LA RICERCA DELLE SOSTANZE INIBENTI NEL LATTE OVINO

GLI ANTIBIOTICI SONO COMPOSTI CAPACI DI UCCIDERE O INIBIRE LA CRESCITA DI

AGENTI PATOGENI

SONO PRODOTTI DA BATTERI E FUNGHI PER LIMITARE O IMPEDIRE LA CRESCITA DI ALTRI MICRORGANISMI

LA CLASSIFICAZIONE SI BASA PRINCIPALMENTE SUL

MECCANISMO D’AZIONE CONTRO L’AGENTE PATOGENO

• ALCUNI ANTIBIOTICI ATTACCANO LA PARETE CELLULARE BATTERICA,

• ALTRI ROMPONO LA MEMBRANA CELLULARE • LA MAGGIOR PARTE DI ESSI INIBISCE LA

SINTESI DEGLI ACIDI NUCLEICI E DELLE PROTEINE, MOLECOLE ESSENZIALI PER LA VITA DEGLI ORGANISMI.

GLI ANTIBIOTICI POSSONO ESSERE ANCHE CLASSIFICATI IN BASE ALLA

STRUTTURA CHIMICA

SI POSSONO ALLORA DISTINGUERE:• RIFAMICINE• CLORAMFENICOLO• AMMINOGLICOSIDI• TETRACICLINE• MACROLIDI• BETA-LATTAMICI• SULFAMIDICI

TETRACICLINE

ANTIBIOTICI BATTERIOSTATICI CHE INIBISCONO LA SINTESI PROTEICA DELLE CELLULE BATTERICHE

BETA LATTAMICI

AZIONE BATTERICIDA, DOVUTA ALLA CAPACITA’ DI INIBIRE LA FORMAZIONE DELLA PARETE CELLULARE BATTERICA

L’IMPIEGO DI FARMACI AD ATTIVITA’ ANTIMICROBICA SU LARGA SCALA HA

DETERMINATO E DETERMINA LA PRESENZA DI RESIDUI DI FARMACI NEGLI

ALIMENTI.

DIVERSE SONO LE CAUSE DELLA PRESENZA DEI RESIDUI NEGLI ALIMENTI E TRA LE PIU’

FREQUENTI SI POSSONO CITARE:

• MANCATO RISPETTO DEI TEMPI DI SOSPENSIONE PREVISTI PER IL FARMACO

• MANCATA O ERRONEA INDIVIDUAZIONE DEGLI ANIMALI TRATTATI

• USI IMPROPRI DEL FARMACO ( ES.DOSAGGI TROPPO ELEVATI )

GLI ANTIBIOTICI RAPPRESENTANO

• RISCHIO PER LA SALUTE PUBBLICA

• PROBLEMA TECNOLOGICO: INIBISCONO LE COLTURE DI STARTER IMPIEGATI NELLA PRODUZIONE DI LATTI FERMENTATI

• PRESSIONE SELETTIVA IN GRADO DI SELEZIONARE CEPPI DI BATTERI ANTIBIOTICO - RESISTENTI NON PATOGENI PER GLI ANIMALI, MA POTENZIALI AGENTI TOSSINFETTIVI PER L’UOMO. ( DEPAUPERAMENTO DELLA FLORA MICROBICA INTESTINALE CHE FAVORISCE L’EVENTUALE ADESIONE DI BATTERI PATOGENI )

LA CONSAPEVOLEZZA DEI POTENZIALI RISCHI PER LA SALUTE DEL CONSUMATORE HA INDOTTO I GOVERNI DEI VARI PAESI A

INTRODURRE NELLE PROPRIE LEGISLAZIONI CONCENTRAZIONI MASSIME DI RESIDUI

( Reg. 2377/90/CE )

( LMR= LIMITI MASSIMI DI RESIDUI )

TOLLERATE NEGLI ALIMENTI

IL TERMINE LMR SI PUO’ DEFINIRE COME LA

MASSIMA CONCENTRAZIONE DEL RESIDUO

INDICE DERIVANTE DALL’USO DI MEDICINALI VETERINARI, ESPRESSO IN

ppm (mg/Kg) O ppb (μg/kg)

LEGALMENTE TOLLERATO.

