9.12.2010

1

KLINIČKA BIOHEMIJA

Prof. dr Gordana Grubor-Lajšić

Želim Vam prijatan i uspešan rad!

9.12.2010

2

Metode u kliničkoj biohemiji

Spektrofotometrija

9.12.2010

3

Hromatografija – na koloni

Jonoizmenjivačka hromatografija

9.12.2010

4

Gel-filtracija

Afinitivna hromatografija

9.12.2010

5

Elektroforeza

SDS-PAGE

9.12.2010

6

2D elektroforeza

2D - autoradiogram

9.12.2010

7

Imunološke metode

RIA metode

9.12.2010

8

ELISA

9.12.2010

9

Imunobloting

Biohemijski testovii njihova interpretacija

9.12.2010

10

Klinička (medicinska) biohemija

• proučava hemijski sastav organizma u svetlu fiziološkihi patoloških procesa kod čoveka

• u cilju

– postavljanja dijagnoze

– praćenja terapije

– toka i prognoze bolesti

Kliničko (biohemijsko) ispitivanje

laboratoriskim testovima za odredjivanje:

– supstanci normalno prisutnih u krvi (glukoza, kalcijum)

– ne-funkcionalnih metabolita ili krajnjih (nepoželjnih) produkata (kreatinin, urea)

– metabolita ili enzima koji indiciraju ćelijsko oštećenje ibolest (enzimi jetre – ALT; kardialni enzimi – CK-MB)

– lekova ili toksina

9.12.2010

11

Istorijat

• medicinska biohemija stara koliko i medicina

– Hipokrat – važnost izgleda urina u vezi sa bolešću

– u XVII veku proučavanjem živih bića bavi se organska hemija

– XIX vek – posebna disciplina o hemiji čoveka-fiziološka hemija, uvodi se naziv biohemija

– 30-tih godina prošlog veka – klinička biohemija

A danas...

9.12.2010

12

Izbor testova

• I - na bazi simptoma pacijenta

• II - skrining

(set testova bez obzira na kliničke indikacije)

I - na bazi simptoma pacijenta

• I - izbor testova nakon uzimanja anamneze (80% pacijenata) je logičan i omogućava

– potvrdu dijagnoze– pomaže kod diferenciranja dijagnoze– utvrdjuje intenzitet bolesti– monitor program (progresija bolesti ili odgovor na

terapiju)– detektovanje komplikacija ili sporednih efekata

9.12.2010

13

II – skrining

• opšta ispitivanja, bez jasne kliničke indikacije, sprovode se u slučaju

– skrining u zdravoj populaciji da se detektuju ranisimptomi bolesti

– skrining kod osoba izloženih visokom rizikuobolevanja od odredjene bolesti

– sprovodjenje testova funkcionalnosti odredjenihorgana

– sprovodjenje rutinskih testova pri prijemu u zdravstvenu ustanovu

Uzimanje uzoraka

• većina kvantitativnih hemijskih analiza se radi u krvi(serum, plazma), urinu (često 24-ro časovnom), cerebrospinalna tečnost (CSF, likvor - tečnost koja oblaže mozak i kičmenu moždinu), intestinalnim sekretima, fecesu, kamencima, znoju, amnionskoj tečnosti, pljuvačci

• priprema pacijenta (najčešće posle perioda ne uzimanjahrane)

9.12.2010

14

• od posebne je važnosti uzimanje, čuvanje i transport uzoraka

• oznake na uzorku i obrascu

– ime pacijenta i broju knjizi protokola

– test koji treba uraditi

– gde poslati rezultat

– da li je uzorak možda infektivan

Faktori koji utiču na rezultate testa

• dijeta (kod odredjivanja glukoze, triglicerida…)

• lekovi (podaci neophodni pri uzimanju uzorakaposebno kod toksikoloških ispitivanja)

• različito doba dana (diuralne varijacije) (koncentracijamnogih supstanci se menja u toku dana i vremeuzimanja uzoraka mora se poštovati)

9.12.2010

15

Uzimanje uzoraka krvi

• položaj pacijenta - standardizovati

• koža na delu odakle se uzima uzorak – čista i suva

• najbolje direktno uzimanje krvi iz vene (venepunktiranje)

• poseban postupak pri infuziji (kroz intravenozni sistem igluili kanilu prvo isprati sa krvlju)

• krv iz vene uzimati uz minimalnu stazu

• izbegavati hemolizu

• imati u vidu mogućnost infektivnog uzorka

• serum – bistra, žućkasta tečnost– izdvaja se centrifug. nakon koagulacije

(3000 rpm)– fibrinogen se konvertuje u fibrin i tako

uklanja• plazma – krv bez krvnih ćelija, žućkasta,

bistra tečnost– izdvaja se centrifugiranjem (može odmah

posle vadjenja krvi)– koagulacija se sprečava antikoagulansima

• heparin, EDTA, citrat, oksalat…

9.12.2010

16

• hemolizat

– “oprani” eritrociti, u izotoničnom rastvoru (0,15mM NaCl), bez tragova plazme

– hemoliza se postiže u hipotoničnom rastvoru (voda), zamrzavanjem/odmrzavanjem

– centrifugiranjem (10000 g) odvoje se membrane

Čuvanje uzoraka

• osim acido-baznih merenja i nekih nestabilnihhormona, koncentracija većine supstanci je stabilna u krvi do tri sata ili duže u plazmi ili serumu

• uzorci pune krvi se ne drže u frižideru, dok je uzorkeseruma ili plazme bolje držati u frižideru

9.12.2010

17

• najvažnije promene do kojih dolazi u punoj krvi, a kojemogu uticati na analize

– glukoza se konvertuje u laktat (sprečava se dodatkomfluorida)

– zbog disfunkcije eritrocita dolazi do hemolize– gubi se CO2, jer je pCO2 krvi veći nego u vazduhu– povećava se koncentracija fosfata u plazmi zbog

hidrolize fosfata eritrocita– labilni enzimi gube aktivnost

Uzimanje i čuvanje uzoraka urina

• urin se može uzimati:

– jednokratno (random)

– sakupljati (u toku 24 sata, za klirens)

• kod sakupljanja uzoraka urina voditi računa

– uzimanje u odgovarajućem vremenu

– dodati konzervans, ili držati urin u frižideru

– deo uzorka (npr. 25 ml) je dovoljan za analizu, ali morabiti naznačena zapremina celog uzorka

9.12.2010

18

� neki testovi su grupisani i rade se u isto vreme (panel) zaprocenu stanja i funkcije odredjenog organa ili stanja

� tiroidni panel

� panel funkcije jetre

� kardialni panel

� panel bubrežne funkcije

� osnovni metabolički panel

Laboratorijski podaci

• većina laboratorijskih biohemijskih podataka sunumeričke vrednosti koncentracije ili aktivnosti, izraženih u odgovarujućim jedinicama

• g/L, mg/L, mol/L, mmol/L, µmol/L, nmol/L, pmol/L

• IU/L, mIU/L

9.12.2010

19

Izvori variranja u rezultatima testa

– analitički

– biološki

– patološki faktori

Analitički izvori varijacija

• tačnost

• preciznost

• lične greske

xx

xx

xxxxxxxx

nedovoljno tačno ni precizno

precizno ali ne i tačno

zadovoljavajuće tačno i precizno

9.12.2010

20

• tačnost - dobijeni rezultati odgovaraju pravim vrednostima• preciznost - pri ponavljanju se dobijaju slični rezultati (ne

mora da odgovaraju pravim vrednostima)• pojedinačne vrednosti koncentrisane oko srednje

vrednosti• standardna devijacija (SD) najčešće mera odstupanja

od srednje vrednosti– 68% rezultata u oblasti ± 1SD– 95% rezultata u oblasti ± 2SD– 99% rezultata u oblasti ± 3SD

• lične greške

Biološki uzroci varijacija (različiti fiziološkifaktori)

• na variranje kod iste osobe utiče

– ishrana, doba dana, položaj pri uzimanju krvi, telesne vežbe, normalno fiziološko stanje, lekovi

• na variranje izmedju različitih osoba utiče

– starost, pol, rasa

9.12.2010

21

Interpretacija rezultata

• za adekvatno interpretiranje dobijenih rezultata, neophodno je

– imati podatke za referentni opseg (imati u vidu starost i pol)

– imati podatke za referentni opseg kod bolesti na koju se sumnja

– imati podatke o prevalenci odredjene bolesti u populaciji kojoj pacijent pripada

Referentni opseg

• referentne vrednosti– dobijene serijom analiza (uglavnom kod zdravih osoba)– najbolje imati podatke iste osobe pre nastupanja bolesti– u praksi, davaoci krvi najčešće izabrana referentna grupa– važnost referentnih vrednosti osoba sa odredjenom

dijagnozom• “normalne vrednosti“

– referentni opseg je bolji termin, s obzirom da je oko 5% rezultata kod zdravih osoba van referentnog opsega, što bi ukazivalo da njihovi rezultati nisu normalni

– zato je referentni opseg pogodniji, jer nepotrebno ne ukazuje da li je nešto normalno ili ne

9.12.2010

22

Procena biohemijskih (laboratorijskih) testova

na osnovu rezultata obolelih i zdravih osoba

• senzitivnost (pravi pozitivni rezultat)

– izražava se % pozitivnih rezultata u populaciji obolelihispitanika (idealno bi bilo da je % pozitivnih rezultata100)

• specifičnost (lažno pozitivni rezultati)

– predstavlja se razlikom od 100% minus % lažno pozitivnih rezultata u populaciji koja sigurno nijeobolela od odredjene bolesti (idealno bi bilo da je % lažno pozitivnih rezultata 0)

• idealni test je sa 100% senzitivnosti i 100% specifičnosti (0% lažno pozitivnih rezultat)

• u praksi je najvažnije odrediti graničnu vrednost koja će odvajati "zdrave" od "bolesne" grupe (cut-off vrednost)

9.12.2010

23

Poremećaji metabolizmaugljenih hidrata

Digestija, apsorpcija i transport ugljenih hidrata

• izvor energije (40-50% unetih kalorija)

– skrob (glukan, amiloza i amilopektin)

– saharoza (glukoza i fruktoza)

– laktoza (glukoza i galaktoza)

9.12.2010

24

Digestija

• hidroliza glikozidnih veza (glikozidaze)

– α amilaza pljuvačke

– α amilaza pankreasa

– specifične disaharidaze

Apsorpcija

• apsorptivne epitelne ćelije creva

– olakšana difuzija (posredstvomproteina transportera glukoze) niz koncentracioni gradijent

– Na+ -zavisno olakšani transport nasuprot koncentracionomgradijentu

• tkivno-specifični transporteriglukoze

(GLUT 1-GLUT 5)

9.12.2010

25

Poremećaji apsorpcije

• oboljenja intestinalnog trakta

• oboljenje pankreasa (deficit u aktivnosti amilaze)

• deficit intestinalnih disaharidaza

• poremećaj u transportu monosaharida

Metabolizam ugljenih hidrata

• glikogeneza (sinteza glikogena)

• glikogenoliza (razlaganje glikogena)

• glikoliza

• glukoneogeneza

• pentozofosfatni put

9.12.2010

26

glikogen glukoza piruvat

laktat

acetil-CoA

ribozo 5-fosfatNADPH

pentozofosfatni put

glikogenoliza

glikogeneza glikoliza

glukoneogeneza

aerobno

anaerobno

Metaboliti glukoze se uključuju u drugemetaboličke puteve

9.12.2010

27

I Homeostaza glukoze

• posle unošenja ugljenih hidrata– 70% odstranjuje jetra i koristi za

• glikolizu• glikogenezu• sintezu masnih kiselina i

TAG (VLDL) • u gladovanju

– glukoneogeneza• glicerol, laktat, piruvat,

glukogene aminokiseline

II Homeostaza glukoze

• 4.5 – 11.1 mmol/l• 3.4 – 5.5 mmol/l• 1.7mmol/l prva tri dana života• 2.2 mmol/l u prvoj godini životahiperglikemija• >7.8 mmol/l• >11.1 mmol/l (2 h posle jela)hipoglikemija• <2.5 mmol/l

9.12.2010

28

Hormonska regulacija

• insulin

• glukagon

• adrenalin

• kortizol

9.12.2010

29

Insulin

• snižava koncentraciju glukoze u krvi

• najvažniji hormon homeostazeglukoze

Sekrecija insulina

• sinteza u ß-ćelijama ostrvaca pankreasa

– odgovor na povećanu konc.glukoze

– odgovor na hiperglikemiju povećan glukozo-zavisniminsulinotropnim peptidom (GIP)

• sintetiše se kao prepro-insulin od koga nastaje

• pro-insulin (A i B lanac insulina i C-peptid)

• posle proteolize u krv se otpušta insulin i C-peptid

• delovanje preko receptora

9.12.2010

30

Aktivnost insulina

• povećava brzinu ulaskaglukoze u ćelije

– insulin se vezuje zareceptore, reguliše relokaciju GLUT 4 transportera iz citosolado ćelijske membrane

• adipozno tkivo

• mišići

9.12.2010

31

� u jetri indukuje povećanje aktivnosti glukokinaze(fosforiliše glukozu do glukozo-6-fosfata, supstrat zaglikogenolizu)

� na taj način održava nisku konc. glukoze u hepatocitima (uspostavljeni koncentracioni gradijentolakšava ulazak glukoze)

• niska koncentracija glukoze u ćeliji se održava i

– stimulacijom glikogeneze

– inhibicijom glikogenolize i glukoneogeneze

tako što se …

� aktiviraju enzimi za sintezu, a inhibiraju za razgradnjuglikogena (postreceptorskiefekat delovanja insulina)� aktivira se fosfoprotein

fosfataza (enzimiglikogeneze aktivninefosforilisani, a glikogenolize inhibirani)

9.12.2010

32

Aktivnost insulina

• stimuliše korišćenje glukoze (oksidacija, glikogeneza, lipogeneza)

9.12.2010

33

Normalni odgovor na hiperglikemiju

• adekvatna sekrecija insulina

• normalni receptori insulina

• normalna intraćelijska reakcija na vezivanje insulina(postreceptorski odgovor)

Antagonisti insulina-povećavaju nivo glukoze u krvi

• u jetri– glukagon

• α-ćelije ostrvaca pankreasa• povećava nivo glukoze u krvi

stimulacijom glikogenolize iglukoneogeneze

9.12.2010

34

Kombinovani efekti delovanja insulina i glukagona

ali i drugih hormona…

– adrenalin• povećava glikogenolizu i glukoneogenezu• smanjuje glikolizu

– kortizol

• povećava nivo glukoze u krvi stimulacijomglukoneogeneze

• smanjuje usvajanje glukoze

– hormon rasta

• povećava glikogenolizu i glukoneogenezu

• smanjuje glikolizu

9.12.2010

35

• u mišićima– adrenalin

• povećava glikogenolizu• povećava glikolizu

– kortizol• smanjuje usvajanje

glukoze• adrenalin

– hormon rasta• povećava glikolizu

(kratko vreme)• smanjuje glikolizu (duže

vreme)

