Qisthy Adillah

240210120006

V.PEMBAHASAN

Praktikum kali ini yaitu mengenai kromatografi preparatif. Dalam praktikum ini dipelajari operasi pemisahan dan pemurnian suatu komponen bioaktif dengan menggunakan kromatografi kolom preparatif. Tujuan dilakukannya praktikum ini adalah agar dapat memahami prinsip kerja kromatografi kolom preparatif dalam memisahkan dan memurnikan komponen bioaktif kemudian dapat memilih jenis pelarut (fase gerak) dan adsorben (fase diam) yang tepat untuk suatu pemisahan dan pemurnian komponen bioaktif.

Kromatografi adalah teknik pemisahan komponen bahan dengan kemurnian yang tinggi dan biasanya digunakan pada analisa. Namun biasanya kapasitas bahan yang dapat dipisahkannya sangat sedikit dan hanya untuk keperluan analisis (Claeson, 1992). Teknik kromatografi bermanfaat sebagai cara untuk menguraikan suatu campuran. Dalam kromatografi, komponen terdistribusi dalam dua fase. Salah satu fase adalah fase diam. Transfer massa antar fase bergerak dan fase diam terjadi bila molekul-molekul campuran terserap pada permukaan partikel atau terserap didalam pori-pori partikel atau terbagi ke dalam sejumlah cairan yang terikat pada permukaan atau di dalam pori. Laju perpindahan suatu molekul zat terlarut tertentu didalam kolom atau lapisan tipis zat penyerap secara langsung berhubungan dengan bagian bagian molekul-molekul tersebut diantara fase bergerak dan fase diam (Gritter, 1991).

Jenis kromatografi yang digunakan pada prktikum ini adalah HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Sampel yang digunakan yaitu Kratingdeng, Lipovitan, Promen, dan Hemaviton. Penggunaan kromatografi pada praktikum ini bertujuan untuk menghitung kadar kafein dalam minuman energi. Fase gerak yang digunakan adalah methanol dan air yang bersifat polar dengan perbandingan 70 : 20 dan 80 : 20. Setiap sampel yang akan diuji diberi dua perlakuan terlebih dahulu yaitu sampel dengan pengenceran dan sampel tanpa pengenceran. Hasil pembacaan komponen bioaktif pada sampel akan keluar sebagai kromatogram. Sebelum sampel diinjeksikan ke dalam kolom, harus ditetapkan terlebih dahulu standar komponen bioaktif yang ingin diidentifikasi.Kromatografi didasarkan pada distribusi atau partisi solut (analit) sampel antara fase diam dan fase gerak. Teknik kromatografi yang saat ini umum digunakan untuk analisis bahan makanan adalah: kromatografi lapis tipis, kromatografi cair kinerja tinggi, kromatografi cair super kritik, dan kromatografi gas. Metode-metode kromatografi sering difungsikan sebagai metode pemisahan analit dalam sampel makanan. Metode kromatografi juga seringkali dihubungkan dengan instrumen yang lain seperti dengan sprektometer massa sehingga terdapat kromatografi cair-spektrometri massa (LC-MS) dan kromatografi gas-spektrometri massa (GC-MS) (Rohman, 2013).

Pemisahan yang terjadi pada kromatografi dilaksanakan dengan memanipulasi sedemikian rupa sifat-sifat fisik umum dari suatu senyawa atau molekul, yaitu:

a. Kecenderungan suatu molekul untuk larut dalam cairan (kelarutan).

b. Kecenderungan suatu molekul untuk bertaut dengan suatu serbuk bahan padat (absorbsi).

c. Kecenderungan suatu molekul untuk menguap (volatilitas) (Sudarmadji, 2010).

Dalam kromatografi, senyawa-senyawa yang akan dipisahkan ditempatkan pada situasi dinamik (bergerak) yaitu dengan melakukan pengaliran dan selama itu akan terjadi peristiwa pelarutan, absorbsi atau penguapan (Sudarmadji, 2010).

(a)

(b)

Gambar 1.a) dan b) Rangkaian Alat HPLC

(Sumber : Dokumentasi pribadi, 2015)

Prinsip dari kromatografi yaitu didasarkan pada absorbsi komponen-komponen campuran dengan afinitas berbeda terhadap permukaan fase diam. Absorben bertindak sebagai fase diam dan fase geraknya adalah cairan yang mengalir membawa komponen campuran sepanjang kolom. Sampel yang mempunyai afinitas besar terhadap absorben akan secara selektif tertahan dan afinitasnya paling kecil akan mengikuti aliran pelarut (Rebolegi, 2013).

Alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Fasa diam yang biasa digunakan (pada kolom) HPLC jenis fasa terbalik adalah RMe2 SiCl dimana R adalah rantai alkana C-18 atau C-8. Sementara fasa geraknya berupa larutan yang diatur komposisinya (gradien elusi), misalnya air: asetonitril (80:20) dan sebagainya. Hal ini bergantung pada kepolaran analit yang akan dipisahkan. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan waktu retensinya akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya terpisah. Waktu retensi yaitu waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu. Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda.

Seluruh bentuk kromatografi memiliki fase diam (berupa padatan atau cairan yang didukung pada padatan) dan fase gerak (cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen dari campuran bersama-sama. Komponen-komponen yang berbeda akan bergerak pada laju yang berbeda pula. Kita akan melihat alasannya pada halaman selanjutnya. Dalam kromatografi kertas, fase diam adalah kertas serap yang sangat seragam. Fase gerak adalah pelarut atau campuran pelarut yang sesuai (Kristianingrum, 2011).

Teknik HPLC merupakan suatu metode kromatografi cair-cair, yang dapat digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kualitatif dengan teknik HPLC didasarkan pada pengukuran luas area standar. Pada prakteknya, metode pembandingan area standar dan sampel kurang menghasilkan data yang akurat bila hanya melibatkan suatu konsentrasi standar. Oleh karena itu, dilakukan dengan menggunakan teknik kurva kalibrasi (Wiji, 2010).

Cara kerja dari HPLC yaitu pertama fasa gerak dialirkan melalui kolom kedetektor dengan bantuan pompa. Kemudian cuplikan dimasukan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Didalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran karena perbedan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom terlebih dahulu. Sebaliknya solut-solut yang interaksinya kuat dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih lama. Setiap komponen yang campuran yang keluar kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram (Hendayana, 2006).

Konsentrasi sampel dapat diperoleh dengan menggunakan perhitungan sebagai berikut.

Praktikum kali ini berjalan dengan kurang baik karena penetapan standar memerlukan waktu yang lama dan tidak terbaca oleh detector HPLC. Hal ini bisa disebabkan karena standar yang digunakan telah disimpan dalam waktu yang cukup lama sehingga memungkinkan adanya kerusakan atau terdapat kotoran pada alat yang menyebabkan proses pembacaannya terganggu.

HPLC merupakan salah satu metode kromatografi cair yang menggunakan fasa diam yang ditempatkan dalam suatu kolom tertutup dan juga fasa geraknya berupa pelarut yang dialirkan dengan cepat ke dalam kolom dengan bantuan pompa/tekanan. Berikut adalah ilustrasi dari HPLC.

Gambar 2. Komponen Pokok dalam Alat HPLC

Sumber: http://pustaka.unpad.ac.id/wp-content/uploads/2009/12/diktat_pelatihan_hplc_2007.pdf1. Gradien Controller/Solvent Reservoir :

Fungsinya untuk menampung fasa gerak yang akan dialirkan ke dalam kolom dengan bantuan pompa. Syarat fasa gerak yang digunakan harus dimilipore (pori-pori 5m) dan didegass.

2. Pompa :

Fungsinya untuk mendorong fasa gerak masuk ke dalam kolom.

3. Sample Introductions/Injector :

Fungsinya sebagai tempat memasukkan cuplikan/sampel dengan bantuan syringe.

4. Kolom :

Merupakan jantung dari sistem HPLC, karena di dalam kolomlah terjadi pemisahan komponen-komponen cuplikan.

5. Detektor :

Fungsinya untuk mendeteksi komponen-komponen cuplikan hasil pemisahan kolom.

6. Data Output :

Fungsinya untuk menampilkan hasil yang diperoleh (Anshori, 2007).

Keuntungan dari penggunaan HPLC antara lain:

Kerja lebih mudah dengan automatisasi dalam prosedur analisis dan pengolahan data

Volume sampel kecil

Daya pisah tinggi

Merupakan metode analitis:a. Cepat

b. Peka

c. Akurat

d. Tepat

e. Reproducible

Juga Preparatif

Dapat digunakan untuk analisis sampel organik dan anorganik, bersifat volatil dan non-volatil, stabil dan tidak stabil secara thermal.

Pilihan fasa diam dan fasa geraknya luas (Anshori, 2007).

Beberapa contoh aplikasi HPLC adalah sebagai berikut. HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida.

Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.

Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis zat berpori.

Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX.

Dapat memisahkan vitamin-vitamin yang larut dalam air.

Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia.

Kromatografi cairan kinerja tinggi (KCKT/HPLC) digunakan untuk memisahkan golongan-golongan takatsiri, misalnya terpenoid tiggi, segala jenis senyawa fenol, alkaloid, lipid dan gula.

