hplc sunum

HAZIRLAYAN: Eda AÇIKGÖZDANIŞMAN: Doç. Dr. Deniz YILDIZ

MUSTAFA KEMAL ÜNİVERSİTESİ (2010)

HPLC VE

BİYOKİMYA’DAKİ KULLANIM ALANLARI

HPLC NEDİR?

Yüksek hızda gerçekleştirilen ayırmaların yapıldığı sıvı kromatografi sistemlerine, Yüksek Basınç Sıvı Kromatografi (HPSC) denir.

Yüksek basınç altında sıvı olan hareketli faz ile katı olan sabit faz arasında maddelerin dağılma esasına dayanan ayırma yöntemidir.

HPLC’nin Çalışma Prensibi

Ayırma prensibi, karışımdaki bileşenlerin sabit faz üzerinde farklı zaman harcaması esasına dayanır.Sadece burada dikkat edilmesi gereken noktalar;çözücülerin mutlak suretle kabarcık oluşumunu engellemek için gaz gidericiden geçirilmesi gerektiği ve pompanın basınç değişikliklerini engelleyecek şekilde çalıştırılmasıdır.

YÜKSEK PERFORMANSI ARTIRAN KRİTERLER

Yüksek basınçta kolon doldurulması

Doğru, düşük hacimli enjektör kullanımı

Duyarlı düşük hacimli dedektörler

İyi pompalama sistemlerinin kullanılması

Dar bir dağılım aralığında çok küçük partiküllerin kullanılması (Uniformgözenek boyutu ve dağılımı)

Klasik Tekniklere Göre HPLC

Partikül boyutu çok küçük(3.5-10μm) matrikslerin kullanılması

Basınca dayanıklı paslanmaz çelik kolonların kullanılması

Yüksek iç basınç ve kontrollü akış hızı sağlanması

Örnek gereksinimin az olması

Sürekli akış dedektörleri ile küçük miktarların tayinine olanak sağlanması

Otomasyona müsait

Hızlı analiz imkanı

Yüksek ayırma gücü

HPLC’NİN KISIMLARI

POMPALAR

Eluent’in; enjektör, kolon ve dedektör boyunca sürekli sabit akışının kontrolünü gerçekleştiren üniteler

Akış hızına göre Standart bore sistemleri Preperatif pompa sistemleri

Pompanın yapıldığı malzemeye göre metalik

ametalik

Şırınga tip

Mobil faz iletme mekanizmasına göre Piston pompa

Microbore Pompa Sistemleri

ENJEKTÖR

HPLC donanımını oluşturan enjektör örneğin sabit faz (kolon) öncesinde mobil faza enjekte edilmesi için kullanılır. Elle kumanda edilen manuel ve bilgisayar kumandalı oto-enjektörler olmak üzere 2 çeşidi bulunmaktadır.

KOLON Modern HPLC donanımının 4 temel yapı taşından

birisi olan kolon, karmaşık örneklerde bileşenlerin birbirinden iyi çözünürlükle ayırımından sorumlu sabit fazdır.

Kullanılacak mobil fazın ve uygulanacak HPLC metodunun özelliklerine ve analizi yapılacak örneğin bilinen kimyasal ve fiziksel özelliklerine göre seçilmelidir. Seçilecek kolonun HPLC uygulamasında kullanılacak akış hızı ve dolayısıyla oluşacak basınca dayanıklı olmasına dikkat edilmelidir.

Yüzeyde bulunan porların boyutu oldukça önemlidir. Uygulanacak olan örneğe göre bunu iyi ayarlanması gerekiyor.

KOLON

Kolon uzunluğu alıkonma (retention)

Akış Hızı: kolondaki partikül boyutuna bağlı ve ters orantılı.

Akış Hızı ve Kolon Uzunluğunu Etkisi

Kolondan elüe olan örnek bileşenlerinden alınan cevap doğrultusunda sinyallerin kromatogram üzerinde pik olarak ifade edilmesini sağlayan ünitelerdir.

