UJI KUANTITATIF DNA

Oleh : Nur Fatimah, S.TP PBT Ahli Pertama

A. PENDAHULUAN

Asam deoksiribonukleat atau lebih dikenal dengan DNA

(deoxyribonucleid acid) adalah sejenis asam nukleat yang tergolong

biomolekul utama penyusun berat kering setiap organisme. Di dalam sel,

DNA umumnya terletak di dalam inti sel. Tetapi ada pula DNA yang

terdapat di mitokondria, oleh karena itu disebut DNA mitokondria. Secara

garis besar, peran DNA di dalam sebuah sel adalah sebagai materi

genetik. Artinya, DNA menyimpan cetak biru bagi segala aktifitas sel. Dan

ini berlaku umum bagi setiap organisme (Anonim, 2011).

Keberadaan DNA dalam suatu organisme dapat diketahui

dengan 2 cara yaitu secara kualitatif dengan metode Elektroforesis Gel

Agarose dan secara kuantitatif dengan metode spektrofotometri. Uji

kuantitatif DNA adalah analisis untuk menentukan kandungan/jumlah

DNA yang terdapat dalam suatu zat atau komponen zat yang

sebelumnya telah diketahui keberadaan DNA plasmidnya dalam larutan

contoh dengan cara uji kualitatif (Larasati, 2011).

Pengujian kuantitatif DNA dapat dilakukan dengan menggunakan

metode spektrofotometri. Terdapat beberapa cara yaitu spektrofotometri

Vis (visible), spektrofotometri UV (ultra violet), Spektrofotometri UV-Vis

(ultra violet visible) dan Spektrofotometri Infra Red (Riyadi, 2009).

Dalam tulisan ini, hanya akan dijelaskan mengenai spektrofotometri Vis

dan UV Vis.

B. TUJUAN

Uji kuantitatif DNA dengan metode spektrofometri ini bertujuan

untuk mengetahui keberadaan dan jumlah DNA di dalam suatu larutan

contoh uji dan untuk memahami penggunaan dan perbedaan

spektrofotometer Vis dan UV-Vis.

C. UJI KUANTITATIF DNA

Uji kuantitatif DNA diawali dengan isolasi DNA. Hal ini bertujuan

untuk mengeluarkan DNA yang berada dalam inti sel dari organisme.

Kemudian dilakukan dengan uji kualitatif DNA dengan metode

elektroforesis gel agarosa. Uji ini bertujuan untuk mengetahui keberadaan

DNA dalam larutan contoh. Setelah itu dilanjutkan dengan uji kuantitatif

DNA dengan metode spekrofotometri.

Spektrofotometri merupakan suatu metode analisis untuk

mengukur konsentrasi suatu senyawa berdasarkan kemampuan senyawa

tersebut mengabsorbsi berkas sinar atau cahaya. Alat ini terdiri dari

spektrofotometer dan fotometer. Spektrofotometer menghasilkan sinar

dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu, sementara fotometer

adalah pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi

(Riyadi, 2009).

Uji kuantitatif DNA dapat dilakukan dengan beberapa cara antara

lain :

1. Spektrofotometri Vis (Visible)

Pada spektrofotometri ini yang digunakan sebagai sumber

sinar/energi adalah cahaya tampak (visible). Cahaya visible termasuk

spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia.

Panjang gelombang cahaya tampak adalah 380 sampai 750 nm.

Sehingga semua cahaya yang dapat dilihat oleh kita, entah itu putih,

merah, biru, hijau, atau warna apapun selama ia dapat dilihat oleh mata,

maka cahaya tersebut termasuk ke dalam cahaya tampak (visible).

Sumber cahaya tampak yang umumnya dipakai pada spektro

visible adalah lampu Tungsten. Tungsten yang dikenal juga dengan nama

Wolfram merupakan unsur kimia dengan simbol W dan no atom 74.

Tungsten mempunyai titik didih yang tertinggi (3422 C) dibanding logam

lainnya. karena sifat inilah maka ia digunakan sebagai sumber lampu.

Alat ini bekerja berdasarkan hukum Lambert-beer.

Jumlah radiasi yang diserap proporsional dengan ketebalan sel (b), konsentrasi

analit (c), dan koefisien absorptivitas molekuler (a) dari suatu spesi (senyawa)

pada suatu panjang gelombang

Logika prinsip dari alat spektro-vis adalah intensitas warna dari

suatu larutan sebanding dengan jumlah cahaya yang diserap. Semakin

pekat warna, semakin banyak cahaya yang diserap.