• u adipoznom tkivu

– kortizol

• smanjujeglikolizu

Ostali hormoni koji utiču na metabolizam glukoze

• tiroksin– ubrzava glikogenolizu

• somatostatin– smanjuje sekreciju insulina i njegovih antagonista

• humani laktogen placente (HPL)– anti-insulinsko delovanje

9.12.2010

36

Deficit enzima i bolesti metabolizma

• enzimski deficitglukozo 6-fosfataza

fosforilaza mišićafosforilaza jetreUDP-galaktotransferazagalaktokinazafruktokinaza jetrefruktozo 1-fosfat aldolaza jetrepiruvat kinazaglukozo 6-fosfat dehidrogenaza

• obolenjeTip I GSD (von Gierke)

Tip V GSD (McArdle)Tip VI GSD (Hers)galaktozemijagalaktozemijaesenc. fruktozurijanasledna netolerancija fruktozehemolitična anemijahemolitična bolest

_________________________GSD – bolesti vezane za skladištenje

glikogena

Nedostatak enzima metabolizma glikogena

• bolesti vezane za skladištenje glikogena (GSD, glycogen storage disease)

• ima ih 9

• sve osim nedostatka glikogen sintaze (GSD 0) vode u nakupljanje glikogena

9.12.2010

37

Primer - glukozo-6-fosfataza (GSD I)• nemogućnost oslobadjanjaglukoze iz glukozo-6-fosfata nastalog razgradnjom glikogena(glikogenolizom) iliglukoneogenezom

•nakuplja se glikogen u jetri(hepatomegalija)

•nakuplja se laktat (laktatnaacidoza)

•hiperlipidemija

glukozo-6-fosfataza

ili glikogen fosforilaze (GSD V i VI)

9.12.2010

38

Galaktozemija

• klasična galaktozemija(nedostatak enzima galaktozo-1-fosfat uridil transferaze(teška genetska bolest)

• nedostatak enzima UDP-galaktozo 4-epimeraze (retkabolest)

• nedostatak galaktokinaze

Hiperglikemija

• Diabetes mellitus

• intravenozna infuzija glukoze

• naglašeni stres

9.12.2010

39

Diabetes mellitus

• Tip 1 (I DM)– insulin zavisni (pankreas malo/nimalo proizvodi

insulin) – uglavnom se javlja rano (pre 30 g.)– 10 – 15% svih DM– karakteriše se hiperglikemijom i često ketoacidozom sa

poremećajem metabolizma ugljenih hidrata, lipida iproteina

– autoimuna bolest sa genetskom osnovom; faktorisredine (virusi, neki proteini kravljeg mleka mogu bitiokodači autoimunog procesa)

– destrukcija > 90% β ćelija pankreasa

– u serumu se mogu detektovati antitela (u ranoj fazi) zaćelije pankreasa koje luče insulin

9.12.2010

40

• Tip 2

– patogeneza različita

– izrazita familijarna incidenca

– insulin nije uvek neophodan

– hiperglikemija

– dijeta, aktivnosti, lekovi

• DM povezan sa drugim uslovima

– apsolutna deficijencija insulina (bolest pankreasa)

– relativna deficijencija insulina

• višak hormona rasta (akromegalija)

• sekrecije glukokortikoida (Cushing-ov sindrom)

• povećanje glukokortikoida u plazmi (uzimanjesteroida)

– uticaj nekih lekova

9.12.2010

41

Biohemijski parametri

• glukoza u krvi i plazmi

– post-prandijalna glukoza >11.1 mmol/l

• oralni test tolerancije glukoze (GTT)

– 75 g glukoze u 250-350 ml vode, praćenje glukoze 2 h u intervalima (na 30 min)

• glicirani hemoglobin HbA1c

• glicirani proteini plazme

• mikroalbuminemija (kod početne dijabetične nefropatije)

Metaboličke komplikacije DM

• hiperglikemija (sa ili bez ketoacidoze)

• mlečno-kiselinska acidoza (sa ili bez hiperglikemije)

• hipoglikemija

• uremija (zbog dijabetične nefropatije)

9.12.2010

42

Analize

• monitoring nivoa glukoze u krvi(uz terapiju insulinom, pre jela, 1 i 2 h posle i uveče)

• Hb1c periodično

• stabilan proizvodneezimske glikozilacije

• normalno do 6%

• daje podatke zaprethodnih 1-3 meseca

• nivo fruktozamina

• nastaje u reakciji glukoze i plazma proteina

• daje podatke za prošle 1 do 3 nedelje

• testovi za ketonska tela u urinu

(I DM)

9.12.2010

43

Odredjivanje glukoze

• u krvi, serumu, plazmi, urinu• preprandijalna glukoza (nakon 6 sati gladovanja)• obrada uzorka

– u krvi (odmah); NaF– u serumu (30-40 min odvojiti serum; 8 sati na RT; 72

sata u frižideru)– u 24-satnom urinu uz dodatak konzervansa

Metode odredjivanja

• redukcione

• hemijske

– O-toluidin

• enzimske

– heksokinaza

– glukozo-oksidaza

– glukozo-dehidrogenaza

9.12.2010

44

Poremećaji metabolizma proteina

Proteini plazme

Poremećaji metabolizma proteina

• balans azota – razlika izmedju unetog i ekskretovanogazota, daje uvid u status proteina

– proteini

– neproteinske azotne supstance

– aminokiseline

9.12.2010

45

• pozitivan balans azota - unos azota veći od ekskrecije

– u periodu rasta

– u trudnoći

• negativan balans azota - unos azota manji od ekskrecije– gladovanje– bolesti digestivnog trakta– stanje ubrzanog katabolizma tkivnih proteina– povećano gubljenje proteina iz organizma– nedovoljno unošenje esencijalnih aminokiselina

9.12.2010

46

Proteini

• struktura i funkcija

• varenje i apsorpcija

• metabolizam proteina

– metabolizam aminokiselina

• metode analize proteina

• proteini plazme

• enzimi plazme u dijagnostici

9.12.2010

47

Proteini

• najzastupljeniji organski molekuli u ćeliji (50% mase)

• 30 – 50 000 strukturnih gena kodirano za proteine

• svaka ćelija sadrži 3 – 5 000 različitih proteina

• oko 300 proteina identifikovano u plazmi

Sastav proteina

• amino kiseline (prosti proteini)

– 20 (standardnih) amino kiselina

– konjugovani proteini sadrže prostetične grupe

• metaloproteini

• glikoproteini

• fosfoproteini

• lipoproteini

• nukleoproteini

9.12.2010

48

Veličina proteina

• usvojeno da je najmanja masa 5 000 Da

• mogu biti > 1 000 000 Da

– većina proteina ima masu 12 – 36 KDa

• 100 – 300 amino kiselina

• Alb, 66 KDa, 550 amino kiselinskih ostataka

Struktura proteina

• primarna struktura (polipeptidni lanac)

• sekundarna struktura (α- i β- zavojnica)

• tercijarna struktura (globula)

• kvarterna struktura (vise globula-subjedinica)

9.12.2010

49

Nivoi strukture proteina

Primarna struktura je genetski odredjena

• uzrok mnogih bolesti

– nedostatak gena za neki protein

– promenjeni (neadekvatno funkcionalni) proteini, kao posledica promena na nivou gena

9.12.2010

50

Struktura proteina – odražava njihovufunkciju

• nativna struktura

• denaturacija proteina, koagulacija proteina

9.12.2010

51

Funkcija proteina

• uključeni u skoro sve aktivnosti ćelije

• gradivne komponente (kolagen, keratin, miozin, aktin)

• transportni molekuli (Hb, lipoproteini, transferin, ceruloplazmin)

• katalizatori (enzimi)

• učestvuju u odbrani organizma (antitela)

• regulatorni molekuli (hormoni,faktori rasta)

• koagulacija (skoro svi faktori koagulacije)

• rezervne forme (ovalbumin, gluten, kazein, feritin)

• kretanje i kontraktilnost (flagelin, aktin, miozin)

Apsorpcija i metabolizam proteina iaminokiselina

9.12.2010

52

9.12.2010

53

Genetske bolesti katabolizma aminokiselina

Proteini se obnavljaju

• ravnoteža izmedju sinteze i razgradnje proteina

– regulacija metabolizma na nivou

• enzima

• peptidnih hormona

• medjućelijske komunikacije

• sprečavanje nagomilavanja abnormalnih proteina

9.12.2010

54

Poluživot proteina je različit

• dug poluživot (izražava se godinama)

– strukturni proteini• proteini vezivnog tkiva (kolagen)

• kratak poluživot (izražava se danima i minutima)

– regulatorni proteini (minuti)

– proteini tkiva više izloženih spoljašnjim uticajima

• proteini jetre i intestinalne mukoze (10 dana)

• proteini plazme (15 dana)

• proteini mišića (180 dana)

9.12.2010

55

Degradacija ćelijskih proteina se dešava u samoj ćeliji

• intracelularne proteaze• sistem “obeležavanja” proteina za razgradnju (ubikvatin)• oslobodjene aminokiseline zajedno sa onima iz hrane čine

“pool” aminokiselina• usmeravaju se ka anaboličkim ili kataboličkim procesima

Za laboratorijska ispitivanja najpristupačnijisu proteini

• krvi• urina• cerebrospinalne tečnosti• amnionske tečnosti• peritonealne tečnosti• pleuralne• salive• fecesa

9.12.2010

56

Proteini plazme

• različitog porekla i funkcije

– za mnoge funkcija nije identifikovana

• odražavaju balans izmedju sinteze irazgradnje/gubljenja/redistribucije izmedju intra iekstravaskularnih prostora

• preko 300

– specifične funkcije

– organska oštećenja ako se smanji njihova koncentracija

• mnogi enzimi i tumorski markeri

– bez odredjene funkcije u krvi

– rezultat ćelijske smrti i oštećenja tkiva

9.12.2010

57

Uloga proteina plazme

• održavanje koloidnog osmotskog pritiska (uglavnomalbumin)

• transportna uloga (za hormone, vitamine, lipide, bilirubin, kalcijum, mikroelemente, lekove)

• odbrandbena– imunoglobulini (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD)– sistem komplementa

• koagulacija i fibrinoliza

Analiza proteina plazme

• ukupni proteini

– g/L

– male kliničke vrednosti

– velike razlike u Alb i Ig utiču značajnije

– moguće maskiranje (↓Alb i ↑Ig)

• specifični proteini

– g/L; ng/L

– aktivnost

9.12.2010

58

Odredjivanje proteina, na osnovu

• reaktivnosti

– Biuretska, Lowry metoda, Bradford-ova

• hemijskih osobina

– apsorpcija na 280 nm (Phe) ili 280 nm (Trp, Tyr)

• aktivnosti

– enzimi, imunoglobulini

• imunogenosti

Metode analize proteina plazme

• hemijske metode

• hromatografske (gel filtracija, HPLC, jonoizmenjivačka, afinitivna)

• elektroforetske (skrobni, agarozni gel, celulozo acetat)

• imunološke metode

– poliklonska antitela

– monoklonska

9.12.2010

59

Promene u koncentraciji ukupnih proteina

• povećanje plazma proteina

– gubitak dela tečnosti bez proteina

– povećanje u nekom od imunoglobulina

• smanjenje plazma proteina

– hipoalbuminemija

– izražena deficijencija u imunoglobulinima

Elektroforeza proteina seruma

• razdvajanje proteina na bazi naelektrisanja

• celulozo-acetat ili agaroza

• 5 glavnih proteinskih grupa se identifikuje– albumini i 4 globulinske frakcije (α1; α2; β i γ)

• svaka grupa sadrži mnoštvo drugih proteina

9.12.2010

60

– serum (ostavi se krv da koaguliše i izdvoji serum)

– plazma (slaba traka fibrinogena u ß – γ delu)

Elektroforetske frakcije proteinaElektroforetske frakcije proteinaElektroforetske frakcije proteinaElektroforetske frakcije proteina

• prealbumin prealbumin prealbumin prealbumin • albumin (kvantitativno najznacajniji)albumin (kvantitativno najznacajniji)albumin (kvantitativno najznacajniji)albumin (kvantitativno najznacajniji)• αααα1 1 1 1 globuliniglobuliniglobuliniglobulini• αααα2222 globuliniglobuliniglobuliniglobulini• ßßßß1111 globuliniglobuliniglobuliniglobulini• ßßßß2 2 2 2 globulinglobulinglobulinglobulin• γγγγ globuliniglobuliniglobuliniglobulini

9.12.2010

61

Elektroforetske frakcije proteina

• prealbumin

• albumin (kvantitativno najznačajniji)

• α1 globulini

• α2 globulini

• ß1 globulini

• ß2 globulin

• γ globulini

• prealbumin– T4, protein koji vezuje retinol (RBP)

• albumin– transport (masne kiseline, bilirubin), rezervoar

aminokiselina, onkotski pritisak

• α1 – globulinska frakcija– α1-antitripsin (inhibitor proteaza), apolipo A (transport

lipida), α-fetoprotein (protein fetalne plazme)

9.12.2010

62

• α2 – globulinska frakcija

– haptoglobin (vezuje Hb u plazmi), ceruloplazmin(transport Cu), α2-makroglobulin (inhibitor proteaza)

• β1 – globulinska frakcija

– transferin (transport Fe), apolipo B (transport lipida), C4 (protein sistema komplementa)

• β2 – globulinska frakcija

– fibrinogen (prekursor fibrina), C3 (protein sistemakomplementa), β2 – mikroglobilin

• γ – globulinska frakcija

– IgG, IgA, IgM, CRP (C-reaktivni protein)

9.12.2010

63

Analiza elektroforegrama

• abnormalna koncentracija albumina

• promene u raznim frakcijama proteina

• izostaje neka frakcija proteina

Albumin (Mr 66 kDa)

• sintetiše se u jetri– parametar nutricionog statusa

• poluživot oko 20 d.• 35 – 50 g/L (referentna vrednost)• uloga

– onkotski pritisak– transport (bilirubin, masne kiseline, hormoni,

kalcijum, lekovi)– antioksidaciona aktivnost– pufer

9.12.2010

64

Promene u albuminskoj frakciji

• hipoalbuminemija

• hiperalbuminemija

• analbuminemija

– retka bolest (genetska)

– albumin manji od 1.0 g/L

– najčešće bez simptoma jer se kompenzatornopovećavaju globulini

Hipoalbuminemija

• fiziološka – trudnoća– artefakt zbog razblaženja infuzijom

9.12.2010

65

• patološka

– smanjena sinteza (bolest jetre, nutricioni deficit)

– promenjena distribucija (↑kapilarna permeabilnost, ascites)

– povećan katabolizam (oštećenje tkiva, infekcije, malignitet)

– abnormalni gubitak (nefrotski sindrom, opekotine, bolesti GI)

• prekomerna hidratacija (obično jatrogena)

Hiperalbuminemija

• dehidratacija

• prekomerna staza pri venepunkciji

• uglavnom retka, nema klinički značaj

9.12.2010

66

Pre-albumin

• tiroksin-vezujući protein (transtiretin – TBPA

– u kompleksu sa retinol-vezujućim proteinom (RBP)

• jedini protein koji “putuje” ispred Alb

• osetljiv marker nutritivnog statusa (t1/2 samo 2 dana)

alfa1-antitripsin (alfa-AT)

• inhibitor proteaza (vezuje se i inaktivira tripsin)

• deficit povezan sa

– emfizemom pluća

– cirozom jetre

• elektroforeza proteina seruma samo skrining test za deficit alfa-AT

9.12.2010

67

Ostali alfa-1 proteini

• alfa1 – kisili glikoprotein (orozomukoid)

