Download - PCR và giải trình tự
81
PCR và giải trình tự
Giải trình tự là gì?
DNA là cơ sở hóa học của gen. Phân tử DNA là một chuỗi xoắn kép của hai mạch đơn
được cấu tạo từ 4 loại nucleotide khác nhau nhờ các base của chúng, đó là: A (adenine),
C (cytosine), G (guanine) và T (thymine). Các nucleotide này nối kết liên tiếp với nhau
theo một thứ tự xác định. Giải trình tự của gen tức là phát hiện được thứ tự sắp xếp của 4
loại nucleotide này trên phân tử DNA.
Các phương pháp giải trình tự gene
1. Phương pháp hóa học giải trình tự DNA
Vào năm 1977, Maxam và Gilbert đã phát minh được một phương pháp hóa học
để có thể giải trình tự một đoạn DNA. Nguyên tắc của phương pháp này là: (1) Trước
hết là phải đánh dấu một đầu của đoạn DNA cần phải giải trình tự bằng một gốc
phospho đồng vị phóng xạ (32P); (2) Xử lý các đoạn DNA đã đánh dấu này với chất
hóa học có thể làm biến đổi đặc hiệu một hoặc hai loại base của nucleotide trên đoạn
DNA. Ví dụ, dimethylsulphate để biến đổi Guanine bằng các thêm một gốc methyl ở vị
trí nitrogen thứ 7 (N7), hydrazine làm biến đổi Thymine và Cytosine, hydrazine và
NaCl để làm biến đổi Cytosine, acid để làm biến đổi Guanine và Adenine, NaOH để
làm biến đổi Adenine và Cytosine với Adenine ưu tiên hơn Cytosine. Như vậy trong
giai đoạn này, phải dùng ít nhất 4 ống nghiệm và trong mỗi ống nghiệm, DNA được xử
lý với một lượng rất giới hạn của một trong các chất hóa học nêu trên để mỗi ống
nghiệm chỉ có chứa các đoạn DNA mà trên mỗi đoạn DNA này chỉ có một vị trí
nucleotide đặc hiệu với chất hóa học là bị biến đổi; (3) Các nucleotide bị biến đổi này
sẽ bị lấy ra khỏi mạch khung đường-phosphate (sugar-phosphate backbone) của đoạn
DNA và nhờ đó tách ra được các đoạn mạch đơn có một đầu đánh dấu 32P và một đầu
bị mất phân tử base vì phân tử này đã bị lấy ra khỏi mạch khung (hình 37). (4) Thực
hiện điện di mẫu DNA đã xử lý trong 4 ống nghiệm này trên 4 hàng của một gel
polyacrylamide biến tính để các mạch đơn trong mẫu di chuyển trong gel không bị biến
đổi trong quá trình điện di. Nhờ đó, sau khi hoàn tất điện di, các mạch đơn sẽ bị dừng
tại các vị trí khác nhau, tùy thuộc vào mạch đơn này dài ngắn khác nhau, theo hàng dọc
suốt chiều dài của gel. Áp gel đã điện di này trên một phim nhạy tia X, các vị trí dừng
82
lại của các mạch đơn trên gel điện di sẽ tạo thành các vạch trên phim vì các vị trí này
đều bị đánh dấu phóng xạ do các mạch đơn đều có một đầu được đánh dấu bằng 32P.
Từ các vạch trên phim xạ ký tự ghi này (autoradiography), có thể đọc được trình tự của
các nucleotide của đoạn DNA (hình 38).
Phương pháp hóa học xác định trình tự DNA của Maxam và Gilbert trên thực tế
không phải dễ thực hiện vì cần phải xác định khá nhiều thông số tối ưu cho thí nghiệm,
trong đó khó nhất là phải xác định được nồng độ giới hạn nhất của các chất hóa học sao
cho khi xử lý mẫu DNA thì trên mỗi đoạn DNA chỉ có một base bị biến đổi để ứng với
mỗi vị trí của base bị biến đổi thì sẽ có một mạch đơn có đầu đánh dấu 32P được tách ra.
Chính vì sự phức tạp này, phương pháp Maxam Gilbert hiện nay ít được sử dụng, mà
thay vào đó các nhà khoa học dùng phương pháp enzyme với nhiều ưu điểm vượt trội
hơn.
Mạch đơn DNA
32P A p G p C p T p T p T p G p A p G p G p A p C p G p A..
32P 32P 32P 32P 32P
Các mạch DNA đơn có đầu bị đánh dấu 32P
Hình 37: Các mạch đơn có một đầu đánh dấu với 32P và một đầu base Guanine bị lấy khỏi mạch khung do bị
biến đổi. Các mạch đơn này có chiều dài ngắn khác nhau tùy thuộc vào vị trí của Guanidine trên đoạn DNA.
Hình 38: Hình xạ ký tự ghi trên phim nhạy tia X một gel polyacrylamide sau khi đã điện di. Các vạch là vị trí các mạch đơn bị dừng lại sau điện di. Các vị trí này gần hay xa khởi điểm là tuỳ kích thước của mạch đơn dài hay ngắn khác nhau. Từ các vạch này, đọc trình tự của đoạn DNA trong mẫu.
C T+G G
A>C
3’ 5’ G C C C A C T T C A G A A G A A A A A G G
83
2. Phương pháp enzyme giải trình tự DNA
Phương pháp enzyme được Sanger và các cộng sự phát minh cũng vào năm 1977,
và ngày hôm nay phương pháp này càng ngày càng được hoàn thiện và thực hiện dễ
dàng tại các phòng thí nghiệm. Nguyên tắc chung của phương pháp này có thể tóm tắt
như sau:
thêm d*NTP, DNA polymerase, ddATP
GGAATGC
CCTTACG CATACGTGG
mồi GGAATGC
CCTTACG CATACGTGG
CGTAAGG*C*CdA CGTAAGG*C*C*A*C*G*TdA
CGTAAGGdC CGTAAGG*CdC CGTAAGG*C*C*AdC
CGTAAGG*C*C*A*CdG CGTAAGG*C*C*A*C*G*T*A *TdG
CGTAAGG*C*C*A*C*GdT CGTAAGG*C*C*A*C*G*T*AdT
CGTAAGG*C*C*A*C*G*T*A *TdG CGTAAGG*C*C*A*C*G*T*AdT CGTAAGG*C*C*A*C*G*TdA CGTAAGG*C*C*A*C*GdT CGTAAGG*C*C*A*CdG CGTAAGG*C*C*AdC CGTAAGG*C*CdA CGTAAGG*CdC CGTAAGGdC
điện di trên gel
Chiều điện di
thêm d*NTP, DNA polymerase, ddCTP
thêm d*NTP, DNA polymerase, ddGTP
thêm d*NTP, DNA polymerase, ddTTP
Hình 39: Phương pháp Enzyme giải trình tự DNA. Đoạn DNA được chèn vào một vector tại một vị trí biết rõ
trình tự, nhờ đó có thể tổng hợp được các mạch đơn có một đầu là mồi, một đầu là các nucleotide tận. Trong hình các nucleotide đánh dấu * là các nucleotide được dánh dấu 35S, nhờ vậy các mạch đơn được đánh dấu.
84
Trước hết chèn các đoạn DNA cần phải xác định trình tự vào một vector là phage
hay plasmid tại một vị trí mà trình tự chuỗi của vị trí này đã được xác định rõ. Chuyển
thể tức là đưa các vector mang đoạn chèn DNA này vào tế bào vi khuẩn để nhân bản
các vector này thành nhiều bản sao, sau đó tách chiết và tinh khiết các vector từ vi
khuẩn để thành các vector tự do.
Dùng các đoạn mồi bổ sung một cách đặc hiệu với trình tự của vector tại vị trí
chèn đoạn DNA. Thêm vào ống phản ứng men DNA polymerase và 4 loại nucleotide
tự do (gọi là dNTP: deoxynucleotide triphosphate) và một lượng rất giới hạn các
nucleotide tận (terminator, là ddNTP: dideoxynucleotide triphosphate, cũng như dNTP,
có 4 loại ddNTP tương ứng với 4 base A, T, C và G). Phản ứng được thực hiện trong 4
ống, và mỗi ống cho một loại ddNTP khác nhau. Bắt đầu từ đoạn mồi, men DNA
polymerase sẽ kéo các dNTP vào để tổng hợp mạch đơn bổ sung với mạch DNA chèn
trên vector, và sự tổng hợp mạch đơn sẽ bị dừng
lại tại vị trí mà ddNTP được kéo vào thay vì
dNTP. Lý do sự tổng hợp bị dừng lại là vì
ddNTP có cấu trúc hóa học bị mất đi gốc OH tại
vị trí carbon thứ 3 của đường deoxyribose, mà
gốc OH tại vị trí này chính là nơi để dNTP kế
tiếp được gắn vào. Nhờ vậy trong ống phản ứng
có các mạch đơn DNA có các chiều dài khác
nhau tương ứng với các vị trí trình tự các
nucleotide trên đoạn DNA gốc (hình 39).
Để giải trình tự, người ta dùng phương pháp
điện di trên gel polyacrylamide biến tính. Với
phương pháp đánh dấu mồi hay các dNTP bằng
đồng vị phóng xạ 32P hay 35S thì sau khi điện di,
cũng giống như phương pháp của Maxam và Gilbert, người ta phát hiện các vạch điện
di bằng kỹ thuật xạ ký tự ghi, và từ các vạch này giải được trình tự của đoạn DNA
(hình 40).
T 3’ C G C A G T C C T A G C T T A G C G G 5’
A C G T
Hình 40: Hình xạ ký tự ghi một kết quả giải trình tự DNA trên gel polyacrylamide. Từ kết quả này, đọc được trình tự DNA
85
3. Giải trình tự bằng máy tự động (automated sequencer)
Các phòng thí nghiệm hiện nay đều dùng phản ứng giải trình tự bằng phương pháp
enzyme, nhưng khi làm giải trình tự thì thường dùng các máy tự động chứ không dùng
kỹ thuật xạ ký tự ghi như trước đây. Để thực hiện được giải trình tự bằng máy tự động
thì các mạch DNA đơn sản sinh trong ống phản ứng giải trình tự phải được đánh dấu
huỳnh quang để các vạch điện di của các mạch đơn này phát sáng khi đi qua một chùm
tia sáng laser. Cấu tạo của một máy tự động giải trình tự gồm hai phần chính yếu, đó
là: phần điện di với gel polyacrylamide và phần phát hiện các vạch điện di. Phần điện
Hình 41: Sơ đồ khối một máy tự động giải trình tư dùng bản gel polyacrylamide. Máy gồm hai phần: phần điện di gel polyacrylamide, phần phát hiện các vạch điện di. Các vạch điện di được các con mắt cảm quang phát hiện khi đi qua chùm tia laser và phát sáng lên. Tín hiệu được mắt cảm quang truyền về máy tính để hiển thị thành các đỉnh cường độ sáng
A G C T T A C G G A C T A A T G C
Màu 1
Màu 2
Màu 3
Màu 4
Tia LASER
Máy tính
Th i gian
Mắt cảm quang
A G C T T A C G G A C T A A T G C
Màu 1
Màu 2
Màu 3
Màu 4
Tia LASER
Máy tính
Th i gian
Mắt cảm quang
86
di polyacrylamide có thể là một bản gel hay là một ống mao quản chứa gel. Phần phát
hiện vạch điện di là những con mắt cảm quang và một chùm tia laser đi qua trước nó.