DEDEKTÖR

UV-Görünür Bölge Dedektörleri -Sabit Dalga Boyu -Değişebilir Dalga Boyu -DiodeArray Floresan Dedektörler Refraktif İndeks Dedektörler Elektrokimyasal Dedektörler Radyokimyasal Dedektörler KondüktümetrikDedektörler Kütle Spektrometrik Dedektörler Evaporatif Işık Saçılım Dedektörler

HPLC’DE KULLANILAN BAZI DEDEKTÖRLER

A) Normal faz (Normal phase-NP) (ilk geliştirilen teknik, kolon polar, mobil faz apolardır, kullanılan kolonlar silica gel, cyano, amino, diol veya nitro kolonlardır)

B) Ters faz (Reverse phase-RP) (en sık kullanılan teknik, kolon apolar,

mobil faz polardır, kullanılan kolonlar C18, C8, C4, phenyl, TMS, Cyano’dur)

C) Ters faz iyon çifti (Reverse phase ion pairing-IP) D) İyon değişim (Ion exchange-IC) E) Size exclusion SEC (GPC/GFC) F) Kiral ayırım (Chiral separation)

HPLC ÇEŞİTLERİ

1. Basıncın artması Sorun HPLC cihazınızın karşıt basıncı sürekli olarak artmakta ve

başlangıç değerini % 10 aşmaktadır.Nedenler

**Giriş kılcal boruları tıkalı, kolon tıkalı, Detektör hücresi tıkalı olabilir.Tıkanıklıklar şu sebeplerden kaynaklanabilir:

- Mekanik kirlenmeler, pompa contalarında aşınma, enjektör valfındaki rotor pistonunun aşınması.

- Dökülen tampon tuzlar ve numuneler. - Bakteri üremesi ve çözelti içindeki diğer kirlenmeler.

HPLC’de Olası Problemler ve Çözümleri

Tıkanmanın olduğu yeri tespit etmeye çalışın Bunun için,

Pompa çalışır halde iken Pompa ile Detektör arasındaki tüm vida bağlantılarını açın.

Vidaları açarken Detektör ile başlayıp Pompa’ya doğru ilerleyin.

Burada basıncın belirgin şekilde nerede düştüğüne dikkat edin. Gerekirse tıkalı kılcal boruları değiştirin.

Şayet sebep süzgeç veya filtreler ise, bunların yenilenmesi veya değiştirilmesi gerekir.


2. Çözünürlüğün azalması veya düşük ayrım etkisiSorun: Kromatogramda elde ettiğiniz çözünürlük giderek

kötüleşmekte, pikler gittikçe genişlemektedir. Pikler asimetrik bir şekil almaktadır. Çift pikler belirmektedir.

Nedenler

**Kolon, güçlü şekilde alıkonan bir madde ile kirlenmiş durumda. Çözücü maddenin veya numunenin sebep olabileceği kirlilik, numune ile kuvvetli ikincil bir etkileşime giriyor.

**Kolon içindeki dolgu maddesinde kanallar oluşmuş. Kuvvetli basınç darbeleri veya mekanik etkiler ile etkilenen dolgu yatağı, buna sebep olabilir


3. Kolonun ayrım performansının değişkenlik göstermesiSorun:Kolonun ayrım etkinliği sabit değil. Bir enjeksiyonda iyi bir

ayrım elde ederken bir diğerinde geniş veya üst üste binmiş pikler elde ediyorsunuz.

Nedenler: Çoğu defa sorun kolonun aşırı yüklenmesinden kaynaklanmaktadır. Bir kolonun yüklenebilirliği içerdiği durgun fazın kütlesine bağlıdır.

- Kütlesel yüklenebilirlik sınırı: 100 µg/g durgun faz- Hacimsel yüklenebilirlik sınırı: 50 µl/g durgun faz


HPLC’de elde edilen kromatogramda piklerin özellikleri oldukça önemlidir. Pikler ile ilgili olarak;

Parçalı pikler (Bölünmüş pikler) Piklerin Uçları Piklerin genişliği gibi özellikler önemli olup sistemdeki olası

problemler hakkında da bilgi sahibi olmamıza yardımcı olmaktadır.

** Parçalı pikler genelde kolondaki kirlilikten kaynaklanmaktadır.

HPLC’de PİKLER…

**Pik genişliğinin fazla olması

İşlemde kullanılacak olan mobil fazın pH’sını oldukça etkilidir. pH aynı zamanda örneğin kolondaki alıkonma süresini de etkilemektedir.


