí trên các

đại phân tử DNA vẫn không thể giải trình tự được mà từ đó các nhà khoa học của HGP

có thể hoàn tất việc xếp đúng vị trí các đoạn DNA đã giải trình tự trên đại phân tử

DNA của nhiễm sắc thể.

Tiến sĩ Crag Venter đã thực hiện một phương pháp giải trình tự bộ gen người một

cách hoàn toàn khác hẳn (hình 45). Trước hết ông cho tách chiết toàn bộ DNA nhiễm

sắc thể tế bào người rồi phá bung một cách không định hướng các đại phân tử DNA

thành các mảnh DNA nhỏ hơn. Đem giải trình tự tất cả các mảnh DNA nhỏ này. Cuối

cùng dùng những máy điện toán cực mạnh mà ông đã hợp tác với công ty ABI chế tạo

ra, dò tìm các đầu trùng lặp của các mảnh DNA nhỏ này để lắp nối vào đúng các vị trí

của chúng trên đại phân tử DNA của nhiễm sắc thể. Chính nhờ áp dụng chiến lược giải

trình tự này mà Celera Genomics đã giải trình tự rất nhanh các mảnh DNA, chỉ cần lặp

lại cho mỗi mảnh DNA có 5 lần, và đã xếp đúng gần như hầu hết vị trí của các mảnh

90

DNA đã giải trình tự trên đại phân tử DNA của nhiễm sắc thể. Hơn thế nữa, TS. Crag

Venter cũng tuyên bố công ty đã triển khai một kỹ thuật mới có thể làm cho phương

pháp giải trình tự bộ gen của công ty, vốn dĩ đã là phương pháp nhanh nhất rồi, trở

thành nhanh hơn nữa. Cuối năm 2000, Celera Genomics đã hoàn thành việc giải trình

tự bộ gen của chuột với 2.3 tỷ “ký tự hóa học” trong đó có rất nhiều tương đồng với bộ

gen người, nhờ vậy sẽ giúp các nhà khoa học dễ dàng hơn trong việc truy tìm các chức

năng của các gen.

2. Kết quả giải trình tự bộ gene người

Sau gần 10 năm nghiên cứu

thực hiện với những năm càng về

sau càng sôi động không khí thi

đua do sự nhập cuộc của các công

ty tư nhân, ngày 26 tháng 6 năm

2000, tại Tòa Bạch Ốc với sự

hiện diện của Tổng Thống Hoa

Kỳ Bill Clinton, hai khoa học gia

Mỹ là Tiến Sĩ Crag Venter đại

diện cho Celera Genomic và Tiến

Sĩ Francis Collins đại diện cho

HGP (HGP: Human Genome

Project) của NIH (NIH: National

Institute of Health) công bố một

cách long trọng là chương trình

giải trình tự bộ gen người đã

hoàn tất. Đây chính là một thời

khắc lịch sử cực kỳ quan trọng và

đáng nhớ của nhân loại, đánh dấu

ngày nhân loại đã có trong tay

một bản đồ sinh học cần thiết để

bước vào kỷ nguyên mới với

nhiều hứa hẹn các thành tựu vĩ

c a g g c a t t t c c a g c

g g c g g c g g a g c a g

c g a g c g g c g g

c c a g c a g t g a g g a g a c a g c

c c a g c a g t g a g g a g a c a g c

c g a g c g g c g g g g c g g c g g a g c a g

c a g g c a t t t c c a g c

c g a g c g g c g g c g g a g c a g g c a t t t c c a g c a g t g a g g a g a c a g c t g t a c

ccgtcaaccggagtta

acgttct

DNA từ mhiễm sắc thể được phá bung thành

nhiều mãnh nhỏ

Các mãnh DNA nhỏ được giải trình tự

Các mãnh DNA nhỏ được chương trình phân tích tự động tìm các đầu trùng lặp, nhờ đó tái hiện

được trình tự của đại phân tử DNA

Hình 45:

Phương pháp giải trình tự bộ gen người của công ty Celera Genomics: trước hết tách chiết toàn bộ DNA của nhiễm sắc thể tế bào người, sau đó phá tung DNA thành các mảnh nhỏ, giải trình tự tất cả các mảnh nhỏ này, cuối cùng nhờ chương trình vi tính cực mạnh để nối kết các đoạn DAN nhỏ này lại với nhau bằng cách dò tìm các đầu trùng lặp nhờ vậy tái hiện được mạch DNA nguyên thủy

91

đại về sinh y học trong tương lai. Dù thành công của các nhà khoa học giải trình tự

được 3.1 tỷ các “ký tự hóa học” làm nên bộ gen người đã được ví như sự kiện lịch sử

con người bước lên mặt trăng (ngày 26 tháng 7 năm 1969, từ khoang đổ bộ phi thuyền

Apollo, Neil Armstrong bước xuống đi dạo trên mặt trăng và đánh dấu thời điểm con

người thực hiện được hoàn toàn ước mơ đã từng ao ước bấy lâu: khắc dấu chân mình

trên bề mặt chị Hằng), nhưng đây chưa phải là thời điểm mà con người đã toại nguyện

được ước mơ hiểu biết tường tận được bộ gen của mình.

Thật sự cho đến thời điểm đó các nhà khoa học ở Công ty Celera Genomic hãy

còn chưa giải trình tự được 3% bộ gen người, tức khoảng 150 triệu, và công việc này

đòi hỏi phải từ 1 đến 2 năm nữa mới có thể hoàn tất vì 3% còn lại này nằm trên phần

khó giải trình tự nhất. Còn HGP thì thành công ít hơn, hãy còn nhiều đoạn trình tự của

bộ gen mà các nhà khoa học của HGP chưa giải được và cũng có nhiều đoạn trình tự đã

giải được nhưng họ vẫn chưa sắp xếp vào đúng vị trí. Ngoài ra, cho dù các nhà khoa

học có giải trình tự được một cách trọn vẹn bộ gen con người, thì cuốn sách của đời

sống (the book of life) này hãy còn chưa đọc được, như Gerald Rubin, Phó Giám đốc

Nghiên Cứu Y Sinh Học của Viện Y Học Howard Hughes giải thích: “Cuốn sách được

viết bằng một ngoại ngữ rất phức tạp, cần phải có một thời gian dài chúng ta mới hiểu

được”. Thật vậy, có thể tưởng tượng là nếu các trình tự của bộ gen người được in ra

thành sách thì sẽ cần phải khoảng 200 cuốn và mỗi cuốn dày phải 500 trang. Có 3000

trang nằm rải rác trong 200 cuốn sách trên là có ý nghĩa tức là có gen, mà cho đến hiện

nay chỉ mới có một số ít trang trong 3 ngàn trang này là khoa học đã đọc được tức là

xác định được gen. Hãy còn vài trang (khoảng 3%) chưa viết xong và những trang này

là những trang khó viết nhất vì thuộc những vùng khó giải trình tự nhất trong bộ gen

người.

Cho đến tháng 4 năm 2003, các trang khuyết này đã được các nhà khoa học viết

hoàn tất. Tuy vậy, một việc rất lớn hiện đang đặt ra trước mắt các nhà khoa học đó là

phải xác định được các trình tự nào là gen và chức năng của các gen này. Chỉ có 3%

của bộ gen người là mang gen tức là mang trình tự có ý nghĩa và hiện nay các nhà khoa

học cũng chưa biết chính xác là thật sự có bao nhiêu gen trong bộ gen người. Câu trả

lời phỏng chừng nhất là từ 28.000 đến 140.000 gen, và gần đây nhất có lẽ là đang gần

đến con số chính xác hơn, đó là 30.000 gen. Trong khoảng 30.000 gen này, các nhà

92

khoa học hiện chỉ biết được chức năng của khoảng 10.000 gen, hãy còn 20.000 chưa

biết chức năng của chúng. Đây chính là một cuộc đua mới cũng hứa hẹn đầy sôi động

vì kết quả từng chặng một của cuộc đua, tức kết quả của việc xác định được chúc năng

của từng gen, đều hứa hẹn những áp dụng cực kỳ ngoạn mục và đầy triển vọng trong

sinh học cũng như y học.

3. Giải trình tự bộ gene người – cuộc đua chưa kết thúc

Gen chính là trình tự các nucleotide trong chuỗi DNA chỉ huy được sự tổng hợp

một protein. Chính vì vậy xác định được chức năng của một gen tức là xác định được

protein mà gen tổng hợp có cấu trúc như thế nào và có nhiệm vụ gì trong cơ thể sống.

