Dr.sc. Aida Smajlović, docent

Univerzitet u Tuzli

Farmaceutski fakultet

Doktorski studij

Školska: 2014/2015

Istraživanja amiloidnih fibrila na

modelu čovječijeg stefina B i

njegovih tačkastih mutanata

BIOHEMIJSKA OSNOVA NEURODEGENERATIVNIH

BOLESTI

Neurodegenerativne bolesti su stanja gubitka nervnih ćelija u

mozgu i kičmenoj moždini što je praćeno funkcionalnim padom

(ataksija) ili senzornom disfunkcijom (demencija).

Među najpoznatijim neurodegenerativnim bolestima su

Alzheimerova bolest (AB), Parkinsonova bolest (PB),

Huntingtonova bolest (HB), amiotrofična lateralna skleroza (ALS),

multipla skleroza, demencija sa Lewyevim tijelima...

Prisustvo filamentoznih (vlaknastih)

inkluzija u nervnim ćelijama karakteristika

je niza neurodegenerativnih bolesti.

BOLEST BIOHEMIJSKA KARAKTERISTIKA

Alzheimerova bolest Amiloid-β plakovi,

neurofibrilarne nakupine

Parkinsonova bolest Lewyjeva tjelašaca

Huntingtonova bolest Huntingtin sa poliglutaminskim

produžetkom

Amiotrofična lateralna skleroza Inkluzije superoksid dizmutaze

Biohemijske karakteristike nekih neurodegenerativnih bolesti

Neurodegenerativne bolesti koje zahvataju slična područja u

mozgu naginju stvaranju mnogih sličnih kliničkih sindroma, pa se

tako bolesti kore mozga mogu očitovati kao demencija, a bolesti

bazalnih ganglija kao ekstrapiramidne bolesti pokreta.

Neurodegenerativne bolesti su vrlo široka skupina bolesti čija

osnovna karakteristika je propadanje određenih dijelova mozga što

dovodi do smanjenja kvaliteta života.

Uzroci nastanka neurodegenerativnih bolesti

• Upala

• Djelovanje priona

• Trauma

• Neravnoteža neurotransmiterskih sistema

• Autoimuni poremećaji

• Genetska predispozicija

• Djelovanje teških metala

• Akumuliranje proteina

• Djelovanje slobodnih radikala

Ćelije koje degenerišu uglavnom

sadrže abnormalne proteine koji se

talože u vidu agregata.

Sve je više dokaza da ove bolesti imaju zajedničke ćelijske i

molekularne mehanizme, uključujući proteinsku agregaciju i

formiranje inkluzionih tjelašaca.

Agregati se obično sastoje od vlakana koji sadrže nepravilno

svijene proteine sa β-pločastom konformacijom, pod nazivom

amiloid.

Istaloženi amiloid

BOLESTI ETIOLOGIJAPOGOĐENE

REGIJE

KARAKTERISTIČNA

PATOLOGIJA

PROTEINSKI

AGREGATI

Huntingtonova bolest Huntingtin (dominnatan)

Striatum,bazalne

ganglije, korteks,

drugi regioni

Intranuklearne inkluzije i

citoplazmatski agregati

Huntingtin sa

poliglutaminskim

produžetkom

Ostale poliglutaminske bolestiAtrofin-1, ataksin1-3

(dominantan)

Bazalne ganglije,

kičmena mozdinaIntranuklearne inkluzije

Atrofin-1, ataksini

ili AR

Alzheimerova bolest (AD)

sporadično (Apo E

rizični faktor) ,Amilod

prekursor protein (APP)

(dominantan) Presenilin

1,2 (dominantan)

Cortex,

hipokampus

Bazalne gangije

Neuritski plakovi i

neurofibrilarne nakupine

A peptid (od

APP) i

hiperfosforilisani

tau protein

Fronto-temporalna demencija

sa parkinsonizmom

Tau mutacija

(dominantna)

Frontalni i

teporalni cortex i

hipokampus

Pikova tjelašcaHiperfosforilisani

tau protein

Parkinsonova bolest (PD)

Sporadična -sinuklein

Parkin (recesivna,

nekad dominantna)

Supstancia nigra,

cortexLewyjeva tjelašca -sinuklein

Amiotrofična lateralna skleroza

(ALS)

Sporadična,

Superoksid dizmutaza-

1 (dominantna)

Spinalni motorni

neuroni, motorni

korteks

PeriferinNepoznato

(neurofilamenti)

Prionske bolesti (kuru,

CJD, bolest)

Sporadična,

genska ili infektivna

korteks, mali

mozak, talamusAmiloid i ostali agregati Prion protein

Reaktivni oblici kisika i azota zajedno posreduju u oksidativnim oštećenjima

Akumulacija proteina kod kojih je došlo do promjene konformacije i formiranje amiloidnih fibrila

Poremećaj funkcije mitohondrija koje imajuključnu ulogu u metabolizmu i regulacijiživotnog ciklusa ćelije.