– biološka funkcija nepoznata

• alfa1 – fetoprotein (AFP)

– glavni protein fetusa, pogodan za utvrdjivanje abnormalnosti fetusa (neural tube defects)

Alfa2 - makroglobulin

• osim imunoglobulina, najduže prisutni protein plazme

• inhibitor proteaza

• povećava se u nefrotskom sindromu

• komplentna genetska deficijencija nepoznata

9.12.2010

68

(alfa2) ceruloplazmin (Cp)

• transportni protein Cu

• učestvuje u redoks reakcijama plazme

• Cp varira u zavisnosti od fiziološkog statusa, uglavnom se odredjuje za utvrdjivanje Wilsonove bolesti

– plazma Cp je smanjena zbog inhibicije sinteze

(alfa2) haptoglobin (Hp)

• vezuje se i štiti Hb (ne i Mb)

– kompleks ima peroksidaznu aktivnost i može biti deo inflamantornog odgovora

• hemolitičke bolesti snižavaju nivo Hp

9.12.2010

69

(beta) transferin

• vezuje i nosi Fe ali i Cu

• povećava se kod anemije usled deficijencije Fe, u trudnoći i terapiji estrogenima

• smanjuje se u inflamaciji, malignitetu i obolenju jetre

(beta) proteini komplementa

• C3 i C4 se nalaze u beta oblasti

• smanjuju se kod genetske deficijencije a povećavaju u inflamaciji

9.12.2010

70

Gama - oblast

• uključuje imunoglobuline (IgG, IgA, IgM) i C-reaktivni protein

• jedan oštar pik ukazuje na paraprotein povezan sa monoklonalnom gamatopatijom (multiple myeloma)

• CRP je najosetljiviji indikator reakcije akutne faze

– inflamacija, trauma, infekcija

Proteini plazme u dijagnostici

• inflamatorni odgovor i odgovor imunog sistema

• marker enzimi

• tumorski markeri

9.12.2010

71

Proteini u urinu - proteinurija

• normalno se izluči do 0,08 g/d (60% Alb)

• > 0,15g/d indikacija bolesti

• proteinurija

– glomerularna

– tubularna

– prerenalna

– postrenalna

Glomerularna proteinurija

• povećana permeabilnost membrane glomerula

– selektivna

• uglavnom Alb

– neselektivna

• pored Alb i proteini >Mr

9.12.2010

72

Tubularna proteinurija

• smanjena sposobnost tubula za reapsorpciju• uglavnom proteini <Mr (β2 -mikroglobulin)• akutna (opekotine, hronični pijelonefritis, lekovi)• hronična (hronični pijelonefritis, ciroza, toksične materije)• najčešće se javlja kao mešovita (glomerularno-tubularna)

Proteini plazme u dijagnostici

• inflamatorni odgovor i odgovor imunog sistema

• marker enzimi

• tumorski markeri

9.12.2010

73

Inflamatorni odgovor i odgovor imunogsistema

• posle traume, infekcije, inflamacije, opekotina, infarkt, malignitet – smanjuje se koncentracija nekih proteina– mediatori citokini, prostaglandini i histamini – promene u proteinima akutne faze– promene u imunoglobulinima kao imuni odgovor

Proteini akutne faze (PAF)

• povećanje/smanjenje koncentracije nekih specifičnihproteina (proteini akutne faze)

• “oštećeno” tkivo šalje signal do hepatocita

– posredstvom citokina (interleukina, interferona i faktoratumorske nekroze)

– povećava se/smanjuje sinteza odredjenih proteina

9.12.2010

74

Uloga PAF

� medijatori inflamacije

� inhibitori inflamacije

� »čistači« produkata inflamacije

� modulatori imunog odgovora

� modulatori reparacije oštećenog tkiva

Izražene promene koncentracije

• infekcija, trauma, infarkt, hirurški zahvat, opekotine, imunološke bolesti, maligni procesi

Umerene promene koncentracije

• nakon napornih vežbi, nakon toplotnog udara, nakonporodjaja

Neznatne (ali značajna) promene

• nakon psihičkog stresa, psihijatrijske bolesti- šizofrenija, manija, depresija

9.12.2010

75

• negativni reaktanti akutnefaze

• albumin

• transferin

• alfa-fetoprotein

• tiroksin-vezujući globulin

• faktor XII

• pozitivni reaktanti akutnefaze

• komponente komplementa• sistem koagulacije i

fibrinolize• antiproteaze• transportni proteini• činioci inflamatornog

odgovora• ostali činioci

Pozitivni reaktanti akutne faze

• c-reaktivni protein (CRP)• serumski amiloid A

(vezuje se za HDL) • haptoglobin (vezuje Hb)• fibrinogen

• komponente komplementa(C3, C4)

• α1-antitripsin (inhibitor proteaza)

• ceruloplazmin (vezuje Cu, antioksidant)

9.12.2010

76

Negativni reaktanti akutne faze

• najčešće kao rezultatgubitka plazma proteina u ekstravaskularnomprostoru

– albumin

– transferin

– α-fetoprotein

– tiroksin vezujućiglobulin

� otkriven 1930. g.

� dobio ime 1941. g.

� MW = 120 kDa (ne sadrži ili ima malo ugljenih hidrata, pentamer)

CRP- c reaktivni protein

9.12.2010

77

Proinflamatorni efekti-vezuje se za fosfoholin patogena i ćelija domaćina- aktiviše sistem komplementa- vezuje se za fagocitne ćelije-inicira opsonizaciju, fagocitozu i lizu stranih ćelija- prepoznaje autogene supstance oslobodjene iz oštećenog tkivaAntiinflamatorno delovanjeprevenira adheziju neutrofila na endotelne ćelije inhibiše produkciju O2

.- u neutrofilima

Promene u imunoglobulinima kao imuni odgovor

• hipergamaglobulinemija

– (bolesti jetre, infekcije iautoimune bolesti)

– povećana produkcija γ-(teškilanac IgG) globulina

– produkuju ih različite ćelije(klonovi) B ćelija

9.12.2010

78

• monoklonska hiper γ-globulinemija(paraproteinemija)

– produkcija jedne klase(ili fragmenta) imunoglobulina

– potiče od jedne vrsteklona B ćelija (može bitimaligna i benigna)

• krioglobulini – imunoglobulini koji se talože na 4oC, a rastvaraju na 37oC (prisutan kodhipergamaimunoglobulinemije)

9.12.2010

79

Metode odredjivanja

• imunonefelometrija

• RID

• RIA

• metode enzimskog imunoodredjivanja

Enzimi plazme u dijagnostici

• potiču uglavnom iz tkiva

• specifični u odnosu na tkivo

• otpuštanje zavisi

– od stepena oštećenja tkiva

– brzine proliferacije

– stepena indukcije enzimske sinteze

– brzine odstranjivanja iz cirkulacije

9.12.2010

80

Enzimi – biološki katalizatori

– specifičnost

– aktivnost (ili koncentracija)

– merenje promene količine supstrata/produkta

Izražavanje aktivnosti

– IU - količina enzima koja pod odredjenim uslovimakatališe konverziju 1 mmol/min

– moraju se navesti uslovi

– specifičnost primenjene metode

– referenca

– IU nije komparativno izmedju različitih laboratorija

9.12.2010

81

– lokacija

• u većini ćelija ali različite koncentracije

– ALT i AST u jetri, ali AST veće u srcu od ALT

• izoenzimi

– CK u mišićima, ali postoji CK izoenzimspecifičan za miokard

• unutar ćelijska distribucija

– ALT I LDH u citosolu

– glutamat dehidrogenaza u mitohondrijama

– AST u oba kompartmena

9.12.2010

82

– fiziološki faktori

• starost (AST veća u neonatalnom periodu); AP veća u dece

• pol (GGT veća kod muškaraca nego žena)

• fiziološki uslovi (AP veća u trudnoći)

Aktivnost marker enzima

• transaminaze

– AST aspartat transaminaze(GOT; glutamatoksalacetat transaminaze), u mišićima, srcu, jetri, bubrezima, eritrocitima

– ALT alanin transaminaze(GPT glutamat piruvattransaminaze), u jetri, bubrezima, srcu

9.12.2010

83

AST

• artefakt (hemoliza eritrocita)

• fiziološki (neonatalni period)

• značajno povećane (10 do 100 puta)

– stanje šoka, hipoksija, infarkt miokarda, akutnivirusni ili toksični hepatitis

ALT

• značajno povećanje (10 do 100 puta)

– stanje šoka, hipoksija, akutni viralni ili toksičnihepatitis

• srednje povećanje

– ciroza jetre, infektivna mononukleoza, opstruktivna žutica, obilniji operativni zahvati

9.12.2010

84

Laktat dehidrogenaza (LDH)

• široka rasprostranjenost

– skeletni mišići i miokard, jetra, bubrezi, mozak, eritrociti (zato nije dobar tkivni marker)

– tetramer (H i M lanaca)

Izoenzimi LDH

– LDH5 (jetra, skeletnimišići)

– LDH1 i LDH2 (infarktmiokarda i renalni, megaloblastna anemija)

– LDH2 i LDH3 (akutnaleukemija, LD3 marker maligniteta)

– LDH5 i LDH4 (oštećenjejetre ili skeletnih mišića)

9.12.2010

85

Povećanje LDH

– artefakt – zbog hemolize– značajno povećanje (više od 5 puta)

• šok, hipoksija, infarkt miokarda ili renalni, hematološki poremećaji, odbacivanje transplantanta

– srednje povećanje• viralni hepatitis, malignitet, bolesti skeletnih mišića,

plućna embolija, mononukleoza

Kreatin kinaza (CK)

• izoenzimi– CK-1 (BB)

• mozak (GI, uterus)– CK-2 (MB)

• miokard– CK-3 (MM)

• mišićni– CK-MiMi (mitohondrijalna

varijanta)

9.12.2010

86

Povećanje CK

– artefakt – in vitro hemoliza

– fiziološki – neonatalni period

– značajno povećanje

• šok, infarkt miokarda, distrofija mišića

– srednje povećanje

• oštećenje mišića, posle operacije, hipotiroidizam

Amilaza

– značajno povećanje (više od 10)

• akutni pankreatitis, oštećenjebubrega , diabetičnaketoacidoza

– srednje povećanje (više od 5)

• druge abdominalne bolesti, obolenja pljuvačnih žlezda, ozbiljno oštećenje glomerula, infarkt miokarda, intoksikacijaalkoholom,diabetičnaketoacidoza

9.12.2010

87

Alkalna fosfataza (ALP)

• u osteoblastima kosti• ćelijama hepatobilijarnog trakta• ćelijskog zida creva• bubrežnih tubula• placente

• uzroci povećanja

– fiziološki – na kraju trudnoće, kod starijih osoba(izoenzimi kosti)

– bolesti kosti – rahitis, osteomalacija, sekundarnimalignitet, primarni hiperparatiroidizam

– bolesti jetre – holestaze, tumori

– malignitet

9.12.2010

88

Kisela fosfataza (ACP)

• prisutna (više izoenzima)

– u jetri

– prostati

– eritrocitima

– kostima

– trombocitima

• povećanje

– karcinom prostate

γ – glutamil transferaza (GGT)

• prisutna– jetra, bubrezi,

pankreas, prostata• indukcija enzimske

aktivnosti– lekovi i alkohol

• bolesti jetre– infektivni hepatitis

(5-L-glutamil)-peptid + aminokiselina = peptid + 5-L-glutamil aminokiselina

9.12.2010

89

Poremećaji metabolizma lipidai lipoproteina

Lipidi

• masne kiseline i triacilgliceroli

• glicerofosfolipidi i sfingolipidi

• holesterol, soli žučnih kiselina, steroidni hormoni

• eikozanoidi

• u mastima rastvorni vitamini

9.12.2010

90

• egzogeni - lipidi iz hrane

• endogeni – sintetisani u organizmu

Lipidi plazme

• masne kiseline

• triacilgliceroli (TAG, trigliceridi)

• fosfolipidi

• holesterol

9.12.2010

91

• holesterol i ostali lipidi plazme se transportuju u krviproteinskim nosačima

• proteinski nosači – apolipoproteini

• zajedno lipoproteini

Lipoproteini – kompleksi lipida i proteina

hidrofobni lipidi (TG, CE) u jezgru;hidrofilni lipidi (UC, PL) na površini

9.12.2010

92

Apoproteini i njihova uloga

• A, B, C, D, E…(Apo A, A1, Apo B, B-100, Apo C)• omogućavaju rastvorljivost lipida• vezuju se za specifične receptore na membrani (kao

ligandi)– kontrolišu utrošak holesterola i TAG u tkivima

• aktivatori ili inhibitori pojedinih enzima metabolizmalipoproteina

• mehanizam kojim se lipidi transportuju, koriste iodstranjuju u okviru lipoproteina je vrlo kompleksan

• svaka abnormalnost u mehanizmu “nosača” narušavametabolički balans

9.12.2010

93

Lipidi plazme

• masne kiseline

– zasićene, nezasićene

– esterifikovane, neesterifikovane (FFA, slobodne)

• FFA se iz adipocita transportuju vezane za albumine

• triacilgliceroli (TAG, trigliceridi)

– estri FFA i glicerola

– transportuju se lipoproteinima

9.12.2010

94

• fosfolipidi i sfingolipidi

– složena jedinjenja

• glicerofosfolipidi

• sfingofosfolipidi

• sfingolipidi

– važne komponente membrana

– transportuju se lipoproteinima

• holesterol

– prekursor fiziološki važnih steroida

• žučne kiseline, steroidni hormoni, vitamin D

– 90% nastaje konverzijom acetata do mevalonata(HMGCoA reduktaza)

9.12.2010

95

– 1/3 plazma holesterola esterifikovano

• intravaskularno LCAT (lecitinholesterolaciltransferaza)

• intraćelijski ACAT (acetilholesterol aciltransferaza)

Lipoproteini

• klasifikacija na bazi ultracentrifugiranja

– hilomikroni

– VLDL

– LDL

– HDL

9.12.2010

96

Klase lipoproteina

Doi H et al. Circulation 2000;102:670-676; Colome C et al. Atherosclerosis 2000;

149:295-302; Cockerill GW et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1995;15:1987-1994.

