1

Analysering av HbA1c med kromatografisk metodeBFI 03. februar 2015 v/ Gro Nielsen (AHUS)

2

Hva er HbA1c?

• Normalt hemoglobin består av 2 alfakjeder og 2 bettakjeder

• Glykosylert hemoglobin (HbA1c) er et glykoprotein dannet ved en irreversibel reaksjon mellom glukose og betakjeden i hemoglobinet.

• Verdien reflekterer det gjennomsnittlige blodglukosenivået de siste 6-10 ukene før prøvetaking.

• HbA1c avhenger av normal levetid for erytrocyttene. Nedsatt levetid gir falsk for lave resultater.

2

3

Changes in globin expression during embryonic, fetal and adult life

0 -6 months Birth 6 months

α-chain

γ-chain β-chain

δ-chain

22 HbA122 HbA222 HbF

4

HbA1c – diagnostisk test

Kriterier:

• HbA1c > 6,5 %

• Fastende glukose >7,0 mmol/L (hvis ikke HbA1c kan benyttes)

• 2 timers venøs glukose etter 75 g oral glukose >11,1 mmol/L.

3

5

Instrument - TOSOH G8

6

HbA1c på AHUS

• Antall prøver pr. døgn: ca 250 (PHT + interne).

• Analysetid: 1,6 min. pr prøve.Analysering fra kl 08:00 til ca 16:00

• Prøvemateriale: 1 mL EDTA-blod (primærrør)70µL EDTA-blod i analysekopp

• Holdbarhet: 7 dager (2-8 °C)5 dager (romtemp.)

• Referanseområde: 4,0 – 6,0 % (oppgitt av leverandør, verifisert)

4

7

Prinsipp – Kromatografi (HPLC)

HPLC (high performance liquid chromatography)

• Høyt trykks væskekromatografi med ionebytting.

• Stasjonær fase – kolonne ”pakket” med kationer.

• Mobil fase - 3 elueringsbuffere, med ulik pH og ionestyrke.

• Gode separasjonsegenskaper oppnås med kolonne pakket med svært små partikler og en høytrykkspumpe som pumper den mobile fasen gjennom systemet.

8

Analysering av prøver

Prøvemengde4µL blod fortynnes automatisk med hemolyse/ vaskeløsning (1:200) og hemolysatet sendes inn i kolonnen (via forfilteret).

Mobil faseElueringsbufferne sendes deretter inn i kolonnen, en etter en, slik at de ulikehemoglobinfraksjonene separeres.

5

9

Normalt HbA1c- kromatogram

økende bindingsstyrke

10

Når byttes kolonnene?

Kolonnene lever ikke evig og må byttes ved behov:

• For høyt kolonnetrykk

• QC problemer

• For lav teoretisk plateverdi (TP-verdi<250), dvs butte topper.

6

11

Rutiner ved kolonnebytter

• Kalibrerer ny kolonne

• Analyserer kvalitetskontroll

• Analyserer minst 10 pasientprøver med gammel og ny kolonne(korrelasjon). Passing & Bablok regresjon.

• Evt reanalyse av nedfrosset materiale fra tidligere ekstern kvalitetsvurdering eller andre nedfrosne ”arkivprøver”

12

Analysekvalitet - presisjon

• CVa (langtidsCV):

HbA1c nivå ca 6 %: CVa= 0,7 %. Kontrollmateriale, EDTA-blod

HbA1c nivå ca 9 %: CVa= 1,0 %. Kommersiell kontroll, liquid.

Kontrollmaterialene er uavhengige, dvs ikke fra instrumentleverandør.

• Tillatt total feil: TEa = 3 - 4 %

7

13

Analysekvalitet - riktighet

Ekstern kvalitetsvurdering (Noklus)

• Små avvik med ny kalibrator. Bias ca +2 %.Ingen faktorisering på AHUS.

• Biaskrav +/- 2,3 % ved kolonnebytter.

• Små kolonnelot-variasjoner.

14

Ekstern kvalitetsvurdering

Eget resultat:5,85% Avvik fra tillagt verdi: +2,5 %.

Akseptgrense: +/- 7%.

%

antall

Eget resultat

Noklus, 4-2014

8

15

Atypiske kromatogram

• Gammel prøve

Ny prøve ønskes

16

Hemoglobinopatier

• SyntesesviktThalassemier (β og α)

• Mutasjoner i kjedeneUlike varianter (D, S, C og E)

9

17

β - globinkjede

β-thalassemi

α - globinkjede

α-thalassemiNormal Hb-variant

Thalassemi vs hemoglobinvariant

18

Forekomst av hemoglobinopatier(Etnisk norske har ingen)

HbC

HbS

HbD

Talassemier

HbE

10

19

Hemoglobinopatier- varianter

Sannsynlig D-variant

Svar kan gis ut med tillegg:

Funn av variant

20

Hemoglobinopatier- varianter

Sannsynlig S- variant

Svar kan gis ut med tillegg:

Funn av variant

11

21

Hemoglobinopatier- varianter

Sannsynlig E- variant

Tillegg til svaret:

Utført på alternativ metode.Funn av variant.

22

Hemoglobinopatier- føtalt hemoglobin (↑)

Økt mengde HbF (lite barn)

Svar kan gis ut.

HbF=<15 %

12

23

Hemoglobinopatier- Thalassemi

β- Thalassemi minor:

Svar kan ikke rapporteres

Diabetes. Nedsatt levetid på RBC?

Hb,MCV, MCH, RDW ??

24

Hb-typing. Normalt kromatogram

HbFHbA2

HbA0

13

25

Oppsummering:

Brukervennlig instrument. Stabilt Ujevn levetid på kolonnene

Lite vedlikehold Positiv bias over tid (jmfr ERL).Noe mindre med ny kalibrator.

God presisjon. Liten lot til lot variasjon på kolonnene

Mindre kapasitet enn immunologiske metoder (?)

”Ser” hva vi analyserer.Usikkert resultat?

En del kommunikasjonsproblemer mellom TOSOH G8 og LIS

Oppdager hemoglobinopatier.Videre analyse, med kolonne for dette, gjøres ved behov.