Sau kết quả giải trình tự bộ gen người, hiện nay các nhà khoa học đang có nhiều chiến

lược để có thể nhanh chóng phát

hiện chức năng của các gen trong

bộ gen người. Chúng tôi xin trình

bày ra đây ba trong số những chiến

lược đó.

(1) Nhờ kết quả giải trình tự

bộ gen người, các nhà khoa học sẽ

nhanh chóng xác định các trình tự

mang gen. Với các kỹ thuật sinh

học phân tử hiện đại như kỹ thuật

PCR, các nhà khoa học sẽ dễ dàng

nhân bản các gen này trong ống

nghiệm rồi dòng hóa chúng vào các

vectơ để sau đó nhờ các hệ tế bào

biểu hiện để biểu hiện các protein.

Với cách này các nhà khoa học sẽ

nhanh chóng thành lập được một

thư viện các protein của các gen có trong bộ gen người. Vấn đề tiếp theo là phải xác

định các protein trong thư viện protein là có chức năng gì? Để biết được chức năng của

protein trong thư viện, các nhà khoa học sẽ thử nghiệm các protein này hệ thống các

loại nuôi cấy tế bào để tìm hiểu mối giao tiếp giữa protein thử nghiệm với tế bào đích,

Dùng PCR để tổng hợp các gen

Clone vào các vector

Đưa vào các hệ thống tế

bào biểu hiện

Lập thư viện protein

Thử nghiệm trên các loại tế bào đích

Hình 46: Chiến lược tạo thư viện protein để đò tìm chức năng

của gen, tóm tắt là từ gen tổng hợp các protein, trữ trong thư viện protein, rồi thử trên các hệ thống tế bào đích để phát hiện chức năng của protein, từ đó biết được chứng năng của gen.

93

nhờ đó xác định tế bào đích nào có phản ứng với protein thử nghiệm, và nhờ vậy sẽ

biết được chức năng protein để biết được chức năng của gen. (hình 46).

(2) Giải trình tự bộ gen của động vật hữu nhũ

như dã nhân (rất giống bộ gen người) hay chuột,

đây là những bộ gen của các động vật có nhiều

tương đồng với bộ gen người, nhưng lại trên các

động vật mà các nhà khoa học rất dễ làm thí

nghiệm. Trên bộ gen động vật này, các nhà khoa

học sẽ dễ dàng phát hiện các gen, và các chức năng

của gen thông qua sự thay đổi hoặc biểu hiện của

một tính trạng nào đó của động vật thí nghiệm một

khi các nhà nghiên cứu dùng các kỹ thuật sinh học

phân tử gây đột biến hay làm knock-out ngay trên những vùng mang gen của bộ gen.

Một khi đã xác định được gen và chức năng của một gen trên động vật thí nghiệm, các

nhà nghiên cứu sẽ dễ dàng truy tầm và phát hiện gen và chức năng của gen này trên bộ

gen người nhờ phát hiện sự tương đồng về trình tự trong gen người với gen của động

vật thí nghiệm.

(3) Chúng ta biết rằng một protein được tổng hợp từ gen hoạt động như một vai trò

cấu trúc hoặc vai trò chức năng là nhờ hình dáng của nó với các hốc nhỏ hay các nếp

gấp. Chính vì vậy cho nên dù một gen có được giải mã và biểu hiện được một protein,

thì cũng chưa thể xác định được chức năng của protein này nếu chưa biết được các

hình dáng của nó. Chính vì vậy mà Viện Quốc Gia Khoa Học Y Khoa Tổng Quát tại

Hoa Kỳ đang chi một khoảng 20 triệu đô la để thành lập các trung tâm Proteomics, là

các trung tâm chuyên nghiên cứu và lưu trữ các cấu trúc và hình dáng được vi tính hóa

(hình 47) của các protein có trong thiên nhiên. Các viện Proteomics như vậy cũng

đang và sẽ thành lập tại các nước khác. Các nhà khoa học hy vọng rằng trong vòng 10

năm tới đây, các viện proteomics sẽ lưu trữ được hình dáng của gần 10.000 protein có

trong thiên nhiên. Con số này dù hãy còn rất nhỏ so với một số lương khá lớn các

protein thực sự có trong thiên nhiên, nhưng các nhà khoa học cũng hy vọng rằng thư

viện này đủ sức bao gồm tất cả hình dạng của tất cả các protein có liên quan đến sinh

học và y học, vì các protein khác không có trong danh sách cũng chỉ là các biến thể hay

Hình 47: Hình dạng của phân tử kháng thể

được vi tính hóa

94

các đồng dạng với các protein có trong danh sách mà thôi. Nhờ các trung tâm

proteomics và thư viện các hình dạng protein, các nhà nghiên cứu chắc chắn sẽ dễ dàng

hơn trong xác định các chức năng của gen.

4. Việt Nam có thể tham gia vào cuộc đua này không?

Hiện nay các nhà khoa học đang cố gắng nghiên cứu khai phá các bí mật trong

cuốn sách đời sống ghi chép đầy đủ trình tự bộ gen người với nhiều triển vọng sẽ có

các ứng dụng cách mạng trong sinh học, y học, cũng như các lĩnh vực khoa học khác

và sẽ đưa đến nhiều tiến bộ mới cho loài người trong kỷ nguyên mới này. Các nhà y-

sinh học của chúng ta hoàn toàn có thể tham gia trong cuộc đua này, vì theo chúng tôi

thì sinh học phân tử đối với các quốc gia thu nhập thấp có thể coi như là một ngành

khoa học tiểu thủ công nghiệp hiện đại. Tiểu thủ công nghiệp vì không nhất thiết

phải có các máy móc cực kỳ hiện đại và tốn kém mà vẫn có thể thực hiện được các kỹ

thuật bằng các thiết bị không quá đắt tiền. Hiện đại vì nhà nghiên cứu thực hiện kỹ

thuật dựa trên các kiến thức hiện đại với các kết quả hoàn toàn có thể có đóng góp lớn

vào kho tàng kiến thức hiện đại của nhân loại. Vấn đề chính là chúng ta phải có chuẩn

bị như thế nào và phải có chiến lược tham gia vào cuộc đua như thế nào.

Để chuẩn bị, quan trọng nhất là chúng ta phải cố gắng xây dựng và đào tạo trong

cũng như ngoài nước đội ngũ các nhà nghiên cứu y sinh học có trình độ và bản lĩnh

ngang tầm với thế giới. Các nhà nghiên cứu của chúng ta không chỉ phải có kiến thức

và kỹ năng về chuyên môn sinh-y học mà còn phải có khả năng tiếp cận để khai thác

được kho tàng kiến thức cũng như các dữ liệu ngày càng cập nhật trên mạng internet.

Ngoài ra, chúng ta phải tránh tình trạng đào tạo các nhà nghiên cứu nhưng lại không

chuẩn bị cho họ các điều kiện cũng như phương tiện làm việc. Chính vì sự thiếu thốn

điều kiện cũng như phương tiện làm việc mà các nhà nghiên cứu của chúng ta dù có

trình độ và bản lĩnh đến đâu cũng sẽ thui chột dần nhiệt huyết cũng như khả năng theo

thời gian, và dần dần tình trạng chảy máu chất xám trong cũng như ngoài nước sẽ

không thể tránh khỏi.

Về chiến lược, thì có lẽ chúng ta cũng cố gắng tham gia cuộc đua với những đích

nhắm là giải quyết và khai thác những đặc thù trong nước. Chẳn hạn khai thác nghiên

cứu cơ chế ở mức độ sinh học phân tử tác động của các dược liệu trong nước bằng cách

xây dựng các mô hình thí nghiệm ex-vivo trên các cấy tế bào để phát hiện sự cảm ứng

95

biểu hiện gen khi cho các hệ thống nuôi cấy tế bào này tiếp cận với các trích phân của

dược liệu. Phát hiện các cơ chế tác động của dược liệu ở mức độ sinh học phân tử, chắc

chắn chúng ta sẽ khai thác được các nguồn dược liệu quí mà chúng ta vốn có sẵn trong

nước. Ngoài ra, dân tộc Việt của chúng ta là một dân tộc khá thuần nhất, bên cạnh đó

chúng ta cũng có những dân tộc ít người sống rất tập trung và chưa hề bị lai trộn, đây

chính là cơ sở cho các nghiên cứu về sự phân bố các gen cũng như các mã di truyền

cho các nghiên cứu ứng dụng sau này để phát hiện, chữa trị hoặc phòng ngừa các bệnh

lý di truyền.

