Genişlemiş spektrumlu beta-

laktamazlar, AmpC ve

Karbapenemazların tanımlanması

Zeynep GülayDokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi

Tıbbi Mikrobiyoloji AD

Beta-laktamaz üretimi

Gram negatif bakterilerin beta-laktam direncinde önde gelen mekanizmadır.

Beta-laktamaz genleri kromozom, plazmid, transpozon veya integronlarda bulunabilir

Beta-laktamazlara bağlı direnç

fenotipi

Gen ekspresyonu

Hidrolitik etkinlik ve substrat tercihi

Beta-laktam direncinde önemli olan diğer mekanizmalara (örneğin, OmpK35 kaybı, aktif pompa sistemleri) bağlıdır.

Dolayısıyla direnç düzeyi aynı mekanizmayı taşıyan iki suşta farklı olabilir

Beta-laktamazların sınıflandırılması

Moleküler yapılarına göre: A, B, C, D

İşlevsel özelliklerine göre: 1,2,3

Bush ve Jacoby Antimicrob Agents

Chemother Jan 2010

www.lahey.org/Studies

Bush, K. et al. 2010. Antimicrob. Agents Chemother. 54(3):969-976

Grup 1, 2, and 3 {beta}-laktamazlarda artış (1970 – 2009)

GSBL (2be), KPC (2f)

OXA (2de, 2df)

AmpC (1)

MBL (3a)

>890

www.lahey.org/studies

Genişlemiş spektrumlu beta-

laktamazlar

Penisilinler, 1-4. Kuşak sefalosporinler, monobaktamları hidrolize eden enzimlerdir (sefamisinler ve karbapenemler etkilenmez)

ÇOĞU Beta-laktamaz inhibitörleri ile inaktive olurlar (Klavulanat/tazobaktam>sulbaktam)

Genişletilmiş Spektrumlu Beta-

laktamazlar (GSBL)

> 250

Temel gruplar:

I. TEM-türevi GSBLler

II. SHV-türevi GSBLlerIII. TEM ve SHV dışı GSBLler

I. CTX-M -YENİ GSBL: 101 tipi var

II. GES (IBC)(Karbapenemaz)

III. OXA GSBL (grup 2de, sınıf D):OXA-10 ve 2 türevleri

IV. VEB,PER,BEL, BES-1, TLA1/2, SFO-1

Grup

2be;

sınıf A

CLSI: Yeni öneriler

Sınır değerler düşürüldü

GSBL tanımlaması sadece enfeksiyon kontrolü amacıyla öneriliyor.

Rutin hizmet için GSBL tanımlamaya gerek yok! deniyor…

Zaman kaybına gerek yok: MĠK ne kadar düşükse; tedavi olasılığı o kadar yüksektir.

Bazı mikroorganizmalarda tanımlama için zaman kaybedilmektedir

Antibiyotik Eski M100-S19 (2009) MİK değerleri

mg/LYeni M100-S20 (2010) MİK

değerleri mg/L

Duyarlı (S) I Dirençli

(R)

Duyarlı (S) I Dirençli (R)

Sefazolin ≤8 16 ≥32 ≤1 2 ≥4Sefotaksim ≤8 16-32 ≥64 ≤1 2 ≥4Seftizoksim ≤8 16-32 ≥64 ≤1 2 ≥4Seftriakson ≤8 16-32 ≥64 ≤1 2 ≥4Seftazidim ≤8 16 ≥32 ≤4 8 ≥16Aztreonam ≤8 16 ≥32 ≤4 8 ≥16

Antibiyotik Eski M100-S19 (2009) Disk difüzyon

zon çapları (mm)Yeni M100-S20 (2010) ) Disk

difüzyon zon çapları (mm)

Duyarlı (S) I Dirençli

(R)

Duyarlı (S) I Dirençli (R)

Sefazolin ≥ 18 15-17 ≤14 - - -

Sefotaksim ≥23 15-22 ≤14 ≥ 26 23-25 ≤ 22

Seftizoksim ≥20 15-19 ≤14 ≥25 22-24 ≤21

Seftriakson ≥ 21 14-20 ≤13 ≥23 20-22 ≤19

Seftazidim ≥18 15-17 ≤14 ≥21 18-20 ≤17

Aztreonam ≥22 16-21 ≤15 ≥21 18-20 ≤17

EUCAST

Sefotaksim

Seftazidim

Sefepim

Seftriakson

≤1 (S) >2 (R) (CTX, CRO)

>4 (R) (CAZ,FEP,ATM)

Ancak öneriler CLSI gibi uygulanacaktır.

Çekinceler

Daha önceki klinik başarısızlık örnekleri

Daha önce yorum yapılıyordu: şimdi tüm beta-laktamlar rutinde kullanılacak mı?