HDLLDLhilomikroni,VLDL, i

njihovi kataboličkiremnanti

> 30 nm 20–22 nm 9–15 nm

D<1.006 g/mlD<1.006 g/ml D=1.019-1.063g/mlD=1.019-1.063g/ml D=1.063-1.21 g/mlD=1.063-1.21 g/ml

Lipids Online

Lipoproteini u lumenu krvnog suda

9.12.2010

97

Hilomikroni

• transportuju (egzogene) triacilglicerole

• hidroliza delovanjem endotelijalneLPL skeletnih mišića, srca iadipoznog tkiva

• ostaci hilomikrona (Apo E) se odstranjuju iz cirkulacije u jetri

• normalno ih nema u krvi 12-14 sati nakon jela

• višak hilomikrona se izdvaja napovršini seruma (lipemičan)

9.12.2010

98

VLDL – lipoproteini vrlo male gustine

• nose holesterol i TAG od jetre (gde se sintetišu, endogenilipidi) do perifernih tkiva

• lipoprotein lipaza oslobadja TAG iz VLDL od koga ostajeintermedijarni lipoprotein (IDL)

• deo IDL prelazi u LDL, a veći deo preko receptora za Apo E ulazi u jetru

IDL – lipoproteinski intermedijer

• IDL nije klasa lipoproteina, već metaboličkiintermedijer izmedju VLDL i LDL

• ima ga vrlo malo i normalno se ne detektuje u serumu

• moguća deficijencija u Apo E

• VLDL u višku daje mutan

izgled serumu (lipemičan)

9.12.2010

99

LDL – lipoprotein male gustine

• glavni nosač holesterola u organizmu

• doprema holesterol do tkiva (čini 70% holesterola plazme)

• kataboliše se isključivo u jetri

HDL – lipoprotein velike gustine

• transportuje višak holesterola iz perifernog tkiva do jetre (20 - 35% plazma holesterola), reversni transport

• u krvi se menja razmenjujući lipide i proteine sahilomikronima i VLDL

9.12.2010

100

• važne podklase HDL su HDL2 i HDL3 (HDL2 posebnoefikasan kao nosač holesterola)

• skuplja holesterol sa površine ćelije i drugih lipoproteina iesterifikuje ga (LCAT), postaju veće čestice (HDL2)

• esterifikovani holesterol razmenjuje za TAG sa LDL

Lipoprotein (a) – Lp(a)

• sličan je LDL, bogat u holesterolu

• sadrži ApoB i Apo(a)

• faktor rizika za aterosklerozu

• genetski predodredjen

• nije vezan za pol, godine, težinu i ne reaguje na većinulekova za snižavanje lipida

• osobe sa povećanim Lp(a) moraju eliminisati sve faktorerizika

9.12.2010

101

Funkcije apolipoproteina

• aktivišu enzime uključene u metabolizam lipida (LCAT, LPL)

• održavaju strukturni integritet lipid- protein kompleksa

• oslobadjaju lipide u ćelije prepoznavanjem ćelijskihpovršinskih receptora

Varenje masti

– sekrecija hidrolitičkih enzima je hormonski kontrolisana

– ćelije sluzokože duodenuma i jejunuma luče peptidni hormon

holecistokinin kao odgovor na prisustvo masti i delimično svarenih proteina , pristiglih iz želuca; ovaj hormon :

• stimuliše kontrakciju žučne kese i lučenje žuči

• stimuliše egzokrini pankreas da luči digestivne enzime (lipazu)

9.12.2010

102

– druge crevne ćelije luče mali peptidni hormon sekretin kao odgovor na nizak pH želudačnog sadržaja

• sekretin stimuliše pankreas da luči vodeni rastvor bogat bikarbonatima koji neutrališe pH intestinalnog sadržaja

Enzimi uključeni u transport i metabolizam lipida

• lipaze

• lecitin holesterol aciltransferaza (LCAT)

9.12.2010

103

Lipaze

• u pankreasnom soku (pankreasna lipaza)

• lipoproteinska lipaza (LPL)

– vezana za endotel krvnih sudova

– razlaže TAG u hilomikronima i VLDL do glicerola i FFA

• hepatična lipaza

– sliča lipoproteinskoj lipazi

– mobilna lipaza

• u adipoznom tkivu, kontroliše izlazak FFA izadipocita u plazmu

• aktivirana je adrenalinom, hormonom rasta, kortizolom

• inhibirana glukozom, insulinom

9.12.2010

104

L-CAT

• lecitin holesterol aciltransferaza (LCAT)

– prenosi acil grupu sa lecitina na holesterol(esterifikovani holesterol)

9.12.2010

105

Metabolizam egzogenih lipida

• FFA i holesterol (iz hrane iližuči) apsorbovani u ćelijamamukoze se esterifikuju do TAG iholesterol estara

• sa fosfolipidima, apoA i apoB se sekretuju u limfu kaohilomikroni

• Apo C i apoE (iz HDL) se pridodaju u limfi i plazmi

9.12.2010

106

Metabolizam hilomikrona

• metabolišu se u adipoznom tkivu i mišićima• LPL (endotelijalna) - do FFA i glicerola• deo površine hilomikrona se oslobadja i inkorporira u HDL

(apoA, apoC i fosfolipidi) • ostatak hilomikrona (holesterol, apoB i apoE) ulazi u ćelije

jetre (za razliku od LDL, ovo je nezavisno od količineholesterola u ćelijama)

Metabolizam hilomikrona

9.12.2010

107

Metabolizam endogenih lipida

Metabolizam VLDL i IDL

• jetra glavni izvor endogenih lipida (TAG, holesterola)

• transportuju se iz jetre kao VLDL

• deluje lipoprotein lipaza (odvaja TAG), ostaje IDL

• IDL usvajaju ćelije jetre ili se pretvara u LDL

Metabolizam endogenih lipida

9.12.2010

108

Metabolizam LDL

• LDL – holesterol (70% plazma holesterola) i apoB– najduži poluživot– ulazi u ćelije jetre preko receptora na površini ćelija (ima

ih na svim ćelijama, ali najviše jetre) - regulisanousvajanje

• neregulisano usvajanje (makrofazi), receptor nezavisni mehanizam kada je konc. holesterolavisoka

– delovanjem lizozoma oslobadjaju holesterol

– oslobodjeni holesterol se koristi za izgradnju membrana, steroidogenezu

– inhibitorno deluje na procese njegove sinteze i ulaska u ćeliju

9.12.2010

109

Metabolizam LDL

Metabolizam HDL

– učestvuje u kompleksnoj razmeni lipida i proteinaizmedju lipoproteina

– slobodni holesterol iz tkiva “sakuplja” i prenosi kaoHDL plazme

– aktivnošću LCAT (deo HDL čestice) holesterol se esterifikuje i prenosi do LDL, VLDL i IDL

– LDL odlazi u jetru i tako se holesterol “vraća” u jetru(reverzni transport holesterola)

9.12.2010

110

Poremećaji metabolizma lipida

• hiperlipidemija

• hiperholesterolemija

• hipertrigliceridemija

• mešana hiperlipidemija

• retki poremećaji metabolizma lipida

Hiperlipidemija

• nakupljanje lipida u tkivu - rezultat dugotrajnehiperlipidemije

• na zidovima arterija, potkožno, tetivama, rožnjaci

• uglavnom uzrokovano hipertrigliceridemijom iporemećajem metabolizma lipoproteina (LDL, HDL)

9.12.2010

111

Hiperholesterolemija

• 2.5 mmol/l (oko 100 mg/dl) po rodjenju

• 4.0 mmol/l (oko 160 mg/dl) do 20-te godine

• >5.2 mmol/l (oko 200 mg/dl) rizik od kardiovaskularnihbolesti

• <6.5 mmol/l (oko 275 mg/l) poželjno održavati, ako nemadrugih faktora rizika

– povećana koncentracija LDL

– trigliceridi se uglavnom ne menjaju

Uzroci hiperholesterolemije

– sekundarna hiperholesterolemija• primarni hipotiroidizam• Diabetes mellitus• nefrotski sindrom• holestaze• neki lekovi

9.12.2010

112

– primarna hiperholesterolemija (uslovljena genetski)

• abnormalnosti u LDL (produkciji, receptorima…)

• poremećaji sinteze holesterola

• poremećaji deponovanja holesterola

Uloga LDL u aterosklerozi

LDLLDL

LDLLDL

EndotheliumEndothelium

Vessel LumenVessel LumenMonocMonociitt

MaMakkroroffagag

MCPMCP--11

AdheAdhezziivvnniiMoleMolekkululii

Steinberg D et al. N Engl J Med 1989;320:915-924.

PenastePenaste ććelelijeije

ModifiModifikovankovanLDLLDL

preuzimajupreuzimajuMaMakkroroffagagii

IntimaIntima

modifikacijaLDL (oksidovaniLDL)- glavni uzrok oštećenja endotela i mišićnih ćelija

9.12.2010

113

Hipertrigliceridemija

• najčšće sekundarna, uzrokovana drugim poremećajima

– prekomerna težina, alkohol, Diabetes mellitus, primarnihipotiroidizam, nefrotski sindrom, neki lekovi, akutnipankreatitis

• povećana koncentracija VLDL ili hilomikrona, ili oba

Hormoni i adipozno tkivo

- adipozno tkivo nije samo veliki depo masti

- produkuje brojne hormone koji regulišu deponovanjemasti

• 1. leptin – smanjuje unos hrane/povećava iskorišćavanjeenergije

• * adekvatni masni depo - oslobadja leptin -smanjuje unos hrane i povećava iskorišćavanjeenergije

9.12.2010

114

Povezanost metabolizma glukoze i lipida

• glukoza u plazmi raste-insulin se sekretuje u β-ćelijama pankreasa

• insulin utiče i na

– smanjenje sintezeglukoze u hepatocitima

– povećanje unosa ideponovanja glukoze u mišićima i masnomtkivu

masno tkivo učestvuje:

oslobadjanjem masnih kis koje

- smanjuju usvajanje glukoze u mišićima

- smanjuju sekreciju insulina u β-ćelijama

- indukuju povećanje produkcijeglukoze iz jetre

ćelije masnog tkiva sekretuju i leptin(smanjuje osećaj gladi)

9.12.2010

115

Laboratorijska dijagnostika odredjivanje lipidnogstatusa

u cilju

– utvrdjivanja rizika od kardiovaskularnih oboljenja

– utvrdjivanja terapije

– postavljanja dijagnoze poremećaja lipida –dislipidemija

• zasniva se na odredjivanju

– lipidnih komponenti lipoproteina (holesterol, trigliceridi)

– apolipoproteina

• I faza

– ukupni holesterol, trigliceridi, HDL-holesterol, LDL-holesterol

• II faza

– elektroforeza lipoproteina i tipizacijahiperlipidemija

• III faza

– HDL2, HDL3, Lp(a)

• Lp(a) se odredjuje i u prvoj fazi ako postojifamilijarni rizik od ateroskleroze

9.12.2010

116

Odredjivanje holesterola i triglicerida

• odredjuje se – ukupni, esterifikovani, HDL-holesterol

– hemijske i enzimske metode– na rezultate utiče

• ishrana (dugotrajno)• starost – sa godinama raste• pol – kod žena manji pre menopauze

• trigliceridi

– enzimska metoda

• utiču starost i pol, ali najviše ishrana

9.12.2010

117

Laboratorijska dijagnostika hiperlipoproteinemija

• odredjivanje holesterola u lipoproteinima

– HDL- holesterol (odvoji se prvo HDL, odrediholesterol)

• razdvajanje HDL2 i HDL3 (analitičkimmetodama)

– VLDL – holesterola (Friedewald-ova formula)VLDL-holesterol = trigliceridi/2.2

referentne vrednosti

m. 0,26 – 0,34 mmol/Lz. 0,26 – 0,62 mmol/L

9.12.2010

118

– LDL – holesterolaLDL-holesterol = ukupni holesterol – VLDLholesterol -

HDLholesterol

referentne vrednosti: <3,5 mmol/Lrizične >4,1 mmol/L

Sastav i elektroforetska mobilnost glavnih klasalipoproteina

sadržaj (%) elektroforetska

lipoprotein nalaženje prot. Hol. TAG. FL. apoprotein mobilnost

_______________________________________________________________________

Hilomikroni creva 1 4 90 5 A, B, (C), (E) start

VLDL jetra 8 25 55 12 B, C, E pre-ß

LDL VLDL (preko IDL) 20 55 5 20 B ß

HDL jetra, creva 50 20 5 25 A, C, E α

9.12.2010

119

Klasifikacija hiperlipidemija(elektroforetska slika, WHO, Fredrikson)

Tip elektroforetski patern povečani lipoproteini___________________________________________________________I naglašeni hilomikroni hilomikroni

IIa naglašeni ß lipoproteini LDL

IIb naglašeni pre-ß i ß lipoproteini VLDL I LDL

III “široka” frakcija ß lipoproteina IDL

IV naglašeni pre-ß lipoproteini VLDL

V naglašeni pre-ß lipoproteini VLDL i hilomikronii hilomikroni

• plazma posle 12-14 sati gladovanja

– samo LDL, VLDL i HDL

• lipemija

– visok sadžaj hilomikrona i VLDL

– serum zamućen (lipemičan)

9.12.2010

120

Nacionalni komitet za izradu vodiča kliničke prakse u Srbiji

Nacionalni komitet za prevenciju kardiovaskularnih bolesti RS

9.12.2010

121

Funkcija i metabolizamvode

Biološka funkcija vode

• strukturni sastojak makromolekula (vezana voda)• rastvarač za niskomolekulska jedinjenja• supstrat/proizvod enzimskih reakcija• termoregulator (isparavanjem vode putem kože i pluća gubi

se velika količina toplote), apsorbuje toplotu hemijskihreakcija

9.12.2010

122

Promet vode

• regulisan – sastavom telesnih tečnosti, hormonima

• načini kretanja - slobodnom difuzijom, akvaporini (vodenikanali)

• poremećaji – dehidratacija/hiperhidratacija

• posledica –hiperosmolarnost/hipoosmolarnost

Kretanje vode

9.12.2010

123

Dnevno uzimanje i gubitak vode

750, voda u hrani

1500, voda koju pijemo

voda u fecesu, 200

izdahom, 300

preko kože, 400

znojenjem, 100

urinom, 1500

gubitak vode2500 mL

uzimanje vode2500 mL

250, metabolička voda

Telesne tečnosti

• voda i u njoj rastvorene supstance

• sastav i zapremina telesnih tečnosti je regulisana –homeostaza telesnih tečnosti

9.12.2010

124

Funkcionalna raspodela vode

40 – 45 L vode (2/3 telesne mase)

• 25 L se nalazi intracelularno (ICT)• 18 L se nalazi ekstracelularno (ECT)

Ekstracelularna voda (18 L)

• 12 L intersticijalna (tkivna) tečnost (IST), ćelije se "kupaju" u ovoj tečnosti, edem

• 3 L krvna plazma• 1-3 L transcelularna tečnost (ispunjava prostor uz

epitelnu membranu)– sinovijalna tečnost zglobova– očna vodica– CSF– znoj– unutar gastrointestinalnog, genitourinarnog i

nazorespiratornog trakta)

9.12.2010

125

9.12.2010

126

Distribucija elektrolita izmedju ćelija iintersticijalne tečnosti

• Na - predominantni ECT katjon (u ćelijama < 1/10)• K – predominantan u ICT (>30 puta nego u ECT)• održava se energetski zavisnim transportnim sistemom

(ATPazne pumpe)• Mg i fosfatni joni intrarcelularni, a hloridi ekstracelularni.