Nhân loại đang bước vào thiên niên kỷ 21 với hành trang mang theo là các tiến bộ

vượt bậc ở nhiều lĩnh vực khoa học khác nhau, trong đó có khoa học Y học và Sinh

học. Một hành trang cần yếu nhất cho một cuộc sống dễ dàng hơn và tốt đẹp hơn là

cuốn sách của đời sống với hầu như toàn bộ trình tự của bộ gen người mà các nhà khoa

học mới vừa kịp hoàn tất. Việc khai thác cuốn cẩm nang sinh học cần yếu nhất này của

nhân loại đòi hỏi một sự hợp tác đa ngành cũng như chuyên ngành. Chính vì vậy nên

chúng tôi cho rằng chúng ta cũng không thể bỏ qua yếu tố hợp tác và học hỏi: chúng ta

phải hợp tác và học hỏi từ bạn bè quốc tế, và quan trọng nhất là phải biết học hỏi và

biết hợp tác giữa chúng ta với nhau.

Ứng dụng công nghệ giải trình tự tại phòng thí nghiệm NK-Biotek

Phòng thí nghiệm NK-Biotek và đơn vị R&D của công ty Nam Khoa đã ứng dụng khá

thành công kỹ thuật giải trình tự vào các dịch vụ chẩn đoán và nghiên cứu. Dưới đây xin

đưa ra một số thành tựu tiêu biểu.

1. Ứng dụng kỹ thuật PCR và giải trình tự để định danh vi khuẩn

Nhờ phát hiện được một cặp mồi mà sau đó được đặt tên là NK16s-F và NK16s-R

khuếch đại được đoạn DNA dài 527 bps chứa các trình tự giúp phân biệt giống và loài

các vi khuẩn, phòng thí nghiệm NK-Biotek và đơn vị R&D của công ty Nam Khoa đã

xây dựng thành công qui trình PCR cho gene 16s rDNA và qui trình giải trình tự trực

tiếp sản phẩm PCR này để định danh vi khuẩn. Thành công này đã giúp phòng thí

nghiệm NK-Biotek và đơn vị R&D của Nam Khoa thực hiện được khá nhiều ứng dụng

trong các xét nghiệm dịch vụ và nghiên cứu.

96

a. Ứng dụng trong xét nghiệm vi sinh lâm sàng định danh vi khuẩn kị khí

Vi khuẩn kị khí là các vi khuẩn chỉ có thể tăng trưởng trong điều kiện khí trường

không có oxygene phân tử (O2). Vi khuẩn kị khí có thể là các vi khuẩn có lợi được sử

dụng trong công nghệ vi sinh, tuy nhiên về mặt y học rất có nhiều loài vi khuẩn kị khí

là các tác nhân nhiễm khuẩn nội sinh hay ngoại sinh. Bệnh lý nhiễm khuẩn kị khí rất đa

dạng, từ các nhiễm khuẩn tại chỗ kết hợp với các vi khuẩn không kị khí, hay các nhiễm

khuẩn hệ thống, hay các nhiễm khuẩn đặc hiệu. Do đa dạng như vậy nên việc xác định

một nhiễm khuẩn kị khí về mặt lâm sàng không phải dễ dàng. Trong khi đó xét nghiệm

vi sinh lâm sàng tại các phòng thí nghiệm thường bỏ hẳn xét nghiệm vi khuẩn kị khí vì

gặp phải nhiều trở ngại về kỹ thuật như là: (1) Có được phương tiện chuyên chở bệnh

phẩm sao cho giữ được bệnh phẩm luôn ở điều kiện kị khí cho đến khi đến được phòng

thí nghiệm. (2) Tạo khí trường kị khí để nuôi cấy phân lập được vi khuẩn kị khí từ các

bệnh phẩm. (3) Định danh cho được vi khuẩn kị khí. (4) Làm được kháng sinh đồ vi

khuẩn kị khí.

Trong các trở ngại trên, trở ngại khó giải quyết nhất là vấn đề định danh vi khuẩn

kị khí phân lập được từ các bệnh phẩm. Có nhiều bộ thử nghiệm như API 20A của Bio-

Merieux, RapIDTM ANA II của Oxoid, PRAS II (Scott), AN Ident (Analytab), ANA

card (Vitek)...có sẵn trên thị trường để cho các phòng thí nghiệm chuyên dùng cho định

danh vi khuẩn kị khí. Tuy nhiên các bộ thử nghiệm này khó có sẵn tại Việt Nam vì nhu

cầu không nhiều. Hơn nữa các bộ thử nghiệm này cũng có nhiểu hạn chế như tỷ lệ định

danh sai khá cao (19% đối với API 20A, 10% đối với RapIDTM ANA II), tỷ lệ không

thể định danh đến loài cũng nhiều (38% đối với RapIDTM ANA II, 29% đối với API

20A).

Chính vì vậy nên để có thể thực hiện được xét nghiệm vi sinh lâm sàng vi khuẩn

kị khí, phòng thí nghiệm NK-Biotek và đơn vị R&D của công ty Nam Khoa đã triển

khai một giải pháp toàn diện, bao gồm chế tạo được môi trường chuyên chở CaryBac

có thể giữ bệnh phẩm ở điểu kiện kị khí trong thời gian 24 giờ hơn cả thời gian cần

thiết để chuyển mẫu từ lâm sàng đến phòng thí nghiệm, sử dụng ổn định phương tiện

tạo khí trường kị khí bằng các túi Anaerocult A của Merck, thực hiện được kháng sinh

đồ vi khuẩn kị khí bằng bộ thử nghiệm kháng sinh đồ kị khí do đơn vị R&D nghiên

cứu và thiết kế ra. Trong định danh vi khuẩn kị khí, phòng thí nghiệm NK-Biotek và

97

đơn vị R&D của công ty Nam Khoa đã đưa ra một tiếp cận hoàn toàn mới và hiện đại,

nhưng lại ít tốn kém nhất, đó là giải pháp giải trình tự một đoạn chứa trình tự đặc hiệu

giống và loài nằm trong gene 16S của vi khuẩn.

Có thể tóm tắt qui trình như sau: Vi khuẩn mọc trên hộp thạch phân lập được gặt

vào nước muối sinh lý vô khuẩn để đạt độ đục 0.5 – 1 McF. Sau đó đun cách thủy sôi

trong 10 phút. Để nguội rồi ly tâm 13.000RPM trong 5’. Lấy 5µl dịch nổi cho vào PCR

mix 45µl chứa sẵn các thành phần kể cả cặp mồi NK16s-F và NK16s-R khuếch đại đoạn

DNA dài 527 bps chứa trình tự đặc hiệu loài trên gene 16S của vi khuẩn. Chạy chương

trình nhiệt PCR gồm 1 chu kỳ 95oC/5’ để kích hoạt enzyme hot start Taq polymerase,

rồi 40 chu kỳ 94oC/15”-60oC/30”-72oC/1’. Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch bằng

bộ “Wizard SV Gel and PCR clean-up Sytem” của Promega. Sản phẩm tinh sạch được

điện di trên thạch và sau đó định lượng bằng quang phổ GenQuant của Pharmacia, sau

đó được đưa vào phản ứng giải trình tự 2 chiều sử dụng mồi xuôi và mồi ngược của

PCR thực hiện trên bộ thuốc thử “DTCS cycle sequencing kit” của Beckman Coulter.

Chương trình luân nhiệt của phản ứng giải trình tự với bộ thuốc thử trên là 30 chu kỳ

96oC/20”-50oC/20”-60oC/4’. Sản phẩm của phản ứng giải trình tự được tủa bằng

ethanol, rồi sau đó được chạy điện di giải trình tự trên máy giải trình tự CEQ8000. Kết

quả giải trình tự được so chuỗi bằng chương trình blast search trên ngân hàng dữ liệu

gene của NCBI. Từ kết quả so chuỗi, chúng ta sẽ có được kết quả định danh vi khuẩn.

Sau này, với các trang bị thêm như điện di bằng DNA chip của Bio-analyzer và máy

giải trình tự ABI 3130XL 16 capillary, qui trình của phản ứng giải trình tự và điện di

giải trình tự cũng đã được nghiên cứu để tương thích với các trang bị này. Cụ thể là

thay vì điện di trên gel rồi định lượng bằng quang phổ 260/280 thì kết hợp cả hai bằng

điện di và định lượng trên Bio-analyzer DNA chip của Agilent; thay vì dùng DTCS để

là phản ứng giải trình tự thì dùng “BigDye Terminator V. 3.1 Cycle Sequencing kit”

của ABI với chương trình luân nhiệt của phản ứng giải trình tự là trước hết 1 chu kỳ

96oC/1’, theo sau 25 chu kỳ 96oC/10”-50oC/5”-60oC/4’. Sản phẩm của phản ứng giải

trình tự sau khi tủa bằng ethanol, được chạy điện di giải trình tự trên máy giải trình tự

ABI 3130XL với gel POP 7 và mao quản 50cm. Hình 48 là một kết quả định danh

bằng giải trình tự 16s rDNA vi khuẩn kị khí phân lập từ mẫu mủ xoang của bệnh nhân.