Nguyên tắc hoạt động của máy là trong suốt quá trình điện di, mỗi khi có một vạch
điện di đi qua chùm tia laser thì vạch điện di sẽ phát sáng lên và sự phát sáng này sẽ
được con mắt cảm quang
ghi nhận và lưu lại thành
một đỉnh cường độ sáng
trong biểu đồ. Từ biểu đồ
của các đỉnh cường độ
sáng này, máy sẽ so dòng
của các đỉnh tương ứng
với các màu để cuối cùng
phân tích thành trình tự
của đoạn DNA (hình 41).
Với các máy thế hệ
mới sau này, người ta có
thể dùng 4 màu huỳnh
quang khác nhau để đánh
dấu 4 loại ddNTP, nhờ vậy
phản ứng giải trình tự có
thể thực hiện được chỉ
trong một ống nghiệm và
khi giải trình tự chỉ cần điện di trên một hàng mà không cần phải trên 4 hàng khác nhau
như trước đây (hình 42). Nếu dùng diện di mao quản thì tùy thuộc vào số mao quản có
thể chạy một lần mà người làm thí nghiệm có thể có số mẫu cho mỗi lần chạy nhiều
hay ít. Hình 43 là sơ đồ khối minh họa cho một giải trình tự 8 mao quản (CEQ8000,
hay CEQ8800). Tùy thuộc vào qui mô của phòng thí nghiệm cùng với số mẫu giải
trình tự mà phòng thí nghiệm có thể trang bị giải trình tự ít hay nhiều mao quản. Ví dụ
với ABI thì có nhiều loại: chỉ 1 mao quản, 4 mao quản, 16 mao quản, 48 mao quản, rồi
96 mao quản. Phòng thí nghiệm R&D của công ty Nam Khoa trước đây nhu cầu giải
trình tự không nhiều nên chỉ trang bị CEQ8000 có 8 mao quản (hình 44). Nhưng nay
GGAATGCCCTTACGCATACGTGG
CGTAAGGCCdACGTAAGGCdCCGTAAGGCCACdGCGTAAGGCCACGTdACGTAAGGdCCGTAAGGCCACGTA TdGCGTAAGGCCAdCCGTAAGGCCACGdTCGTAAGGCCACGTAdT
*CGTAAGGCCACGTA TdG*CGTAAGGCCACGTAdT*CGTAAGGCCACGTdA*CGTAAGGCCACGdT*CGTAAGGCCACdG
*CGTAAGGCCAdC*CGTAAGGCCdA*CGTAAGGCdC
*CGTAAGGdC
thêmdNTP, DNA polymerase, ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP
Chiều điện di
GGAATGCCCTTACGCATACGTGG
CGTAAGGCCdACGTAAGGCdCCGTAAGGCCACdGCGTAAGGCCACGTdACGTAAGGdCCGTAAGGCCACGTA TdGCGTAAGGCCAdCCGTAAGGCCACGdTCGTAAGGCCACGTAdT
*CGTAAGGCCACGTA TdG*CGTAAGGCCACGTAdT*CGTAAGGCCACGTdA*CGTAAGGCCACGdT*CGTAAGGCCACdG
*CGTAAGGCCAdC*CGTAAGGCCdA*CGTAAGGCdC
*CGTAAGGdC
thêmdNTP, DNA polymerase, ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP
thêmdNTP, DNA polymerase, ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP
Chiều điện di
Hình 42: Với các ddNTP đánh dấu hùynh quang khác nhau, các đọan
trình tự tận cùng ở đầu 5’ sẽ được đánh dấu bằng 4 màu hùynh quang khác nhau tương ứng với nuleotide tận là A, hay T, hay C hay G. Chính nhờ vậy không cần phải thực hiện phản ứng giải trình tự trong 4 ống phản ứng.
87
do nhu cầu nghiên cứu và dịch vụ ngày càng nhiều nên đã trang bị thêm ABI 3130XL
có đến 16 mao quản (hình 44).
Các thế hệ máy về sau ngày càng có những chương trình đi kèm để chẳng những
có thể hiển thị tự động các ký tự hoá học của trình tự DNA mà còn giúp các nhà nghiên
cứu có thể: (1) Phát hiện các chi tiết cần thiết trên trình tự như mã khởi đầu, mã kết
thúc, vùng đọc mở (ORF: Open Reading Frame), trình tự đặc hiệu cho các enzyme cắt
giới hạn (restriction enzyme), các dấu ấn di truyền...mà các chi tiết này rất cần thiết để
lập bản đồ gen...(2) Phiên dịch trình tự trong vùng đọc mở (tức là vùng trình tự có ý
nghĩa) thành trình tự acid amin của một protein, nhờ đó có thể xác định, phỏng đoán,
hay làm cơ sở ban đầu để hiểu được chức năng của gen...(3) Tự động so sánh trình tự
DNA trong thí nghiệm hay
một trình tự DNA nạp vào
máy, hay có thể trình tự acid
amin của protein, với các
trình tự khác đã có trong ngân
hàng dữ liệu để phát hiện
được sự tương đồng với trình
tự đã biết, nhờ đó làm cơ sở
để xác định gen và chức năng
gen...
Hình 44: Máy giải trình tự CEQ8000 có 8 mao quản của Beckman Coulter và ABI 3130XL có 16 mao quản của Applied Biosystem được trang bị tại phòng thí nghiệm R&D của công ty Nam Khoa
Cực [-]
Cự
c[+
]
Laser
Cảmquang
Điện thế cao
Mao quản
Cực [-]
Cự
c[+
]
Laser
Cảmquang
Điện thế cao
Cực [-]
Cự
c[+
]
Laser
Cảmquang
Điện thế cao
Mao quản
Hình 43: Sơ đồ khối một máy diện di mao quản dùng giải trình tự DNA
88
PCR là công cụ giúp hoàn thiện và mở rộng phổ áp dụng kỹ thuật giải trình tự
PCR đã đóng góp rất nhiều vào công nghệ giải trình tự làm cho công nghệ giải trình tự
ngày càng dễ dàng hơn và thuận tiện hơn. Không chỉ vậy PCR còn làm cho giải trình tự
có nhiều ứng dụng hơn không chỉ trong nghiên cứu mà cả trong chẩn đoán nữa.
Trước khi có PCR thì người ta chỉ có thể giải trình tự các đoạn gene được cô lập và
chèn vào plasmid vì chỉ có như vậy thì mới có thể nhân bản được đoạn gene muốn giải
trình tự thành nhiều bản sao với số lượng đủ để chạy được phản ứng giải trình tự. Ngoài
ra, enzyme polymerase cũng là loại enzyme không chịu nhiệt nên phản ứng giải trình tự
chỉ thực hiện ở 37oC, do vậy mà vấn đề tối ưu các thành phần của phản ứng rất là khó
đồng thời hiệu quả của phản ứng giải trình tự cũng không cao.
Từ khi có sự ra đời của kỹ thuật PCR thì kỹ thuật giải trình tự cũng có những tiến bộ
rất vượt bực. Chỉ cần dùng PCR là có thể nhân bản đoạn gene muốn giải trình tự thành
hàng tỷ bản sao hoàn toàn giống hệt nhau và sản phẩm khuếch đại này có thể đưa vào
giải trình tự trực tiếp mà không cần phải chèn vào một plasmid giải trình tự nữa. Sự phát
minh ra kỹ thuật nhân bản DNA trong ống nghiệm bằng PCR cũng giúp cho việc cải tiến
phản ứng giải trình tự kém hiệu quả trước đây trở nên hiệu quả hơn nhờ áp dụng enzyme
polymerase giải trình tự bền với nhiệt độ để phản ứng giải trình tự được thực hiện qua các
chu kỳ nhiệt giống hệt PCR, mà ngày nay chúng ta gọi là phản ứng chu kỳ nhiệt giải trình
tự. Với phản ứng chu kỳ nhiệt giải trình tự thì hiệu quả phản ứng tốt hơn rất nhiều, đồng
thời tối ưu hóa các thành phần của phản ứng cũng dễ dàng hơn rất nhiều. Có thể nói
chính sự ra đời và hoàn thiện kỹ thuật PCR đã giúp tăng tốc kỹ thuật giải trình tự không
những trong vấn đề hoàn thiện nó, mà cả trong vấn đề phạm vi áp dụng.
Giải trình tự bộ gene người
1. Làm thế nào giải trình tự bộ gene người
Giải trình tự bộ gen người tức là giải trình tự toàn bộ thứ tự sắp xếp các nucleotide
A, T, C, và G của DNA trong 23 cặp nhiễm sắc thể tế bào người. Dự án giải trình tự bộ
gen người được Tiến Sĩ James Watson, cha đẻ của phát hiện cấu trúc DNA, đề ra từ
giữa thập niên 1980. Đến tháng 10 năm 1990, dự án được ra đời với kinh phí 3 tỷ Mỹ
kim do HGP (Human Genome Project) của Viện Quốc Gia Y Tế Hoa Kỳ lãnh đạo
cùng với sự tham gia của nhiều trung tâm nghiên cứu bộ gen người của nhiều quốc gia
89
trên thế giới. Do tiên đoán giá trị kinh tế mang lại từ việc giải mã thành công bộ gen
người sẽ rất lớn, nên đã có một số công ty sinh học chuyên về bộ gen người đã được
hình thành. Sự nhập cuộc của các công ty tư nhân này đã tạo nên một bầu không khí thi
đua cho việc khai phá bí mật về bộ gen của loài người chúng ta, càng gần đến những
ngày đến đích càng cực kỳ ngoạn mục. Trong cuộc chạy đua này, nhờ đã áp dụng một
phương pháp cực kỳ độc đáo kết hợp giữa công nghệ PCR, công nghệ giải trình tự
DNA với công nghệ tin học, nên chỉ với kinh phí khoảng 200 triệu mỹ kim, Tiến Sĩ
Crag Venter của Celera Genomics trở thành người dẫn đầu thành công nhất trong việc
giải trình tự được gần như hoàn toàn bộ gen người.
Cái khó khăn của việc giải trình tự bộ gene người là không thể nào tách từng đại
phân tử DNA của từng nhiễm sắc thể rồi đem giải trình tự đại phân tử DNA nguyên
vẹn này. Các nhà khoa học của HGP cũng như các trung tâm khác trên thế giới nghiên
cứu về bộ gen người thường cắt các đại phân tử DNA của nhiễm sắc thể một cách định
hướng theo bản đồ di truyền, rồi đem giải trình tự các đoạn cắt DNA này, và cuối cùng
tìm cách ghép nối chúng lại với nhau cho đúng vị trí của chúng trên đại phân tử DNA.
Phương pháp này đòi hỏi phải tốn nhiều thời gian và công sức vì có nhiều khi các đoạn
cắt DNA quá lớn, rất khó giải trình tự cũng như khó cho kết quả giải trình tự chính xác.
Do đó, với mỗi một đoạn DNA các nhà khoa học phải thực hiện giải trình tự ít nhất là
7 lần để đảm bảo độ lặp lại. Chính vì vậy, với cách tiếp cận này, nhiều vị trí trên các
đại phân tử DNA vẫn không thể giải trình tự được mà từ đó các nhà khoa học của HGP
có thể hoàn tất việc xếp đúng vị trí các đoạn DNA đã giải trình tự trên đại phân tử
DNA của nhiễm sắc thể.