** “Hayalet Pikler” : Örnek enjekte edilmediği halde görünen piklerdir

Nedeni: Mobil faz kirliği olmasından kaynaklanıyor


Piklerin çakışması

Bileşiklerin alıkonma zamanı daha kısa alıkonma sürelerine kayması ile oluşuyor. Nedeni:

Diğer nedeni ise;


Numunenin çözündüğü çözücünün gücü >> hareketli faz gücü

Kolon girişindeki ölü hacimdir

Piklerde asimetri**Kolonda aşırı yükleme yapınca

** Ağır metaller, kötü kolon, artık maddelerin etkisi


HPLC günümüzde kimya, biyokimya, biyoteknoloji, farmakoloji, tıp kimyası, bitki kimyası, tarım ve kimya mühendisliğini içeren alanlarda ayırma ve analiz için vazgeçilmez bir araç olarak kabul edilmektedir. Bilhassa diğer kromatografik tekniklere uygun olmayan bileşiklerin ayrılması ve analizi için uygundur. Çevre sıcaklığında termal olarak kararsız bileşikleri ve yüksek polarlıktaki bileşikleri herhangi bir türevlendirme olmaksızın ayırabilir ve analiz edebilir.

HPLC UYGULAMALARI

HPLC UYGULAMALARI

Preparatif HPLC

Saflaştırma

İdentifikasyon

Miktar Tayini Kimyasal Ayırma

HPLC UYGULAMALARI

Günümüzde değişik alanlarda yapılan biyokimyasal çalışmalarda HPLC çok sık kullanılmaktadır. HPLC diğer kromotografik tekniklerden daha güvenilir olduğu için biyokimyasal analizlerde tercih ediliyor. Hastanelerde, Adli Tıp Kurumlarında, Gıda sektöründe ve Sanayinin birçok alt dalında biyokimyasal analizler yapıyor.

HPLC’NİN BİYOKİMYASAL UYGULAMALARDAKİ YERİ VE ÖNEMİ

Hastanelerde daha önce klasik yöntemler kullanılarak yapılan bazı analizler HPLC ile daha hızlı yapılabilmektedir. Bu analizler:

Epinefrin, Norepinefrin, Dopamin, Metanefrin, Normetanefrin, VMA, HVA , 5 HIAA, Homosistein

Klinik Biyokimyasal analizlerde HPLC

Eritrositlerdeki Glutatyon miktarı oldukça önemlidir. Daha önce kırmızı kan hücrelerinde bulunan glutatyon miktarının analizinde güçlükler yaşanıyordu. Günümüzde HPLC ile eritrositlerde toplam ve indirgenmiş glutatyon miktarı kolaylıkla analiz edilebilmektedir.


HPLC, hemoglobin moleküllerinin ayrıştırılması ve miktarlarının belirlenmesinde kullanılan hızlı, güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntemdir. Zayıf iyon değiştirici (anyon veya katyon değiştiriciler) kolonlar Hb'lerin analizinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Ayrıca globin zincirlerinin ayrıştırılması ve miktarlarının belirlenmesinde ise reverse faz kolonlu HPLC kullanılıyor. HPLC talasemi ve anormal hemoglobinlerin saptanmasında doğru ve hassas bir metottur. Hızlı, güvenilir ve tekrarlanabilir olmasından dolayı talasemi taramasında tercih edilir. Prenatal ve postnatal talasemi tedavisinde çok kullanılıyor


HPLC vitamin analizlerinde de kullanılabiliyor. Vitaminler genelde kendileri ile benzer kimyasal özelliklere sahip bileşikler ile kombine halde bulunurlar. Vitamin tabletlerinde suda çözünebilme özelliğine sahip vitaminlerin belirlenmesinde kullanılabilir.


Özellikle suda çözünen vitamin ile ilgili yapılan analizlerde “Smartline RF-HPLC” kullanılıyor. Bunun için genellikle C16 kolonlar tercih ediliyor.

Yağda çözünen vitaminlerin (A,D,E,K) analizinde ise HPLC-ELSD (Evaporative Light Scattering Detector) .

A ve E vitaminlerinin analizlerinde Flouresans dedektörlü HPLC kullanılıyor.

HPLC özellikle diyabet hastalarında HbA1c değerlerinin belirlenmesinde kullanılıyor. Kan şekeri artarsa hemoglobin şekerlenir ve buna HbA1c denir. HPLC ile plazmadaki şeker konsantrasyonu ve HbA1c değerleri çok hızlı bir şekilde belirlenebilmektedir.