Poremećaj ravnotežeizmeĎu redoks-aktivnih(željezo i bakar) iredoks-neaktivnih (cink) metalnih jona

ZAJEDNIČKE KARAKTERISTIKE

NEURODEGENERATIVNIH BOLESTI

Karakteristične neuropatološke lezije kod neurodegenerativnih bolesti

Proteini uključeni ustvaranje agregata su β-amiloid, tau

protein, α- sinuklein, parkin protein, prionski proteini i proteini koji

sadrže poliglutamin.

Neurodegenerativna oboljenja  odlikuju  se  sličnom molekulskom 

osnovom:  promjenama  konformacije  proteina, njihovim taloženjem

sa nastajanjem toksičnih oligomera i fibrila.

Jedna  od  najvažnijih  karakteristika  neurodegenerativnih

oboljenja jeste da većina proteina koji su uključeni u patogenezu ovih

oboljenja pokazuju izraženu sklonost ka agregaciji.

AMILOIDNA

HIPOTEZA

METALNA

HIPOTEZA

HIPOTEZA

JONSKIH KANALA

HIPOTEZA

SLOBODNIH

RADIKALA

ZNAČAJNE

HIPOTEZE

Pokretanje agregacije može nastupiti kovalentnom

modifikacijom proteina bolesti, npr., fosforilacijom, olakšavajući

konverziju proteina ka abnormalanoj konformaciji.

Aβ nastaje iz protofibrila.

Protofibrile se mogu prikupiti

u protofilamente i formirati

konačno zrela vlakna.

Agregati protofibrila

Dijagram toka, moguće terapijske intervencije tokom agregacije proteina

Običan protein postaje amiloid ukoliko pređe u

nerastvorljivu formu sa karakterističnim motivom svijanja

koji se naziva „cross-“ („poprečni “; „unakrsni “), čija

struktura je različita od nativnog stanja.

(B) Model za Aβ (1-

40) sa β-nabranom ravni

formiranom od 12-24 i 30-

40 ostataka.

B

(A) Shema poliglutaminskog

produžetka, sa β-zavojima

ograničenim sa prolin-glicin

insertima na svaki deveti

glutamin.

Alzheimerova bolest se

karakteriše oštećenjem kognitivnih

sposobnosti koja se razvija

postepeno, ali nezaustavivo

progredira.

Simptomi Alzheimerove bolesti

mogu se šire kategorizovati u :

ALZHEIMEROVA

BOLEST

Kognitivne

Funkcionalne

Psihičke

AMNEZIJA

Gubitak pamćenja

gubitak sposobnosti

prepoznavanja

AGNOZIJA

Smanjena

sposobnost

prepoznanja ljudi i

objekata

APRAKSIJA

Poremećaj pokreta,

smanjenje sposobnosti

pokreta koji zahtijevaju

vještinu

AFAZIJA

Smanjena sposobnost

komunikacije, pisanja,

razumijevanja

historije bolesti

psiholoških testova

Dijagnoza se

postavlja na

osnovu

magnetne rezonancije kako bi se isključile eventualne strukturne

promjene mozga poput infarkta koje mogu uzrokovati demenciju.

Magnetna rezonanca

Mozak bolesnika sa

Alzheimerovom bolesti izgleda

difuzno atrofičan, dok je ukupna

težina mozga smanjena za 20 i više

posto. Gledano svjetlosnim

mikroskopom uočavaju se široka

područja bez nervnih ćelija (više od

40 % ćelija većih od 90 milimikrona

zauvijek propada) dok su preostale

ćelije smanjena volumena s

umanjenim dendritima i gubitkom

sinapsi. Mozak kod AB

Glavne patohistološke promjene kod

Alzheimerove bolesti su

ekstracelularni depoziti amiloida-β

(Aβ ) – amiloidni ili senilni plakovi

(SP) i intracelularne nakupine tau

proteina – neurofibrilarne nakupine,

zatim gubitak sinapsi i, na kraju, i

samih neurona .