Tiến sĩ Crag Venter đã thực hiện một phương pháp giải trình tự bộ gen người một
cách hoàn toàn khác hẳn (hình 45). Trước hết ông cho tách chiết toàn bộ DNA nhiễm
sắc thể tế bào người rồi phá bung một cách không định hướng các đại phân tử DNA
thành các mảnh DNA nhỏ hơn. Đem giải trình tự tất cả các mảnh DNA nhỏ này. Cuối
cùng dùng những máy điện toán cực mạnh mà ông đã hợp tác với công ty ABI chế tạo
ra, dò tìm các đầu trùng lặp của các mảnh DNA nhỏ này để lắp nối vào đúng các vị trí
của chúng trên đại phân tử DNA của nhiễm sắc thể. Chính nhờ áp dụng chiến lược giải
trình tự này mà Celera Genomics đã giải trình tự rất nhanh các mảnh DNA, chỉ cần lặp
lại cho mỗi mảnh DNA có 5 lần, và đã xếp đúng gần như hầu hết vị trí của các mảnh
90
DNA đã giải trình tự trên đại phân tử DNA của nhiễm sắc thể. Hơn thế nữa, TS. Crag
Venter cũng tuyên bố công ty đã triển khai một kỹ thuật mới có thể làm cho phương
pháp giải trình tự bộ gen của công ty, vốn dĩ đã là phương pháp nhanh nhất rồi, trở
thành nhanh hơn nữa. Cuối năm 2000, Celera Genomics đã hoàn thành việc giải trình
tự bộ gen của chuột với 2.3 tỷ “ký tự hóa học” trong đó có rất nhiều tương đồng với bộ
gen người, nhờ vậy sẽ giúp các nhà khoa học dễ dàng hơn trong việc truy tìm các chức
năng của các gen.
2. Kết quả giải trình tự bộ gene người
Sau gần 10 năm nghiên cứu
thực hiện với những năm càng về
sau càng sôi động không khí thi
đua do sự nhập cuộc của các công
ty tư nhân, ngày 26 tháng 6 năm
2000, tại Tòa Bạch Ốc với sự
hiện diện của Tổng Thống Hoa
Kỳ Bill Clinton, hai khoa học gia
Mỹ là Tiến Sĩ Crag Venter đại
diện cho Celera Genomic và Tiến
Sĩ Francis Collins đại diện cho
HGP (HGP: Human Genome
Project) của NIH (NIH: National
Institute of Health) công bố một
cách long trọng là chương trình
giải trình tự bộ gen người đã
hoàn tất. Đây chính là một thời
khắc lịch sử cực kỳ quan trọng và
đáng nhớ của nhân loại, đánh dấu
ngày nhân loại đã có trong tay
một bản đồ sinh học cần thiết để
bước vào kỷ nguyên mới với
nhiều hứa hẹn các thành tựu vĩ
c a g g c a t t t c c a g c
g g c g g c g g a g c a g
c g a g c g g c g g
c c a g c a g t g a g g a g a c a g c
c c a g c a g t g a g g a g a c a g c
c g a g c g g c g g g g c g g c g g a g c a g
c a g g c a t t t c c a g c
c g a g c g g c g g c g g a g c a g g c a t t t c c a g c a g t g a g g a g a c a g c t g t a c
ccgtcaaccggagtta
acgttct
DNA từ mhiễm sắc thể được phá bung thành
nhiều mãnh nhỏ
Các mãnh DNA nhỏ được giải trình tự
Các mãnh DNA nhỏ được chương trình phân tích tự động tìm các đầu trùng lặp, nhờ đó tái hiện
được trình tự của đại phân tử DNA
Hình 45:
Phương pháp giải trình tự bộ gen người của công ty Celera Genomics: trước hết tách chiết toàn bộ DNA của nhiễm sắc thể tế bào người, sau đó phá tung DNA thành các mảnh nhỏ, giải trình tự tất cả các mảnh nhỏ này, cuối cùng nhờ chương trình vi tính cực mạnh để nối kết các đoạn DAN nhỏ này lại với nhau bằng cách dò tìm các đầu trùng lặp nhờ vậy tái hiện được mạch DNA nguyên thủy
91
đại về sinh y học trong tương lai. Dù thành công của các nhà khoa học giải trình tự
được 3.1 tỷ các “ký tự hóa học” làm nên bộ gen người đã được ví như sự kiện lịch sử
con người bước lên mặt trăng (ngày 26 tháng 7 năm 1969, từ khoang đổ bộ phi thuyền
Apollo, Neil Armstrong bước xuống đi dạo trên mặt trăng và đánh dấu thời điểm con
người thực hiện được hoàn toàn ước mơ đã từng ao ước bấy lâu: khắc dấu chân mình
trên bề mặt chị Hằng), nhưng đây chưa phải là thời điểm mà con người đã toại nguyện
được ước mơ hiểu biết tường tận được bộ gen của mình.
Thật sự cho đến thời điểm đó các nhà khoa học ở Công ty Celera Genomic hãy
còn chưa giải trình tự được 3% bộ gen người, tức khoảng 150 triệu, và công việc này
đòi hỏi phải từ 1 đến 2 năm nữa mới có thể hoàn tất vì 3% còn lại này nằm trên phần
khó giải trình tự nhất. Còn HGP thì thành công ít hơn, hãy còn nhiều đoạn trình tự của
bộ gen mà các nhà khoa học của HGP chưa giải được và cũng có nhiều đoạn trình tự đã
giải được nhưng họ vẫn chưa sắp xếp vào đúng vị trí. Ngoài ra, cho dù các nhà khoa
học có giải trình tự được một cách trọn vẹn bộ gen con người, thì cuốn sách của đời
sống (the book of life) này hãy còn chưa đọc được, như Gerald Rubin, Phó Giám đốc
Nghiên Cứu Y Sinh Học của Viện Y Học Howard Hughes giải thích: “Cuốn sách được
viết bằng một ngoại ngữ rất phức tạp, cần phải có một thời gian dài chúng ta mới hiểu
được”. Thật vậy, có thể tưởng tượng là nếu các trình tự của bộ gen người được in ra
thành sách thì sẽ cần phải khoảng 200 cuốn và mỗi cuốn dày phải 500 trang. Có 3000
trang nằm rải rác trong 200 cuốn sách trên là có ý nghĩa tức là có gen, mà cho đến hiện
nay chỉ mới có một số ít trang trong 3 ngàn trang này là khoa học đã đọc được tức là
xác định được gen. Hãy còn vài trang (khoảng 3%) chưa viết xong và những trang này
là những trang khó viết nhất vì thuộc những vùng khó giải trình tự nhất trong bộ gen
người.
Cho đến tháng 4 năm 2003, các trang khuyết này đã được các nhà khoa học viết
hoàn tất. Tuy vậy, một việc rất lớn hiện đang đặt ra trước mắt các nhà khoa học đó là
phải xác định được các trình tự nào là gen và chức năng của các gen này. Chỉ có 3%
của bộ gen người là mang gen tức là mang trình tự có ý nghĩa và hiện nay các nhà khoa
học cũng chưa biết chính xác là thật sự có bao nhiêu gen trong bộ gen người. Câu trả
lời phỏng chừng nhất là từ 28.000 đến 140.000 gen, và gần đây nhất có lẽ là đang gần
đến con số chính xác hơn, đó là 30.000 gen. Trong khoảng 30.000 gen này, các nhà
92
khoa học hiện chỉ biết được chức năng của khoảng 10.000 gen, hãy còn 20.000 chưa
biết chức năng của chúng. Đây chính là một cuộc đua mới cũng hứa hẹn đầy sôi động
vì kết quả từng chặng một của cuộc đua, tức kết quả của việc xác định được chúc năng
của từng gen, đều hứa hẹn những áp dụng cực kỳ ngoạn mục và đầy triển vọng trong
sinh học cũng như y học.
3. Giải trình tự bộ gene người – cuộc đua chưa kết thúc
Gen chính là trình tự các nucleotide trong chuỗi DNA chỉ huy được sự tổng hợp
một protein. Chính vì vậy xác định được chức năng của một gen tức là xác định được
protein mà gen tổng hợp có cấu trúc như thế nào và có nhiệm vụ gì trong cơ thể sống.
Sau kết quả giải trình tự bộ gen người, hiện nay các nhà khoa học đang có nhiều chiến
lược để có thể nhanh chóng phát
hiện chức năng của các gen trong
bộ gen người. Chúng tôi xin trình
bày ra đây ba trong số những chiến
lược đó.
(1) Nhờ kết quả giải trình tự
bộ gen người, các nhà khoa học sẽ
nhanh chóng xác định các trình tự
mang gen. Với các kỹ thuật sinh
học phân tử hiện đại như kỹ thuật
PCR, các nhà khoa học sẽ dễ dàng
nhân bản các gen này trong ống
nghiệm rồi dòng hóa chúng vào các
vectơ để sau đó nhờ các hệ tế bào
biểu hiện để biểu hiện các protein.
Với cách này các nhà khoa học sẽ
nhanh chóng thành lập được một
thư viện các protein của các gen có trong bộ gen người. Vấn đề tiếp theo là phải xác
định các protein trong thư viện protein là có chức năng gì? Để biết được chức năng của
protein trong thư viện, các nhà khoa học sẽ thử nghiệm các protein này hệ thống các
loại nuôi cấy tế bào để tìm hiểu mối giao tiếp giữa protein thử nghiệm với tế bào đích,
Dùng PCR để tổng hợp các gen
Clone vào các vector
Đưa vào các hệ thống tế
bào biểu hiện
Lập thư viện protein
Thử nghiệm trên các loại tế bào đích
Hình 46: Chiến lược tạo thư viện protein để đò tìm chức năng
của gen, tóm tắt là từ gen tổng hợp các protein, trữ trong thư viện protein, rồi thử trên các hệ thống tế bào đích để phát hiện chức năng của protein, từ đó biết được chứng năng của gen.
93
nhờ đó xác định tế bào đích nào có phản ứng với protein thử nghiệm, và nhờ vậy sẽ
biết được chức năng protein để biết được chức năng của gen. (hình 46).
(2) Giải trình tự bộ gen của động vật hữu nhũ
như dã nhân (rất giống bộ gen người) hay chuột,
đây là những bộ gen của các động vật có nhiều
tương đồng với bộ gen người, nhưng lại trên các
động vật mà các nhà khoa học rất dễ làm thí
nghiệm. Trên bộ gen động vật này, các nhà khoa
học sẽ dễ dàng phát hiện các gen, và các chức năng
của gen thông qua sự thay đổi hoặc biểu hiện của
một tính trạng nào đó của động vật thí nghiệm một
khi các nhà nghiên cứu dùng các kỹ thuật sinh học
phân tử gây đột biến hay làm knock-out ngay trên những vùng mang gen của bộ gen.
Một khi đã xác định được gen và chức năng của một gen trên động vật thí nghiệm, các
nhà nghiên cứu sẽ dễ dàng truy tầm và phát hiện gen và chức năng của gen này trên bộ
gen người nhờ phát hiện sự tương đồng về trình tự trong gen người với gen của động
vật thí nghiệm.
