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MICROBIOLOGIA ANALITICA
Screening Microbiologico per la ricerca di residui
di chemioterapici e antibiotici negli alimenti
Dr.ssa Monica Ceccon
SC S1 Analisi del rischio e sorveglianza in sanità pubblica
Laboratorio Controlli Ufficiali
IZS-VE Legnaro Padova
6° Congresso Nazionale F.I.Te.La.B. Verona 2 Ottobre 2015
Residui negli alimenti: un problema
di Sicurezza Alimentare
I residui di antimicrobici (chemioterapici e antibiotici) presenti negli alimenti
sono derivati dai trattamenti zootecnici per scopo terapeutico o auxinico
(favoriscono la crescita degli animali).
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Secondo le leggi vigenti viene definito residuo:
“… residuo di sostanza ad azione farmacologica, di loro prodotti di
trasformazione, nonché di altre sostanze che si trasmettono ai prodotti animali che possono essere nocivi per la saluta umana”
Monica Ceccon
I residui antimicrobici possono essere:
Antibiotici sostanze naturali prodotte da microrganismi viventi o di semi
sintesi che a basse concentrazioni possono dimostrarsi tossiche in
modo selettivo verso altri microrganismi. A questa classe
appartengono: b-lattamici penicilline e cefalosporine, aminoglicosidi,
macrolidi, tetracicline, cloramfenicolo e rifampicine
Chemioterapici sostanze prodotte per sintesi che causano gli stessi
effetti degli antibiotici e vi appartengono: sulfamidici, trimethoprim,
chinolonici, fluorochinolonici e nitrofurani
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In campo veterinario gli antimicrobici più usati sono:
β-lattamici (mastiti, artriti, malattie respiratorie)
aminoglicosidi (streptomicina infezioni aerobi gram negativi)
tetracicline (ossitetraciclina infezioni respiratorie e gastrointestinali)
macrolidi (infezioni respiratorie e gastroenteriche)
fluorochinolonici e chinolonici (infezioni gastrointestinali respiratorie e renali)
sulfamidici (infezioni respiratorie e alimentari)
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Le cause della presenza di questi residui negli alimenti sono:
Dirette il produttore non rispetta i tempi di sospensione del trattamento
farmacologico o per dosaggio improprio e uso di sostanze illecite, o non
sospensione di mangimi medicati prima dell’immissione in commercio
dell’alimento
Indirette dipendono dallo stato di salute dell’animale dal suo metabolismo e
capacità di eliminare il farmaco
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I residui di antimicrobici possono essere presenti nei diversi
alimenti:
Latte
Carni
Uova
Mangimi
Pesce
Altri alimenti
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I Rischi tossicologici che si possono manifestare nell’uomo in seguito a consumo di alimenti
contaminati con residui di antimicrobici in quantità modeste (ordine di ppb) sono:
1) DIRETTI
Tossicità organo specifica come nefrotossicità, neurotossicità ed epatotossicità
(streptomicina nefrotossicità e neurotossicità)
Effetti cancerogeni formazione e accumulo di metaboliti reattivi che modificano
il DNA cellulare
Effetti teratogenici
2) INDIRETTI
Effetti allergici vanno da forme cutanee fino allo shock anafilattico (penicilline
contenute nel latte)
Fenomeni di antibiotico resistenza trasmissione di plasmide R da germi saprofiti a
germi patogeni che può indurre a rischi gravi di patologie
Rischi per la salute
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Legislazione europea a tutela dei
consumatori La tolleranza residuale ossia la quantità massima di residuo viene definita con
L.M.R. = Limite Massimo Residuale
LMR per ogni sostanza farmacologicamente attiva negli alimenti di origine
animale è contenuto nel reg. CEE 470/2009 che abroga il reg 2377/90
Al fine di rendere più efficace il sistema di controllo dei residui il D.lgs.
158/2006 che recepisce le direttive CEE 1996/22/CE 1996/23/CE istituisce
l’annuale Piano Nazionale Residui che è considerato uno strumento di
valutazione statistica
Oltre a questo piano sussistono tutti i controlli ufficiali effettuati dagli di
vigilanza territoriale e nazionale, sono sistemi che hanno il compito di
controllo contro gli illeciti
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ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE. svolge un ruolo attivo e fondamentale nel
campo della sicurezza alimentare analizzando tutti i campioni sia ufficiali che
provenienti dal PNR
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l’analisi di ricerca dei residui è un’indagine complessa ossia
necessita di valutazione qualitativa e quantitativa
Per ridurre i tempi di risposta quindi aumentare la qualità
verso l’utenza esterna e ridurre i costi di analisi
Si utilizza una metodica di
SCREENING MICROBIOLOGICO
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Microbiologia Analitica
La microbiologia analitica è l’utilizzo di ceppi batterici per la determinazione
qualitativa di sostanze chimiche ed è un’unione tra analisi microbiologica e
chimica
Perché usare i batteri?