Neuron sa degeneriranim neurofibrilama

Alzheimerova bolest je obilježena i poremećajem unutar svih

znanih neurotransmiterskih sistema: noradrenergički, GABA -

ergički, serotoninergički, glutamatski, peptidergički .

CH 3-N-CH 2-CH 2-O -C-CH 3

OCH 3

CH 3

+

Biohemijski su najstalniji

manjci acetilholina i

njemu pridruženih enzima

(holin acetil transferaze i

acetilholinesteraze) u kori

mozga hipokampusu, i

amigdali

Struktura acetil-holina

β-amiloid zapravo nastaje od

većeg proteina tzv. amiloidnog

prekursor proteina (APP). Gen za taj

protein smješten je na 21.

kromosomu. Nepravilna razgradnja

APP-a stvara peptide koji tvore

netopljivi β-amiloid, a koji se gomila

u senilnim plakovima.Aβ plakovi.

Neurofibrilarne nakupine se sastoje od parnih helikalnih

filamenata, čiju strukturu čini za mikrotubule vezan protein u

hiperfosforilisanom stanju.

Važna dijagnostička

karakteristika Alzheimerove

bolesti je degeneracija

neurofibrila.

Degeneracija neurofibrila

BIOHEMIJSKE

PROMJENE KOD

ALZHEIMEROVE

BOLESTI

Sniženje

GABA-e

Sniženje

noradrenalina

Sniženje

acetilholinaSniženje

serotonina

Sniženje

neuropeptida

Sniženje

glutamata

Sniženje

somatostatina

Pod normalnim okolnostima razlaganje APP odvija se po

„neamiloidogenom“ putu, djelovanjem α i γ sekretaze, koje

djeluju na transmembranski domen.

Kod AB umjesto α, aktivira se β sekretaza („amiloidogeni put“)

što dovodi do stvaranja amiloida-β koji se sastoji iz dijela

transmembranskog domena i kratkog ekstracelularnog fragmenta.

Cijepanjem APP na N-terminalnom kraju Aβ sekvence oslobađaju se topivi

(solubilni APP) sAPPβ i C terminalni fragment, C99. Fragment C99 dalje se cijepa

pod dejstvom γ-sekretaze dajući solubilni Aβ, najviše Aβ 1-40 i AICD fragment.

Stvaranje β-amiloida

PATOLOŠKI EFEKTI

AMILOID β

Escitotoksičnost sa nakupljanjem

kalcijuma u ćeliji

oksidativni stres

Smanjenje fluidnosti membrana

smanjenje energetskih zaliha

izmjena citoskeleta

podsticanje upalnih procesa

promjena homeostaze metala

Alzheimerova bolest nastaje kada se poremeti

balans produkcije i uklanjanja Aβ, te se zbog

toga stvara veći broj molekula nego što može

da se ukloni.

inhibitori acetil holin esteraze (donepezil, rivastigmin) koji

povećavaju koncentraciju acetil holina u ranoj i srednjoj fazi

bolesti,

NMDA antagonisti (memantin) koji utiču na regulaciju funkcije

glutamatergičkog sistema, u srednjoj i kasnoj fazi bolesti ,

antidepresivi,

antipsihotici

U novije vrijeme se pribjegava terapiji

antitijelima koja mogu prepoznati nepravilno

svijene proteine i izvršiti njihovo uklanjanje.

Ovo podrazumijeva terapijsku strategiju koja

za AB koristi antitijela (ABS) usmjerena na β

amiloid i tau protein.

Anti-amiloid-β monoklonska antitijela mogu

“otopiti“ amiloid β agregate in vitro i spriječiti

amiloid β monomere da agregiraju.

Struktura antitijela

Parkinsonsonova bolest nastaje usljed smanjenja dopamina u

subkortikalnim ganglijama koje nastaje usljed oštećenja nervnih

ćelija koje sadrže dopamin (arterioskleroza) usljed pražnjenja depoa

dopamina u tim ćelijama (reserpin) kao i usljed blokade dopaminskih

receptora .

Struktura dopamina

SIMPTOMI PARKINSONIZMA

TREMOR

Nevoljni

pokreti tijela

RIGIDITET

Ukočenost

u mišićima

BRADIKINEZIJA

sporost pokreta

POSTURALNA

NESTABILNOST

gubitak refleksa

Potreban je detaljan neurološki pregled i obrada

kako bi se postavila dijagnoza bolesti.

Makroskoski se vidi samo gubitak pigmenta

substancije nigre

Mikroskopski u tim područjima postoji gubitak

neurona koji sadrže melanin, nakupljanje

ekstraneuralnog pigmenta i prisutnost Lewyjevih

tjelašaca u nekima od sačuvanih neurona.