HbA1c değerinin belirlenmesinde “Katyon değiştirici HPLC”

(CE-HPLC)’ den yararlanılmaktadır. Burada hemoglobin türleri yüklerine bağlı olarak ayrışmaktadır.

HbA1c beta zincirinin N-terminal(Valin ) amino grubuna glukoz bağlanıyor. HbA1’in diğer türleri (-) yüklü olduğu için HbA1c’ye oranla daha hızlı ayrılıyor.


Lipitlerin ve spesifik steroidlerin analizlerinde ise RP-HPLC-Corona CAD (Charged Aerosol Detector)


MEKANİZMA

HPLC mobil fazı Nitrogen gazı ile sprey hale getiriliyor

Ortam sıcaklığında solvent buharlaşıyor ve analit partikülleri oluşuyor

Yük meydana getirmek için iyonize nitrogen gazı ile karıştırılıyor

İyon Trap reaksiyona girmeyen iyon gazlarını uzaklaştırıyor

Yüklü olan partiküller bir sinyal meydana getiriyor

Oluşan sinyal elektrometre ile okunuyor.

Adli toksikoloji departmanında zehirlenmelere bağlı ölüm olaylarının aydınlatılmasında

DNA ile ilgili çalışmalarda Kan örneklerinde referans olabilecek moleküllerin

belirlenmesinde Vücut sıvılarında bulunan aminoasitlerin konsatrasyonlarının

ölçülmesinde Kandaki hemoglabin varyantlarına bakılarak ortamdaki

lekenin insan veya diğer canlılara ait olup olmadığının ortaya çıkarılmasında HPLC sistemlerinden yararlanılmaktadır

ADLİ BİYOKİMYADA HPLC

Göz Sıvısında ve Serebrospinal Sıvıda Ölüm Sebebi ve Zamanına İlişkin Serbest Aminoasit Konsantrasyonu belirlenmesinde HLPC kullanılıyor.


Serbest aminoasitler HPLC ile direkt olarak analiz edilemiyor. Reverse Faz C18 silika kolon ile ayrıştırılıyor

PTC kromofor ‘da 245 nm’de belirleme (İşlem 25-30 dk sürmektedir


http://www.biotech.iastate.edu/facilities/protein/aaa.html#Anchor21651

1. PROTEOMİK ÇALIŞMALARDA HPLC Proteinlerin saflaştırılması ve protein çözeltisinin tuzunun

giderilmesi

Protein identifikasyonunun ilk aşamasında

DENEYSEL BİYOKİMYA ÇALIŞMALARINDA HPLC

Protein ve polipeptidlerin primer yapılarının aydınlatılmasıda

1. EDMAN degradasyonu

2. Bu yöntem otomasyona bağlı olup elde edilen PTH-AAs’ler HPLC ile ayrıştırılıp belirlenmektedir.

PROTEİNLERİN YAPISINDA BULUNAN AMİNOASİTLERİN TARAMASINDA HPLC

Monolitik , nano ve switching mode kolonlar ile daha hızlı ve etkili ayırım

MALDİ ve elektrosprey ile kombine halde bulunan dedektörlerin geliştilmesiyle ile girişim yapan pikler azaltılarak daha net verilerin elde edilmesi.

Proteomik –HPLC özellikler

Boncuklardan çok porlu kanallara sahip, HPLC’nin içinde kullanılan özel tipte kolonlardır.

Makropor yapılı(2µm) veya mesoporlu yapıda(15nm) Avantajı: düşük “multiple-path” ve üretiminin kolay olması Dezavantajı: dikkatle gerçekleştirilmesi gereken bir organik

senteze ihtiyaç duymasıdır. Monolitler **Organik polimer esaslı monolitik kolonlar Sol-gel teknolojisi ile hazırlanma Bazik çözücülerle kullanılmaz**İnorganik silika esaslı kolonlar Akrilamit, metakrilat ve stiren esaslı polimerler içermektedir Geniş pH aralığında çalışma

Monolithic Kolon-HPLC

Nano-HPLC Multidimentional HPLC sistemleri

Yüksek hassasiyet Yüksek ayırım kapasitesi ve pik kapasitesi Minimal örnek kaybı Daha az örnek ihtiyacı

Proteomik Çalışmalarında En Çok Kullanılan HPLC Sistemleri….