Al momento risulta il metodo più economico e a più largo spettro per rilevare la
presenza di sostanze antimicrobiche in un campione di alimento
Test a “singolo tubo”
specie batterica
+
indicatore di crescita
+
1 solo campione
(es.Premi Test, Delvo Test)
Test multiplo in piastra
Più specie batteriche in più piastre
+
3 – 4 campioni per piastra
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Lo scopo dello screening è di selezionare campioni dei
campioni che con molta probabilità contengono uno o più
residui (multiresiduale) che vengono successivamente
confermati chimicamente in modo più preciso
Le caratteristiche che deve rispettare sono:
1) di semplice realizzazione
2) economico
3) veloce
SCREENING MICROBIOLOGICO
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Principio della metodica di screening
microbiologico Lo screening microbiologico si basa sull’inibizione della crescita batterica, in
piastre Petri con terreno argarizzato insemenzato con ceppi batterici
specifici, causata dalla presenza nel campione alimento di eventuali residui
di antimicrobici definiti come sostanze inibenti
L’inibizione della crescita provoca la formazione di un alone definito come
alone di inibizione
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Fattori che influiscono sulla metodica
Influiscono sulla sensibilità verso la rilevazione di un residuo alcune
variabili sulla composizione e le proprietà dell’agar quali:
1. inoculo: la con. deve essere standardizzata 104-106 UFC/mL
2. ceppo batterico utilizzato: organismi test presentono sensibilità diverse
verso gli antimicrobici
3. pH del terreno: influisce sul potere inibente del residuo
4. azione enzimatica e chimica: aumento/diminuzione del diametro
dell’alone di inibizione
5. Dimensione standardizzata del campione test: omogeneità delle di
pezzi di campione 1 cm su ogni piastra test
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SVILUPPO DELLO SCREENING
MICROBIOLOGICO CEPPI BATTERICI
B. subtilis BGA: sensibilità generale ai sulfamidici, chinolonici, macrolidi e
β-lattamici
B. cereus 11778: sensibile a tetracicline
B. cereus K 250: resistente a tetracicline
Sarina lutea ATCC 9341: sensibile ai β-lattamici e meno sensibile ai
macrolidi resistente ai chinolonici
B. stearothermophilus: sensibile β-lattamici e macrolidi
E. coli ATCC 11303: sensibile ai chinolonici 6° C ongresso
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AZIONE ENZIMATICA E CHIMICA
L’impiego di determinati enzimi va a confermare la classe antibiotica
rompendo la molecola inibente, mentre alcune sostanze possono enfatizzare
la reazione inibente all’antibiotico.
In particolare si usano:
Penicillinasi (PENASI): scinde l’anello β-lattamico penicilline
Cefalosporinasi (CEFASI): scinde l’anello β-lattamico cefalosporine
Trimetoprim (TMP): azione sinergica con i sulfamidici
Acido p-amminobenzoico (PABA): neutralizzazione l’azione inibenti dei
sulfamidici effetto competitivo
Tilosina: effetto sinergico con i macrolidi 6° C ongresso
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TERRENI AGARIZZATI E VARIAZIONI DI pH
Terreno Sostanze Inibenti TSI pH 7.2: per i ceppi K 250 e1178 Sarcina L., BGA
T. SULFA/+PABA: ceppo BGA specifico per la ricerca dei sulfamidici
T. β-Lattamici/+PENASI/CEFASI: ceppo B. Stearothermophilus specifico
ricerca β-Lattamici
Standard II pH 8: ceppo di E.coli ATCC 11303
Antibiotic medium 1 pH 6.5: Sarcina L. + 2% K2HPO4 + 1%
penicillinasi + 0,75% tilosina 1mg/ml
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VARIE MATRICI ALIMENTARI E SUOI TRATTAMENTI
A seconda della natura della matrice alimentare sono sottoposti a
trattamenti fisici e chimici preliminari:
carne e derivati: cubetti da 1 cm il più possibile formato omogeneo in tutte le piastre test
mangimi: estrazione chimica con tre differenti soluzioni a pH differenti
uova: estrazione chimica con solvente e trattamento termico disattivazione
del lisozima
latte crudo e pastorizzato: si applica il D.M. 26.03.92 prevede DELVO TEST
Latte UHT e liquidi: nessun trattamento
POST DEPOSITO CAMPIONE INCUBAZIONE IIN
TERMOSTATO ALLE SPECIFICHE TEMP. PER 24 H DELLE PIASTRE TEST
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Fasi operative di esecuzione dello
screening
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Interpretazione dei risultati
Il campione viene considerato positivo allo screening per presenza
antimicrobici quando presenta un alone di inibizione superiore a 2 mm.
Per alone di inibizione si intende lo spazio che intercorre tra la fine del
campione e l’inizio della crescita batterica.