Sastav najviše prisutnih jona u intracelularnoj iekstracelularnoj tečnosti

Ekstracelularna tečnost intracelularna tečnostKonstituenti plazma (mmol/L) intersticijum ćelije mišićnog tkiva_________________________________________________________________________

_Natrijum 142 145* 12Kalijum 4.3 4.4 150Kalcijum (jon.) 1.2** 1.2** 4

Hloridi 104 117* 4Bikarbonati 24 27 12Fosfati 2 2 40Proteini(g) 70 ~ 0 25

pH 7.4 7.4 7.0_______________________________________________________________________*mala razlika je zbog negativnog naelektrisanja proteina** jonizovani kalcijum, ukupni je duplo

9.12.2010

127

Faktori koji utiču na distribuciju tečnosti

• osmotski pritisak– osmolalnost – broj rastvorenih čestica / jedinici mase

vode [mmol/kg]– osmolarnost – [mmol/L]

• diraktno merenje• aproksimativno

osmol. plazme [mmol/L] = 2[Na+] + 2[K+] + [glukoza] + [urea]

faktor 2 zbog anjona;osmotski aktivne supstance su jošalkohol i manitol

• onkotski pritisak (osmotski pritisak koloidnog rastvora)

Mehanizam homeostaze telesnih tečnosti

• hranom preko GI se usvajaju ugljeni hidrati, proteini, lipidi, minerali, voda i NK

• → krvna plazma → intersticijalna tečnost → ćelija iobratno

• iz pluća se uzima kiseonik, a izdvaja ugljendioksid i voda• bubrezima se eksretuju joni, neelektroliti i voda• znojem se gube joni i voda

9.12.2010

128

Ravnoteža vode

– voda se gubi

• urinom, fecesom, znojem, preko pluća

• gubitak vode zavisi od temperature, vlažnosti, fizičke aktivnosti

– regulacija gubitka vode

• u bubrezima

• delovanje antidiuretičkog hormona

9.12.2010

129

Kontrola ravnoteže vode

• osmoreceptori u hipotalamusu

– stimulišu/smanjuju sekreciju antidiuretičkog hormona(ADH), koji utiče na reapsorpciju vode u nefronima iprodukuje se manja/veća zapremina koncentrovanogurina

• indukuje povećanje ukupne koncentracije u plazmi iintersticijalnoj tečnosti (osmolarnost), što vodi do

– kretanja vode iz ćelija osmozom

– koncentruje se unutarćelijski prostor

• ovo uzrokuje da receptorske ćelije (osmoreceptori, baroreceptori) utiču na povećanje unosa vode (osećaj žedji) ismanjenje izlučivanja urina

Dehidratacija

9.12.2010

130

Hidratacija

• suprotan efekat

– nema osećaja žedji

– povećava se zapremina urina

Natrijum

• najvažniji za osmolalnost plazme

• pored hlorida najvažniji elektrolit u ekstracelularnojtečnosti

• hranom se unese 8-15 g (196-260 mmol)

• dnevne potrebe su 1-2 mmol (ostalo se izlučuje)

9.12.2010

131

Uloga Na+

• odgovoran za održavanje rasporeda vode i osmotskogpritiska u ECT

• učestvuje u procesima transporta kroz ćelijskumembranu

– aminokiselina, glukoze

– natrijum se zakači za proteinski nosač i ondakoncentracioni gradijent natrijuma uzrokuje difuzijuu ćeliju

Unošenje natrijuma

• iz digestivnog trakta

– kanalima za natrijum (koncentracioni gradijent)

– Na+/H+ antiportom

– kotransportom (sa aminokiselinama, glukozom, galaktozom i dr.)

9.12.2010

132

Gubljenje natrijuma

• putem GI (uglavnom malo, ali kod poremećaja može i više)

• kože (varijabilno, opekotine)

• bubrega (glavno mesto ali i mesto regulacije)

Bubrezi - glavno mesto regulacije (reapsorpcijei eliminacije Na+)

• 4 mehanizma su regulatori gubitka Na+

– sistem renin-angiotenzin-aldosteron (najvažniji)

– glomerularna filtracija (GFR)

– natriuretični faktor (peptid)

– dopamin i NO� (azot monoksid radikal)

9.12.2010

133

Sistem renin-angiotenzin-aldosteron

• renin (proteaza) se sekretuje kao odgovor na– smanjenje pritiska u arteriolama bubrega ili – smanjenje Na+ u distalnim tubulama

• renin konvertuje angiotenzinogen u plazmi u angiotenzin I(AI)

• AI prelazi u AII delovanjem angiotenzin konverting enzima (ACE)

renin ACE

• AII i njegov metabolički produkt AIII su farmakološkiaktivni– stimulišu oslobadjanje aldosterona

(mineralokortikosteroid) iz kore nadbubrega• aldosteron

– deluje na distalne tubule bubrege (ali i na znojne ipljuvačne žljezde i kolon)

– utiče na reapsorpciju (zadržavanje) Na+ (u zamenuse gubi H+ ili K+)

– aldosteron glavni za čuvanje natrijuma, a tako i vode• kako Na+ ne ulazi u ćeliju (zajedno sa H2O, koju

zadržava) utiče na povećanje zapremine ECT

9.12.2010

134

Glomerularna filtracija (GFR)

• smanjenjem GFR manje se eksretuje Na+ i obratno

Natriuretični faktor (peptid)

• sintetiše se u miocitima na delovanje visokog pritiska

• utiče na povećanje GFR (više se ekstretuje Na+) ismanjenje reapsorpcije Na+

9.12.2010

135

Dopamin i NO�

(azot monoksid radikal, signalni glasnik)

• utiču na povećanje ekskrecije natrijuma

Poremećaji mehanizama homeostaze Na+

• hipernatremija

– bolest bubrega

– dehidratacija

• hiponatremija

– hidratacija

– gubitak jona povraćanjem

9.12.2010

136

Hiponatremija

• unošenje natrijuma manje od izlučivanja

• u krvi manje od 20 mmol/l (smanjena osmolarnost)

• u odnosu na zapreminu ECT, hiponatremija može biti sa smanjenom,normalnom i povećanom ECT

• nastaje kao posledica– poremećaja u GI traktu– prekomernog znojenja– smanjenog lučenja aldosterona– terapije diureticima– nedovoljnog lučenja antidiuretičkog hormona

9.12.2010

137

Hipernatremija

• unos Na+veće od izlučivanja• obično povezano sa povećanjem zapremine ECT

(posebno IST – edemi) – insuficijencija srca, bolesti jetre, bolesti bubrega,

hiperaldosteronizam, trudnoća

• Na i voda se najčešće gube u GI traktu, urinom

• tahikardija, hipotenzija, oligurija

• davanje fiziološkog rastvora i rastvora sa albumin/dekstranom za povećanje zapremine

• hiponatremija sa normalnom zapreminom ECF (akutnozadržavanje vode posledica hiruškog zahvata, porodjaja)

9.12.2010

138

Dijagnostika

• nedovoljno samo odredjivanje natrijuma (neophodnacelokupna klinička slika)

• u krvi

– plazma albumin, urea i kreatinin, hloridi, osmolalnostplazme

• u urinu

– osmolalnost (kod poliurije i oligurije), natrijum

Metode odredjivanja natrijuma

• plamena emisiona spektrometrija

• elektrohemijski (jon selektivne elektrode)

• atomska apsorpciona spektrometrija

9.12.2010

139

Uzorak

• serum, plazma, znoj, urin, likvor

Referentne vrednosti

• u serumu 136 – 146 mmol/L

• u urinu 40 – 220 mmol/L

9.12.2010

140

Kalijum

• glavni katjon u ćelijama (98% intracelularno)• koncentracija 150 – 160 mmol/L ICT, 3.5 – 5 mmol/L ECT• meri se koncentracija u plazmi, promene se odražavaju na

neuromuskulatornu i srčanu aktivnost

Ulazak/izlazak K u organizmu

• GI

• bubrezi

• membrane drugih ćelija

9.12.2010

141

• bubrezi - filtrira se u glomerulima, a reapsorbuje u tubulama (delom se ipak izlučuje u zamenu za Na+ )

• GI - apsorbuje se u tankom crevu, a gubi intestinalnomsekrecijom

• ćelijska membrana - gradijent se održava Na/K-ATPaznom“pumpom”

Poremećaji koncentracije kalijuma u plazmi• hipokalemija

– uzrokovana redistribucijom K+izmedju ECT i ICT-alkaloza, insulin i adrenalin utiču na povećan ulazak K+

u ćelije

– poremećen balans (nedovoljni unos, gubitak kroz GI ilibubrege)

9.12.2010

142

• hiperkalemija (>6,5mmol/l)

– uzrokovana redistribucijom K+izmedju ECT i ICT-acidoza, nekontrolisan dijabetes, nekroza tkiva

– poremećen balans (povećan unos, bolesti bubrega)

– artefakt (greškom uzeta krv sa K,Na-EDTA; >3 h zaodvajanje seruma; zamrzavanje uzorka krvi)

Homeostaza vodonikovih jona

(acido-bazna ravnoteža)

9.12.2010

143

Acido-bazna ravnoteža

• homeostaza H+ (35-45mmol/L)

• održava se

– fiziološkim puferima

– CO2 centralno mesto u homeostazi H+

– uloga pluća u eliminisanju CO2

– uloga bubrega u izlučivanju H+ i kontroli HCO3- i

H2O

• u plazmi pCO2 5,3kPa (40mmHg), pH 7,4

1. CO2 je krajnji produkt aerobnog metabolozma2. nastaje uglavnom u mitohondrijama gde je pCO2 najveći3. eliminacija CO2 - jedan od glavnih regulatornih

mehanizama organizma

9.12.2010

144

Fiziološki puferi (tkivno specifični)

• bikarbonatni (plazma, IT, eritrociti)

CO2 + H2O ↔ H+ + HCO3-

• hemoglobin (eritrociti)

• proteini (plazma, eritrociti)

• HPO42-/H2PO4

- (eritrociti, bubreg)

Bikarbonatni pufer (važan u ECT)

– CO2 + H2O ↔↔↔↔ H2CO3 ↔↔↔↔ HCO3- + H+

• važnost reverzibilnosti (Le Šateljejev princip) ove reakcije– CO2 + H2O →→→→ H2CO3 →→→→ HCO3

- + H+

• snižava pH oslobadjanjem H+

– CO2 + H2O ←←←← H2CO3 ←←←← HCO3- + H+

• povećava pH vezivanjem H+

• funkcioniše u respiratornom i urinarnom sistemu

– da snizi pH, bubrezima se eliminiše HCO3-

– da poveća pH, u bubrezima i plućima se eliminiše CO2

9.12.2010

145

Fosfatni puferski sistem (važan u ICF i bubrežnim tubulama)

• dihidrogen fosfatni jon (H2PO4-)

slaba kiselina• hidrogen fosfatni jon (HPO4

2-)slaba baza

H2PO4- ���� H+ + HPO4

2-

Proteinski pufer

• odnosi se na ~75% hemijskih pufera u telesnim tečnostima

• zasniva se na jonskim osobinama funkcionalnih grupa aminokiselina

- COOH ���� - COO- + H+

- NH3+ ���� - NH2 + H+

9.12.2010

146

Regulacija respiratornim sistemom

• transport O2 (Hb, dO2)

• transport CO2 (iz tkiva do pluća) u obliku

– bikarbonata

– karbaminohemoglobin/protein

– dCO2

Uloga eritrocita (karboanhidraze, KA) i Hb

delovanjem KA H2CO3 disosuje u H+ i CO3

-

H+ se uglavnomkombinuje sa Hb(snažan pufer) a HCO3

- difunduje izRBC u plazmu u zamenu za Cl-

9.12.2010

147

Respiratorna kontrola pH

• bikarbonatni sistem

– CO2 + H2O →→→→ H2CO3 →→→→ HCO3- + H+

• snižava se pH oslobadjanjem H+

– CO2(izdah) + H2O ←←←← H2CO3 ←←←← HCO3- + H+

• raste pH vezivanjem H+

• ↑↑↑↑ CO2 i ↓↓↓↓ pH stimuliše plućnu ventilaciju, a ↑↑↑↑ pH inhibira

U plućima

oksigenacija Hb

↓↓↓↓

↑↑↑↑ kiselost Hb

↓↓↓↓

↓↓↓↓ ↓↓↓↓

↓↓↓↓ vezivanje CO2 za Hb ↓↓↓↓ vezivanje H+ za Hb

↓↓↓↓ ↓↓↓↓

↑↑↑↑ oslobadjanje H+ iz Hb

oslobadjanje CO2 iz Hb ↓↓↓↓

↑↑↑↑ formiranje H2CO3

↓↓↓↓

↑↑↑↑ oslobadjanje CO2

9.12.2010

148

Regulacija u bubregu

• bubreg ima veliki kapacitet za “amortizaciju” pH

– sekrecijom i puferovanjem H+ jona (acidogeneza)

– reapsorpcijom filtriranog bikarbonata(regeneracijabikarbonata)

– sintezom i izlučivanjem amonijum jona(amonijumgeneza)

Eliminacija H+ u bubrezima

CAH - karboanhidraza

9.12.2010

149

Reapsorpcija filtriranog bikarbonata

Puferski sistemi u urinu

• u generisanjebikarbonata suuključeni i fosfatnipufer i amonijumjoni (puferi urina)

9.12.2010

150

Acidoza i alkaloza

• CO2 od najveće važnosti za homeostazu H+

• [HCO3-]=25mmol/L pri pCO2 5.3kPa

• za homeostazu H+ važan Hb i renalna funkcija

Dva glavna tipa acidoze i alkaloze –respiratorna i metabolička

• respiratorna acidoza:

– povećanje CO2 uzrokovano oštećenjem respiratornog centra u mozgu, opstrukcijom disanja, problemi sa izmenom gasova

• metabolička acidoza:

– akumulacija kiseline ili gubitak baze (bolest bubrega, diareja, dijabetes)

• respiratorna alkaloza:

– hiperventilacija i prekomerni gubitak CO2

• metabolička alkaloza:

– veliki gubitak H+

9.12.2010

151

• acidoza- pH<7,36 [H+]44nmol/L

– (smanjen odnos [HCO3-]/PCO2)

– veća produkcija H+; disfunkcija pluća ili bubrega; veći gubitak bikarbonata

• alkaloza-pH>7,44 [H+] 36nmol/L

– povećan odnos [HCO3-]/PCO2)

Acidoza

• poremećaj zbog nedostatka baze HCO3-

– acidemija pH < 7.35• respiratorna acidoza

– retencija CO2

• metabolička acidoza– intenzivna produkcija kiselina (npr. ketoacidoza,

laktatna acidoza)• neadekvatna eksrecija H+

– poremećaj renalne funkcije

9.12.2010

152

Alkaloza

• poremećaj zbog viška baze

– alkalemija pH > 7.45

• metabolička alkaloza

– neadekvatna produkcija/gubitak kiselina

– gubitak K+

• respiratorna alkaloza

– relativni višak bikarbonata

Ispitivanje acido-baznog statusa

• meri se [H+] i PCO2 u arterijskoj krvi (sa heparinom)– [dCO2] se izračunava iz PCO2 ako je kPa x 0,23; ako je

mmHg x 0,03• [HCO3

-] se izračunava iz Henderson-Haselbahovejednačine

pH = 6,1 x [HCO3- ]/PCO2 x 0,23

• izbeći mehuriće vazduha u uzorku; što pre uraditi u medjuvremenu držati uzorak na hladnom

9.12.2010

153

Acido-bazni poremećaji

[H+] PCO2 plaz. [HCO3-] plaz. [totalCO2]

(nmol/L) (kPa) (mmol/L) (mmol/L)________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

ref. opseg 36-44 4,4-6,1 21,0-27,5 24-30

resp. acidoza 58 9,3 29 32

resp. alkaloza 29 3,2 20 22

met. acidoza 72 3,2 8 11

met. alkaloza 28 6,0 39 43

Uloga bubrega

• izlučivanje i eliminacija

– toksičnih supstanci

• održavanje homeostaze

– reguliše zapreminu plazme i tako koncentraciju

• endokrina funkcija

– hormoni

9.12.2010

154

Regulatorna uloga bubrega u homeostazi

• formiranje urina

– glomerularna filtracija (u glomerulima, zavisi od pritiska)

• filtrat sličan plazmi (osim proteina)

• količina filtrata kroz bubrege, oko 125 mL/min; oko 180 litara/dan

reapsorpcija u tubulamaglukoza, aminokiseline, K+, HCO3

-, 75% Na+...