(3) Chúng ta biết rằng một protein được tổng hợp từ gen hoạt động như một vai trò
cấu trúc hoặc vai trò chức năng là nhờ hình dáng của nó với các hốc nhỏ hay các nếp
gấp. Chính vì vậy cho nên dù một gen có được giải mã và biểu hiện được một protein,
thì cũng chưa thể xác định được chức năng của protein này nếu chưa biết được các
hình dáng của nó. Chính vì vậy mà Viện Quốc Gia Khoa Học Y Khoa Tổng Quát tại
Hoa Kỳ đang chi một khoảng 20 triệu đô la để thành lập các trung tâm Proteomics, là
các trung tâm chuyên nghiên cứu và lưu trữ các cấu trúc và hình dáng được vi tính hóa
(hình 47) của các protein có trong thiên nhiên. Các viện Proteomics như vậy cũng
đang và sẽ thành lập tại các nước khác. Các nhà khoa học hy vọng rằng trong vòng 10
năm tới đây, các viện proteomics sẽ lưu trữ được hình dáng của gần 10.000 protein có
trong thiên nhiên. Con số này dù hãy còn rất nhỏ so với một số lương khá lớn các
protein thực sự có trong thiên nhiên, nhưng các nhà khoa học cũng hy vọng rằng thư
viện này đủ sức bao gồm tất cả hình dạng của tất cả các protein có liên quan đến sinh
học và y học, vì các protein khác không có trong danh sách cũng chỉ là các biến thể hay
Hình 47: Hình dạng của phân tử kháng thể
được vi tính hóa
94
các đồng dạng với các protein có trong danh sách mà thôi. Nhờ các trung tâm
proteomics và thư viện các hình dạng protein, các nhà nghiên cứu chắc chắn sẽ dễ dàng
hơn trong xác định các chức năng của gen.
4. Việt Nam có thể tham gia vào cuộc đua này không?
Hiện nay các nhà khoa học đang cố gắng nghiên cứu khai phá các bí mật trong
cuốn sách đời sống ghi chép đầy đủ trình tự bộ gen người với nhiều triển vọng sẽ có
các ứng dụng cách mạng trong sinh học, y học, cũng như các lĩnh vực khoa học khác
và sẽ đưa đến nhiều tiến bộ mới cho loài người trong kỷ nguyên mới này. Các nhà y-
sinh học của chúng ta hoàn toàn có thể tham gia trong cuộc đua này, vì theo chúng tôi
thì sinh học phân tử đối với các quốc gia thu nhập thấp có thể coi như là một ngành
khoa học tiểu thủ công nghiệp hiện đại. Tiểu thủ công nghiệp vì không nhất thiết
phải có các máy móc cực kỳ hiện đại và tốn kém mà vẫn có thể thực hiện được các kỹ
thuật bằng các thiết bị không quá đắt tiền. Hiện đại vì nhà nghiên cứu thực hiện kỹ
thuật dựa trên các kiến thức hiện đại với các kết quả hoàn toàn có thể có đóng góp lớn
vào kho tàng kiến thức hiện đại của nhân loại. Vấn đề chính là chúng ta phải có chuẩn
bị như thế nào và phải có chiến lược tham gia vào cuộc đua như thế nào.
Để chuẩn bị, quan trọng nhất là chúng ta phải cố gắng xây dựng và đào tạo trong
cũng như ngoài nước đội ngũ các nhà nghiên cứu y sinh học có trình độ và bản lĩnh
ngang tầm với thế giới. Các nhà nghiên cứu của chúng ta không chỉ phải có kiến thức
và kỹ năng về chuyên môn sinh-y học mà còn phải có khả năng tiếp cận để khai thác
được kho tàng kiến thức cũng như các dữ liệu ngày càng cập nhật trên mạng internet.
Ngoài ra, chúng ta phải tránh tình trạng đào tạo các nhà nghiên cứu nhưng lại không
chuẩn bị cho họ các điều kiện cũng như phương tiện làm việc. Chính vì sự thiếu thốn
điều kiện cũng như phương tiện làm việc mà các nhà nghiên cứu của chúng ta dù có
trình độ và bản lĩnh đến đâu cũng sẽ thui chột dần nhiệt huyết cũng như khả năng theo
thời gian, và dần dần tình trạng chảy máu chất xám trong cũng như ngoài nước sẽ
không thể tránh khỏi.
Về chiến lược, thì có lẽ chúng ta cũng cố gắng tham gia cuộc đua với những đích
nhắm là giải quyết và khai thác những đặc thù trong nước. Chẳn hạn khai thác nghiên
cứu cơ chế ở mức độ sinh học phân tử tác động của các dược liệu trong nước bằng cách
xây dựng các mô hình thí nghiệm ex-vivo trên các cấy tế bào để phát hiện sự cảm ứng
95
biểu hiện gen khi cho các hệ thống nuôi cấy tế bào này tiếp cận với các trích phân của
dược liệu. Phát hiện các cơ chế tác động của dược liệu ở mức độ sinh học phân tử, chắc
chắn chúng ta sẽ khai thác được các nguồn dược liệu quí mà chúng ta vốn có sẵn trong
nước. Ngoài ra, dân tộc Việt của chúng ta là một dân tộc khá thuần nhất, bên cạnh đó
chúng ta cũng có những dân tộc ít người sống rất tập trung và chưa hề bị lai trộn, đây
chính là cơ sở cho các nghiên cứu về sự phân bố các gen cũng như các mã di truyền
cho các nghiên cứu ứng dụng sau này để phát hiện, chữa trị hoặc phòng ngừa các bệnh
lý di truyền.
Nhân loại đang bước vào thiên niên kỷ 21 với hành trang mang theo là các tiến bộ
vượt bậc ở nhiều lĩnh vực khoa học khác nhau, trong đó có khoa học Y học và Sinh
học. Một hành trang cần yếu nhất cho một cuộc sống dễ dàng hơn và tốt đẹp hơn là
cuốn sách của đời sống với hầu như toàn bộ trình tự của bộ gen người mà các nhà khoa
học mới vừa kịp hoàn tất. Việc khai thác cuốn cẩm nang sinh học cần yếu nhất này của
nhân loại đòi hỏi một sự hợp tác đa ngành cũng như chuyên ngành. Chính vì vậy nên
chúng tôi cho rằng chúng ta cũng không thể bỏ qua yếu tố hợp tác và học hỏi: chúng ta
phải hợp tác và học hỏi từ bạn bè quốc tế, và quan trọng nhất là phải biết học hỏi và
biết hợp tác giữa chúng ta với nhau.
Ứng dụng công nghệ giải trình tự tại phòng thí nghiệm NK-Biotek
Phòng thí nghiệm NK-Biotek và đơn vị R&D của công ty Nam Khoa đã ứng dụng khá
thành công kỹ thuật giải trình tự vào các dịch vụ chẩn đoán và nghiên cứu. Dưới đây xin
đưa ra một số thành tựu tiêu biểu.
1. Ứng dụng kỹ thuật PCR và giải trình tự để định danh vi khuẩn
Nhờ phát hiện được một cặp mồi mà sau đó được đặt tên là NK16s-F và NK16s-R
khuếch đại được đoạn DNA dài 527 bps chứa các trình tự giúp phân biệt giống và loài
các vi khuẩn, phòng thí nghiệm NK-Biotek và đơn vị R&D của công ty Nam Khoa đã
xây dựng thành công qui trình PCR cho gene 16s rDNA và qui trình giải trình tự trực
tiếp sản phẩm PCR này để định danh vi khuẩn. Thành công này đã giúp phòng thí
nghiệm NK-Biotek và đơn vị R&D của Nam Khoa thực hiện được khá nhiều ứng dụng
trong các xét nghiệm dịch vụ và nghiên cứu.
96
a. Ứng dụng trong xét nghiệm vi sinh lâm sàng định danh vi khuẩn kị khí
Vi khuẩn kị khí là các vi khuẩn chỉ có thể tăng trưởng trong điều kiện khí trường
không có oxygene phân tử (O2). Vi khuẩn kị khí có thể là các vi khuẩn có lợi được sử
dụng trong công nghệ vi sinh, tuy nhiên về mặt y học rất có nhiều loài vi khuẩn kị khí
là các tác nhân nhiễm khuẩn nội sinh hay ngoại sinh. Bệnh lý nhiễm khuẩn kị khí rất đa
dạng, từ các nhiễm khuẩn tại chỗ kết hợp với các vi khuẩn không kị khí, hay các nhiễm
khuẩn hệ thống, hay các nhiễm khuẩn đặc hiệu. Do đa dạng như vậy nên việc xác định
một nhiễm khuẩn kị khí về mặt lâm sàng không phải dễ dàng. Trong khi đó xét nghiệm
vi sinh lâm sàng tại các phòng thí nghiệm thường bỏ hẳn xét nghiệm vi khuẩn kị khí vì
gặp phải nhiều trở ngại về kỹ thuật như là: (1) Có được phương tiện chuyên chở bệnh
phẩm sao cho giữ được bệnh phẩm luôn ở điều kiện kị khí cho đến khi đến được phòng
thí nghiệm. (2) Tạo khí trường kị khí để nuôi cấy phân lập được vi khuẩn kị khí từ các
bệnh phẩm. (3) Định danh cho được vi khuẩn kị khí. (4) Làm được kháng sinh đồ vi
khuẩn kị khí.
Trong các trở ngại trên, trở ngại khó giải quyết nhất là vấn đề định danh vi khuẩn
kị khí phân lập được từ các bệnh phẩm. Có nhiều bộ thử nghiệm như API 20A của Bio-
Merieux, RapIDTM ANA II của Oxoid, PRAS II (Scott), AN Ident (Analytab), ANA
card (Vitek)...có sẵn trên thị trường để cho các phòng thí nghiệm chuyên dùng cho định
danh vi khuẩn kị khí. Tuy nhiên các bộ thử nghiệm này khó có sẵn tại Việt Nam vì nhu
cầu không nhiều. Hơn nữa các bộ thử nghiệm này cũng có nhiểu hạn chế như tỷ lệ định
danh sai khá cao (19% đối với API 20A, 10% đối với RapIDTM ANA II), tỷ lệ không
thể định danh đến loài cũng nhiều (38% đối với RapIDTM ANA II, 29% đối với API
20A).
Chính vì vậy nên để có thể thực hiện được xét nghiệm vi sinh lâm sàng vi khuẩn
kị khí, phòng thí nghiệm NK-Biotek và đơn vị R&D của công ty Nam Khoa đã triển
khai một giải pháp toàn diện, bao gồm chế tạo được môi trường chuyên chở CaryBac
có thể giữ bệnh phẩm ở điểu kiện kị khí trong thời gian 24 giờ hơn cả thời gian cần
thiết để chuyển mẫu từ lâm sàng đến phòng thí nghiệm, sử dụng ổn định phương tiện
tạo khí trường kị khí bằng các túi Anaerocult A của Merck, thực hiện được kháng sinh
đồ vi khuẩn kị khí bằng bộ thử nghiệm kháng sinh đồ kị khí do đơn vị R&D nghiên
cứu và thiết kế ra. Trong định danh vi khuẩn kị khí, phòng thí nghiệm NK-Biotek và
97
đơn vị R&D của công ty Nam Khoa đã đưa ra một tiếp cận hoàn toàn mới và hiện đại,
nhưng lại ít tốn kém nhất, đó là giải pháp giải trình tự một đoạn chứa trình tự đặc hiệu
giống và loài nằm trong gene 16S của vi khuẩn.