Sample yang dapat dianalisa dengan metode ini hanya sample

yang memiliki warna. Hal ini menjadi kelemahan tersendiri dari metode

spektrofotometri visible.

Oleh karena itu, untuk sample yang tidak memiliki warna harus

terlebih dulu dibuat berwarna dengan menggunakan reagent spesifik

yang akan menghasilkan senyawa berwarna. Reagent yang digunakan

harus betul-betul spesifik hanya bereaksi dengan analat yang akan

dianalisa. Selain itu juga produk senyawa berwarna yang dihasilkan

harus benar-benar stabil (Riyadi, 2009).

Berikut adalah sifat-sifat yang harus dimiliki oleh reagen

pembentuk warna (chromogenik reagent):

1. Kestabilan dalam larutan. Pereaksi-pereaksi yang berubah sifatnya

dalam waktu beberapa jam, dapat menyebabkan timbulnya semacam

cendawan bila disimpan. Oleh sebab itu harus dibuat baru dan kurva

kalibarasi yang baru harus dibuat saat setiap kali analisis.

2. Pembentukan warna yang dianalisis harus cepat.

3. Reaksi dengan komponen yang dianalisa harus berlangsung secara

stoikiometrik.

4. Pereaksi tidak boleh menyerap cahaya dalam spektrum dimana

dilakukan pengukuran.

5. Pereaksi harus selektif dan spesifik (khas) untuk komponen yang

dianalisa, sehingga warna yang terjadi benar-benar merupakan ukuran

bagi komponen tersebut saja.

6. Tidak boleh ada gangguan-gangguan dari komponen-komponen lain

dalam larutan yang dapat mengubah zat pereaksi atau komponen

komponen yang dianalisa menjadi suatu bentuk atau kompleks yang

tidak berwarna, sehingga pembentukan warna yang dikehendaki tidak

sempurna.

7. Pereaksi yang dipakai harus dapat menimbulkan hasil reaksi berwarna

yang dikehendaki dengan komponen yang dianalisa, dalam pelarut

yang dipakai.

Setelah ditambahkan reagen atau zat pembentuk warna maka

larutan tersebut harus memiliki lima sifat di bawah ini :

1. Kestabilan warna yang cukup lama guna memungkinkan pengukuran

absorbansi dengan teliti. Ketidakstabilan, yang mengakibatkan

menyusutnya warna larutan (fading), disebabkan oleh oksidasi oleh

udara, penguraian secara fotokimia, pengaruh keasaman, suhu dan

jenis pelarut. Namun kadang-kadang dengan mengubah kondisi

larutan dapat diperoleh kestabilan yang lebih baik.

2. Warna larutan yang akan diukur harus mempunyai intensitas yang

cukup tinggi (warna harus cukup tua) yang berarti bahwa absortivitas

molarnya () besar. Hal ini dapat dikontrol dengan mengubah

pelarutnya. Dalam hal ini dengan memilih pereaksi yang memiliki

kepekaan yang cukup tinggi.

3. Warna larutan yang diukur sebaiknya bebas daripada pengaruh

variasi-variasi kecil kecil dalam nilai pH, suhu maupun kondisis-kondisi

yang lain.

4. Hasil reaksi yang berwarna ini harus larut dalam pelarut yang dipakai.

5. Sistem yang berwarna ini harus memenuhi Hukum Lambert-Beer.

(Wanibesak, E. 2011)

Gb 1. Spektrofotometer Visible tipe spectronic-20 lama yang sudah

jarang bahkan mungkin tidak diproduksi lagi

Gb 2. Spektrofotometer Visible tipe Spectronic-20 terbaru

Untuk mengukur konsentrasi DNA digunakan rumus sebagai berikut :

[DNA] = 260 x 50 x Faktor pengenceran

Keterangan :

260 = nilai absorbansi pada 260 nm

50 = larutan dengan nilai absorbansi 1,0 sebanding dengan 50 ug

untai ganda DNA per ml (dsDNA)

[RNA] = 260 x 40 x Faktor pengenceran

Keterangan :

40 = 40 ug/ml untai tunggal RNA (ssRNA)

(Fatchiyah, 2011).