Phòng thí nghiệm NK biotek đã áp dụng tiếp cận này trong năm 2008 cho xét nghiệm

98

Hình 48: Kết quả giải trình tự 16s rDNA trực khuẩn Gram [+] phân lập kị khí từ bệnh phẩm mũ xoang lấy từ bệnh nhân cho phép kết luận đây là Propionibacterium acnes

vi sinh lâm sàng vi khuẩn kị khí với các mẫu bệnh phẩm là 39 mẫu mủ xoang lấy từ

bệnh nhân bị viêm xoang mạn tính. Kết quả xét nghiệm cho thấy có 31% (18/59) cấy ra

tác nhân vi khuẩn kị khí và kết quả định danh bằng phương pháp giải trình tự 16s

rDNA cho thấy có 11% (2/18) Veillonella (cầu khuẩn Gram -), 17% (3/18) Prevotella

buccae (trực khuẩn Gram -), 22% (4/18) là Propionibacterium acnes, 6% (1/18) là

Streptococcus aginosus, 17% (3/18) là Streptococcus constellatus, 17% (3/18) là

Streptococcus gordonii, 6% (1/18) là Peptostreptococcus micros, và 6% (1/18) là

Peptostreptococcus stomatis. Kết quả này cho thấy PCR và giải trình tự 16s rDNA là

một giải pháp kỹ thuật hoàn toàn có thể sử dụng để định danh vi khuẩn kị khí, giải

quyết được khâu kỹ thuật phức tạp và khó khăn nhất trong qui trình xét nghiệm vi sinh

lâm sàng vi khuẩn kị khí.

b. Phát hiện chất lượng các sản phẩm probiotic cho người và cho thủy sản

Probiotic chính là các vi sinh vật không gây bệnh, được dùng làm sản phẩm trợ

sinh qua đường ăn hay uống sử dụng trên người, gia súc, hay thủy sản để phát huy hiệu

quả chống lại các nhiễm trùng nhờ các cơ chế như cạnh tranh chất dinh dưỡng và chổ

99

bám của vi sinh vật gây bệnh, phục hồi vi khuẩn chí bình thường cho ruột hay cho môi

trường, kích thích hệ thống miễn dịch không đặc hiệu của cơ thể vật chủ chống lại vi

sinh vật gây bệnh, hay tiết ra các chất có tính kháng sinh kháng được các vi sinh vật

gây bệnh.

Các vi khuẩn thường được dùng làm probiotic là Bacillus subtilis, Lactobacillus

acidophilus, Bifidobacterium...và thường được cung cấp dưới dạng bột ghi hàm lượng

và các loại vi khuẩn có trong sản phẩm. Do các vi khuẩn này thường là các vi khuẩn dễ

mọc nên chỉ với các phương tiện phòng thí nghiệm và các môi trường nuôi cấy thông

thường là có thể sản xuất được các sản phẩm probiotic nên hiện nay trên thị trường của

chúng ta xuất hiện khá nhiều sản phẩm probiotic được sản xuất từ rất nhiều cơ sở trong

và ngoài nước để sử dụng không chỉ cho gia súc, thủy sản mà cả cho người. Chính vì

tình trạng này nên có một vấn đề mà nhiều người rất quan tâm, đó là liệu chất lượng

của các sản phẩm probiotic hiện đang có mặt trong thị trường có thật sự đúng như nhà

sản xuất công bố hay không, đặc biệt là liệu các vi khuẩn được ghi trong nhãn hiệu sản

phẩm có đúng là vi khuẩn có trong sản phẩm hay không, và hàm lượng có đảm bảo

đúng như vậy hay không.

Để trả lời câu hỏi trên, trong năm 2008 phòng thí nghiệm NK-Biotek và bộ phận

R&D của Nam Khoa đã hướng dẫn một số đề tài tốt nghiệp luận văn Thạc Sĩ có nội

dung tìm hiểu chất lượng các sản phẩm probiotic dùng cho người và thủy sản hiện

đang lưu thông trên thị trường. Để kiểm tra hàm lượng thì giải pháp kỹ thuật không

khó, chỉ cần thực hiện cấy định lượng bằng phương pháp thạch đổ hay phương pháp

láng trên bề mặt môi trường dinh dưỡng và ủ ở điều kiện thích hợp là có thể cho được

kết quả định lượng chính xác hàm lượng vi khuẩn đích có trong mẫu sản phẩm cần

phải kiểm tra. Tuy nhiên để xác định chính xác tên vi khuẩn có trong sản phẩm có

đúng như tên được nêu trong nhãn sản phẩm hay không lại là một vấn đề không đơn

giản vì các vi khuẩn probiotic như B. subtilis, L. acidophilus...không phải là các vi

khuẩn dễ dàng được định danh đến loài nếu chỉ dựa vào các tính chất sinh vật hóa học.

Chính vì vậy, chúng tôi đã giải pháp PCR và giải trình tự gene 16s rDNA của vi khuẩn

phân lập được từ các sản phẩm probiotic để xác định danh tính của vi khuẩn. Kết quả

cho thấy có khá nhiều loại sản phẩm probiotic sử dụng cho người và cho thủy sản có

vấn đề về mặt chất lượng cả về hàm lượng lẫn về vi khuẩn thật sự có trong sản phẩm.

100

Bảng 13 và 14 trình bày kết quả cho thấy sự khác biệt giữa vi khuẩn thật sự có trong

sản phẩm probiotic so với kết quả được nhà sản xuất công bố trên nhãn.

STT Tên sản phẩm Tên vi khuẩn trên nhãn sản phẩm Kết quả PCR và giải trình tự 16sDNA

1 Biosubtyl DL Bacillus subtilis 107/gr Bacillus subtilis 106/gr

2 Bidisubtilis (gói giấy) Bacillus subtilis 108/gr Bacillus cereus 107/gr

3 Bidisubtilis (gói nhôm) Bacillus subtilis 108/gr Bacillus subtilis 106/gr

4 Bio – Acimin Bacillus subtilis 108/gr Bacillus cereus 107/gr

5 Biosubtyl II (gói) Bacillus subtilis 107/gr Bacillus pumilus 107/gr

6 Biosubtyl II (viên) Bacillus subtilis 108/gr Bacillus subtilis 108/gr

7 Subtyl Bacillus subtilis 107/gr Bacillus cereus 107/gr

8 Medilac – Vita Bacillus subtilis 106/gr Bacillus cereus 106/gr

9 Bio Baby Bacillus subtilis 106/gr Bacillus subtilis 106/gr

10 Bio Vita Bacillus subtilis 106/gr Bacillus subtilis 106/gr

Bảng 13: Kết quả định danh bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự 16s rDNA và kết quả định lượng các vi khuẩn thật sự có trong các probiotic sử dụng trên người

STT Tên sản phẩm Tên và lượng* vi khuẩn trên nhãn sản phẩm

Kết quả định danh và định lượng* thực tế

1 DT-LACTO Bacillus subtilis Lactobacillus acidophilus

Bacillus pumilus Không tìm thấyL. acidophilus

2 Bio-DW Bacillus subtilis 109/gr Lactobacillus acidophilus

Bacillus subtilis 106/gr Không tìm thấyL. acidophilus

3 Probiotex-one Bacillus subtilis B. megaterium

4 Vime-Subtyl Bacillus subtilis 1011/gr Bacillus subtilis 104/gr

5 Biozyme for fish Bacillus subtilis 109/gr Bacillus subtilis 106/gr

6 Novazyme F Bacillus subtilis 109/gr Bacillus subtilis 105/gr

7 Subtyl-LA Bacillus subtilis Bacillus pumilus

8 NPV-Prozyme 90 Bacillus subtilis 106/gr Lactobacillus acidophilus

Bacillus subtilis Không tìm thấyL. acidophilus 106/gr

9 ProKura Bacillus subtilis 109/gr Bacillus subtilis 107/gr

10 Men gấu vàng Bacillus subtilis Lactobacillus acidophilus

Bacillus cereus Không tìm thấyL. acidophilus

11 Biobac Bacillus subtilis Bacillus pumilus

12 Pond clear Bacillus subtilis 1011/gr Lactobacillus acidophilus

Bacillus subtilis 105/gr Không tìm thấyL. acidophilus

13 Bio Pond Bacillus subtilis 108/gr Lactobacillus acidophilus

Bacillus subtilis 105/gr Không tìm thấyL. acidophilus

14 Men Bac Bacillus subtilis Lactobacillus acidophilus

Bacillus cereus Không tìm thấyL. acidophilus

15 Microzyme Bacillus subtilis ? Lactobacillus acidophilus

Bacillus subtilis 105/gr Không tìm thấyL. acidophilus

16 Zymmix Lactobacillus acidophilus Acidovorax sp.

17 Lactovet Lactobacillus acidophilus Clostridium phylofermentant

18 Zeofarm Lactobacillus acidophilus 109/gr L. acidophilus 106/gr

*Chỉ nêu lên lượng các vi khuẩn mà định danh bằng PCR và giải trình tự cho thấy kết quả không sai lệch