Lewijeva tjelašaca su sastavljena uglavnom od

proteina koji se naziva α-sinuklein.

Taj protein se inače nalazi i u ćelijama mozga zdravih

ljudi, meĎutim kod oboljelih od Parkinsonove bolesti on

je izmijenjen.

Lewyjevo tjelašce

α-sinuklein se metabolizira, ubikvitiskim proteasomskim putem,

a mutacije na α-sinukleinu dovode do sporije razgradnje na

ubikvitinskom proteasomskom putu.

Model molekule ubikvitina

Nakupljanje

proteina

Smrt

ćelije

Levo dopa (l-dihidroksi-fenilalanin)

LIJEKOVI KOJI SE KORISTE

U TERAPIJI

PARKINSONIZMA

Antiholinergički lijekovi

( triheksifenidil, prociklidin)

Amantadin

Bromokriptin

Pergolid

Selegilin

Huntingtonova bolest je nasljedni progresivni

neurodegenerativni poremećaj, čiji su karakteristični simptomi

koreja, nepravilnosti u kretnjama očiju, psihološki i kognitivni

poremećaji te progresivna demencija.

Jedan segment na genu Huntingtin sadrži određeni dio DNA

poznat kao ponavljajući slijed trinukleotida CAG.

U normalnim okolnostima CAG se ponavlja 10 do 35 puta

unutar gena.

Osobe sa HB imaju abnormalno visok broj tripleta CAG čak i

do 120 ponavljanja.

U osnovi ove bolesti je mutirani

gen za protein huntingtin.

Inkluzije koje sadrže huntingtin

su prisutne u regionima mozga

koji se degeneriše.

Trodimenzionalna struktura,

proteina Huntingtin.

Dokazano je da se protein huntingtin direktno veže na drugi

protein p53 uzrokujući njegovu pojačanu aktivnost, a on dalje

uzrokuje pojačanu aktivnost velikog broja gena i proteina u ćeliji.

Neki od tih proteina uzrokuju poremećaje u mitohondrijama,

energetskoj centrali ćelije , te se na taj način izaziva poremećaj u

metabolizmu ćelije dovodeći na kraju do smrti ćelije.

Lijekovi koji su u upotrebi;

Tetrabenazin – 2006. godine odobren od strane FDA (Agencija za

hranu i lijekove), SAD odobrio tetrabenazin za liječenje grčevitih,

nevoljnih pokreta koji su povezani sa Huntingtonovom bolesti.

Amiotrofična lateralna skleroza je degenerativno oboljenje ćelija

prednjih rogova motornih neurona i motornog sistema koje dovodi

do slabosti, atrofije mišića, hiperrefleksije i progresivne iznurenosti

sa smrtnim ishodom za 3-5 godina.

Najznačajniji nalaz kod ALS je gubitak motornih ćelija

prednjih rogova kičmene mozdine i motoričkih jezgri donjeg

moždanog stabla.

Nervna ćelija kod ALS-a

Kod 5–10% svih slučajeva riječ je o familijarnom obliku, a

20% familijarnih oblika bolesti uzrokovano je mutacijom

gena za bakar-cink superoksid dizmutazu (CuZn SOD).

Ovaj enzim ima značajnu ulogu u regulaciji oksidativnog

oštećenja ćelija, jer katalizuje prevoĎenje superoksidnog

radikala u vodonik peroksid.

OKSIDATIVNI

STRES KOD ALS-a

Povećanje

ekstracelularnog

glutamataPovećanje

proizvodnje

reaktivnih oblika

kisika Povećena

proizvodnja

peroksinitrita i

hidroksi radikala

Reaktivni oblici

kisika uzrokuju

agregaciju

neurofilamenata

Reaktivni oblici

kisika aktiviraju

mikroglijalne

ćelije

Riluzol je jedini lijek za koji postoji preporuka FDA da se koristi

kod ove bolesti. Smatra se da smanjuje ekscitotoksičnost, koja kod

ALS ide najvjerovatnije preko non-NMDS glutamatnih

receptora.

U završnoj fazi su testiranja za lijekove koji bi mogli poslužiti u

terapijske svrhe, a to su gabapentin, ksaliproden, meskamserin.