IN PARTICOLARE LE TOLLERANZE AMMESSE PER LE SOSTANZE PIÙ LARGAMENTE

IMPIEGATE IN MEDICINA VETERINARIA PER IL TRATTAMENTO DEGLI OVINI SONO :

TETRACICLINE 100 ppb (μg/kg)PENICILLINA G 4 ppb (μg/kg)

OCCORRE SAPERE CHE I LIMITI MASSIMI RESIDUI SONO STABILITI E FISSATI PER

ALIMENTI NON TRATTATI.

SAREBBE PERCIO’ IMPORTANTE AVERE INFORMAZIONI SULL’INFLUENZA DI ALCUNI

TRATTAMENTI( ES. CALORE ) CHE SUBISCE L’ALIMENTO

PRIMA DI ESSERE CONSUMATO E CHE POSSONO DETERMINARE UN CAMBIAMENTO

NELLA STRUTTURA DELLE MOLECOLE AD ATTIVITA’ FARMACOLOGICA

QUESTI TRATTAMENTI POSSONO RIDURRE, LASCIARE INVARIATA O PEGGIORARE LA

PERICOLOSITA’ DELLE MOLECOLE ( ATTIVITA’ ALLERGENICA, TERATOGENA,

MUTAGENA ).

IN GENERALE SI PUÒ AFFERMARE CHE L’ATTIVITÀ ANTIMICROBICA TENDE AD

DIMINUIRE DURANTE I PROCESSI DI PREPARAZIONE DEGLI ALIMENTI ANCHE SE

ANCORA NON SI È IN GRADO DI ESCLUDERE LA POSSIBILE FORMAZIONE DI

METABOLICI TOSSICI IN SEGUITO AI DIVERSI PROCESSI.

AL GIORNO D’OGGI SI CONOSCONO E VENGONO NORMALMENTE IMPIEGATE

DIVERSE METODICHE PER LA RICERCA DEI RESIDUI DI FARMACI AD AZIONE ANTIMICROBICA NEGLI ALIMENTI:

METODI BASATI SU:

•INIBIZIONE DELLA CRESCITA MICROBICA •TEST DEL RECETTORE MICROBICO •TEST ENZIMATICO-COLORIMETRICI•METODICHE CROMATOGRAFICHE

•TEST IMMUNOCHIMICI

ALCUNI TEST DANNO RISPOSTE DI TIPO QUALITATIVO, ALTRE QUANTITATIVO,

ALTRE SEMIQUANTITATIVO.

TEST QUALITATIVI: RICHIEDONO CHE SIA STABILITO UN VALORE

SOGLIA PER CLASSIFICARE I CAMPIONI IN POSITIVI E NEGATIVI

( QUESTO VALORE DOVRÀ ESSERE DEFINITOTENENDO CONTO DEI LMR ).

TEST QUANTITATIVI: È NECESSARIO TESTARE UN CAMPIONE E PARAGONARLO A VALORI DI RIFERIMENTO

CERTIFICATI CON CUI COSTRUIRE UNA CURVA DI CALIBRAZIONE.

TEST SEMIQUANTITATIVI:SONO SIMILI A QUELLI QUANTITATIVI MA LE

RISPOSTE NON SONO ESPRESSE COME PRECISI VALORI DI CONCENTRAZIONE MA COME RANGE DI CONCENTRAZIONE ( AD ES.