Bảng 14: Kết quả định danh bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự 16s rDNA và kết quả định lượng* các vi khuẩn thật sự có trong các probiotic sử dụng cho thủy sản

101

Phân tích các dữ kiện trình bày trong hai bảng trên, chúng ta thấy đối với các sản

phẩm probiotic dùng cho người, sự sai biệt về hàm lượng giữa kết quả kiểm tra so với

công bố trên nhãn không nhiều (không quá 10 lần), nhưng có đến 50% tên vi khuẩn

công bố không đúng với kết quả định danh. Thậm chí có đến 4 sản phẩm lại sử dụng B.

cereus, vi khuẩn không được phép có mặt trong thực phẩm vì có khả năng gây tiêu

chảy và ói mữa do có thể chứa các toxin, làm vi khuẩn trợ sinh. Đối với các sản phẩm

probiotic dùng cho thủy sản, kết quả kiểm tra cho thấy đối với vi khuẩn B. subtilis, có

6/15 mẫu không phải là B. subtilis mà là B. cereus hay B. pumilus; và chỉ có một sản

phẩm là có chứa L. acidophilus còn hầu hết là không tìm thấy vi khuẩn này như công

bố trên nhãn. Hình 49 minh họa một kết quả giải trình tự gene 16s rDNA xác định vi

khuẩn là B. cereus trong khi nhãn sản phẩm lại là B. subtilis. Còn về mặt hàm lượng thì

thật thảm hại, trong các các sản phẩm được kiểm tra thật sự có vi khuẩn như công bố

thì đa số hàm lượng tụt giảm từ 104 đến 105 so với công bố. Kết quả của nghiên cứu là

một tiếng chuông báo động để các nhà sản xuất cũng như các cơ quan kiểm tra chất

Hình 49: Một chủng vi khuẩn phân lập từ một sản phẩm probiotic nếu chi dựa vào tính chất khuẩn lạc và nhuộm Gram thì không thể biết đây không phải là B. subtilis, nhưng khi giải trình tự 16s rDNA thì xác định được đây là B. cereus.

102

lượng nên quan tâm đến vấn đề chất lượng của các sản phẩm probiotic sử dụng cho

người và thủy sản hiện đang lưu hành tại Việt Nam; và để kiểm tra được chất lượng

các sản phẩm probiotic thì phải sử dụng PCR và giải trình tự gene 16s rDNA vì chỉ có

giải pháp này mới có thể định danh chính xác vi khuẩn được sử dụng làm probiotic,

tránh nhầm lẫn với các vi khuẩn không có tác dụng probiotic hay thậm chí có thể độc

hại.

Hình 50: Một phiếu lý lịch 16s rDNA của một chủng vi khuẩn dùng trong kiểm chuẩn với các thông tin về tính chất khuẩn lạc, hình ảnh Gram, các tính chất sinh hóa cơ bản, và quan trọng nhất là trình tự gene 16s rDNA

103

c. Xây dựng lý lịch 16s rDNA của các chủng vi khuẩn dùng trong kiểm chuẩn

Trong nội kiểm hay ngoại kiểm vi sinh, rất cần thiết phải dùng các chủng vi sinh

có lý lịch định danh chủng chính xác. Các phòng thí nghiệm vi sinh thường yêu cầu

cung cấp các chủng quốc tế với lý lịch xuất phát từ nhà cung cấp chủng. Hiện nay rất

khó để có thể đạt mua các chủng gốc quốc tế vì vấn đề nguy cơ khủng bố sinh học.

Chính vì vậy giải pháp hay nhất hiện nay là sử dụng các chủng gốc quốc tế hiện đang

lưu giữ tại các phòng thí nghiệm, thậm chí sử dụng các chủng gốc phân lập được

nhưng phải có lý lịch dịnh danh chính xác đến loài. Đứng trước yêu cầu này, phòng thí

nghiệm NK-Biotek và đơn vị R&D của Nam Khoa đã xây dựng lý lịch 16s rDNA của

tất cả các chủng quốc tế ATCC, cũng như một số chủng phân lập được và tiêu biểu cho

các giống và loại vi khuẩn cần cho kiểm chuẩn. Hình 50 minh họa một lý lịch 16s

rDNA của 1 chủng vi khuẩn được phòng thí nghiệm NK-Biotek và đơn vi R&D của

Nam Khoa để cung cấp dùng trong kiểm chuẩn.

Hình 51: Một kết quả định danh bằng PCR và giải trình tự 16s rDNA của một chủng vi sinh công nghiệp cho thấy đây là Acrobacterium tumefaciens, là vi khuẩn rất khó định danh bằng vi sinh kinh điển

104

d. Làm xét nghiệm dịch vụ định danh vi khuẩn

Cũng với công nghệ PCR và giải trình tự 16s rDNA của vi khuẩn, phòng thí

nghiệm NK-Biotek và đơn vị R&D của Nam Khoa đã và đang thực hiện dịch vụ định

danh các vi khuẩn được dùng trong vi sinh công nghiệm cũng như vi sinh nông nghiệm

được gửi đến từ các công ty, nhà máy, hay từ các yêu cầu của các đề tài nghiên cứu.

Mẫu được gửi đến để định danh có thể là các chủng vi khuẩn cấy trên môi trường nuôi

cấy, hay là các dịch tách chiết DNA, hay huyền dịch vi khuẩn. Có thể nói với giải pháp

kỹ thuật PCR và giải trình tự gene 16s rDNA, các vi khuẩn dù lạ đến đâu, dù khó định

danh đến đâu cũng đều được định danh đến loài. Hình 51 là kết quả một chủng vi

khuẩn dùng trong vi sinh công nghiệm được yêu cầu định danh, và kết quả định danh

cho thấy đây là vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.

2. Ứng dụng kỹ thuật PCR và giải trình tự để định danh vi nấm

Trong các xét nghiệm vi sinh thì định danh vi nấm có lẽ là một trở ngại lớn nhất vì

nếu sử dụng các phương pháp kinh điển thì không chỉ phân tích hình thái đại thể và vi

thể, vốn dĩ phức tạp và công phu, mà còn phải làm cho được các khảo sát sinh vật hóa

học khác như đồng hóa đường, phân tích các chất biến dưỡng...Chính vì vậy thông

thường ít có phòng thí nghiệm vi sinh làm được xét nghiệm vi nấm.

Nhận diện được trở ngại kỹ thuật chính yếu này, phòng thí nghiệm NK-Biotek và

đơn vị R&D công ty Nam Khoa đã cố gắng tìm giải pháp vượt qua, và sau một thời

gian nghiên cứu - thử nghiệm, đã xây dựng được một giải pháp kỹ thuật đó là sử dụng

PCR và giải trình tự gene 28s rDNA. Nguyên tắc của giải pháp này là sử dụng bộ NKFUNGI-DNAPREP do đơn vị R&D của công ty Nam Khoa chế tạo để tách chiết

DNA toàn phần từ mẫu vi nấm hay mẫu thử chứa vi nấm cần định danh, sau đó sử

dụng PCR với một cặp mồi được đặt tên là NK28s-F và NK28s-R đặc hiệu một đoạn

DNA dài khoảng 260 bps có chứa các trình tự đặc hiệu giống và loài của vi nấm trên

gene 26s rDNA, và sau cùng là giải trình tự trực tiếp và 2 chiều sản phẩm PCR để định

danh vi nấm qua blast search trên ngân hàng dữ liệu gene của NCBI.