U istraživanju je terapija matičnim ćelijama iz koštane srži

samog pacijenta (NurOwn) gdje za razliku od embrionskih

matičnih ćelija, nema opasnosti od odbacivanja ili razvoja

kancera. Ovom terapijom se pomaže organizmu pacijenta da

proizvede neuroprotektorne proteine koji štite mozak od

neurodegenerativnih poremećaja, čime bi moglo da se uspori

napredovanje bolesti.

Zajedničko svojstvo neurodegenerativnih bolesti da imaju polagani i

progresivan tok, nepoznatu patogenezu i ne reaguju na bilo koju poznatu

terapiju, kao i akumulacija patoloških proteina u nervnim ćelijama.

Alzheimerova bolest, Parkinsonova bolest, Huntingtonova bolest i Amiotrofična

lateralna skleroza opisuju se kao „konformacione bolesti proteina“.

Neurodegenerativna oboljenja odlikuju se sličnom molekularnom osnovom:

promjenama konformacije proteina i taloženjem proteina uz nastajanje toksičnih

oligomera i fibrila.

Mada se trodimenzionalne strukture ovih proteina u njihovim nativnim stanjima

enormno razlikuju, abnormalne amiloidne strukture imaju karakterističan motiv

svijanja koji se naziva “cross-” (“poprečni ”; “unakrsni ”), različit od strukture

nativnog proteina. Ćelije koje se degenerišu uglavnom sadrže abnormalne

proteine, koji se talože u vidu agregata.

Sa druge strane, ove bolesti se međusobno mnogo razlikuju, neke

imaju jasan uzrok nasljeđivanja, druge su sporadične, neke pokazuju

više, neke manje specifične intracelularne abnormalnosti, dok kod

nekih bolesti je patološki proces predstavljen atrofijom i gubitkom

zahvaćenih neurona, bez posebnih svojstava.

Niti jedna od ovih bolesti nije izlječiva, terapija je uglavnom

simptomatska, mada se u novije vrijeme istražuje i primjena genske

terapije, terapije monoklonskim antitijelima i primjena matičnih ćelija,

a sve u cilju usporavanja progresije oboljenja i eventualnog

izlječenja.

Pojašnjenje patoloških procesa kod ovih bolesti, dovest će do

razvoja novih strategija u terapiji, otkrića novih lijekova i procedura

za poboljšanje kvaliteta života bolesnika.

▄ Zajednički ćelijski i molekulski mehanizmi čine osnovu

različitih neurodegenerativnih bolesti, kao što su:

- Alzheimerove bolesti (AD)

- Parkinsonove bolesti (PD)

- Hantingtonove bolesti demencije sa Lewyevim tijelima

- Amiotrofne lateralne skleroze (ALS)

▄ Alzheimerova bolest (AD) i Parkinsonova bolest (PD) su

najopštije forme od starosti ovisnih neurodegenerativnih

oboljenja.

▄ Molekulski mehanizmi uključuju pogrešno svijanje proteina i

agregaciju u formu amiloidnih fibrila.

▄ Iako se za vezu između formiranja amiloidnih fibrila i niza

poremećaja, uključujući neurodegenerativne bolesti poput

Alzheimerove, Parkinsonove, a i prionskih bolesti već dugo zna,

mehanizam formiranja amiloidnih fibrila kao osnova za

rješavanje bolesti još uvijek je daleko od potpunog

razumjevanja.

▄ Agregaciji proteina pripada centralno mjesto u ovim

neurodegerativnim bolestima:

- istraživanja na modelima transgenskih miševa

- primjeri familijarnih oblika ovih neurodegenerativnih bolesti

▄ Agregaciju proteina u ćeliji mogu uzrokovati

različiti oblici stresa (kao što su infekcija,

temperatura, oksidativno oštećenje).

▄ Ćelija raspolaže regulatornim mehanizmima

kojima joj se može suprostaviti. U normalnim

uslovima, vitalnu ulogu imaju sistem ubikvitin-

proteasom (UPS) i autofagija.

Struktura amiloidnih fibrila

▄ Iako se trodimenzionalne strukture proteina koji grade amiloidne

fibrile u njihovim nativnim stanjima enormno razlikuju, abnormalne

amiloidne strukture koje grade, imaju karakterističan motiv svijanja

koji se naziva „cross-β“ („poprečni “; „unakrsni β“), različit od

strukture nativnog stanja.

▄ Fibrilogeneza zahtjeva djelimično odvijanje globularnih proteina

odnosno nepotpuno svijanje „nativno nesvijenih“ proteina.

▄ Nativno nesvijeni proteini mogu preći u metastabilnu parcijalno

svijenu konformaciju koja se stabilizira oligomerizacijom.