2. Spektrofotometri UV- Vis (Ultraviolet Visible)

Spektrofotometri ini merupakan gabungan antara spektrofotometri

UV dan Visible. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm.

Karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata kita, maka senyawa

yang dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak

memiliki warna. Bening dan transparan.

Oleh karena itu, sample tidak berwarna tidak perlu dibuat

berwarna dengan penambahan reagent tertentu. Bahkan sample dapat

langsung dianalisa meskipun tanpa preparasi. Namun perlu diingat,

sampel keruh tetap harus dibuat jernih dengan filtrasi atau centrifugasi.

Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah sampel harus jernih dan larut

sempurna. Tidak ada partikel koloid apalagi suspensi.

Alat ini menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber

cahaya UV dan sumber cahaya visible. Meskipun untuk alat yang lebih

canggih sudah menggunakan hanya satu sumber sinar sebagai sumber

UV dan Vis, yaitu photodiode yang dilengkapi dengan monokromator.

Untuk sistem spektrofotometri, UV-Vis paling banyak tersedia dan

paling populer digunakan. Kemudahan metode ini adalah dapat

digunakan baik untuk sample berwarna juga untuk sample tak berwarna

(Riyadi, 2011)

DNA yang mengandung basa-basa purin dan pirimidin dapat

menyerap cahaya UV. Pita ganda DNA dapat menyerap cahaya UV pada

260 nm, sedang kontaminan protein atau phenol dapat menyerap

cahaya pada 280 nm. Dengan adanya perbedaan penyerapan cahaya

UV ini, sehingga kemurnian DNA dapat diukur dengan menghitung nilai

absorbansi 260 nm dibagi dengan nilai absorbansi 280 (260/280),

dan nilai kemurnian DNA berkisar antara 1.8-2.0 (Fatchiyah, 2011). Jika

nilai melebihi 2,0 maka larutan yang diuji masih mengandung kontaminan

dari protein membran / senyawa lainnya sehingga kadar DNA plasmid

yang didapat belum murni. Jika kurang dari 1,8 maka ddH2O yang diambil

terlalu banyak sedangkan DNA yang diambil terlalu sedikit (Larasati,

2011).

Alat yang digunakan dalam uji ini dengan metode spektrofotometri

UV-Vis antara lain : mikropipet, kuvet, nanodrop spektrofotometer dan

seperangkat komputer. Bahan yang digunakan adalah isolat DNA dan

aquadest sebagai blanko. Cara kerja pengujian kuantitatif DNA diawali

dengan menghidukan alat nanodrop spektrofotometer. Kemudian

melakukan uji blanko menggunakan aquadest. Setelah itu dilanjutkan

dengan menguji isolat DNA dengan cara meneteskannya pada tempat

sampel sebanyak 1 mikroliter. Kemudian mengukur kemurnian DNA dan

baca hasil kemurnian DNA-nya.

Gb. Nanodrop Spektrofotometer

D. MANFAAT UJI KUANTITATIF DNA Pengujian DNA secara kuantitatif ini diharapkan dapat

memberikan manfaat dalam penemuan materi genetik organisme, dimana

selanjutnya tulisan ini dapat dijadikan acuan dalam pengujian DNA terutama

komoditi tanaman perkebunan.

Sumber :

Anonim, 2011. Asam Deoksiribonukleat. http://id.wikipedia.org/wiki/Asam_ deoksiribonukleat. Diakses tanggal 24 September 2011.

Fatchiyah, 2011. Modul Pelatihan Analisis Fingerprinting DNA Tanaman Dengan Metode RAPD. Laboratorium Sentral Ilmu Hayati Universitas Brawijaya, Malang.

Larasati, P. 2011. Quantifikasi DNA dan Analisis Kualitas.

http://puspalarasati.wordpress.com. Diakses tanggal 22 September 2011.

Riyadi, W. 2009. Macam Spektrofotometri dan Perbedaannya (Vis, UV dan

IR). http://wahyuriyadi.blogspot.com. Diakses tanggal 23 September 2011.

Riyadi, W. 2009. Prinsip Dasar Spektrofotometer Visible. http://wahyuriyadi.blogspot.com. Diakses tanggal 23 September 2011.

Wanibesak, E. 2011. Spektrofotometri Sinar tampak (Visible).

http://wanibesak.wordpress.com. Diakses tanggal 22 September 2011.