Ứng dụng giải pháp kỹ thuật này, phòng thí nghiệm NK-Biotek và đơn vị R&D

của công ty Nam khoa đang thực hiện rất thành công hai dịch vụ, đó là:

105

Cand ida orthopsilosis1 (2%)

M alassezia rest rict a 2 (3%)

Rhinocladiella at rovirens3 (5%)

Penicit rium cit rinum3 (5%)

X ylaria curta1 (2%)

Schizophyllum cominune1 (2%)

Pichia guilliermondii1 (2%)

Pseudallescheria boydi4 (7%)

A spergillus f lavus2 (3%)

A spergillus oryzae11 (19%)

Aspergillus fumigatus23 (40%)

Aspergillus niger4 (7%)

Neosartorya f ischeri 2 (3%)

Biểu đồ 12: Tổng kết các kết quả phát hiện và định danh nấm bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự 28s rDNA trong các mẫu bi nấm lấy từ mổ viêm xoang trên bệnh nhân

a. Phát hiện và định danh vi nấm trong các bi nấm lấy ra từ phẫu thuật bệnh nhân

viêm xoang

Trước đây, các bệnh phẩm bi nấm (fungus ball) thường được các bác sĩ tai mũi

họng gửi đến phòng thí nghiệm giải phẩu bệnh và kết quả thường được nhận về sau 1

tuần là nhìn thấy vi thể các sợi tơ nấm nghi Aspergillus. Hiện nay với xét nghiệm PCR

và giải trình tự được thực hiện tại phòng thí nghiệm NK-biotek thì các nhà lâm sàng sẽ

có kết quả sau 2 ngày với định danh vi nấm đến loài. Biểu đồ 12 tổng kết các kết quả

phát hiện và định danh vi nấm trong các bi nấm được bệnh viện Tai Mũi Họng TP.Hồ

Chí Minh gửi đến trong thời gian gần đây. Có tổng cộng 58 mẫu được gửi đến làm xét

nghiệm, và cả 58 đều phát hiện và định danh được vi nấm là tác nhân gây bệnh.

b. Dịch vụ định danh vi nấm

Trên cơ sở của kỹ thuật PCR và giải trình tự gene 28s rDNA, phòng thí nghiệm

NK-Biotek và đơn vị R&D của công ty Nam Khoa triển khai được xét nghiệm dịch vụ

định danh vi nấm với các nguồn mẫu là từ các công ty, nhà máy trong lĩnh vực công

nông nghiệp, hay là từ các phòng thí nghiệm của các trường đại học hay của các trung

tâm nghiên cứu. Có thể nói là cho đến nay, hầu như không có mẫu vi nấm nào gửi đến

phòng thí nghiệm NK-Biotek là không có kết quả định danh. Hình 52 và hình 53 minh

họa hai kết quả định danh nấm trong xét nghiệm dịch vụ định danh vi nấm của NK-

Biotek.

106

3. Ứng dụng PCR và giải trình tự để phát hiện, định lượng và xác định genotype

HCV

Phát hiện, định lượng và xác định genotype HCV là các thông số mà bác sĩ cần

phải biết trước khi cho chỉ định điều trị đặc hiệu bằng interferon phối hợp với ribavirin

là phát đồ điều trị chuẩn cho bệnh nhân có antiHCV [+]. Phát hiện HCV-RNA để xác

định là bệnh nhân đang nhiễm HCV, định lượng HCV-RNA là để xác định lượng virus

trước khi bắt đầu điều trị và làm cơ sở để theo dõi hiệu quả điều trị, còn xác định

genotype HCV là để giúp bác sĩ điều trị quyết định được thời gian điều trị cho bệnh

nhân. Thông thường các phòng thí nghiệm lâm sàng sẽ phải thực hiện các yêu cầu này

riêng lẽ, nghĩa là họ phải phát hiện HCV-RNA trước, rồi mới định lượng, và cuối cùng

Hình 52: Vi nấm có hình dạng vi thể hình hạt men như góc trên trái cho kết quả PCR và giải trình tự 28s rDNA như bên dưới, và từ trình tự này kết quả blast search trên ngân hàng gene NCBI cho kết quả định danh Candida tropicalis với độ tương đồng 99%.

Hình 53: Vi nấm có hình dạng vi thể hình que dài như góc trên trái cho kết quả PCR và giải trình tự 28s rDNA như bên dưới, và từ trình tự này kết quả blast search trên ngân hàng gene NCBI cho kết quả định danh Rhinocladiella atrovirens với độ tương đồng 99%.

107

mới định genotype HCV và thường thì

do yêu cầu kỹ thuật nên các xét

nghiệm này đều phải bắt đầu từ mẫu

huyết thanh của bệnh nhân. Công ty

Nam Khoa lại sử dụng một tiếp cận

khác rất mới mẽ, tiện lợi, và ít tốn kém

hơn để phát triển một giải pháp toàn

diện thực hiện được các yêu cầu này

của bác sĩ cùng một lúc. Đó là giải

pháp sử dụng RT real-time PCR để

phát hiện và định lượng HCV-RNA

trong mẫu huyết thanh bệnh nhân và

sau đó giải trình tự trực tiếp sản phẩm

real-time PCR để xác định genotype

HCV bằng cách so chuỗi trình tự giải

được với ngân hàng dữ liệu genotype

HCV trên thư viện NCBI và thư viện

Los Alamos.

Để xác định genotype HCV, ngoài

lý do là một mắt xích của giải pháp

toàn diện như đã nêu ở trên, công ty

Nam Khoa chọn tiếp cận giải trình tự

vì còn có nhiều lý do: (1) Nếu sử dụng

kit InoLIPA của Siemen (Bayer) là kit

được các nhà y học thừa nhận thì sẽ là

một lựa chọn khá tốn kém vì giá thành

của kit này khá cao, kết quả có đôi khi

không phân biệt được subtype, và với

version cũ thì có sự nhầm lẫn giữa 6a và 1b; (2) Nếu sử dụng kỹ thuật giải trình tự

vùng 5’NC của HCV bằng hệ thống giải trình tự kín Trugene của Siemen (Bayer) dù

rất được nhiều nhà y học thừa nhận, nhưng cũng sẽ là một lựa chọn tốn kém vì giá

Yêu cầu xác định

genotype HCV

Định lượng HCV-RNA bằng xét nghiệm

RT-qPCR sử dụng kit NKRT-HCVqPCR

Xác định genotype HCV: giải trình tự trực tiếp sản phẩm HCVqPCR (#200bp trên vùng 5’NC)

ABI 3130XL (16 capillaries)

CEQ8000 (8 capillaries)

KẾT QUẢ 24 giờ sau khi nhận mẫu

Định lượng 37.017 copies/ml

Kiểu gene 1c

Hình 54: Qui trình RT-realtime PCR và giải trình tự vùng 5’NC để phát hiện, định lượng và định genotype HCV

108

Biểu đồ 13: Phân bố các genotype HCV trong 2000 mẫu huyết thanh bệnh nhân nhiễm HCV được gửi đến xét nghiệm tại phòng thí nghiệm NK-Biotek trong năm 2008

thành của các vật liệu tiêu hao đi kèm theo hệ thống này rất cao; (3) Sử dụng phương

pháp real-time PCR với các probe đặc hiệu là một tiếp cận đơn giản và rẻ tiền nhưng

không đủ nhạy cảm cho chẩn đoán vì vùng khuếch đại không phải là vùng 5’ NC (là

vùng được công nhận là nhạy cảm nhất cho chẩn đoán), không có khả năng phân biệt

cao các subtype thường gặp vì khó thiết kế được các probe đặc hiệu đến subtype, và

nguy cơ phát hiện chéo không đặc hiệu mà vẫn được lầm tưởng là có khả năng phát

hiện đồng nhiễm.

Chính vì các lý do trên, Phòng thí Nghiệm Y Khoa NK-BIOTEK và công ty Nam

Khoa đã nghiên cứu và xây dựng được phương pháp xét nghiệm xác định genotype

HCV bằng kỹ thuật giải trình tự vùng 5’NC của HCV nhưng thay vì sử dụng hệ thống

giải trình tự kín của Trugene, sử dụng hệ thống giải trình tự mở của ABI (máy ABI

3130XL có 16 mao quản) hay của Beckman Coulter (máy CEQ8000 có 8 mao quản).