Aβ α-sinuklein Tau protein

▄ In vitro istraživanja su pokazala da veliki broj proteina, za koje nije

dokazano da su uključeni u neku poznatu patologiju, također mogu

agregirati u amiloidne fibrile, pa takvi proteini mogu služiti kao modeli za

studij procesa agregacije.

▄ Proteini koji nisu uključeni u neku poznatu amiloidogenu bolest mogu

agregirati i postati toksični kao i patološki proteini.

- Čovječija acilfosfataza (AcP) dobar model-sistem za studiranje

važnosti aromatičnosti za amiloidnu agregaciju

- Inzulin model protein za istraživanja strukture amiloidnih fibrila

-Transthyretin

▄ Hipoteza o „generičkom“ mehanizmu stvaranja amiloidnih

fibrila (Dobson i sar., 2002).

- Jedan model bi trebao biti validan za većinu proteina.

Nepravilno

svijena stanja

Agregacija

Kinetičke zamke na putu svijanja

-izlažu hidrofobne aminokiselinske

ostatke

-izlažu regione sa nestruktuiranom

kičmom polipeptidnog lanca prema

otapalu

amorfne strukture amiloidni fibrilarni

agregati

Hrapavost lijevka

energetskog miljea

svijanja rezultat je

nastajanja intermedijata

svijanja sa nenativnim

metastabilnim

interakcijama.

Cistatinska superfamilija inhibitora

cisteinskih proteinaza

široka

rasprostranjenost

u svim višim

organizmima

njihova oligomerna

stanja pristupačna

su za strukturne i

termodinamičke

karakterizacije visoko amiloidogeni

in vitro i in vivo

pogodni za studije agregacije i

fibrilogeneze, jer su strukturno

homologni proteini, pa

predstavljaju prirodan set

varijanti aminokiselinske

sekvence

imaju znatno

očuvano svojstvo

oligomerizacije

Stefin B

(cistatin B)

mali α/β

globularni protein

98 aminokiselinskih

ostataka

molekulska masa 11 kDa

ne sadrži disulfidne veze

inhibitor cisteinskih proteaza

familije papaina

odreĎena mu je kristalna

struktura (Stubbs i sar.,

1990) okarakterisana mu je

enzimska aktivnost.

in vitro, vezuje se na katepsine

B, L, H i S, lizozomske cisteinske

proteaze tipa papaina

njegova široka i ravnomjerna

distribucija ukazuje na opštu

protektivnu ulogu stefina B u

organizmu sisara

Najvjerovatnije da spriječava

neodgovarajuću proteolizu lizozomskim

cisteinskim proteinazama, prvenstveno

katepsinima B, H, K, L, S, a moguće su i

njegove druge funkcije

Konfokalne mikroskopske analize

subcelularne lokalizacije ukazale su na

pretežno intranuklearnu lokalizaciju u

proliferirajućim ćelijama

u diferenciranim ćelijama nalazi i

u nukleusu i u citoplazmi

Lokalizovan je u vezikularnim

strukturama tj., Golđijevom

aparatu/lizozomima, dokazano

mu je prisustvo u primarnim

mioblastima

Struktura i funkcija čovječijeg stefina B

N-terminalni segment

prvi β-zavoj, koji sadrži

QVVAG sekvencu

drugi β-zavoj

Visoko očuvani dijelovi sekvenci stefina smješteni u prvom i

drugom β-zavoju koji povezuju antiparalelne lance β-strukture,

kao i N-terminalnom dijelu inhibitora tvore tripartitni klin koji

priliježe u aktivno mjesto papaina

Stefin B kao model za istraživanje mehanizma

amiloidne fibrilacije

▄ Istraživanja u zadnjih nekoliko godina ukazuju da bi sposobnost

stvaranja amiloidnih stuktura mogla biti opšta osobina

polipeptidnog lanca i da se radi o generičkom svojstvu proteina.

▄ Pojedinačne studije pokazuju da bi važnu ulogu mogli imati:

stabilnost proteina, neutralizacija ionskih interakcija i nakupljanje

aromatskih ostataka

▄ Amiloidni fibrili se ne stvaraju direktno iz nativne

konformacije, nego iz intermedijata koji su samo

djelomično svijeni, a stabilnost nativnog stanja

disfavorizuje tranziciju u visoko odvijeno stanje, koje

se transformira u „skup odgovarajućih intermedijata“

N*.

▄ Za istraživanje i razumjevanje fenomena

agregacije proteina nužan je razvoj in vitro modelnih

sistema, kojima je moguće okarakterizirati strukturu,

kinetiku i termodinamiku.