Có thể tóm tắt qui trình như sau: Vi khuẩn mọc trên hộp thạch phân lập được gặt
vào nước muối sinh lý vô khuẩn để đạt độ đục 0.5 – 1 McF. Sau đó đun cách thủy sôi
trong 10 phút. Để nguội rồi ly tâm 13.000RPM trong 5’. Lấy 5µl dịch nổi cho vào PCR
mix 45µl chứa sẵn các thành phần kể cả cặp mồi NK16s-F và NK16s-R khuếch đại đoạn
DNA dài 527 bps chứa trình tự đặc hiệu loài trên gene 16S của vi khuẩn. Chạy chương
trình nhiệt PCR gồm 1 chu kỳ 95oC/5’ để kích hoạt enzyme hot start Taq polymerase,
rồi 40 chu kỳ 94oC/15”-60oC/30”-72oC/1’. Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch bằng
bộ “Wizard SV Gel and PCR clean-up Sytem” của Promega. Sản phẩm tinh sạch được
điện di trên thạch và sau đó định lượng bằng quang phổ GenQuant của Pharmacia, sau
đó được đưa vào phản ứng giải trình tự 2 chiều sử dụng mồi xuôi và mồi ngược của
PCR thực hiện trên bộ thuốc thử “DTCS cycle sequencing kit” của Beckman Coulter.
Chương trình luân nhiệt của phản ứng giải trình tự với bộ thuốc thử trên là 30 chu kỳ
96oC/20”-50oC/20”-60oC/4’. Sản phẩm của phản ứng giải trình tự được tủa bằng
ethanol, rồi sau đó được chạy điện di giải trình tự trên máy giải trình tự CEQ8000. Kết
quả giải trình tự được so chuỗi bằng chương trình blast search trên ngân hàng dữ liệu
gene của NCBI. Từ kết quả so chuỗi, chúng ta sẽ có được kết quả định danh vi khuẩn.
Sau này, với các trang bị thêm như điện di bằng DNA chip của Bio-analyzer và máy
giải trình tự ABI 3130XL 16 capillary, qui trình của phản ứng giải trình tự và điện di
giải trình tự cũng đã được nghiên cứu để tương thích với các trang bị này. Cụ thể là
thay vì điện di trên gel rồi định lượng bằng quang phổ 260/280 thì kết hợp cả hai bằng
điện di và định lượng trên Bio-analyzer DNA chip của Agilent; thay vì dùng DTCS để
là phản ứng giải trình tự thì dùng “BigDye Terminator V. 3.1 Cycle Sequencing kit”
của ABI với chương trình luân nhiệt của phản ứng giải trình tự là trước hết 1 chu kỳ
96oC/1’, theo sau 25 chu kỳ 96oC/10”-50oC/5”-60oC/4’. Sản phẩm của phản ứng giải
trình tự sau khi tủa bằng ethanol, được chạy điện di giải trình tự trên máy giải trình tự
ABI 3130XL với gel POP 7 và mao quản 50cm. Hình 48 là một kết quả định danh
bằng giải trình tự 16s rDNA vi khuẩn kị khí phân lập từ mẫu mủ xoang của bệnh nhân.
Phòng thí nghiệm NK biotek đã áp dụng tiếp cận này trong năm 2008 cho xét nghiệm
98
Hình 48: Kết quả giải trình tự 16s rDNA trực khuẩn Gram [+] phân lập kị khí từ bệnh phẩm mũ xoang lấy từ bệnh nhân cho phép kết luận đây là Propionibacterium acnes
vi sinh lâm sàng vi khuẩn kị khí với các mẫu bệnh phẩm là 39 mẫu mủ xoang lấy từ
bệnh nhân bị viêm xoang mạn tính. Kết quả xét nghiệm cho thấy có 31% (18/59) cấy ra
tác nhân vi khuẩn kị khí và kết quả định danh bằng phương pháp giải trình tự 16s
rDNA cho thấy có 11% (2/18) Veillonella (cầu khuẩn Gram -), 17% (3/18) Prevotella
buccae (trực khuẩn Gram -), 22% (4/18) là Propionibacterium acnes, 6% (1/18) là
Streptococcus aginosus, 17% (3/18) là Streptococcus constellatus, 17% (3/18) là
Streptococcus gordonii, 6% (1/18) là Peptostreptococcus micros, và 6% (1/18) là
Peptostreptococcus stomatis. Kết quả này cho thấy PCR và giải trình tự 16s rDNA là
một giải pháp kỹ thuật hoàn toàn có thể sử dụng để định danh vi khuẩn kị khí, giải
quyết được khâu kỹ thuật phức tạp và khó khăn nhất trong qui trình xét nghiệm vi sinh
lâm sàng vi khuẩn kị khí.
b. Phát hiện chất lượng các sản phẩm probiotic cho người và cho thủy sản
Probiotic chính là các vi sinh vật không gây bệnh, được dùng làm sản phẩm trợ
sinh qua đường ăn hay uống sử dụng trên người, gia súc, hay thủy sản để phát huy hiệu
quả chống lại các nhiễm trùng nhờ các cơ chế như cạnh tranh chất dinh dưỡng và chổ
99
bám của vi sinh vật gây bệnh, phục hồi vi khuẩn chí bình thường cho ruột hay cho môi
trường, kích thích hệ thống miễn dịch không đặc hiệu của cơ thể vật chủ chống lại vi
sinh vật gây bệnh, hay tiết ra các chất có tính kháng sinh kháng được các vi sinh vật
gây bệnh.
Các vi khuẩn thường được dùng làm probiotic là Bacillus subtilis, Lactobacillus
acidophilus, Bifidobacterium...và thường được cung cấp dưới dạng bột ghi hàm lượng
và các loại vi khuẩn có trong sản phẩm. Do các vi khuẩn này thường là các vi khuẩn dễ
mọc nên chỉ với các phương tiện phòng thí nghiệm và các môi trường nuôi cấy thông
thường là có thể sản xuất được các sản phẩm probiotic nên hiện nay trên thị trường của
chúng ta xuất hiện khá nhiều sản phẩm probiotic được sản xuất từ rất nhiều cơ sở trong
và ngoài nước để sử dụng không chỉ cho gia súc, thủy sản mà cả cho người. Chính vì
tình trạng này nên có một vấn đề mà nhiều người rất quan tâm, đó là liệu chất lượng
của các sản phẩm probiotic hiện đang có mặt trong thị trường có thật sự đúng như nhà
sản xuất công bố hay không, đặc biệt là liệu các vi khuẩn được ghi trong nhãn hiệu sản
phẩm có đúng là vi khuẩn có trong sản phẩm hay không, và hàm lượng có đảm bảo
đúng như vậy hay không.
Để trả lời câu hỏi trên, trong năm 2008 phòng thí nghiệm NK-Biotek và bộ phận
R&D của Nam Khoa đã hướng dẫn một số đề tài tốt nghiệp luận văn Thạc Sĩ có nội
dung tìm hiểu chất lượng các sản phẩm probiotic dùng cho người và thủy sản hiện
đang lưu thông trên thị trường. Để kiểm tra hàm lượng thì giải pháp kỹ thuật không
khó, chỉ cần thực hiện cấy định lượng bằng phương pháp thạch đổ hay phương pháp
láng trên bề mặt môi trường dinh dưỡng và ủ ở điều kiện thích hợp là có thể cho được
kết quả định lượng chính xác hàm lượng vi khuẩn đích có trong mẫu sản phẩm cần
phải kiểm tra. Tuy nhiên để xác định chính xác tên vi khuẩn có trong sản phẩm có
đúng như tên được nêu trong nhãn sản phẩm hay không lại là một vấn đề không đơn
giản vì các vi khuẩn probiotic như B. subtilis, L. acidophilus...không phải là các vi
khuẩn dễ dàng được định danh đến loài nếu chỉ dựa vào các tính chất sinh vật hóa học.
Chính vì vậy, chúng tôi đã giải pháp PCR và giải trình tự gene 16s rDNA của vi khuẩn
phân lập được từ các sản phẩm probiotic để xác định danh tính của vi khuẩn. Kết quả
cho thấy có khá nhiều loại sản phẩm probiotic sử dụng cho người và cho thủy sản có
vấn đề về mặt chất lượng cả về hàm lượng lẫn về vi khuẩn thật sự có trong sản phẩm.
100
Bảng 13 và 14 trình bày kết quả cho thấy sự khác biệt giữa vi khuẩn thật sự có trong
sản phẩm probiotic so với kết quả được nhà sản xuất công bố trên nhãn.
STT Tên sản phẩm Tên vi khuẩn trên nhãn sản phẩm Kết quả PCR và giải trình tự 16sDNA
1 Biosubtyl DL Bacillus subtilis 107/gr Bacillus subtilis 106/gr
2 Bidisubtilis (gói giấy) Bacillus subtilis 108/gr Bacillus cereus 107/gr
3 Bidisubtilis (gói nhôm) Bacillus subtilis 108/gr Bacillus subtilis 106/gr
4 Bio – Acimin Bacillus subtilis 108/gr Bacillus cereus 107/gr
5 Biosubtyl II (gói) Bacillus subtilis 107/gr Bacillus pumilus 107/gr
6 Biosubtyl II (viên) Bacillus subtilis 108/gr Bacillus subtilis 108/gr
7 Subtyl Bacillus subtilis 107/gr Bacillus cereus 107/gr
8 Medilac – Vita Bacillus subtilis 106/gr Bacillus cereus 106/gr
9 Bio Baby Bacillus subtilis 106/gr Bacillus subtilis 106/gr
10 Bio Vita Bacillus subtilis 106/gr Bacillus subtilis 106/gr
Bảng 13: Kết quả định danh bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự 16s rDNA và kết quả định lượng các vi khuẩn thật sự có trong các probiotic sử dụng trên người
STT Tên sản phẩm Tên và lượng* vi khuẩn trên nhãn sản phẩm
Kết quả định danh và định lượng* thực tế
1 DT-LACTO Bacillus subtilis Lactobacillus acidophilus
Bacillus pumilus Không tìm thấyL. acidophilus
2 Bio-DW Bacillus subtilis 109/gr Lactobacillus acidophilus
Bacillus subtilis 106/gr Không tìm thấyL. acidophilus
3 Probiotex-one Bacillus subtilis B. megaterium
4 Vime-Subtyl Bacillus subtilis 1011/gr Bacillus subtilis 104/gr
5 Biozyme for fish Bacillus subtilis 109/gr Bacillus subtilis 106/gr
6 Novazyme F Bacillus subtilis 109/gr Bacillus subtilis 105/gr
7 Subtyl-LA Bacillus subtilis Bacillus pumilus
8 NPV-Prozyme 90 Bacillus subtilis 106/gr Lactobacillus acidophilus
Bacillus subtilis Không tìm thấyL. acidophilus 106/gr
9 ProKura Bacillus subtilis 109/gr Bacillus subtilis 107/gr
10 Men gấu vàng Bacillus subtilis Lactobacillus acidophilus
Bacillus cereus Không tìm thấyL. acidophilus
11 Biobac Bacillus subtilis Bacillus pumilus
12 Pond clear Bacillus subtilis 1011/gr Lactobacillus acidophilus
Bacillus subtilis 105/gr Không tìm thấyL. acidophilus
13 Bio Pond Bacillus subtilis 108/gr Lactobacillus acidophilus
Bacillus subtilis 105/gr Không tìm thấyL. acidophilus
14 Men Bac Bacillus subtilis Lactobacillus acidophilus
Bacillus cereus Không tìm thấyL. acidophilus
15 Microzyme Bacillus subtilis ? Lactobacillus acidophilus
Bacillus subtilis 105/gr Không tìm thấyL. acidophilus
16 Zymmix Lactobacillus acidophilus Acidovorax sp.
17 Lactovet Lactobacillus acidophilus Clostridium phylofermentant
18 Zeofarm Lactobacillus acidophilus 109/gr L. acidophilus 106/gr
*Chỉ nêu lên lượng các vi khuẩn mà định danh bằng PCR và giải trình tự cho thấy kết quả không sai lệch
Bảng 14: Kết quả định danh bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự 16s rDNA và kết quả định lượng* các vi khuẩn thật sự có trong các probiotic sử dụng cho thủy sản
101
Phân tích các dữ kiện trình bày trong hai bảng trên, chúng ta thấy đối với các sản
phẩm probiotic dùng cho người, sự sai biệt về hàm lượng giữa kết quả kiểm tra so với
công bố trên nhãn không nhiều (không quá 10 lần), nhưng có đến 50% tên vi khuẩn
công bố không đúng với kết quả định danh. Thậm chí có đến 4 sản phẩm lại sử dụng B.