9.12.2010

155

Endokrina funkcija bubrega

odgovoran za sintezu

– eritropoteina, renina, prostaglandina

– u bubregu se dovršava sinteza dihidroksiholekalciferola (vitamin D3)

� eritropoetin – sekretuje se kao odgovor na O2 u krvi, stimuliše produkciju eritrocita u koštanoj srži

� renin - odgovoran za oslobadjanje aldosterona koji utiče na reapsorpciju Na+ u zamenu za K+

Testovi funkcije bubrega

kompleksna interakcija ekskretorne, regulatorne i endokrine

funkcije bubrega

� merenje glomerularne filtracije (kreatinin, urea, ß2-

mikroglobulin)

– klirens test

� testovi funkcionalnosti tubula

– osmolarnost

� analiza urina

9.12.2010

156

• klirens - test brzine glomerularne filtracije

– filtracija neke supstance u glomerulima, koja se nereapsorbuje ni sekretuje u tubulama

klirens = U x V/P

U – konc.u urinu

V - zapremina urina

P - konc. u plazmi

klirens-zapremina plazme koja se u jedinici vremenapotpuno “očisti” od neke supstance

– dobri markeri

• kreatinin, urea (metaboliti)

• inulin (inertna supstanca, daje se intravenski)

9.12.2010

157

Kreatinin

• sintetiše se u jetri, bubrezima

• sinteza od aminokiselina

• uloga – rezerva ATP-a (kreatin-fosfat)

• važan za ćelije mišića i mozga

• 1-2% kreatina mišića se dnevno konvertuje u kreatinin i oslobadja u telesne tečnosti konstantnom brzinom

• ref. vrednosti u plazmi: 55 – 120 µmol/L

• niska koncentracija u plazmi

– fiziološka (trudnoća)

– patološka (smanjenje mišićne mase)

• povečana koncentracija u plazmi

– nepatološka (povećan unos mesa, naporne vežbe, nekilekovi)

– patološka (akutno ili hronično smanjenje glomerularnefiltracije-glomerulonefritis)

9.12.2010

158

Urea

• sintetiše se u jetri

• način eliminasanja azota kod čoveka (ureotelični)

• manje dobar parametar glomerularne filtracije odkreatinina, jer se deo reapsorbuje u tubulama

– manji unos proteina

– ozbiljno oštećenje jetre

– zadržavanje vode

Smanjena koncentracija u plazmi

9.12.2010

159

Povećana koncentracija u plazmi

• mesto mogućeg uzroka

– prerenalno: hrana bogata proteinima; povećan katabolizam proteina (operacija, trauma, gladovanje); GI krvarenje; oštećena renalnaperfuzija

– renalno: akutno ili hronično smanjenjeglomerularne filtracije

– postrenalno: sve što uzrokuje opstrukciju izlučivanjaurina (hipertrofija prostate, malignitet, kamen)

Proteinurija

narušen integritet glomerula

proteinurija (prisustvo proteina u urinu) npr. albumina

– oštećenje membrane glomerula (više od 25 mg /24 sata)

–smanjena tubularna reapsorpcija normalno filtriranih proteina

• ozbiljno oštećenje glomerula pojava krvi u urinu (hematurija)

– hematurija može biti rezultat lezija bilo gde u urinarnom traktu

9.12.2010

160

ß 2- mikroglobulin

� β2- mali peptid (11.8 kDa), prisutan u plazmi u maloj konc.

� kompletno se filtrira u glomerulima, reapsorbuje i kataboliše u

ćelijama proksimalnih tubula

� β2-mikroglobulin je dobar indeks GFR (nezavisan od ishrane i

mišićne mase)

� povećava se kod odredjenih maligniteta i inflamantornih bolesti

� odličan parametar tubularnog integriteta

• kreatinin, urea, mokraćna kis., amino kiseline, amonijak, glikoproteini, proteini u tragu, enzimi i purin, natrijum, hlorid, kalijum, sulfati, fosfati, oksalati, piruvat, citrat, slobodnemasne kis., hormoni, vitamini, porfirini u tragu

• kvalitativna i kvantitativna analiza urina

– fizičkim

– hemijskim (biohemijskim)

– mikroskopskim postupcima

Pregled urina

9.12.2010

161

• izgled urina

– bistar, svetlo žute boje

– zamućenje (normalno - zbog soli, patološko - leukociti, bakterije, eritrociti)

• pH urina oko 6 (zavisi od hrane 4,6 – 8)

– odredjuje se u svežem urinu (stajanjem izlazi CO2 irazlaže se urea do NH3)

• relativna gustina 1,016 do 1,022

– zavisi od sposobnosti bubrega da održava homeostazutelesnih tečnosti i elektrolita

– meri se urinometrom ili refraktometrom)

• osmolalnos - 500 – 850 mOsm/kg vode– meri se osmometrom– 1osm/kg H2O, 1 mol neelktrolita u 1 kg H2O

9.12.2010

162

• proteini u urinu (proteinurija)

– povećana propustljivost glomerula

– biuretska metoda

• šećeri u urinu (glukozurija)

– glukoza nije normalno prisutna (prag reapsorpcije 9-10 mmol/L)

– ukazuje na povećane konc. i u plazmi

– fruktoza i galaktoza usled enzimskog deficita njihovogmetabolizma

• ketonska tela u urinu (ketonurija)

– acetoacetat, ß-hidroksibutirat, aceton

– normalno samo u tragovima; povećanje kod šećerne bolesti, gladovanja

• urobilinogen u urinu

– normalno samo malo; povećanje kod bolesti jetre ihemolitičke žutice

• bilirubin u urinu (bilirubinurija)

– u patološkim stanjima (opstruktivna i hemolitička žutica)

9.12.2010

163

• krv u urinu (hematurija)

– samo hemoglobin (hemoglobinurija

• nitriti u urinu

– u svežem urinu je znak infekcije urogenitalnogtrakta (redukuju nitrate do nitrita)

Trake za analizu urina

• reagensi na traci reaguju sa supstancama u urinu, stvara se odredjena boja, a intenzitet boje zavisi od koncentracije (poredjenjem boje - semikvantitativno odredjivanje)

9.12.2010

164

• analiza sedimenta urina– epitelne ćelije urinarnog trakta;

eritrociti, leukociti; bakterije, gljivice, paraziti

• mokraćni kamenci– depoziti hemijskih supstanci

u čvrstom obliku: kalcijum, oksalati, fosfati, karbonati, urati, cistin, ksantin

ISPITIVANJE FUNKCIJE JETRE

- metabolizam hema -

9.12.2010

165

Struktura jetre

– hepatociti (60%)

– endotelijalne Kupffer-ove ćelije (makrofage, deoretikuloendotelijanog sistema) (30%)

– vaskularno i vezivno tkivo (10%)

Uloga jetre

• mesto intermedijernog metabolizma (sinteza ugljenihhidrata, proteina, lipida)

• mesto detoksikacije (lekova)

• sekrecija soli žučnih kiselina

9.12.2010

166

Opšte metaboličke funkcije

• sinteza glikogena• sinteza masnih kiselina (transportuju se do adipocita kao

VLDL)• glikogenoliza• glukoneogeneza (od glicerola, laktata /Korijev ciklus/,

amino kiselina)• ureogeneza• ketogeneza

• sinteza proteina (osim IgG)

• većina faktora koagulacije (značaj vit. K)

• sinteza VLDL, HDL

• soli žučnih kiselina

9.12.2010

167

Uloga jetre u ekskreciji i detoksikaciji

• bilirubin

• amino grupe amino kiselina

• holesterol (eksrecija u žuč, slobodan ili esterifikovan)

• steroidni hormoni (kao glukuronati ili sulfati)

• mnogi lekovi, toksini (ksenobiotici)

Bilirubin – sinteza i metabolizam

• nastaje od hema

– 80% eritrociti

– 20% mioglobin, citohromi, peroksidaze

• Fe se izdvaja iz hema, a od tetrapirolskog prstenanastaje bilirubin

9.12.2010

168

Hem

• sinteza u većini tkiva (najintenzivnije u ćelijamaeritrocitne loze, zatim u hepatocitima)

• ugradnja u Hb u koštanoj srži

• hemoglobin, mioglobin, citohromi

Sinteza hema

• od glicina i sukcinata do 5-aminolevulinata (ALA)

• 2 molekula ALA u porfobilinogen

• 4 molekula porfobilinogena do uroporfirinogena

• ugradnja Fe2+ u jedan od izomera

9.12.2010

169

Sinteza hema

9.12.2010

170

Poremećaji sinteze hema

• stečeni: trovanje olovom

• kongenitalni: porfirije

Poremećaj sinteze hema - porfirije

• retke nasledne/stečene bolesti (poznato 6)

• defekt u enzimima za sintezu hema (povećan aminolevulinat i porfobilinogen)

• biohemijske abnormalnosti vode do

– neuroloških poremećaja

– kožne lezije

• po mestu nakupljanja porfirina

– hepatične porfirije

– eritropoetske porfirije

9.12.2010

171

Porfirije

• većina porfirija se nasledjuje autozomalno dominantno• 50% normalne vrednosti enzima• nakupljaju se prekursori hema (porfirini), koji su toksični u visokim koncentracijama• bolest mogu da isprovociraju neke hemikalije, hrana, i

izlaganje suncu

Mehanizam oštećenja

• povećane koncentracije porfirina izložene dnevnom svetlu generišu slobodne radikale, oni oštećuju ćelijskemembrane i uzrokuju smrt ćelija

9.12.2010

172

Not a ‘vampire’s’ disease

zbog nekih simptoma porfirije, veruje se da je ova bolest u osnovi legende o vampirima : ekstremna senzitivnost na sunce; anemia

porfirija je retka, ali teška bolest: teška za dijagnozu i nema specifične terapije

George III : jak bol u abdomenu, mentalna konfuzija, taman urin

9.12.2010

173

Laboratorijski testovi porfirija

• prisustvo protoporfirina van eritrocita

• prisustvo aminolevulinata u 24-časovnom urinu(čuvanje u kiseloj sredini) i porfobilinogena (čuvanje u baznoj sredini)

• potvrda prisustvom porfirina u stolici

• abnormalna eksrecija porfirina se javlja i kod

– trovanja olovom (inhibira neke enzime sinteze hema), ALA se javlja u urinu

– bolesti jetre (smanjena bilijarna eksrecija), povećan koproporfirin u urinu

– ulkusne lezije u gornjem delu GI trakta (povećanjeporfirina u stolici zbog degradacije hema usledkrvarenja)

9.12.2010

174

Razgradnja hema (u slezini)

hem > biliverdin > bilirubin >

(dolazi do jetre kao bilirubin-albumin

kompleks u krvi) > bilirubin diglukuronid >

ekskrecija

Razlaganje hema – nastanak bilirubina

9.12.2010

175

Transport bilirubina

• u plazmi vezan za albumin (nekonjugovani, indirektnibilirubin)

• ulaskom u hepatocite vezuju se za protein Y (ligandin) i Z protein

• u ER se konjuguje sa glukuronskom kiselinom(konjugovani, direktni bilirubin)

9.12.2010

176

Dalji metabolizam bilirubina

• izlučuje se u žuč, a zajedno u tanko crevo

• delovanjem bakterija degradira se do urobilinogena

• oksidacijom urobilinogena nastaje sterkobilin (u fecesu) i urobilin (u urinu)

• najveći deo urobilinogena se izlučuje

9.12.2010

177

Ćelije krvi

LIVER

Bilirubin diglukuronid

(u vodi rstvor.)

2 UDP-glukuronska kis.

Putem žuči do creva

Sterkobilin

izlučen fecesom

Urobilinogen

Stvoren bakterijama Bubreg

Urobilin

izlučen urinom

CO

Biliverdin IXα

Hem oksigenaza

O2

Bilirubin

(u vodi

nerastvorljiv)

NADP+

NADPH

Biliverdin

reduktaza

Hem

Globin

Hemoglobin

reabsorbovan

u krv

Bilirubin

(u vodi nerstvor.)Putem

krvi do

jetre

(albumin,

lipoprot.)

INTESTINUM

Katabolizam hemoglobina

Y

Z

9.12.2010

178

Hiperbilirubinemija

• dve forme:

• direktni bilirubin: konjugovan sa glukuronskom kiselinom

• indirektni bilirubin: nekonjugovani, nerastvorljiv u vodi

Hiperbilirubinemija (žutica, ikterus)

– koncentracija ukupnog bilirubina u serumu (nekonjugovanog i konjugovanog)

do 17,1 µmol/L

– koncentracija direktnog (konjugovanog)

do 4,3 µmol/L

9.12.2010

179

Prema etiologiji

• hemolitička

• toksična

• infektivna

• opstrukciona

Prema anatomskom mestu nastanka

• prehepatična (povećan nekonjugovani bilirubin)

• hepatična i posthepatična (povećan konjugovani bilirubin)

9.12.2010

180

Prema vrsti bilirubina koji je povećan

• nekonjugovani, indirektni (vezan za Alb)

• konjugovani, direktni (glukuronid)

Povećana konc. indirektnog bilirubina

• zbog intenzivne hemolize (prehepatična, hemolitička žutica)

• neodgovarajuća sudbina bilirubina u jetri (hepatična)

• nedostatak enzima

• neonatalna i fiziološka žutica

• koncentracija albumina u plazmi mala

9.12.2010

181

Povećana konc. direktnog bilirubina

• oštećenje parenhima jetre

• poremećaj hepatične eksrecije (opstrukcija)

• može se naći u urinu (uvek patološki nalaz)

A. Hemolitička

anemia

ekscesivna

hemoliza

� nekonjugovani bilirubin

(u krvi)

� konjugovani bilirubin

(izlučuje se u žučni vod)

B. Hepatitis

� nekonjugovani bilirubin

(u krvi)

� konjugovani bilirubin

(u krvi)

C. Bilijarni kamen

� nekonjugovani bilirubin

(u krvi)

� konjugovani bilirubin

(u krvi)

Hiperbilirubinemije

ALT, AST GGT, AF, 5’NU

9.12.2010

182

Genetski poremećaji metabolizma bilirubina

Poremećaj Defekt Bilirubin Klinički nalaz

Crigler-NajjarsyndromeTip I i II

težak deficit UDP-glukuroniltransferaze

nekonjugovanibilirubin ⇑⇑⇑⇑⇑⇑⇑⇑⇑⇑⇑⇑

teška žuticaI (450-700 µmol/L) II (100-400 µmol/L)

Gilberts syndrome

redukovana aktivnostUDP-glukuroniltransferaze

nekonjugovanibilirubin ⇑⇑⇑⇑

blaga žuticatokom bolesti

Dubin-Johnson syndrome

abnormalan transport konjugovanog bilirubina u bilijarni sistem

konjugovanibilirubin ⇑⇑⇑⇑⇑⇑⇑⇑

umerenažutica (50-250 µmol/L)