Tiếp cận này đã mang đến cho bệnh nhân và các nhà lâm sàng nhiều lợi điểm: (1) Nhờ

giải trình tự trực tiếp được sản phẩm PCR từ real-time PCR sử dụng mồi và taqman

probe đặc hiệu vùng 5’NC nên kết quả xét nghiệm xác định genotype luôn đi kèm với

kết quả định lượng HCV-RNA. Do vậy các nhà lâm sàng trước khi quyết định điều trị

đặc hiệu cho bệnh nhân chỉ cần cho một chỉ định xét nghiệm xác định genotype HCV

là đủ mà không cần cho thêm xét nghiệm định lượng. (2) Đạt được độ nhạy cho chẩn

đoán nhờ sản phẩm đích để giải

trình tự xác định genotype HCV

chính là sản phẩm PCR dựa trên

vùng đích 5’NC là vùng duy nhất

trên genome HCV được thừa

nhận là đủ nhạy cảm để làm chẩn

đoán xác định và định lượng

HCV. (3) Đạt được độ chính xác

trong xác định genotype HCV

không khác biệt với hệ thống giải

trình tự kín Trugene nhờ giải

trình tự đúng ngay đoạn đích mà hệ thống Trugene sử dụng trên vùng 5’-NC của

genome HCV. (4) Nhà lâm sàng hay nghiên cứu còn được cung cấp thông tin về trình

109

tự vùng 5’NC đã giải được và các thông tin này rất quí giá trong các nghiên cứu về

phylogenetic để góp phần trong nghiên cứu nguồn gốc nhiễm trùng hay nghiên cứu

đồng nhiễm HIV/HCV.

Hình 54 tóm tắt qui trình phát hiện, định lượng và định genotype HCV bằng kỹ

thuật RT real-time PCR trên đích là vùng 5’ NC của bộ gene HCV rồi sau đó giải trình

tự trực tiếp sản phẩm PCR để xác định genotype HCV. Trong năm 2008, tổng kết 2000

mẫu xét nghiệm định genotype HCV thực hiện tại phòng thí nghiệm NK-Biotek, chúng

tôi nhận thấy đa số genotype của HCV nhiễm trên bệnh nhân là 1b (58%), kế đó là 6a

(17%). Biểu đồ 13 tổng kết sự phân bố các genotype HCV trong 2000 mẫu huyết thanh

bệnh nhân nhiễm HCV được gửi đến xét nghiệm tại phòng thí nghiệm NK-Biotek

trong năm 2008.

4. Áp dụng PCR và giải trình tự để phát hiện đột biến kháng thuốc của HBV

Hiện nay tại Việt Nam, nhờ các tiến bộ về kỹ thuật sinh học phân tử định lượng

được HBV để làm cơ sở đánh giá hiệu quả điều trị; và phát đồ cũng như các thuốc có

khả năng điều trị bệnh viêm gan virus B mạn tính luôn có sẵn trên thị trường để bác sĩ

dễ dàng lựa chọn, nên việc điều trị đặc hiệu cho bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính

đã phổ biến hơn. Tuy nhiên, điều trị đặc hiệu bệnh lý viêm gan virus B mạn tính bằng

các thuốc kháng virus là một điều trị lâu dài. Chính vì vậy nên HBV (virus viêm gan B,

hepatitis B virus) có cơ hội tiếp xúc lâu dài với các thuốc kháng virus và tạo được các

đột biến kháng thuốc, và từ đấy nảy sinh ra yêu cầu phải có xét nghiệm phát hiện các

đột biến kháng thuốc của HBV, đặc biệt đối với các thuốc như lamivudine, adefovir và

entecavir là các thuốc thường được sử dụng hiện nay.

Để phát hiện đầy đủ các đột biến kháng các thuốc nêu trên, nếu chọn tiếp cận real-

time PCR hay PCR-RFLP thì chỉ có thể phát hiện được rất ít đột biến kháng thuốc của

HBV vì có quá nhiều các biến thể của HBV đã làm cho việc thiết kế các probe phát

hiện đột biến hay thiết kế các vị trí để enzyme cắt giới hạn nhận diện bị khó khăn rất

nhiều. Hơn nữa cho đến hiện nay, y văn chỉ mới báo cáo có real-time PCR và PCR-

RFLP phát hiện đột biến kháng lamivudine ở hai vị trí 180 và 204 trong khi đó còn

nhiều đột biến nữa không chỉ tạo cho virus kháng lamivudine, mà cả adefovir và

entecavir nữa. Chọn tiếp cận như vậy chắc chắn sẽ không đáp ứng được thực tế.

110

Do vậy phòng thí nghiệm NK-

BIOTEK và công ty Nam Khoa đã

chọn một tiếp cận khác dựa trên

phương tiện và trang thiết bị hiện

đại đang có ở công ty, đó chính là

tiếp cận PCR và giải trình tự một

đoạn DNA dài 550 bps trên vùng

gene preS để làm xét nghiệm phát

hiện các đột biến kháng

Lamivudine, Adefovir và

Entecavir. Xét nghiệm dựa trên tiếp

cận này hiện nay đang được nhiều

nhà lâm sàng và nghiên cứu y học

tin cậy nhờ các ưu điểm sau: (1)

Phát hiện được hầu hết các vị trí

đột biến có thể xảy ra để gây ra

kháng 3 loại thuốc trên; (2) Với độ

nhạy cảm của thiết bị giải trình tự

hiện nay (sequencer ABI 3130XL,

giải hai chiều), không chỉ tất cả các

điểm đột biến kể trên đều được giải

đến, mà cả tình trạng heterozygote

của đột biến/hoang dại vẫn được

phát hiện; (3) Với trình tự giải

được, kết quả xét nghiệm còn cung

cấp thông tin một cách chính xác

về genotype của HBV mà không

cần phải có chỉ định xét nghiệm

này từ lâm sàng. Hình 55 mô tả qui trình xét nghiệm PCR và giải trình tự gene preS để

phát hiện các đột biến kháng thuốc và xác định genotype HBV, trong đó kết quả phát

hiện đột biến được trình bày trong một bảng liệt kê các vị trí đột biến đột biến kháng

Yêu cầu tìm đột biến kháng thuốc của HBV

PCR khuếch đại đọan đặc hiệu 550bps trên vùng

gene preS của HBV

Tìm đột biến kháng thuốc: giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR 550bps từ vùng gene preS

ABI 3130XL (16 capillaries)

KEÁT QUAÛ (24 giôø sau khi nhaän maãu)

Genotype Genotype C

Phát hiện đột biến

TAATTTGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCTTGTCCTCCAATTTGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTACCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTACTTCCAGGAACATCAACTACCAGCACGGGACCATGCAAGACCTGCACGATTCCTGCTCAAGGAACCTCTATGTTTCCCTCTTGTTGCTGTACAAAACCTTCGGACGGAAATTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCTTGGGCTTTCGCAAGATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAACATCTTGAATCCCTTTTTACCGCTGT

Kháng Lamivudine

KQ

Kháng Adefovir

KQ

Kháng Entecavir

KQ

I169T K L80V/I K T184G K V173L K S85A K S202I K L180M Coù V84M K M250V K A181T K A181V/T K T184S K V214A K M204I Coù Q215S K

V207M/I K N236T K Q215S K

Hình 55: Qui trình xét nghiệm phát hiện đột biến kháng thuốc và xác định genotype của HBV bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự một đọan DNA 550 bps trên gene PreS của HBV

111

lamivudine, adefovir và entecavir đã được các nhà nghiên cứu ghi nhận và tất cả các vị

trí đột biến này đều nằm trong trình tự được

giải.

Trong năm 2008, phòng thí nghiệm

NK-Biotek của công ty Nam Khoa đã thực

hiện được 455 xét nghiệm PCR và giải trình

tự vùng gene PreS của HBV, kết quả cho

thấy có đến 69% các trường hợp là thuộc

genotype B và 31% là genotype C, không

có các genotype khác. Có 46% phát hiện có

đột biến kháng lamivudine với 30% ở vị trí

204, 9% ở hai vị trí 204 và 207, 6.5% ở 204 và 180, và 0.5% đột biến cả 204, 180 và

207. Kết quả này được trình bày trong biểu đồ 14.

5. Áp dụng PCR và giải trình tự phát hiện đột biến precore/ promoter và genotype

HBV

Trong quá trình phản ứng với các đáp ứng miễn dịch từ bệnh nhân, HBV có thể bị

đột biến precore và đột biến core promoter. Đột biến precore là đột biến tại vị trí

nucleotide 1896 từ G thành A (G1896A) làm cho codon TGG trở thành TAG là một

stop codon. Đột biến này đã làm cho HBV không thể tổng hợp được HBeAg. Do vậy,

khi thử máu bệnh nhân, không phát hiện được HBeAg mà HBV-DNA vẫn tồn lại cùng

với HBeAb [+]. Đây là một đột biến rất quan trọng cần phải được phát hiện vì bệnh

nhân sẽ có nguy cơ cao vào xơ gan hay ung thư gan, đặc biệt khi phát hiện được thêm

đột biến core promoter tại hai vị trí nucleotide 1762 và 1764 (A1762T, G1764A). Khi

bệnh nhân bị phát hiện mang HBV có các đột biến này thì phải được điều trị bằng

thuốc kháng virus suốt đời. Chính vì tầm quan trọng đối với lâm sàng như vậy nên

trong thời gian qua phòng thí nghiệm NK-BIOTEK & công ty Nam Khoa đã xây dựng

được kỹ thuật PCR và giải trình tự vùng gene core để làm xét nghiệm phát hiện đột

biến precore và đột biến core promoter và không chỉ vậy, còn cho biết thêm về

genotype HBV. Hình 56 minh họa qui trình này.