cereus, vi khuẩn không được phép có mặt trong thực phẩm vì có khả năng gây tiêu
chảy và ói mữa do có thể chứa các toxin, làm vi khuẩn trợ sinh. Đối với các sản phẩm
probiotic dùng cho thủy sản, kết quả kiểm tra cho thấy đối với vi khuẩn B. subtilis, có
6/15 mẫu không phải là B. subtilis mà là B. cereus hay B. pumilus; và chỉ có một sản
phẩm là có chứa L. acidophilus còn hầu hết là không tìm thấy vi khuẩn này như công
bố trên nhãn. Hình 49 minh họa một kết quả giải trình tự gene 16s rDNA xác định vi
khuẩn là B. cereus trong khi nhãn sản phẩm lại là B. subtilis. Còn về mặt hàm lượng thì
thật thảm hại, trong các các sản phẩm được kiểm tra thật sự có vi khuẩn như công bố
thì đa số hàm lượng tụt giảm từ 104 đến 105 so với công bố. Kết quả của nghiên cứu là
một tiếng chuông báo động để các nhà sản xuất cũng như các cơ quan kiểm tra chất
Hình 49: Một chủng vi khuẩn phân lập từ một sản phẩm probiotic nếu chi dựa vào tính chất khuẩn lạc và nhuộm Gram thì không thể biết đây không phải là B. subtilis, nhưng khi giải trình tự 16s rDNA thì xác định được đây là B. cereus.
102
lượng nên quan tâm đến vấn đề chất lượng của các sản phẩm probiotic sử dụng cho
người và thủy sản hiện đang lưu hành tại Việt Nam; và để kiểm tra được chất lượng
các sản phẩm probiotic thì phải sử dụng PCR và giải trình tự gene 16s rDNA vì chỉ có
giải pháp này mới có thể định danh chính xác vi khuẩn được sử dụng làm probiotic,
tránh nhầm lẫn với các vi khuẩn không có tác dụng probiotic hay thậm chí có thể độc
hại.
Hình 50: Một phiếu lý lịch 16s rDNA của một chủng vi khuẩn dùng trong kiểm chuẩn với các thông tin về tính chất khuẩn lạc, hình ảnh Gram, các tính chất sinh hóa cơ bản, và quan trọng nhất là trình tự gene 16s rDNA
103
c. Xây dựng lý lịch 16s rDNA của các chủng vi khuẩn dùng trong kiểm chuẩn
Trong nội kiểm hay ngoại kiểm vi sinh, rất cần thiết phải dùng các chủng vi sinh
có lý lịch định danh chủng chính xác. Các phòng thí nghiệm vi sinh thường yêu cầu
cung cấp các chủng quốc tế với lý lịch xuất phát từ nhà cung cấp chủng. Hiện nay rất
khó để có thể đạt mua các chủng gốc quốc tế vì vấn đề nguy cơ khủng bố sinh học.
Chính vì vậy giải pháp hay nhất hiện nay là sử dụng các chủng gốc quốc tế hiện đang
lưu giữ tại các phòng thí nghiệm, thậm chí sử dụng các chủng gốc phân lập được
nhưng phải có lý lịch dịnh danh chính xác đến loài. Đứng trước yêu cầu này, phòng thí
nghiệm NK-Biotek và đơn vị R&D của Nam Khoa đã xây dựng lý lịch 16s rDNA của
tất cả các chủng quốc tế ATCC, cũng như một số chủng phân lập được và tiêu biểu cho
các giống và loại vi khuẩn cần cho kiểm chuẩn. Hình 50 minh họa một lý lịch 16s
rDNA của 1 chủng vi khuẩn được phòng thí nghiệm NK-Biotek và đơn vi R&D của
Nam Khoa để cung cấp dùng trong kiểm chuẩn.
Hình 51: Một kết quả định danh bằng PCR và giải trình tự 16s rDNA của một chủng vi sinh công nghiệp cho thấy đây là Acrobacterium tumefaciens, là vi khuẩn rất khó định danh bằng vi sinh kinh điển
104
d. Làm xét nghiệm dịch vụ định danh vi khuẩn
Cũng với công nghệ PCR và giải trình tự 16s rDNA của vi khuẩn, phòng thí
nghiệm NK-Biotek và đơn vị R&D của Nam Khoa đã và đang thực hiện dịch vụ định
danh các vi khuẩn được dùng trong vi sinh công nghiệm cũng như vi sinh nông nghiệm
được gửi đến từ các công ty, nhà máy, hay từ các yêu cầu của các đề tài nghiên cứu.
Mẫu được gửi đến để định danh có thể là các chủng vi khuẩn cấy trên môi trường nuôi
cấy, hay là các dịch tách chiết DNA, hay huyền dịch vi khuẩn. Có thể nói với giải pháp
kỹ thuật PCR và giải trình tự gene 16s rDNA, các vi khuẩn dù lạ đến đâu, dù khó định
danh đến đâu cũng đều được định danh đến loài. Hình 51 là kết quả một chủng vi
khuẩn dùng trong vi sinh công nghiệm được yêu cầu định danh, và kết quả định danh
cho thấy đây là vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
2. Ứng dụng kỹ thuật PCR và giải trình tự để định danh vi nấm
Trong các xét nghiệm vi sinh thì định danh vi nấm có lẽ là một trở ngại lớn nhất vì
nếu sử dụng các phương pháp kinh điển thì không chỉ phân tích hình thái đại thể và vi
thể, vốn dĩ phức tạp và công phu, mà còn phải làm cho được các khảo sát sinh vật hóa
học khác như đồng hóa đường, phân tích các chất biến dưỡng...Chính vì vậy thông
thường ít có phòng thí nghiệm vi sinh làm được xét nghiệm vi nấm.
Nhận diện được trở ngại kỹ thuật chính yếu này, phòng thí nghiệm NK-Biotek và
đơn vị R&D công ty Nam Khoa đã cố gắng tìm giải pháp vượt qua, và sau một thời
gian nghiên cứu - thử nghiệm, đã xây dựng được một giải pháp kỹ thuật đó là sử dụng
PCR và giải trình tự gene 28s rDNA. Nguyên tắc của giải pháp này là sử dụng bộ NKFUNGI-DNAPREP do đơn vị R&D của công ty Nam Khoa chế tạo để tách chiết
DNA toàn phần từ mẫu vi nấm hay mẫu thử chứa vi nấm cần định danh, sau đó sử
dụng PCR với một cặp mồi được đặt tên là NK28s-F và NK28s-R đặc hiệu một đoạn
DNA dài khoảng 260 bps có chứa các trình tự đặc hiệu giống và loài của vi nấm trên
gene 26s rDNA, và sau cùng là giải trình tự trực tiếp và 2 chiều sản phẩm PCR để định
danh vi nấm qua blast search trên ngân hàng dữ liệu gene của NCBI.
Ứng dụng giải pháp kỹ thuật này, phòng thí nghiệm NK-Biotek và đơn vị R&D
của công ty Nam khoa đang thực hiện rất thành công hai dịch vụ, đó là:
105
Cand ida orthopsilosis1 (2%)
M alassezia rest rict a 2 (3%)
Rhinocladiella at rovirens3 (5%)
Penicit rium cit rinum3 (5%)
X ylaria curta1 (2%)
Schizophyllum cominune1 (2%)
Pichia guilliermondii1 (2%)
Pseudallescheria boydi4 (7%)
A spergillus f lavus2 (3%)
A spergillus oryzae11 (19%)
Aspergillus fumigatus23 (40%)
Aspergillus niger4 (7%)
Neosartorya f ischeri 2 (3%)
Biểu đồ 12: Tổng kết các kết quả phát hiện và định danh nấm bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự 28s rDNA trong các mẫu bi nấm lấy từ mổ viêm xoang trên bệnh nhân
a. Phát hiện và định danh vi nấm trong các bi nấm lấy ra từ phẫu thuật bệnh nhân
viêm xoang
Trước đây, các bệnh phẩm bi nấm (fungus ball) thường được các bác sĩ tai mũi
họng gửi đến phòng thí nghiệm giải phẩu bệnh và kết quả thường được nhận về sau 1
tuần là nhìn thấy vi thể các sợi tơ nấm nghi Aspergillus. Hiện nay với xét nghiệm PCR
và giải trình tự được thực hiện tại phòng thí nghiệm NK-biotek thì các nhà lâm sàng sẽ
có kết quả sau 2 ngày với định danh vi nấm đến loài. Biểu đồ 12 tổng kết các kết quả
phát hiện và định danh vi nấm trong các bi nấm được bệnh viện Tai Mũi Họng TP.Hồ
Chí Minh gửi đến trong thời gian gần đây. Có tổng cộng 58 mẫu được gửi đến làm xét
nghiệm, và cả 58 đều phát hiện và định danh được vi nấm là tác nhân gây bệnh.
b. Dịch vụ định danh vi nấm
Trên cơ sở của kỹ thuật PCR và giải trình tự gene 28s rDNA, phòng thí nghiệm
NK-Biotek và đơn vị R&D của công ty Nam Khoa triển khai được xét nghiệm dịch vụ
định danh vi nấm với các nguồn mẫu là từ các công ty, nhà máy trong lĩnh vực công
nông nghiệp, hay là từ các phòng thí nghiệm của các trường đại học hay của các trung
tâm nghiên cứu. Có thể nói là cho đến nay, hầu như không có mẫu vi nấm nào gửi đến
phòng thí nghiệm NK-Biotek là không có kết quả định danh. Hình 52 và hình 53 minh
họa hai kết quả định danh nấm trong xét nghiệm dịch vụ định danh vi nấm của NK-
Biotek.