MĠK değerlerinde + 1 dilüsyon fark zaten normal kabul ediliyor: Kesin ve doğru sonuç verilmesi ??? Tedaviye yansıması???

Gerek yok denince laboratuvarlar tanımlama yapacak mı? Enfeksiyon kontrolü yönü!!!

CLSI notu. 2010 kriterleri lab.a girene kadar M100-S19 kriterleri uygulanabilir

MĠK g/ml: SHV-3 üreten Citrobacter freundii

CFU/ml Sefotaksim Seftazidim Aztreonam Sefepim

5 x 105

2 1 0.5 0.5

KS Thomson and ES Moland, Creighton University

(CLSI duyarlılık sınırı 8 g/ml)

GSBL saptama problemleri:

İnokulum etkisi

5 x 107

256 32 32 512

Ġki basamaklıdır:

1- Tarama: Ġndikatör sefalosporinlerle (oksimino sefalosporinler; seftazidim, sefotaksim, sefpodoksim) duyarlılık testi

2- Doğrulama: Taramada şüpheli olanlara uygulanır

• Beta-laktamaz inhibitörlerine duyarlılık temellidir

GSBL Tanımlanması

GSBL saptanması/CLSI önerileri

Antibiyotik* Disk tarama (mm)

MĠK tarama (mg/L)

Sefpodoksim 17 8 (2)**

Seftazidim 22 2

Sefotaksim 27 2

Seftriakson 25 (NA)** 2 (NA)**

Aztreonam 27 (NA)** 2 (NA)**

*: Disk içeriği 30g ( )**: Proteus mirabilis için özel

CLSI M100 S19, 2009

Doğrulama testleri

Disk içeriği Yorum MĠK dağılımı (mg/L)

Yorum

CAZ 30g -- 0.25-128 --

CAZ +klav 30g+ 10 g

5mm= GSBL

0.25/4-128/4

3 log 2 dil= GSBL

CTX 30g -- 0.25-128 --

CTX+klav 30g+ 10 g

5mm= GSBL

0.25/4-128/4

3 dil= GSBL

=8 kat azalma

Kombinasyon diskleri: CAZ+ klav

CTX+ Klav (Ticari olarak bulunuyor)

= 22 mm

= 32 mm

Genişleme > 5mm

Genişleme herhangi birinde olabilir

Çift disk sinerji (Jarlier V, 1988)

Sefotaksim

Sefotaksim

+

Klavulanik

A.

GSBL için ETest TM

CT/CTL

TZ/TZL

PM/PML

MİK

değerinde >8

kat azalma

“Fantom zon” = GSBL

GSBL Raporlanması

Görülen antibiyogram:Sefepim (S), sefotaksim(S) aztreonamR, seftazidimR, sefoksitinS

Sonuç: GSBL pozitif E.coliVerilen antibiyogram: Sefepim,

sefotaksim, aztreonam, seftazidim,diğer 3.kuşak vb (R),

sefoksitin: raporlanmaz

Karbapenemler dışındaki tüm beta-laktamlar dirençli olarak bildirilir

GSBL doğrulama testleri (fenotipik)Avantaj Dezavantaj

Çift Disk Sinerji (ÇDS)

Ucuz, kolay uygulanır, rutin antibiyograma

alınır

-Diskler arası uzaklık ayarlanması

-Değerlendirenin deneyimi

Kombine Disk

Ucuz, duyarlı, özgül;

kantitatif sonuç

Kontroller doğru uygulanmalı

ETest

Duyarlı, kolay, kantitatif

Pahalı, K1 ile yalancı pozitiflik

GSBL saptanması: Manuel ve otomatize sistemler

Yöntem Duyarlılık Özgüllük PPV NPV

Microscan 83.4 72.9 81.6 75.5

Phoenix 98.8 52.2 75.0 96.6

Vitek 2 85.9 78.0 84.9 79.3

ÇDS 94.1 81.4 87.9 90.6

Kombine

Disk

92.9 96.6 97.5 90.5

ETest 94.1 84.7 89.9 90.9

Wiengand JCM 2007;45:1167

Plazmid Kökenli AmpC aşırı üreten bir bakteri: GSBL de yapıyor mu?