CAMPIONI NEGATIVI, DEBOLMENTE POSITIVI, POSITIVI , MOLTO POSITIVI )

LA DIVERSITA’ DELLE METODICHE PUO’ ESSERE SFRUTTATA IMPIEGANDO I

DIVERSI TEST IN RAPPORTO ALLE DIVERSE ESIGENZE

UNA METODICA CHE PERMETTE DI SAGGIARE UN GRANDE NUMERO DI CAMPIONI, DANDO UN BASSO

NUMERO DI FALSI NEGATIVI E UN ACCETTABILE NUMERO DI FALSI POSITIVI POTREBBE ESSERE

IL TEST DI INIBIZIONE DELLA CRESCITA MICROBICA.

UNA METODICA IN GRADO DI SVELARE IL TIPO DI RESIDUO POTREBBE ESSERE IL

TEST IMMUNOENZIMATICO O RECETTORIALE

PER LA CONFERMA DELLA POSITIVITA’ E LA QUANTIFICAZIONE DEL RESIDUO

OCCORREREBBE UTILIZZARE METODI QUANTITATIVI

TECNICHE CROMATOGRAFICHE ASSOCIATE ALLA SPETTROMETRIA DI

MASSA PER UNA CONFERMA DI CERTEZZA

(EU 93/256 “Methods based only on chromatographic analysis without the

use of molecular spectometric detection are not suitable for use as

confirmatory methods”)

CONCENTREREMO LA NOSTRA ATTENZIONE SU QUELLI PIU’ FREQUENTEMENTE

UTILIZZATI IN AMBITO VETERINARIO E IN PARTICOLAR MODO NEGLI OVINI

ALLO SCOPO DI COMPARARE LA PERFORMANCE DI DUE DIVERSI TEST PRESENTI SUL MERCATO

E DI DETERMINARE LA SENSIBILITÀ DEI DUE TEST

( TEST 1 E TEST 2 ) AI PRINCIPALI PRINCIPI ATTIVI

( PENICILLINA E TETRACICLINA ), IL LABORATORIO ANALISI LATTE

DELL’ASSOCIAZIONE REGIONALE ALLEVATORI DELLA SARDEGNA HA CONDOTTO NEL 2003

UNO STUDIO DI VALIDAZIONE IN LATTE DI PECORA .

LO STUDIO ERA RIFERITO A 1165 CAMPIONI DI LATTE OVINO DELLA RACCOLTA DI ROUTINE

NEL PERIODO LUGLIO- AGOSTO 2003.

LA TOTALITÀ DEI CAMPIONI È STATA ANALIZZATA CON DUE DIVERSI TEST

ENTRAMBI BASATI SULL’INIBIZIONE DELLA CRESCITA MICROBICA, ED È STATA ESEGUITA

SIA UNA LETTURA VISIVA CHE UNA SPETTROFOTOMETRICA

SONO STATI PRESI IN CONSIDERAZIONE SIA I RISULTATI POSITIVI E NEGATIVI

CHE QUELLI DUBBI O INTERMEDI

COMPARAZIONE DELLE PERFORMANCE IN ROUTINE:

SI È REGISTRATO UN 100% DI COINCIDENZA TRA I DUE TEST SUI CAMPIONI POSITIVI,

CI SONO STATI 5 CASI CON RISULTATI DISCORDANTI (+- vs. -) lo 0,4%

ALLO SCOPO DI DETERMINARE LA SENSIBILITÀ AI DIVERSI ANTIBIOTICI SONO STATI ADULTERATI

DEI CAMPIONI DI LATTE CON 7 CONCENTRAZIONI DI PRINCIPI ATTIVI E

SONO STATI ANALIZZATI IN DOPPIO CON I DUE TEST

I CAMPIONI DI LATTE PROVENIVANO DA PECORE DI RAZZA SARDA DELL'AZIENDA SPERIMENTALE

DELL'IZCS DI BONASSAICOMPLESSIVAMENTE 20 CAMPIONI 10 DELLA

MUNGITURA DELLA MATTINA E 10 DELLA SERA

AGENTE ANTIMICROBICO

• PENICILLINA G

• DIIDROSSISTREPTOMICINA

• SULFADIAZINA

• TETRACICLINA

CONCENTRAZIONE (ppb)