106
3. Ứng dụng PCR và giải trình tự để phát hiện, định lượng và xác định genotype
HCV
Phát hiện, định lượng và xác định genotype HCV là các thông số mà bác sĩ cần
phải biết trước khi cho chỉ định điều trị đặc hiệu bằng interferon phối hợp với ribavirin
là phát đồ điều trị chuẩn cho bệnh nhân có antiHCV [+]. Phát hiện HCV-RNA để xác
định là bệnh nhân đang nhiễm HCV, định lượng HCV-RNA là để xác định lượng virus
trước khi bắt đầu điều trị và làm cơ sở để theo dõi hiệu quả điều trị, còn xác định
genotype HCV là để giúp bác sĩ điều trị quyết định được thời gian điều trị cho bệnh
nhân. Thông thường các phòng thí nghiệm lâm sàng sẽ phải thực hiện các yêu cầu này
riêng lẽ, nghĩa là họ phải phát hiện HCV-RNA trước, rồi mới định lượng, và cuối cùng
Hình 52: Vi nấm có hình dạng vi thể hình hạt men như góc trên trái cho kết quả PCR và giải trình tự 28s rDNA như bên dưới, và từ trình tự này kết quả blast search trên ngân hàng gene NCBI cho kết quả định danh Candida tropicalis với độ tương đồng 99%.
Hình 53: Vi nấm có hình dạng vi thể hình que dài như góc trên trái cho kết quả PCR và giải trình tự 28s rDNA như bên dưới, và từ trình tự này kết quả blast search trên ngân hàng gene NCBI cho kết quả định danh Rhinocladiella atrovirens với độ tương đồng 99%.
107
mới định genotype HCV và thường thì
do yêu cầu kỹ thuật nên các xét
nghiệm này đều phải bắt đầu từ mẫu
huyết thanh của bệnh nhân. Công ty
Nam Khoa lại sử dụng một tiếp cận
khác rất mới mẽ, tiện lợi, và ít tốn kém
hơn để phát triển một giải pháp toàn
diện thực hiện được các yêu cầu này
của bác sĩ cùng một lúc. Đó là giải
pháp sử dụng RT real-time PCR để
phát hiện và định lượng HCV-RNA
trong mẫu huyết thanh bệnh nhân và
sau đó giải trình tự trực tiếp sản phẩm
real-time PCR để xác định genotype
HCV bằng cách so chuỗi trình tự giải
được với ngân hàng dữ liệu genotype
HCV trên thư viện NCBI và thư viện
Los Alamos.
Để xác định genotype HCV, ngoài
lý do là một mắt xích của giải pháp
toàn diện như đã nêu ở trên, công ty
Nam Khoa chọn tiếp cận giải trình tự
vì còn có nhiều lý do: (1) Nếu sử dụng
kit InoLIPA của Siemen (Bayer) là kit
được các nhà y học thừa nhận thì sẽ là
một lựa chọn khá tốn kém vì giá thành
của kit này khá cao, kết quả có đôi khi
không phân biệt được subtype, và với
version cũ thì có sự nhầm lẫn giữa 6a và 1b; (2) Nếu sử dụng kỹ thuật giải trình tự
vùng 5’NC của HCV bằng hệ thống giải trình tự kín Trugene của Siemen (Bayer) dù
rất được nhiều nhà y học thừa nhận, nhưng cũng sẽ là một lựa chọn tốn kém vì giá
Yêu cầu xác định
genotype HCV
Định lượng HCV-RNA bằng xét nghiệm
RT-qPCR sử dụng kit NKRT-HCVqPCR
Xác định genotype HCV: giải trình tự trực tiếp sản phẩm HCVqPCR (#200bp trên vùng 5’NC)
ABI 3130XL (16 capillaries)
CEQ8000 (8 capillaries)
KẾT QUẢ 24 giờ sau khi nhận mẫu
Định lượng 37.017 copies/ml
Kiểu gene 1c
Hình 54: Qui trình RT-realtime PCR và giải trình tự vùng 5’NC để phát hiện, định lượng và định genotype HCV
108
Biểu đồ 13: Phân bố các genotype HCV trong 2000 mẫu huyết thanh bệnh nhân nhiễm HCV được gửi đến xét nghiệm tại phòng thí nghiệm NK-Biotek trong năm 2008
thành của các vật liệu tiêu hao đi kèm theo hệ thống này rất cao; (3) Sử dụng phương
pháp real-time PCR với các probe đặc hiệu là một tiếp cận đơn giản và rẻ tiền nhưng
không đủ nhạy cảm cho chẩn đoán vì vùng khuếch đại không phải là vùng 5’ NC (là
vùng được công nhận là nhạy cảm nhất cho chẩn đoán), không có khả năng phân biệt
cao các subtype thường gặp vì khó thiết kế được các probe đặc hiệu đến subtype, và
nguy cơ phát hiện chéo không đặc hiệu mà vẫn được lầm tưởng là có khả năng phát
hiện đồng nhiễm.
Chính vì các lý do trên, Phòng thí Nghiệm Y Khoa NK-BIOTEK và công ty Nam
Khoa đã nghiên cứu và xây dựng được phương pháp xét nghiệm xác định genotype
HCV bằng kỹ thuật giải trình tự vùng 5’NC của HCV nhưng thay vì sử dụng hệ thống
giải trình tự kín của Trugene, sử dụng hệ thống giải trình tự mở của ABI (máy ABI
3130XL có 16 mao quản) hay của Beckman Coulter (máy CEQ8000 có 8 mao quản).
Tiếp cận này đã mang đến cho bệnh nhân và các nhà lâm sàng nhiều lợi điểm: (1) Nhờ
giải trình tự trực tiếp được sản phẩm PCR từ real-time PCR sử dụng mồi và taqman
probe đặc hiệu vùng 5’NC nên kết quả xét nghiệm xác định genotype luôn đi kèm với
kết quả định lượng HCV-RNA. Do vậy các nhà lâm sàng trước khi quyết định điều trị
đặc hiệu cho bệnh nhân chỉ cần cho một chỉ định xét nghiệm xác định genotype HCV
là đủ mà không cần cho thêm xét nghiệm định lượng. (2) Đạt được độ nhạy cho chẩn
đoán nhờ sản phẩm đích để giải
trình tự xác định genotype HCV
chính là sản phẩm PCR dựa trên
vùng đích 5’NC là vùng duy nhất
trên genome HCV được thừa
nhận là đủ nhạy cảm để làm chẩn
đoán xác định và định lượng
HCV. (3) Đạt được độ chính xác
trong xác định genotype HCV
không khác biệt với hệ thống giải
trình tự kín Trugene nhờ giải
trình tự đúng ngay đoạn đích mà hệ thống Trugene sử dụng trên vùng 5’-NC của
genome HCV. (4) Nhà lâm sàng hay nghiên cứu còn được cung cấp thông tin về trình
109
tự vùng 5’NC đã giải được và các thông tin này rất quí giá trong các nghiên cứu về
phylogenetic để góp phần trong nghiên cứu nguồn gốc nhiễm trùng hay nghiên cứu
đồng nhiễm HIV/HCV.
Hình 54 tóm tắt qui trình phát hiện, định lượng và định genotype HCV bằng kỹ
thuật RT real-time PCR trên đích là vùng 5’ NC của bộ gene HCV rồi sau đó giải trình
tự trực tiếp sản phẩm PCR để xác định genotype HCV. Trong năm 2008, tổng kết 2000
mẫu xét nghiệm định genotype HCV thực hiện tại phòng thí nghiệm NK-Biotek, chúng
tôi nhận thấy đa số genotype của HCV nhiễm trên bệnh nhân là 1b (58%), kế đó là 6a
(17%). Biểu đồ 13 tổng kết sự phân bố các genotype HCV trong 2000 mẫu huyết thanh
bệnh nhân nhiễm HCV được gửi đến xét nghiệm tại phòng thí nghiệm NK-Biotek
trong năm 2008.
4. Áp dụng PCR và giải trình tự để phát hiện đột biến kháng thuốc của HBV
Hiện nay tại Việt Nam, nhờ các tiến bộ về kỹ thuật sinh học phân tử định lượng
được HBV để làm cơ sở đánh giá hiệu quả điều trị; và phát đồ cũng như các thuốc có
khả năng điều trị bệnh viêm gan virus B mạn tính luôn có sẵn trên thị trường để bác sĩ
dễ dàng lựa chọn, nên việc điều trị đặc hiệu cho bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính
đã phổ biến hơn. Tuy nhiên, điều trị đặc hiệu bệnh lý viêm gan virus B mạn tính bằng
các thuốc kháng virus là một điều trị lâu dài. Chính vì vậy nên HBV (virus viêm gan B,
hepatitis B virus) có cơ hội tiếp xúc lâu dài với các thuốc kháng virus và tạo được các
đột biến kháng thuốc, và từ đấy nảy sinh ra yêu cầu phải có xét nghiệm phát hiện các
đột biến kháng thuốc của HBV, đặc biệt đối với các thuốc như lamivudine, adefovir và
entecavir là các thuốc thường được sử dụng hiện nay.
Để phát hiện đầy đủ các đột biến kháng các thuốc nêu trên, nếu chọn tiếp cận real-
time PCR hay PCR-RFLP thì chỉ có thể phát hiện được rất ít đột biến kháng thuốc của
HBV vì có quá nhiều các biến thể của HBV đã làm cho việc thiết kế các probe phát
hiện đột biến hay thiết kế các vị trí để enzyme cắt giới hạn nhận diện bị khó khăn rất
nhiều. Hơn nữa cho đến hiện nay, y văn chỉ mới báo cáo có real-time PCR và PCR-
RFLP phát hiện đột biến kháng lamivudine ở hai vị trí 180 và 204 trong khi đó còn
nhiều đột biến nữa không chỉ tạo cho virus kháng lamivudine, mà cả adefovir và
entecavir nữa. Chọn tiếp cận như vậy chắc chắn sẽ không đáp ứng được thực tế.