Confrontando le misure degli aloni di inibizione con la correlazione tra
sensibilità e resistenza dei vari ceppi batterici con la presenza/assenza di aloni
nelle piastre contenenti PABA, cefasi e penasi, si può risalire in modo indicativo
alle famiglie di antimicrobici presenti nel campione di alimento
Per alone di inibizione si intende lo spazio che intercorre tra la fine del
campione e l’inizio della crescita batterica.
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SCHEMA INTERPRETATIVO 22
Tetracicline ß lattamici
Macrolidi
Sulfamidici
Chinolonici
B. subtilis BGA S
B. cereus K250 R S
B. cereus 11778 S R
M. luteus S S
M. luteus + PENASI 1% + TILOSINA 0,75 % +K2HPO4 2%
R S
E. coli
S
B. subtilis + Trimetoprim S
B. subtilis + Trimetoprim + PABA (ac. paramminobenzoico)
R
B. stearothermophilus S S
B. stearotherm. + PENASI (penicillinasi)
R (penicilline) S
B. stearotherm. + CEFASI
(cefalosporinasi)
R (cefalosporine) S
S: sensibile
presenza alone
di inibi.
R: resistente no
alone inib.
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Esempio di lettura per presenza di
Residui di Tetracicline
Presenza di Alone di inibizione nella piastra di B. cereus 11778 e assenza in
quella di B. cereus K 250
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Cosa succede al campione?
Se dalla lettura si ottiene un
alone di inibizione > 2 mm
l’alimento è quindi contaminato
da a DA ANTIMICROBICI
Si procede con la
determinazione quantitativa
in HPLC per verificare se
vengono rispettati i valori di
L.M.R. specifici
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RIEPILOGO CAMPIONI ALIMENTI PER MATRICE 2005-06
MATERIALE TOTALE N P
Confermati
> LMR
Non conformi
(ALTRO) 2 1 1
ACQUA DI VARIA
PROVENIENZA 9 8 1
ALIMENTI 1^INFANZIA,
DIETETICI 1 1
CARNE 181 167 14 5
FEGATO 43 42 1 1
RENE 103 74 29 2
PRODOTTI A BASE DI CARNE
E REPARAZIONE
GASTRONOMICHE
7 7
FORMAGGIO 21 21
INSACCATI 3 3
LATTE CRUDO AZIENDALE 2 2
LATTE UHT E DERIVATI 5 5
MANGIMI 28 20 8
MATERIALE APISTICO 1 1
PRODOTTO ITTICO E
PREPARAZIONI A BASE DI
PESCE
17 15 2
UOVA DA CONSUMO 61 37 24
PRODOTTO D’UOVO 1 1
Totale complessivo 488 402 83
(17%)
8
(1,6%)
RIEPILOGO CAMPIONI ALIMENTI PER MATRICE dal 01/01/2014 al 30/09/2015
MATERIALE TOTALE N P
Confermati
> LMR
Non conformi
CARNE 3218 3202 13 3
FEGATO 13 13
RENE 3 3
FORMAGGIO E PRODOTTI A
BASE DI LATTE 17 17
INSACCATI 1 1
LATTE CRUDO AZIENDALE 221 208 13
LATTE ACIDIFICATO 1 1
MANGIMI 43 41 2
PRODOTTO ITTICO E
PREPARAZIONI A BASE DI
PESCE
2 2
UOVA DA CONSUMO 30 20 10
Totale complessivo 3549 3508 38
(1,1%)
3
(0,08%)
Confronto tra i
risultati 2005/06 e
2014/15
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ANALISI DEI TEMPI E COSTI PER PRODURRE IL RISULTANTO
con o senza applicazione dello screening 2005-2006
per 83 campioni positivi
COSTO (€)
ANALISI SENZA
SCREENING
COSTO ( €)
ANALISI CON
SCREENING
ANALISI
SCREENING
MICROBIO-
LOGICO
/ 3.000
ANALISI
CHIMICA 41.500 10.600
% di risparmio
con screening
TOTALE COSTI
(circa) 41.500 € 13.560 € 33 %
COSTO X
CAMPIONE (1
indicazione
presuntiva)
500 € 155 € 31 %
TEMPI DI RISPOSTA
I tempi di risposta con l’applicazione dello
screening sperimentale si riducono
globalmente del 50 %
TEMPI DI RISPOSTA SENZA
L’APPLICAZIONE DELLO
SCREENNING
TEMPI DI RISPOSTA CON
L’APPLICAZIONE DELLO
SCREENNING
25-30 giorni 15 giorni
TOTALE
83 campioni
di alimenti
analizzati
Analisi con screening
3.000 € an. batt. +
10.600 € an. chimica
41.500 € costo tot. senza
screening
13.500 € costo tot. con
screening
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CONCLUSIONI
Lo screening microbiologico risulta essere di semplice
realizzazione, economico e veloce, ed inoltre molto sensibile ai
fini dei test di conferma chimica
Riduce i tempi di risposta e i costi di analisi
Pertanto viene utilizzato come supporto nell’analisi di routine nei
campioni di alimenti nei quali è richiesta la ricerca di residui di
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