0,1,2,3,4,5,6,7

1000,2000,2500,3000,3500,4000,4500

0,20,40,60,80,100,120,140

0, 200, 250, 350, 450, 550, 650, 800

CONCENTRAZIONE DI ANTIBIOTICO NEI CAMPIONI CONTAMINATI

IL TEST 1 È RISULTATO PIÙ SENSIBILE DEL TEST 2 NELLA RILEVAZIONE DELLA

TETRACICLINA SIA SUI CAMPIONI POSITIVI CHE SU QUELLI “ NON NEGATIVI”.

725> 800483650TETRACICLINA

2,502,972,482,97PENICILLINA

TEST 2NON

NEGATIVI

TEST 2POSITIVI

TEST 1NON

NEGATIVI

TEST 1POSITIVI

SENSIBILITÀ

IN PPB SU LATTE OVINO

DETECTION LIMITS OF ANTIMICROBIALS IN EWE MILK BY DELVOTEST

PHOTOMETRIC MEASUREMENTS( J. DAIRY SC. 2003 )

SENSIBILITÀIN PPB SU LATTE OVINO

AGENTE ANTIMICROBICO

DETECTION LIMIT

LMR

PENICILLINA G 1 4,00

TETRACICLINA 590 100

DAGLI STUDI DI SENSIBILITÀ È EMERSO UN DATO IMPORTANTE PER ALTRO GIÀ NOTO DA STUDI EFFETTUATI PRECEDENTEMENTE

SUL LATTE BOVINO

(M.BENEDETTI, G.VARISCO, G.BOLZONI: VALUTAZIONE DEI LIMITI DI SENSIBILITÀ METODO MICROBIOLOGICO PER LA

DETERMINAZIONE DELLE SOSTANZE INIBENTI NEL LATTE )

OGGI CON L’INTRODUZIONE DI SISTEMI AUTOMATICI DI INCUBAZIONE E LETTURA E’ POSSIBILE MIGLIORARE LA SENSIBILITA’ DEL

METODO SENZA MODIFICHE DEL KIT DI PARTENZA. (DI PROSSIMA PUBBLICAZIONE LAVORO SU LATTE DI PECORA

E CAPRA –AGRIS SARDEGNA)

MENTRE LA SENSIBILITÀ ALLA PENICILLINA DEI TEST DI SCREENING E DEI TEST BASATI SU

SAGGIO ENZIMATICO RECETTORE SPECIFICO ( ES. SNAP ) È AL DI SOTTO DEI LMR, LA

SENSIBILITÀ DEI TEST DI SCREENING BASATI SULL’INIBIZIONE DELLA CRESCITA MICROBICA ( ES DELVOTEST ) SI RIVELA INADEGUATA ALLA

RILEVAZIONE DELLE TETRACICLINE.( LMR 100 PPB TEST DI SCREENING LETTURA

> 650 PPB, BEN AL DI SOPRA DEI LIMITI MASSIMI CONSENTITI. )

QUESTO SOPRATTUTTO IN CONSIDERAZIONE DEL FATTO ESTREMAMENTE IMPORTANTE CHE NELLA REALTÀ DELLA SARDEGNA PER IL LATTE

OVINO L’ANTIBIOTICO PIÙ LARGAMENTE UTILIZZATO

(ANZI QUASI ESCLUSIVAMENTE ) È L’OSSITETRACICLINA

( DATI ESTRATTI DA INDAGINI SVOLTE DAI VETERINARI ARAS PRESENTI SU TUTTO IL TERRITORIO REGIONALE)