▄ Istraživanja raĎena na transgenskim miševima sugeriraju

specifičnu funkciju stefina B u CNS i još nepoznatu fiziologiju ovog

proteina.

▄ Novija istraživanja sugeriraju na esencijalnu ulogu stefina B u

nekim neuronima u CNS, koji ove ćelije štiti od apoptoze.

▄ Tehnikom sistem dvostrukih hibrida dokazali su interakciju stefina B sa

velikim brojem citoplazmatskih proteina (β-spectrin, NF-L, RACK-1, TCrp

i Mtrp) koji su uključeni u regulaciju funkcija citoskeleta.

▄ In vivo je detektovan multiproteinski kompleks stefina B sa nekim

od gore navedenih proteina, specifičan za cerebelum.

▄ Novije studije su raĎene na interakciji izmeĎu čovječijeg stefina B

i amyloid-β (1-40) peptida (Aβ) metodom površinske plazmonske

rezonance (SPR) i masene spektroskopije sa elektroraspršenjem

(ESI MS) su pokazali, da egzistira direktna interakcija izmeĎu dva

proteina.

▄ Stefin B je drugi APP / Aβ vezujući protein in vitro i vjerovatno

pogodan i za ćeliju.

Fibrili stefina B pokazuju karakteristike koje su zajedničke svim

amiloidnim fibrilima:

- u pogledu oblika,

- dužine (preko 1 µm),

- kinetike rasta,

-specifičnog vezivanja boja Kongo crvenog i Tioflavina T

▄ Lako gradi amiloidne fibrile već pri pH nešto nižem od 5, za razliku od

njemu homolognog stefina A.

▄ Različita sklonost ka gradnji fibrila ova dva proteina moguće da je

posljedica prisustva ionskih mostova u stefinu A.

▄ Generalno protonizacija malog broja ili samo jednog bočnog lanca u

hidrofobnom središtu proteina nekada je dovoljna za narušavanje nativne

strukture, usljed kidanja unutrašnjeg ionskog mosta ili nastajanjem

naboja u unutrašnjosti proteina.

Najistraživanija patologija vezana za mutaciju na genu za čovječiji stefin

B je progresivna mioklonusna epilepsija Unverricht-Lundborg tipa

(EPM1) autozomno recesivna bolest

Gen za stefin B lociran je na

hromozomu 21 mutacije na genu za

citatin B (EPM1)

zamjenu nukleotida

426G u C na egzonu 1

supstitucija Gly4Arg

ponavljajući tandem

dodekamera na 5`

području gena -

(polimorfizam)

mutacija G u C na

zadnjem nukleotidu

introna 1

mutacija CGA u TGAmutacija Gln71Pro

supstitucija Gly50Glu (G50E)

delecija prvih 18

nukleotida sa 5`

položaja introna 2

Amiloidni fibrili

- Specifična tinktorijalna svojstva, tj. vezuju Kongo crveno i Tioflavin S

- Zajedničke strukturne karakteristike amiloida

▄ Korištenje lanaca stefin B amiloidogenog polipeptida, kao

model sistema, pokazuju da tokom reakcije fibrilacije njegov

polipeptidni lanac prolazi kroz lag fazu, fazu rasta i fazu

elongacije. Na tom putu prolazi kroz niz transformacija, niz

koje je vrlo teško identifikovati.

Svi proteini lako

stvaraju amiloidne

fibrile,ako su odabrani

pogodni uslovi

i odgovarajuća koncentracija

proteina u otopini

Metode za praćenje kinetike formiranja amiloidnih fibrila

Model stefina B▄ Divlji-tip (wt) čovječijeg stefina B (E31) ▄ Izo-obliku (wt) čovječijeg stefina B

(Y31)

▄ Mutant P74S(E31) ▄ Mutant H75W(Y31)

ThT fluorescenca-482 nm

-pH 4,8

Transmisijska

elektronska

mikroskopija (TEM)

Metode za induciranje fibrilacije in vitro

destabiliziraju

nativno

stanje

denaturacijska

sredstva

ili temperatura

održavajući pri tome stanja koja

favorizuju formiranje sekundarne

strukture

favorizuju intermedijatna stanja („I“

stanja)

kod nekih proteina su to prekursori

amiloidnih fibrila

▄ Tačkaste mutacije kod rekombinantnih proteina P74S(E31) i

H75W(Y31) ugrađene su na sredini treće petlje.