Rotorov smanjena ekskrecija konjugovani umerena

syndrom bilirubin ⇑⇑⇑⇑⇑⇑⇑⇑ žutica

Rutinski testovi funkcije jetre

testovi funkcija

koja se ispituje

Alb; protromb.vreme sinteza proteina

plazma bilirubin hepatični transport

ALT; AST integritet hepatocita

ALP; GGT prisutne holestaze

9.12.2010

183

Sintetička funkcija jetre

• albumin

• protrombinsko vreme (PT)

– može biti zbog holestaza, ne usvaja se

dovoljno vitamina K zbog deficijencije

soli žučnih kiselina

– oštećenje ćelija jetre utiče na

sposobnost sinteze faktora koagulacije

Eksretorna funkcija jetre

• visoka koncentracija konjugovanog bilirubina u plazmi

• povećana aktivnost alkalne fosfataze (ALP)

9.12.2010

184

Narušen integritet hepatocita (akutni ihronični hepatitis, ciroza)

• plazma ALT i AST su povećane

• povećana GGT

• alkalna fosfataza povećana

Akutni hepatitis

• oštećenje ćelijske membrane• povećanje ALT veće od AST• virusni hepatitis• akutni alkoholni hepatitis

– transaminaze nisu mnogo povećane– GGT izrazito povećan– može da predje u cirozu

• neki lekovi i drugi toksini (hepatotoksini)

9.12.2010

185

Virusni hepatitis

• mononukleoza, rubela i citomegalovirus• hepatitis A, (HAV, infektivni)

– najčešće potpuni oporavak– detekcija anti-HAV-IgM i IgG

• hepatitis B, (HBV, “serumski hepatitis”)– može se razviti u hronični/cirozu– mogu biti asimptomski prenosioci– detekcija antitela na različite delove virusa

HBsAg, anti-HBs, HBcAg, anti-HBc, HBeAg, anti-HBe

• hepatitis C, HCV, (najčešće se prenosi transfuzijom)

– 50% prelazi u hronični i cirozu

– mere se antitela i virusna RNK

• dijagnoza za sve virusne infekcije

– serološki testovi na antigene

– antitela nastala kao odgovor na

prisustvo virusa

– virusna RNK

9.12.2010

186

Hronicni hepatitis

• blago povećane transaminaze• oštećenje hepatocita (smenjuju se faze

destrukcije i oporavka)• često posledica HBV ili HCV ili lekova• deo autoimunog procesa

Opstruktivna obolenja

• holestaze

– povećan ukupni bilirubin (i do 850µmol/L), najviše se povećava konjugovani (direktni)

– u urinu mnogo bilirubina, nedostaje urobilinogen

– povećana alkalna fosfataza (i do 3 puta)

– povećana GGT

9.12.2010

187

• intrahepatične (sekrecija otežana)

– viralni hepatitis, lekovi, alkohol

• ekstrahepatična (opstrukcija kroz žučne puteve)

– kamen u žuči

– upala žučnih kanala

– spoljni pritisak od malignog tkiva

Ciroza jetre

• dolazi do uništavanja hepatocita, posledica– alkoholizma– virusnog hepatitisa– produžene holestaze– cistične fibroze– galaktozemije (nedostatak heksozo-1-fosfat

uridiltransferaze)• u početku blago povećanje AST i ALT,

kasnije, parametri smanjene funkcijehepatocita

9.12.2010

188

Nasledne hiperbilirubinemije

• Gilbert-ov sindrom

– bilirubin ne ulazi normalno u ćelije jetre

– ↑nekonjugov. bilirubina (20-40µmol/L)

– poremečaj bezopasan

• Dubin-Johnson-ov sindrom

– ↑ konjugovanog bilirubina

– detektuje se u urinu, ALP normalna , hepatomegalija, obično je bolest bezopasna

Žučne kiseline

• sinteza u jetri

– važne za ekskreciju holesterola i varenje masti

• primarne

– holna i henodezoksiholna (sekretuju se konjugovanesa glicinom i taurinom)

• sekundarne

– deoksiholna i litoholna (nastaju dekonjugacijomprimarnih, delovanjem bakterija)

9.12.2010

189

• 1-2 L žuči se dnevno proizvede u jetri

– bilirubin, soli žučnih kiselina, fosfolipidi, holesterol, elektroliti, malo proteina

• u žučnoj kesi koncentrovana žuč

Žučni kamenci

• pigmentni– u hroničnim hemolitičkim stanjima– uglavnom soli žučnih kis. sa malo Ca– mali su, ima ih više, tamno zeleni ili crni

• holesterolski– jedan ili više– beli ili žućkasti, na preseku kristalni

• mešani– smesa holesterola, žučnih boja i Ca

9.12.2010

190

• prvi biohemijski skrining

– koncentracija bilirubina

– koncentracija urobilinogena u urinu

– aktivnost transaminaza

– aktivnost alkalne fosfataze

Odredjivanje bilirubuna

• HPLC

• Diazo reagens (diazotovana sulfanilna kiselina), Jendrassik-Grof-ova metoda

– crvena boja u neutralnoj pH sredini, u kiseloj plava

– direktni (konjugovani bilirubin)

– indirektni (vezan za albumin), reaguje nakon dodatkaalkohola ili kofeina kao “pokretača”

9.12.2010

191

• uzorak

– plazma ili serum (uzeta krv na taste)

• čuvati u mraku (fotoosetljiv) i na hladno (do 3 dana)

Metabolizam gvoždja

• 3 – 4 g Fe u organizmu

• slobodan Fe toksičan

– u plazmi vezan za transferin (0.1%)

– u depoima vezan za feritin i hemosiderin (25%)

– u eritrocitima vezan za hemoglobin (70%)

– ostatak u Mb, Cyt, enzimima sa Fe

9.12.2010

192

• apsorpcija Fe

– 1 mg/dan, vezivanjem za protein nastaje apoferitin, a zatim feritin

• ekskrecija Fe

– 1 mg/dan, žene više

– depoziti su toliki da bi kroz 3 godine bez uzimanja Fe došlo do deficijencije

Koncentracija Fe u plazmi

• fiziološki faktori– pol, godine, trudnoća

• patološki faktori– mikrocistična anemija– akutne i hronične bolesti– nemogućnost usvajanja Fe u koštanoj srži (nedostatak

eritropoetičnih faktora npr. B12 ili folat)– hemolitička anemija (plazma Fe povećano)

9.12.2010

193

Odredjivanje koncentracije Fe

• transferin

– može i [Fe] ali samo Fe ne znači mnogo

• TIBC (totalni kapacitet vezivanja Fe), za indirektnoodredjivanje transferina

– doda se višak Fe u plazmu, ne vezani se odvoji, a odredjuje vezani

– 44,8 – 80,6 µmol/L

• UIBC (količina Fe koja jos može da se veže)

– doda se višak Fe u plazmu, višak Fe se odredjujespektrofotometrijski

– m. 18,0 – 48,7 µmol/L

– z. 12,9 – 55,0 µmol/L

9.12.2010

194

Testovi funkcije gastrointestinalnogtrakta

Funkcija

• digestija hrane

• apsorpcija nutrijenata

• sinteza hormona (parakrini), koji

– regulišu pokretljivost

– utiču na oslobadjanje digestivnih enzima

– pospešuju sekreciju (HCl, bikarbonata)

9.12.2010

195

• gastrin (kontroliše sekreciju zeludačnog soka)

• sekretin (pospešuje sekreciju bikarbonata iz pankresa)

• holecistokinin (indukuje sekreciju digestivnih enzima i žuči)

• gastrični inhibitorni polipeptid (GIP, inhibira sekreciju HCl u želudcu, pospešuje sekreciju insulina)

• vazoaktivni intestinalni polipeptid (VIP,uslovljava relaksaciju u digestivnom sistemu, stimuliše sekreciju vode)

• somatostatin (inhibitorni hormon koji supresuje sekreciju drugih gastrointestinalnih hormona)

• bombesin (stimuliše otpuštanje gastrina)

• glukagon (ima suprotan efekat od insulina)

Hormoni

Enzimi (neki se sekretuju kao proenzimi)

• pepsin (želudac)• tripsin, himotripsin• karboksipeptidaze• nukleaze• lipaze, fosfolipaze, holesterolesteraza• amilaza (pankreas)• oligo i disaharidaze

9.12.2010

196

Primenjivi testovi

• mikrobiološki testovi

• radiološka snimanja

• endoskopija

• biopsija

Ispitivanje funkcije zeluca

• ispitivanje želudačnog soka

– gastrični ulkus (prisustvo Helicobacter pylori ),pilorusna opstrukcija, karcinom i Zollinger-Ellisonovsindrom (neoplazija ćelija koje produkuju gastrin)

– zapremina, miris, konzistencija, boja, HCl, enzimi, mukus, krv, hrana, unutrašnji faktor (važno za usvajanje B12)

9.12.2010

197

Ispitivanje funkcije pankreasa

• endokrina (kontrola koncentracije glukoze)

• egzokrina funkcija pankreasa (alkalna pankreasna tečnost idigestivni enzimi-tripsin, himotripsin, amilaza i lipaza)

– sekretin stimuliše oslobadjanje alkalne tečnosti

– holecistokinin stimuliše oslobadjanje tečnosti bogate u enzimima

Testovi egzokrine funkcije pankreasa

• enzimi u plazmi

– tripsin

– amilaza

• obeleženi sintetički peptidi kao supstrat

9.12.2010

198

Bolesti pankreasa

• akutni pankreatitis (posledica kamena u žuči, alkoholizma, vaskularne i infektivne bolesti)

– nekroza tkiva

• amilaza do 10x povećana (normalna ili smanjenane isključuje pankreatitis)

• hronični pankreatitis

• karcinom pankreasa

Poremećaji intestinalne apsorpcije

• bolesti pankreasa – smanjena sekrecija enzima

• posledice

u fecesu:

– kreatoreja (pojava mišićnih vlakana)

– stetoreja (povećana količina masti)

– amiloreja (povećana količina skroba)

9.12.2010

199

Hormoni

Hormoni

• definicija: supstance (hemijski glasnici) koje sekretujuendokrine žlezde i posebne ćelije pojedinih tkiva

• hormon (od grčke reči koja znači stimulirajući, ekscitirajući)

• regulišu metabolizam soli, vode, šećera, lipida i proteina

• održavaju homeostazu – stalnost hemijskog sastava intra iekstra ćelijske tečnosti

• imaju fiziološki patern sekrecije

9.12.2010

200

Hormoni

• klasična definicija – hemijskiglasnici koji se sekretuju u krvi deluju na specifične, target ćelije

• novija definicija – uključuje ifaktore koji se produkuju ideluju lokalno– deluju autokrino (deluju na ćelije

koje ih proizvode) ili parakrino(deluju na susedne ćelije , bezulaska u cirkulaciju)

Hemijska priroda hormona

• proteini, polipeptidi

• lipidi

– steroidi

– eikozanoidi

9.12.2010

201

• biogeni amini, derivatiamino kiselina

– tiroksin, trijodtironin

– epinefrin

– norepinefrin

hormoni deluju u vrlo malim količinamappb (ng/mL) ili ppt (pg/mL)

• od hemijske prirodehormona (i veličine inaelektrisanja) zavisida li ne prolaze krozćelijsku membranu(receptori u membrani) ili ne (receptori u ćeliji)

9.12.2010

202

Hormoni deluju preko receptora ciljnih celija

• većina hormona cirkuliše u krvi i dolazi u kontakt sa skorosvićelijama

– efekat hormona se ispoljava samo na onim koje imajureceptore - ciljne (target) ćelije

Mehanizam delovanja hormona

• proteini (peptidi) i u vodirastvorni amini– hormon (A) se vezuje za

receptor u ćelijskojmembrani

– aktivira se G-protein– aktivira se adenilat kinaza– konvertuje ATP u cAMP– cAMP aktivira protein

kinazu– biološki odgovor

9.12.2010

203

G protein je povezan i sa drugim sistemomsekundarnih glasnika (metabolizmom fosfolipida)

• delovanjem fosfolipaze C

– nastaju drugi sekundarniglasnici

• inozitol trifosfat (IP3)

• diacilglicerol (DAG)

• utiču na konc. Ca 2+ u ćeliji

ili ...

• tirozin kinazne aktivnosti delareceptora

– vezuje se ATP

– interaguje saintracelularnim proteinima

– fosforilacija drugih proteina

9.12.2010

204

.. a steroidni i tiroidni hormoni

• difunduju kroz plazma membranu

• u citosolu ili ulaskom u jedro, formira se hormon-receptor kompleks

• H-R kompleks se vezuje za DNK aktivira/dezaktivira odredjene gene

• steroidni hormoni: polni i kortikosteroidi

• derivati amino kiselina: tiroksin, adrenalin

• peptidni hormoni: vazopresin, insulin, glukagon

• proteinski hormoni: somatotropni, prolaktin, tirotropin

9.12.2010

205

Glavne endokrine zlezde

Princip hormonske regulacije

• regulacija nekih hormona na tri nivoa - hipotalamus, hipofiza, endokrina žlezda

• hipotalamus preko faktoraotpušanja (releasing factors) kontroliše hipofizu

• tropni hormoni hipofizekontrolišu periferne endokrinežlezde

• regulacija negativnompovratnom spregom

9.12.2010

206

Hipotalamus

• smešten u bazi mozga

• sekretuje hormone ilifaktore koji kontrolišusekreciju prednjeg režnjahipofize

Hipofiza

• žlezda koja kontroliše rast i sekreciju drugihendokrinih žlezda

• prednji režanj -adenohipofiza) lučihormone (tropni) kojikontrolišu sekrecijudrugih endokrinihorgana

• pravi šef je ipakhipotalamus

9.12.2010

207

• zadnji režanj hipofize (hormoni se sintetišu u hipotalamusu) samo sekretuje

– vazopresin (antidiuretički hormon, ADH) ioksitocin

• epifiza (pinealna žlezda)

– serotonin (5-hidroksitriptamin, 5HT) i melatonin (reguliše spavanje-visok nivo; nizak nivo i svetlost-budjenje), ima cirkadialni ritam

9.12.2010

208

Hormon ↑↑↑↑ ↓↓↓↓GH akromegalija patuljast rast

gigantizamPRL amenoreja poremećaj

laktacijegalaktorejaneplodnost

ACTH Cushing-ova sekundarnabolest insuficijencija

nadbubregaTSH hipertireoidizam sekundarni

hipotireoidizamLH/FSH rani pubertet sekundarni

hipogonadizam

GH <10 µg/L; novorodjence 10 – 40 µg/LPRL z. pre men. < 20 µg/L

posle men. < 12 µg/Lm. < 15 µg/L

ACTH u 8 h 25 – 100 ng/Lu 18 h < 25 ng/L

TSH 0.51 – 5.75 mU/LADH m. 0.04-0.85 µU/mL

z. 0.15-0.60 µU/mL trudnice 0.12-0.50 µU/mL

serotonin <46.8 µmol/L

Referentne vrednosti

9.12.2010

209

žene u germinat.periodu FSH [U/L] LH [U/L]

folikularna faza < 11 1.6-7.9sredina ciklusa 5-20 13-83lutealna faza <8.2 0.7-9.9postmenopauza <144 0.6-6.1

muškarci <11 0.5-10deca <10 god. <3.8 <0.9

Hormoni tiroidee i paratiroidea

• štitna žlezda proizvodi– tiroksin (T4)– trijodtironin (T3)

• regulišu brzinu svihmetaboličkih procesa

– kalcitonin• utiče na metabolizam

kalcijuma (smanjuje u plazmi)

• paratiroidna žlezda– PTH; povećava Ca u plazmi

9.12.2010

210

– hipertireoidizam

• ubrzan metab., gubitak težine, umor, znojenje

– hipotireoidizam

• usporen metab., tromost, gojaznost, koža suva, kosaopada, glas hrapav, lice nabreklo

Poremećaj funkcije

– guša

• smetnje u sintezi tiroksina, povećava se TSH (tirotropin), tireoideja se povećava (guša)

9.12.2010

211

Referentne vrednosti

• TSH 0.3 – 5.0 mU/L

• T4

– slobodni 10 - 27 pmol/L– ukupni 70 – 150 nmol/L

• T3

– slobodni 3 – 9 pmol/L– ukupni 1.2 – 2.8 nmol/L

Hormoni kore nadbubrežnih žlezda(adrenokortikosteroidi)

• tri histološki različita sloja

– zona glomeruloza (lučialdosteron)

• sinteza pod kontrolomrenin-angiotenzin sistem

– zona fascikulata i retikularis(luče kortizol i androgene)

• sinteza stimulisanaACTH

9.12.2010

212

• glukokortikoidi– kortizol i kortikosteron

• stimulišu glukoneogenezu i razlaganje masti iproteina, balans tečnosti i krvni pritisak

• imaju antiinflamantorno, imunosupresivno iantialergijsko delovanje

• mineralokortikosteroidi

– aldosteron

• važan za homeostazu Na, a posredno i vode i K

• adrenalni androgeni

– dehidroepiandrosteron (DHA)

– androstendion

• pospešuju sintezu proteina

9.12.2010

213

Referentne vrednosti

• kortizol– u 8 h 160 – 565 nmol/L– u 22 h < 205 nmol/L

• aldosteron– u lezećem polož. 0.083 – 0.28 nmol/L– u sedećem polož.