SNAP TEST

SAGGIO ENZIMATICO RECETTORE SPECIFICO CHE DETERMINA LA PRESENZA DI RESIDUI DI

PENICILLINA G O TETRACICLINA A CONCENTRAZIONI UGUALI O INFERIORI AI

VALORI DI TOLLERANZA E /O DI SICUREZZA IN LATTE DI MASSA NON TRATTATO

SENSIBILITA’ PENICILLINA G: 4 ppbSENSIBILITA’ OSSITETRACICLINA 50 ppb

DALL’ANALISI DEI DATI RELATIVI AL LAVORO DI CONFERMA CON LO SNAP TEST, DEI RISULTATI POSITIVI O DUBBI AL DELVOTEST EFFETTUATO DAL LABORATORIO ARAS NEL PERIODO 2008-

2009 SUL LATTE OVINO EMERGONO I SEGUENTI DATI :

Latte Ovino

AnnataNumero campioni

N° campioni

++

%++

Numero campioni

+-

% +-

2008/2009 45635 210 0,46 139 0,30

2007/2008 46535 144 0,30 94 0,20

2006/2007 47987 120 0,25 38 0,07

2005/2006 41333 90 0,21 44 0,10

2004/2005 40239 129 0,32 70 0,17

N° CAMPIONI OVINI ANALIZZATI CON IL DELVOTEST

100.289

N° CAMPIONI POSITIVI400 ( 0,40% )

N° CAMPIONI DUBBI 248 ( 0,25% )

N° CAMPIONI OVINI POSITIVI AL DELVOTEST E

ANALIZZATI CON LO SNAP TEST: 400

N° CAMPIONI POSITIVI AI BETA LATTAMICI :

211 ( 52,75 % )

N° CAMPIONI POSITIVI ALLE TETRACICLINE: 32 ( 8 % )

N° CAMPIONI OVINI INTERMEDI AL DELVOTEST E

ANALIZZATI CON LO SNAP TEST: 248

N° CAMPIONI POSITIVI AI BETA

LATTAMICI :50 ( 20,16% )

N° CAMPIONI POSITIVI ALLE TETRACICLINE:

25 ( 11% )

TRA I CAMPIONI POSITIVI AL DELVOTEST SI SONO VERIFICATI 4 CASI NEI QUALI SONO RISULTATI POSITIVI SIA AI BETA LATTAMICI

CHE ALLE TETRACICLINE CON LO SNAP TEST

DALL’ANALISI DEI DATI EMERGONO I SEGUENTI DUBBI :

QUALI SONO LE RAGIONI CHE GIUSTIFICANO UNA COSÌ BASSA PERCENTUALE DI CAMPIONI POSITIVI ALLE TETRACICLINE DAL MOMENTO CHE L’OSSITETRACICLINA È L’ANTIBIOTICO PIÙ UTILIZZATO?

E’ UN PROBLEMA DI SENSIBILITÀ DEL METODO DI SCREENING O PIUTTOSTO DIPENDE DALLE MODALITÀ DI UTILIZZO DEL FARMACO ( SI FA PRESENTE CHE NEL CASO DEL LATTE OVINO LA SOMMINISTRAZIONE È QUASI ESCLUSIVAMENTE PARENTERALE ) E DELLA SUA FARMACOCINETICA?

SE PROVASSIMO A ESEGUIRE IL TEST SNAP SULLA TOTALITÀ DEI CAMPIONI

( ANCHE SU QUELLI NEGATIVI ) CI DOVREMMO ATTENDERE UN INCREMENTO DELLA PERCENTUALE DI POSITIVITÀ ALLE TETRACICLINE ?

E LE SEGUENTI NECESSITA’:

SAREBBERO NECESSARI STUDI SU CARRYOVER E UTILIZZO DELLE TETRACICLINE NEI PICCOLI RUMINANTI IN MODO DA DEFINIRE LA REALE CONSISTENZA DEL PROBLEMA

LA DISPONIBILITA’ DI UN BUON METODO DI CONFERMA POTREBBE AIUTARE A RISOLVERE MOLTI DUBBI.