110
Do vậy phòng thí nghiệm NK-
BIOTEK và công ty Nam Khoa đã
chọn một tiếp cận khác dựa trên
phương tiện và trang thiết bị hiện
đại đang có ở công ty, đó chính là
tiếp cận PCR và giải trình tự một
đoạn DNA dài 550 bps trên vùng
gene preS để làm xét nghiệm phát
hiện các đột biến kháng
Lamivudine, Adefovir và
Entecavir. Xét nghiệm dựa trên tiếp
cận này hiện nay đang được nhiều
nhà lâm sàng và nghiên cứu y học
tin cậy nhờ các ưu điểm sau: (1)
Phát hiện được hầu hết các vị trí
đột biến có thể xảy ra để gây ra
kháng 3 loại thuốc trên; (2) Với độ
nhạy cảm của thiết bị giải trình tự
hiện nay (sequencer ABI 3130XL,
giải hai chiều), không chỉ tất cả các
điểm đột biến kể trên đều được giải
đến, mà cả tình trạng heterozygote
của đột biến/hoang dại vẫn được
phát hiện; (3) Với trình tự giải
được, kết quả xét nghiệm còn cung
cấp thông tin một cách chính xác
về genotype của HBV mà không
cần phải có chỉ định xét nghiệm
này từ lâm sàng. Hình 55 mô tả qui trình xét nghiệm PCR và giải trình tự gene preS để
phát hiện các đột biến kháng thuốc và xác định genotype HBV, trong đó kết quả phát
hiện đột biến được trình bày trong một bảng liệt kê các vị trí đột biến đột biến kháng
Yêu cầu tìm đột biến kháng thuốc của HBV
PCR khuếch đại đọan đặc hiệu 550bps trên vùng
gene preS của HBV
Tìm đột biến kháng thuốc: giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR 550bps từ vùng gene preS
ABI 3130XL (16 capillaries)
KEÁT QUAÛ (24 giôø sau khi nhaän maãu)
Genotype Genotype C
Phát hiện đột biến
TAATTTGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCTTGTCCTCCAATTTGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTACCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTACTTCCAGGAACATCAACTACCAGCACGGGACCATGCAAGACCTGCACGATTCCTGCTCAAGGAACCTCTATGTTTCCCTCTTGTTGCTGTACAAAACCTTCGGACGGAAATTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCTTGGGCTTTCGCAAGATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAACATCTTGAATCCCTTTTTACCGCTGT
Kháng Lamivudine
KQ
Kháng Adefovir
KQ
Kháng Entecavir
KQ
I169T K L80V/I K T184G K V173L K S85A K S202I K L180M Coù V84M K M250V K A181T K A181V/T K T184S K V214A K M204I Coù Q215S K
V207M/I K N236T K Q215S K
Hình 55: Qui trình xét nghiệm phát hiện đột biến kháng thuốc và xác định genotype của HBV bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự một đọan DNA 550 bps trên gene PreS của HBV
111
lamivudine, adefovir và entecavir đã được các nhà nghiên cứu ghi nhận và tất cả các vị
trí đột biến này đều nằm trong trình tự được
giải.
Trong năm 2008, phòng thí nghiệm
NK-Biotek của công ty Nam Khoa đã thực
hiện được 455 xét nghiệm PCR và giải trình
tự vùng gene PreS của HBV, kết quả cho
thấy có đến 69% các trường hợp là thuộc
genotype B và 31% là genotype C, không
có các genotype khác. Có 46% phát hiện có
đột biến kháng lamivudine với 30% ở vị trí
204, 9% ở hai vị trí 204 và 207, 6.5% ở 204 và 180, và 0.5% đột biến cả 204, 180 và
207. Kết quả này được trình bày trong biểu đồ 14.
5. Áp dụng PCR và giải trình tự phát hiện đột biến precore/ promoter và genotype
HBV
Trong quá trình phản ứng với các đáp ứng miễn dịch từ bệnh nhân, HBV có thể bị
đột biến precore và đột biến core promoter. Đột biến precore là đột biến tại vị trí
nucleotide 1896 từ G thành A (G1896A) làm cho codon TGG trở thành TAG là một
stop codon. Đột biến này đã làm cho HBV không thể tổng hợp được HBeAg. Do vậy,
khi thử máu bệnh nhân, không phát hiện được HBeAg mà HBV-DNA vẫn tồn lại cùng
với HBeAb [+]. Đây là một đột biến rất quan trọng cần phải được phát hiện vì bệnh
nhân sẽ có nguy cơ cao vào xơ gan hay ung thư gan, đặc biệt khi phát hiện được thêm
đột biến core promoter tại hai vị trí nucleotide 1762 và 1764 (A1762T, G1764A). Khi
bệnh nhân bị phát hiện mang HBV có các đột biến này thì phải được điều trị bằng
thuốc kháng virus suốt đời. Chính vì tầm quan trọng đối với lâm sàng như vậy nên
trong thời gian qua phòng thí nghiệm NK-BIOTEK & công ty Nam Khoa đã xây dựng
được kỹ thuật PCR và giải trình tự vùng gene core để làm xét nghiệm phát hiện đột
biến precore và đột biến core promoter và không chỉ vậy, còn cho biết thêm về
genotype HBV. Hình 56 minh họa qui trình này.
Xét nghiệm này hiện nay đang được nhiều nhà lâm sàng và nghiên cứu y học quan
tâm và tin cậy. Trong năm 2008, phòng thí nghiệm NK-Biotek và công ty Nam Khoa
29.89
8.796.59
0.45
54.28
0
10
20
30
40
50
60
204 204+207 204+180 204+180+207 Khoâng ÑB
Biểu đồ 14: Sự phân bố tỷ lệ các vị trí đột biến kháng lamivudine phát hiện được
112
đã thực hiện 134 mẫu xét nghiệm đột
biến precore và core promoter của
HBV trên các bệnh nhân bị bác sĩ điều
trị nghi ngờ có đột biến precore/core
promoter. Kết quả cho thấy có đến 73%
phát hiện đột biến với nhiều kiểu đột
biến khác nhau, có thể chỉ đột biến
precore, có thể chỉ đột biến core
promoter, có thể đột biến cả promoter
và core promoter. Các thông tin này sẽ
rất hữu dụng để các nhà y học có thể
nghiên cứu sâu hơn về mối liên hệ với
lâm sàng, bệnh học và sinh bệnh học.
Biểu đồ 15 trình bày tỷ lệ phân bố các
kiểu đột biến phát hiện được.
6. PCR và giải trình tự phát hiện đột
biến kháng rifampicine và INH
của M. tuberculosis
Từ năm 1996, chúng tôi đã bắt đầu
triển khai kỹ thuật PCR phát hiện M.
tuberculosis và cho đến hiện nay xét
nghiệm PCR phát hiện M. tuberculosis
do chúng tôi phát triển này đã được các
nhà y học trong nước chấp nhận nhờ độ
nhạy cảm rất cao so với khảo sát trực
tiếp và nuôi cấy. Với PCR, kết quả phát
hiện M. tuberculosis có thể đến tay nhà
lâm sàng chỉ 24 giờ sau khi gửi mẫu đi
xét nghiệm. Nhờ ưu điểm nhanh chóng
và nhạy cảm nên có thể nói công cụ
PCR đã mang đến một lợi ích không
Yêu cầu tìm đột biến
precore/promoter của HBV
PCR khuếch đại đọan đặc hiệu 250bps trên vùng
gene core của HBV
Tìm đột biến precore/promoter: giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR 250bps từ vùng gene core
ABI 3130XL (16 capillaries) hay CEQ8000 (6 capillaries)
KẾT QUẢ (24 giờ sau khi nhận mẫu)
Bệnh nhân có HBeAg- HBeAb+,
HBVDNA+, ALT ↑↓ bất thường
Hình 56: Qui trình PCR và giải trình tự phát
hiện đột biến precore/promoter
3626%
3828%
2820%
2719%
21%
96%
G1896A
A1762T, G1764A
G1896A A1762T, G1764A
Không đột biến
A1762T
G1896A A1762T
Biểu đồ 15: Tỷ lệ phân bố các kiểu đột biến precore/core promoter phát hiện được trong 134 mẫu xét nghiệm
113
chối cãi trong lĩnh vực chẩn đoán lao, vượt qua các công cụ vi sinh kinh điển. Một vấn
đề hiện nay đang được các nhà y học quan tâm là làm thế nào có thể có được kết quả
kháng sinh đồ vi khuẩn M. tuberculosis với thời gian ngắn hơn, vì với phương pháp vi
sinh kinh điển thì kết quả kháng
sinh đồ chỉ có thể có được sau
hơn 2 tháng với 1 tháng để có
được vi khuẩn mọc được trên
môi trường nuôi cấy và 1 tháng
để có kết quả kháng sinh đồ.
Thông tin về kháng sinh đồ mà
bác sĩ cần biết nhất là liệu vi
khuẩn phân lập trên bệnh nhân
có đề kháng với thuốc kháng
lao rifampicin, được coi là hiệu
quả nhất cho đến hiện nay hay
không để có thể tiếp tục duy trì
hay chỉ định cho bệnh nhân
công thức kháng lao có
rifampicine.
Trước thực tế đòi hỏi này,
phòng thí nghiệm NK-Biotek
và đơn vị R&D công ty Nam
405 427 Leu Ser Gln Phe Met Asp Gln Asn Asn Pro Leu Ser Gly Leu Thr His Lys Arg Arg Leu Ser Ala Leu CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC AAC CCG CTG TCG GGG TTG ACC CAC AAG CGC CGA CTG TCG GCG CTG
Pro CCG
Leu CTA
Val GTC
/..../ Dele
Leu TTG
Tyr TAC Asp GAC Gln
CAG Asn AAC Arg
CGC Pro
CCC
Leu TTG Gln
CAG Trp
TGG
Pro CCG
(3%) (3%) (9%) (1%) (1%) (1%)
(28%)
(52%)
Hình 57: Vùng nóng với các đột biến trên rpoB gene và tỷ lệ thường xãy ra
Yêu cầu PCR phát hiện MTB Tìm đột biến kháng Rifampicine và INH
PCR phát hiện MTB dựa trên khuếch đại trình tự 249bp trên IS6110
PCR khuếch đại trình tự đặc hiệu chứa các đột biến trên rpoB, katG, và inhA
Kết quả phát hiện MTB trong vòng 24giờ
Giải trình tự phát hiện đột biến rpoB, katG và inhA
Đột biến rpoB L430P S431G Q432K/L 433 ins TTC(phe : F) D435G/A/V 440 ins TCGGGGTTG H445N/D/Q/S/R/L/Y/F S450L L452P I480V
Đột biến katG S315T
Đột biến inhA C-15T
Kết quả kháng sinh đồ MTB 72 giờ sau khi lấy mẫu đàm
Hình 58: Mô tả qui trình PCR và giải trình tự để phát hiện các đột biến kháng rifampicin và INH của vi khuẩn M. tuberculosis trực tiếp từ mẫu đàm mà không phải qua nuôi cấy. Kết quả đến tay các nhà lâm sàng chỉ 72 giờ sau khi lấy mẫu đàm
114
Khoa đã nghiên cứu và thử nghiệm một qui trình PCR và giải trình tự để khuếch đại
một vùng nóng của gene rpoB của M. tuberculosis để có thể phát hiện được tất cả các
đột biến thường xảy ra tạo cho vi khuẩn kháng được rifampicine (hình 57).
Ngoài vùng nóng này, chúng tôi cũng đã thành công trong xây dựng một qui trình
phát hiện đề kháng INH bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự gene katG để phát hiện vị
trí đột biến thường gặp là S315T và gene inhA để xác định vị trí đột biến C-15T. Hiện
nay qui trình này đã được chúng tôi áp dụng để phát hiện trực tiếp các đột biến kháng
thuốc này từ bệnh phẩm mà không cần thiết phải qua nuôi cấy. Hình 58 minh họa tóm
tắt qui trình được phòng thí nghiệm NK-Biotek thực hiện để phát hiện MTB và cho
luôn kết quả kháng sinh đồ chỉ 72 giờ sau khi lấy mẫu đàm từ bệnh nhân. Hiện nay
chúng tôi đang tiếp tục nghiên cứu để có thể có thêm các kết quả kháng sinh đồ phát
hiện các đột biến kháng các thuốc kháng lao khác như ethambutol, PAS, PZA,
Ofloxacin...để có thể đáp ứng được một cách đầy đủ các yêu cầu đến từ các nhà lâm
sàng trong cuộc chiến đấu chống lại tình hình lao đa kháng ngày càng trầm trọng hiện
nay.