• m. 0.166 – 0.609 nmol/L• z. 0.138 – 0.83 nmol/L

Hormoni srži nadbubrežne žlezde

• epinefrin, norepinefrin, dopamin

– luče ih i mozak i simpatički neuroni

– norepinefrin i dopamin su neurotransmiteri u CNS

– utiču na vaskularni sistem, epinefrin i na metabolizamUH

– krajnji produkt razgradnje je vanilmandelična kiselina -VMA

9.12.2010

214

Polni hormoni

• sekretuju ih polne ćelije pod uticajem gonadotropina LH iFSH

• muški

– testosteron, androstendion i dihidroepiandrosteron

• LH stimuliše sintezu testosterona u Leydigovimćelijama

• FSH stimuliše spermatogenezu

• ženski:

– u I polovini menstrualnogciklusa FSH i LH stimulišu sekreciju estrogena i razvojfolikula ovarijuma

– sredinom ciklusa LH indukuje ovulaciju

– u lutealnoj fazi, žuto teloprodukuje estrogene iprogesteron (pripremaendometrijum)

9.12.2010

215

– ako ne dodje do oplodjenja, opadaju hormoni ovarijuma, menstruacija, raste FSH i LH

– ako dodje do oplodjenja, placenta produkuje horionski gonadotropin (HCG), koncentracija estrogena i progesterona raste

Metode odredjivanja

– bioanalize (eksperimentalne životinje)

• specifični fiziološki odgovor za hormon

• referentna metoda u postupku prečišćavanjahormona

– radioreceptorske analize

• in vitro interakcija hormona sa njegovimbiološkim receptorom

– tehnike imunoanalize (RIA, ELISA)

9.12.2010

216

Metode odredjivanja steroidnih hormona

• hidroliza (kisela, enzimima) hidrosolubilnih konjugata saglukuronskom i sumpornom kis.

• ekstrakcija (uglavnom ukupnih steroidnih hormona) • prečišćavanje i separacija

– selektivna hemijska reakcija– TLC, HPLC, GC

• kvantifikacija– kolorimetrija, fluorimetrija, GC, HPLC, RIA, ELISA

Pankreas

• endokrino (hormoni) i egzokrino tkivo (enzimi)

– oslobadja insulin (beta ćelije), glukagon (alfa ćelije)

9.12.2010

217

Hormoni drugih tkiva

• srčani mišić produkuje atrialni natriuretični hormon– vazodilator– učestvuje u homeostazi vode, Na, K i masti

• masno tkivo produkuje– proteinski hormon leptin– šalje signale u hipotalamus o dovoljno unetoj hrani– kod gojaznih osoba – genetske mutacije uslovljavaju da

je leptin neaktivan ili nema receptorskih ćelija u hipotalamusu

Klinička biohemija u pedijatriji igerijatriji

9.12.2010

218

• novorodjenče (neonata)

– problemi prevremenog rodjenja

– navikavanja na novu sredinu

– problemi sa naslednim bolestima

• kod dece

– problemi u rastu

– napredovanje

– ispoljavanje naslednih bolesti

U pedijatriji

• uzimanje uzoraka krvi kod beba

– mala zapremina krvi

– uglavnom kapilarna (iz pete)

• referentne vrednosti u pedijatriji

– interpretacija rezultata posebno teška kod prevremenorodjene dece

9.12.2010

219

• najčešći problemi

– perinatalna asfiksija (ugušenje)

– respiratorni distres sindrom (“nezrela” pluća)

– infekcije

Rana dijagnoza nekih naslednih bolesti

• fenilketonurija (FKU), poremećaj met. Phe– u urinu ↑ Phe– nagomilavanje i drugih metabolita njegovog

metabolizma (otežano usvajanje svih aminokiselinau jetri i mozgu), ne uzima se Phe kroz hranu

– ↓ konc. Tyr (nastaje od Phe) se mora nadomestitiishranom

• kongenitalni hipotireoidizam, meri se TSH u krvi

9.12.2010

220

Neki od biohemijskih problema u pedijatriji

• hipoglikemija– kod prevremeno rodjenih beba (često kod beba majki sa

dijabetesom)– nasledne bolesti poremećaja metabolizma UH

• kalcijum i magnezijum– kod prevremeno rodjenih beba– nedovoljno uzimanje vit. D

• respiratorni distres sindrom (RDS)– češći kod prevremeno rodjenih beba

• hiperbilirubinemija– fiziološka– patološka (povećanje hemolize, defekt u metabolizmu

hema)• cistična fibroza (poremećaj u prometu jona kroz

membranu), meri se Na i Cl u znoju• patuljast ras – nedostatak hormona rasta (najčešće se meri

uz izazivanje njegove produkcije)

9.12.2010

221

U gerijatriji

• prisutna često multipla patologija

• simptomi često atipični i minimalni

Skrining testovi za starije pacijente

• neadekvatna ishrana

• diabetes mellitus

• bolesti kostiju

• bolesti tereoideje

9.12.2010

222

• u krvi

– albumin, ukupni proteini (slaba ishrana)

– kreatinin, urea (bolesti bubrega)

– glukoza (diabetes mellitus)

– Ca, P, ALP (hipokalcemija, osteomalacija)

– K (hipokalemija, često zbog diuretika)

– TSH, T3, T4 (hipo-ili hipertireoidizam)

– C reaktivni protein, sedimentacija (nespecifični indikatorprisustva bolesti)

• u urinu – glukozurija, proteinurija

• u fecesu – krvarenje u GIT (hemoroidi, kancer)

9.12.2010

223

Biohemijski efekti tumora

Tumorski markeri

• glavne razlike izmedju normalne i maligne ćelije

– poremećena kontrola rasta

– multiple genetske mutacije karakteristične za malignućeliju (zato se smatra da je kancer i genetska bolest)

9.12.2010

224

Rak - pojam za sve zloćudne tumore

– karcinomi – zloćudni tumori epitelnih, mukoidnihćelija, parenhimatoznih organa (jetra, bubreg, pluća i dr.) (parenhim-žlezdane ćelije duž kapilara)

– sarkomi – zloćudni tumori vezivnog i potpornogtkiva

– hemoblastomi – zloćudni tumori hematopoetskogtkiva

Termini

• hiperplazija – povećan broj ćelija koje još uvek odgovarajuna normalne regulatorne mehanizme

• hipertrofija – povećan broj ćelija

• displazija – (‘premalignitet”), ćelije nisu povećane u veličiniili broju, ali imaju abnormalne morfološke karakteristike, ne mora da predju u ćelije kancera

9.12.2010

225

• neoplazija – ćelije koje više nisu pod kontrolomnormalnih bioloških mehanizama

• malignitet – neoplastične ćelije koje su monoklonske, rastu brže od benignih neoplastičnih ćelija, šire se iuništavaju okolno tkivo i mogu da metastaziraju

• proto-onkogeni – geni koji promovišu normalni ćelijskirast (kodiraju proteine signalnih puteva koji kontrolišu proliferaciju i preživljavanje ćelije)

• onkogeni – promenjeni proto-onkogeni koji podstiču abnormalnićelijski rast (menjaju normalne signale, gubi se kontrola rasta i proliferacije-poznato oko 50 onkogena)

• supresor geni – geni koji supresuju abnormalni ćelijskirast (gubitak ili inaktivacija vodi do razvoja tumora)

9.12.2010

226

• efekat tumora može biti lokalni i sistemski

– lokalni – obstrukcija krvnih, limfatičnih i drugihputeva, nekroza okolnog tkiva, krvarenje

– sistemski – tumorske ćelije sekretuju toksine, hormone i druge regulatorne supstance

Tumorski markeri

• bilo koja supstanca koja ukazuje na prisustvo iliprogresiju tumora

• sintetišu ih ćelije kancera ili nastaju kao odgovor naprisustvo tumora

• mogu biti

– polipeptidi

– proteini (gliko/lipo)

– nukleinske kiseline

– enzimi

– hormoni

9.12.2010

227

� ukazuju na

– proliferaciju tumorskih ćelija

– specifične genske mutacije

• uglavnom ih sintetišu neoplastične ćelije

– mogu da menjaju metabolizam i obično pokazujukliničke efekte (npr. hormoni)

– ili su biološki neaktivne supstance koje se mogudetektovati u plazmi ili urinu

Kako odrediti tumorske markere?

• mogu se naći na površini ili unutar ćelija i odrediti

– citohemijski , protočna citometrija

– histohemijski

• u telesnim tečnostima

– krv, urin, CSF, amnionska tečnost

9.12.2010

228

Primena tumorskih markera

• “skrining” bolesti – samo nekoliko markera je dovoljnoosetljivo ili specifično da ukaže na prisustvo tumora

• postavljanje dijagnoze tumora (postoje kliničkemanifestacije)

• davanje prognoze veličine i širenja tumora• praćenje tretmana• praćenje bolesti u remisiji (privremeno smirenje znakova

bolesti)

Grupe tumorskih markera

• hormoni• enzimi• tumorski antigeni

– CEA – karcinoembrionalni antigen - kompleksniglikoproteini plazma membrane tumorskih ćelija, odaklemože da se oslobodi u krv)

• normalno se ekspresuje u fetusu

– AFP- alfa feto protein – normalno se ekspresuje u fetusu

9.12.2010

229

• α- fetoprotein (AFP) (onkofetalni protein, fetalna forma albumina, ↑ se u trudnoći)

– ↑ se mnogo kod tumora jetre

• karcinoembrioni antigen (CEA) (glikoprotein nadjen u ćelijama fetusa)

– produkuju ga neki tumori (debelog creva)

– povećan kod nemalignih bolesti jetre

– povećava se kao posledica hemoterapije i zračenja

Pojedini tumorski markeri

• humani horioni gonadotropin (HCG)

– normalno ga produkuje placenta

– povećan kod tumora gonada

• specifični antigen prostate (PSA)

– protein koji produkuje prostata, povećan i kodbenigne hipertrofije prostate

9.12.2010

230

• ugljenohidratni antigeni (CA)

– grupa tumorskih markera koji se povećavaju u plazmi, koriste se za praćenje tretmana i mogućeg vraćanjabolesti

• CA 125 povećava se kod kancera jajnika• CA 19-9 povećava se kod kancera pankreasa i debelog

creva• CA 15-3 povećava se kod kancera dojke

Neki markeri imaju i dodatni značaj

• prisustvo mutacije na genima BRCA 1 BRCA 2 (breast cancer tumor supresor geni) kao faktora visokog rizikaza genetsku predispoziciju kancera dojke

• visok nivo CEA potvrdjuje prisustvo malignog procesa(za razliku od benignog)

9.12.2010

231

• utvrdjivanje lokacije metastaza (izoenzim alkalnefosfataze karakterističan za kosti, za razliku odizoenzima jetre)

• potencijalno reagovanje kancera na terapiju (prisustvohormonskih receptora kod kancera dojke)

9.12.2010

232

Napomene za interpretaciju nalaza tumorskih markera

• da bi se jasno razdvojili pacijenti sa i bez tumora, tumorski markeri moraju biti

• senzitivni

• specifični

• nijedan nije idealan, dovoljno osetljiv i specifičan

– prostata-specifični antigen (PSA) je jedini marker koji je specifičan za neki organ (ali ne i kancerspecifičan)

• uvek uraditi više uzastopnih testova, a ne samo jednuanalizu– bitno za razlikovanje benignog od malignog procesa

• hiperplazija ima kratko, prolazno povećanje nekihtumorskih markera

• neoplazije uzrokuju progresivno, duže prisutnopovećanje tumorskih markera

9.12.2010

233

• različiti kompleti i različite laboratorije daju različiterezultate za isti uzorak

• pri interpretaciji post-operativne analize voditi računa o poluživotu ispitivanog tumorskog markera– najmanje 2 nedelje, bolje mesec dana posle operacije

9.12.2010

234

• neki testovi pokazuju manje vrednosti (od očekivanih, prema drugim parametrima), ponoviti analizu sarazblaženim uzorkom

Metode odredjivanja

• detekcija uglavnom imunološkim tehnikama (RIA, ELISA, imunohistohemija)

• metode molekularne biologije (PCR, fluorescencija in situ hibridizacije –FISH)

• zbog primene uglavnom različitih antitetala metode je teško standardizovati i odrediti referentne opsege, uglavnom zavise od primenjene metode

9.12.2010

235

Nedostaci tumorskih markera

1. heterogenost tumora

2. mala specifičnost – lažno pozitivni

3. mala osteljivost – lažno negativni

4. benigne bolesti - pozitivan CA 125 ili CEA

5. pušači imaju povećan CEA

6. zdrave osobe imaju malu količinu

7. visok nivo samo kod velikih tumora

8. neki kanceri nikad nemaju visok nivo

Budući pristup

• analiza genoma i proteoma (genomika i proteomika)

• farmakogenomika

– primena lekova zasnovana na analizi gena

• G-skeniranje –mapiranje humanog genoma

• individualizacija tretmana

• rana detekcija malignih promena

• testovi veće osetljivosti i specifičnosti

• bolji monitoring