Nano HPLC

PTMs ( Post Translasyonel Modifikasyonlar) belirlenmesinde HPLC sisteminden yaralanabilmek için Hosoyo ve arkadaşları değişik kolonlar ve yöntemler geliştirmiştir.

Mobil faz olarak “SU” kullanmışlar. Sistemde organik solvent kullanımının minimalizasyonu Fosfopeptidlerin analizinde sorun metal yüzeylere

afinite HPLc sisteminin metal yüzeyinde kompleks oluşumu . Bu problemin çözümü

Polieter eter kolon(PEEK) ya da Titanyum injektör, filtre ve kolonların kullanılması.

PROTEOMİK-PTMs-HPLC

2. METABOLOMİK ÇALIŞMALARDA HPLC Metabolik yol izlerinin (Pathway) aydınlatılması ile ilgili yapılan

çalışmalarda kullanılıyor. Pathway’lerin belli basamaklarında oluşan maddelerin

aydınlatılması


Metabolomik çalışmalada HPLC tek başına kullanılmamaktadır. Diğer yöntemler birlikte kullanılarak çalışmalar yapılmakta.

HPLC-PDA-MS-SPE-NMR içeren kombine sistemler RP-HPLC kullanımı daha yaygın Çalışmalarda HPLC kolonlar analizi yapılacak çok küçük

moleküller ile istenmeyen kompleks moleküller oluşturmayacak şekilde modifiye ediliyor

En yaygın kullanılan kolon: “Xterra C18 RP column” En yaygın kullanılan dedektör: “Coulometric Array

Detector”

METABOLOMİK ÇALIŞMALARDA HPLC

Şekil: Penicillium chrysogenum’un bir straininden izole edilen sorbicillin türevli alkolloidlerin yeni bir üyesi olan Sorbicillacton-A ‘nın biyosentetik orijin ve identifikasyonu ile ilgli bir çalışmada HPLC kullanımı.

Plasmodium ‘da glutatyon metabolik yol izinin aydınlatılması

METABOLOMİK ÇALIŞMALARDA HPLC

3. TRANGENOMİK ÇALIŞMALADA HPLC

DNA ve RNA miktralarının belirlenmesinde kullanılıyor Nükleik asitlerin yapısında bulunan A,G,C,T,U gibi nükleotidler

belirlenmesi Yaklaşık olarak 50 nt uzunluğundaki oligonükleotitlerin belirlenmesinde Anyon-Exchange HPLC Reversed-Phase HPLC tercih edilmektedir

Nükleotidleri içeren mutasyonların araştrılmasında ise daha çok “DHPLC” DHPLC, tanımlanmamış mutasyonların genetik tanısında, DNA

Separation Teknolojisi ile birlikte kullanılan Transgenomik WAWE DNA Fragment Analiz Sistemidir.


1.AŞAMA *Amplifikasyon

* Denatürasyon

* Reanealing

2.AŞAMA

*TEAA( Trietilamonyum asetat)(+)

*ACN (Asetonitrat)

3.AŞAMA

*UV detektör

* Birden çok pik oluşumu

*Mutasyon

TRANSGENOMİK-DHPLC

RNA konsantrasyonunun belirlenmesinde HPLC

Armored RNA fosfodiesteraz ve alkalin kullanıralar kesiliyor

HPLC ile nükleositlerin oluşturduğu pikler ölçülüyor.

Armored RNA sekanslarına dayanılarak preparat içindeki RNA konsantrasyonu hesaplanıyor.

TRANSGENOMİK-HPLC

Armored RNA Quant

In vitro Armored RNA QuantificationHPLC Assay

Determination of RNA concentration by HPLC

Birçok biyokimyasal analizde HPLC kullanılabilir. HPLC’nin kullanımını yaygınlaştırabilmek ve daha iyi sonuçlar alabilmek için:

HPLC sisteminde modifikasyonların yapılması(Kolon, Detektör, Pompa…)

Yapılan değişikliklerin optimize edilmesi

Bütün yapılanların belli standardizasyonu

SONUÇ

HPLC biyokimyasal analizler için tek başına yeterli bir sistem midir?

hplc sunum

Documents