25°C

-10

190

390

590

790

1 101 201 301 401

Vrijeme [h]

ThT

flu

oros

cenc

a 482

nm

stB(E31)

stB(E31)*

P74S(E31)

P74S(E31)*

A

30°C

-10

290

590

890

1190

1490

1790

3,5 53,5 103,5 153,5 203,5 253,5

Vrijeme [h]

ThT

flu

oro

scenca 48

2 n

m

stB(E31)

stB(E31)*

P74S(E31)

P74S(E31)*

B

37°C

0

200

400

600

800

1000

2 52 102 152 202 252 302 352

Time [h]

ThT

flu

oro

scenca 48

2 n

m

stB(E31)

stB(E31)*

P74S(E31)

P74S(E31)*

C

▄ ThT fluorescencom praćena kinetika fibrilacije

divljeg-tipa (wt) čovječijeg stefina B i tačkastog

mutanta P74S(E31) je pokazala da je zamjena Pro u

položaju 74 čovječijeg stefina B Ser vodila

značajnom smanjenju sklonosti ka fibrilaciji.

▄ Fibrile je gradio na višim temperaturama (30°C i

37°C), ali sa znatno produženijom lag fazom u

odnosu na divlji-tip (wt) čovječijeg stefina B.

St B

(wt)

P74S(E31)

TEM slike divljeg-tipa čovječijeg stefina B i njegovog mutanta

P74S(E31) sedmi dan nakon postavljene fibrilacije

rezolucija 2 µm rezolucija 0,5 µm rezolucija 200 nm

23-25°C

0

300

600

900

1200

0 100 200 300 400

Vrijeme [h]

ThT

flu

oro

scenca 4

82 n

m H75W

H75W*

P74S(E31)

P74S(E31)*

stB(Y31)

stB(Y31)*

▄ Mutant H75W u kome je His u položaju 75 zamjenjen Trp pokazao

je manju konformacijsku stabilnost u odnosu na divlji-tip (wt)

čovječijeg stefina B, ali ne i značajno smanjenu sklonost ka

fibrilaciji.

▄ Mutant stefina B P74S(E31) na temperaturi od 25°C ne

fibrilira u posmatranom vremenu od 500 sati, ukazujući na

ključnu ulogu Pro 74 u divljem-tipu (wt) čovječijeg stefina

B (E31) i njegove cis-trans prolinske izomerizacije za

proces formiranja amiloidnih fibrila.

▄ Sklonost ka fibrilaciji H75W(Y31) je manja u odnosu na

divlji-tip (wt) čovječijeg stefina B, što pokazuje 3,7 puta

duža lag faza mutanta H75W(Y31), a neznatno manja u

odnosu na izo-oblik divljeg tipa (wt) čovječijeg stefina B

(Y31) (1,12 puta duža lag faza).

▄ Rezultati istraživanja stabilnosti odnosno fibrilacije

divljeg-tipa (wt) čovječijeg stefina B (E31) i tačkastih

mutanata P74S (E31), P79S (Y31) odnosno H75W (Y31)

pokazuju da globalna stabilnost proteina ne utiče toliko na

fibrilaciju proteina, nego da na fibrilaciju više utiču

specifični efekti prolinske izomerizacije, naboja i aromata.

Kliničke i predkliničke studije nekoliko da sada razvijenih terapijskih

pristupa u liječenju ovih bolesti, kao onaj sa stem ćelijama koje

proizvode nervne faktore rasta koji se bore protiv smrti neurona i

anti-amiloidnim antitijelima, koja uklanjaju amiloidne plakove

pokazala su nus-efekte pri liječenju čovjeka.

Pristup koji mnogo obećava je genska terapija, ali ovo je složen i

zahtjevan pristup i treba vremena. Čini se da bi razumjevanje

primarnog uzroka patologije i usmjeravanje terapije na taj put moglo

ponuditi efikasna rješenja u budućnosti.

Sve više je dokaza da su manji, rastvorljivi proteinski agregati, čak

oligomeri, mnogo toksičniji od samih zrelih fibrila.

Stoga bi bolje razumjevanje molekulskog mehanizma agregacije

proteina, tj. procesa amiloidne fibrilacije, identificiranje i strukturno

okarakteriziranje intermedijata od kojih ovaj proces započinje

doprinijelo racionalnom dizajniranju lijekova za ovaj

tip bolesti.

Istraživanja su raĎena na Odsjeku za biohemiju,

molekularnu i strukturnu biologiju Instituta „Jožef

Stefan” u Ljubljani.

HVALA NA PAŽNJI!