Xét nghiệm này hiện nay đang được nhiều nhà lâm sàng và nghiên cứu y học quan

tâm và tin cậy. Trong năm 2008, phòng thí nghiệm NK-Biotek và công ty Nam Khoa

29.89

8.796.59

0.45

54.28

0

10

20

30

40

50

60

204 204+207 204+180 204+180+207 Khoâng ÑB

Biểu đồ 14: Sự phân bố tỷ lệ các vị trí đột biến kháng lamivudine phát hiện được

112

đã thực hiện 134 mẫu xét nghiệm đột

biến precore và core promoter của

HBV trên các bệnh nhân bị bác sĩ điều

trị nghi ngờ có đột biến precore/core

promoter. Kết quả cho thấy có đến 73%

phát hiện đột biến với nhiều kiểu đột

biến khác nhau, có thể chỉ đột biến

precore, có thể chỉ đột biến core

promoter, có thể đột biến cả promoter

và core promoter. Các thông tin này sẽ

rất hữu dụng để các nhà y học có thể

nghiên cứu sâu hơn về mối liên hệ với

lâm sàng, bệnh học và sinh bệnh học.

Biểu đồ 15 trình bày tỷ lệ phân bố các

kiểu đột biến phát hiện được.

6. PCR và giải trình tự phát hiện đột

biến kháng rifampicine và INH

của M. tuberculosis

Từ năm 1996, chúng tôi đã bắt đầu

triển khai kỹ thuật PCR phát hiện M.

tuberculosis và cho đến hiện nay xét

nghiệm PCR phát hiện M. tuberculosis

do chúng tôi phát triển này đã được các

nhà y học trong nước chấp nhận nhờ độ

nhạy cảm rất cao so với khảo sát trực

tiếp và nuôi cấy. Với PCR, kết quả phát

hiện M. tuberculosis có thể đến tay nhà

lâm sàng chỉ 24 giờ sau khi gửi mẫu đi

xét nghiệm. Nhờ ưu điểm nhanh chóng

và nhạy cảm nên có thể nói công cụ

PCR đã mang đến một lợi ích không

Yêu cầu tìm đột biến

precore/promoter của HBV

PCR khuếch đại đọan đặc hiệu 250bps trên vùng

gene core của HBV

Tìm đột biến precore/promoter: giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR 250bps từ vùng gene core

ABI 3130XL (16 capillaries) hay CEQ8000 (6 capillaries)

KẾT QUẢ (24 giờ sau khi nhận mẫu)

Bệnh nhân có HBeAg- HBeAb+,

HBVDNA+, ALT ↑↓ bất thường

Hình 56: Qui trình PCR và giải trình tự phát

hiện đột biến precore/promoter

3626%

3828%

2820%

2719%

21%

96%

G1896A

A1762T, G1764A

G1896A A1762T, G1764A

Không đột biến

A1762T

G1896A A1762T

Biểu đồ 15: Tỷ lệ phân bố các kiểu đột biến precore/core promoter phát hiện được trong 134 mẫu xét nghiệm

113

chối cãi trong lĩnh vực chẩn đoán lao, vượt qua các công cụ vi sinh kinh điển. Một vấn

đề hiện nay đang được các nhà y học quan tâm là làm thế nào có thể có được kết quả

kháng sinh đồ vi khuẩn M. tuberculosis với thời gian ngắn hơn, vì với phương pháp vi

sinh kinh điển thì kết quả kháng

sinh đồ chỉ có thể có được sau

hơn 2 tháng với 1 tháng để có

được vi khuẩn mọc được trên

môi trường nuôi cấy và 1 tháng

để có kết quả kháng sinh đồ.

Thông tin về kháng sinh đồ mà

bác sĩ cần biết nhất là liệu vi

khuẩn phân lập trên bệnh nhân

có đề kháng với thuốc kháng

lao rifampicin, được coi là hiệu

quả nhất cho đến hiện nay hay

không để có thể tiếp tục duy trì

hay chỉ định cho bệnh nhân

công thức kháng lao có

rifampicine.

Trước thực tế đòi hỏi này,

phòng thí nghiệm NK-Biotek

và đơn vị R&D công ty Nam

405 427 Leu Ser Gln Phe Met Asp Gln Asn Asn Pro Leu Ser Gly Leu Thr His Lys Arg Arg Leu Ser Ala Leu CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC AAC CCG CTG TCG GGG TTG ACC CAC AAG CGC CGA CTG TCG GCG CTG

Pro CCG

Leu CTA

Val GTC

/..../ Dele

Leu TTG

Tyr TAC Asp GAC Gln

CAG Asn AAC Arg

CGC Pro

CCC

Leu TTG Gln

CAG Trp

TGG

Pro CCG

(3%) (3%) (9%) (1%) (1%) (1%)

(28%)

(52%)

Hình 57: Vùng nóng với các đột biến trên rpoB gene và tỷ lệ thường xãy ra

Yêu cầu PCR phát hiện MTB Tìm đột biến kháng Rifampicine và INH

PCR phát hiện MTB dựa trên khuếch đại trình tự 249bp trên IS6110

PCR khuếch đại trình tự đặc hiệu chứa các đột biến trên rpoB, katG, và inhA

Kết quả phát hiện MTB trong vòng 24giờ

Giải trình tự phát hiện đột biến rpoB, katG và inhA

Đột biến rpoB L430P S431G Q432K/L 433 ins TTC(phe : F) D435G/A/V 440 ins TCGGGGTTG H445N/D/Q/S/R/L/Y/F S450L L452P I480V

Đột biến katG S315T

Đột biến inhA C-15T

Kết quả kháng sinh đồ MTB 72 giờ sau khi lấy mẫu đàm

Hình 58: Mô tả qui trình PCR và giải trình tự để phát hiện các đột biến kháng rifampicin và INH của vi khuẩn M. tuberculosis trực tiếp từ mẫu đàm mà không phải qua nuôi cấy. Kết quả đến tay các nhà lâm sàng chỉ 72 giờ sau khi lấy mẫu đàm

114

Khoa đã nghiên cứu và thử nghiệm một qui trình PCR và giải trình tự để khuếch đại

một vùng nóng của gene rpoB của M. tuberculosis để có thể phát hiện được tất cả các

đột biến thường xảy ra tạo cho vi khuẩn kháng được rifampicine (hình 57).

Ngoài vùng nóng này, chúng tôi cũng đã thành công trong xây dựng một qui trình

phát hiện đề kháng INH bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự gene katG để phát hiện vị

trí đột biến thường gặp là S315T và gene inhA để xác định vị trí đột biến C-15T. Hiện

nay qui trình này đã được chúng tôi áp dụng để phát hiện trực tiếp các đột biến kháng

thuốc này từ bệnh phẩm mà không cần thiết phải qua nuôi cấy. Hình 58 minh họa tóm

tắt qui trình được phòng thí nghiệm NK-Biotek thực hiện để phát hiện MTB và cho

luôn kết quả kháng sinh đồ chỉ 72 giờ sau khi lấy mẫu đàm từ bệnh nhân. Hiện nay

chúng tôi đang tiếp tục nghiên cứu để có thể có thêm các kết quả kháng sinh đồ phát

hiện các đột biến kháng các thuốc kháng lao khác như ethambutol, PAS, PZA,

Ofloxacin...để có thể đáp ứng được một cách đầy đủ các yêu cầu đến từ các nhà lâm

sàng trong cuộc chiến đấu chống lại tình hình lao đa kháng ngày càng trầm trọng hiện

nay.