HPLC cocok digunakan untuk memisahkan minyak atsiri. Minyak atsiri terdiri atas campuran yang sangat rumit menjadi golongan-golongan senyawa atau memisahkan golongan senyawa menjadi komponen-komponennya (Anshori, 2007).Instrumentasi HPLC terdiri dari fase gerak, pompa, injektor, kolom, detektor dan pengolah data.

Gambar 3. Skema Instrument HPLCSumber: https://arycho.wordpress.com/2012/04/08/53/Fase gerak (eluen)Berupa zat cair. Fase gerak selain sebagai pembawa senyawa campuran menuju detektor, fase gerak juga dapat berinteraksi dengan solut-solut. Beberapa persyaratan HPLC antara lain :

Harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk sampel yang akan dianalisis

Zat cair harus murni dan jernih untuk menghindari kotoran yang dapat mengganggu interpretasi kromatogram dan menghindarkan penyumbatan kolom

Mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar dan tidak beracun

Memiliki viskositas rendah

Sesuai dengan detektor yang digunakan

PompaDianalogikan sebagai jantung, berfungsi mengalirkan fase gerak cair melalui kolom.

Injektor

Merupakan tempat masuknya sampel. Sampel yang dimasukkan ke dalam HPLC hanya beberapa puluh mikroliter. adakalanya injektor merupakan suatu sistem autosampler.

Kolom

HPLC berisi fase diam, tempat terjadinya pemisahan campuran menjadi komponen-komponennya. Biasanya berukuran antara 5-30 cm dan diameter dalam berkisar antara 4-10 mm. Jenis kolom bervariasi bergantung keperluan, misalnya dikenal kolom C-18, C-8, cyanopropyl, penukar ion. Yang paling banyak dipakai adalah kolom C-8 dan C-18. Saat ini yang baru diperkenalkan adalah kolom HILIC (Hidrophilic Interactive Liquid Chromatography)

Detektor

Denganpersyaratan untuk detektor antara lain harus cukup sensitif, stabilitas dan keterulangannya tinggi, respon terhadap sampel linier, waktu respon pendek sehingga tidak tergantung pada kecepatan alir, reliabilitas tinggi, mudah digunakan serta tidak merusak sampel (Arycho, 2012).

VI.KESIMPULAN

Berdasarkan praktikum yang telah dilaksanakan, maka dpaat ditarik beberpa kesimpulan sebagai berikut. Kromatografi adalah teknik pemisahan komponen bahan dengan kemurnian yang tinggi dan biasanya digunakan pada analisa.

Metode-metode kromatografi sering difungsikan sebagai metode pemisahan analit dalam sampel makanan. Pemisahan yang terjadi pada kromatografi dilaksanakan dengan memanipulasi sedemikian rupa sifat-sifat fisik umum dari suatu senyawa atau molekul. Prinsip dari kromatografi yaitu didasarkan pada absorbsi komponen-komponen campuran dengan afinitas berbeda terhadap permukaan fase diam. Teknik HPLC merupakan suatu metode kromatografi cair-cair, yang dapat digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kualitatif dengan teknik HPLC didasarkan pada pengukuran luas area standar.DAFTAR PUSTAKAAnshori, J. A. Diktat Pelatihan HPLC. Available online at: http://pustaka.unpad.ac.id/wp-content/uploads/2009/12/diktat_pelatihan_hplc_2007.pdf (diakses pada 28 Mei 2015)Arycho. 2012. Prinsip dan Instrumentasi High Performance Liquid Chromatography(HPLC). Available online at: https://arycho.wordpress.com/2012/04/08/53/(diakses pada 28 Mei 2015)Claeson P. 1992. Practical aspects on flash chromatography and preparative liquid

chromatography (MPLC). Buchi Laboratoriums-technik AG 9230 Flawil, Switzerland

Gritter, R.J. J.M. Bobit, and A.E. Schwarting. 1991. Pengantar Kromatografi. (Terjemahan). ITB, Bandung.

Hendayana, S. (2006) . Kimia Pemisahan Metode Kromatografi dan Elektroforensis Modern. PT. Remaja Rosdakarya : Bandung.

Kristianingrum, S. 2011. Kromatografi Kertas. Available online at: http://staff.uny.ac.id/sites/default/files/pendidikan/Susila%20Kristianingrum,%20Dra.,%20M.Si./Handout-KA%20II-KROM.KERTASs.pdf. (diakses pada 28 Mei 2015)Rebolegi. 2013. Kromatografi. Available online at: http://www.slideshare.net/rebolegi/kromatografi-26592457 (diakses pada 28 Mei 2015)Rohman, A. 2013. Analisis Komponen Makanan. Graha Ilmu : Yogyakarta.

Sudarmadji, S. Bambang Haryono dan Suhardi. 2010. Analisa Bahan Makanan dan Pertanian. Penerbit Liberty : Yogyakarta.