Zon genişlemesi= 2 mm

CLSI Kombine disk yöntemi

EVET

Kloksasilin AmpC’yi inhibe eder. Sonuçlar görülür

AmpC yapan türlerde GSBL

AmpC’den etkilenmeyen substratların kullanılması

Sefepim (ÇDS veya ETestTM)

AmpC inhibitörlerinin kullanılması

Kloksasilin ( MHA 200 mg/ml veya 100/500 g/disk ile ÇDS)

Boronik asit ve türevleri (300-500-600 g/disk): Kombine disk veya ÇDS

Kombine disklere boronik asit eklenmesi

Duyarlılık %98-Enterobacter spp %100

Özgüllük % 60 ( K. oxytoca K1’i atlamış)

Enterobacter cloacae; AmpC dereprese + GSBL üretiyor

MHA-Belirsiz sonuç

MHA + kloksasilin (200 mg/L)

Enterobacter cloacae üredi- İzolat GSBL üretmektedir. Temas izolasyonu önerilir

Amikacin S

Cefazolin R

Ampicillin R

Ceftazidime I R

Cefepime S R

Ceftriaxone S R

Gentamicin S

Levofloxacin S

AmpC ile beraber GSBL

saptandığında

AmpC Beta Laktamazlar•Karbapenemler ve sefepim dışındaki tüm

beta-laktamları hidrolize edenSefalosporinazlar,

•Klavulanat ve tazobaktamdan etkilenmezler

•Kromozomal ve plazmid kökenli olabilir

•Bazısı indüklenebilirdir:

•Normalde düşük düzey yapılırken, bazı beta-laktamlarla miktarı artar:

• Kromozomal olanlar; bazı plazmid kökenliler (DHA, ACC)

İndüklenebilir Beta-laktamazı olan türler

Enterobacter spp.

Hafnia alvei

Citrobacter freundii

Serratia marcescens

Morganella morganii

Providencia spp

Pseudomonas aeruginosa

Aeromonas spp

Ayrı test yapılmasına gerek yoktur:

Bazı türlerde bulunduğu bilinmelidir

Sefoksitin

CAZ

CTX

Laboratuvar rapor notu

• Duyarlılık sonuçları değiştirilmez ama Ġndüklenebilir Beta-laktamaz uyarısı yapılır:

• Örnek uyarı: Bu bakteri indüklenebilir beta-laktamaz üretmektedir. Tedavi sırasında 2-3. kuşak sefalosporinler, aztreonam, üreidopenisilinlere direnç gelişebilir. B-laktam inhibitörlerinden kaçınmak gereklidir.

Bush Grup 1 veya AmpC

İndüklenebilir Beta-Laktamazlar

Sorun nedir ? Ġndüklenme sorun değil:

Biliyoruz

Ġlaç varsa indükleniyor; ortadan kalkınca geri dönüşüyor

3. -4.kuşak sefalosporinler zayıf indükleyiciler

Karbapenemler iyi indükleyici ama etkilenmiyor

Sorun: Bu türlerde bulunan dereprese mutantların seçilmesi

Sürekli yüksek miktarda enzim sentezi

3. kuşak sefalosporin tedavisi sırasında seçilirler Tedavi

Başarısızlığı

İndüksiyon değil

derepresyon

sorundur.

E. cloacae İBL

E. cloacae dereprese mutant

Enterobacter cloacae üredi

Amikasin S

Ampisilin R

Sefazolin R

Seftazidim R

Sefepim S

Seftriakson R

Gentamisin S

Levofloksasin S

Yüksek düzey AmpC üretimi varsa

Plazmid kökenli Amp C tipi enzimler

En sık K.pneumoniae, E.coli, Salmonella spp. Proteus mirabilis gibi ĠBL özelliği bulunmayan türlerde görülür. Salgınlar yapabilir.

>100: CMY (1-59), FOX (1-8),LAT-1, MOX (1-8), DHA (1-7), ACT (1-8), ACC (1-4), MIR (1-5),CFE-1

Çoğu sürekli olarak yüksek düzey Amp Cyapımına neden olur.

DHA , ACT ve ACC indüklenebilir enzimlerdir.

Plazmid kökenli AmpC tipi enzim

tanımlanması

Ġndüklenebilir AmpC tipi beta-laktamazı olmayan türlerde

sefoksitin ve beta-laktamaz inhibitörü direnci

Seftazidim, sefotaksim I/R, sefepim –S.

CAZ, CTX I/R ama GSBL negatif düşündürmelidir

Porin mutasyonları ile karışabilir.

GSBL’lerle beraber olabilir: Kloksasilin ve Boronik asit türevleri ile ayırım sağlanabilir.

AmpC saptanması için

Etest™ CN/CNI

Sefotetan (0.5-32 mg/L) + kloksasilin stripleri

MHA, 0.5 McFarland, 16-20 st; MİKde > 8 kat azalma

Bolstrom A et al, ICAAC 2006; D-0451

%91 duyarlı; %93 özgül

Perez-Perez, Hanson. JCM 2002; 40: 2153

Altın standart:Moleküler yöntemler

Kan Kültürlerinden üretilen Klebsiella pneumoniae

izolatlarındaKarbapenem Direnç Oranları (DEÜ

2004-2010)

6,84,9

37

0

10

20

30

40

2004

2005

2006

2007

2008

2009

2010

Yıllar

% Direnç Karbapenem Direnci

Karbapenemazlar

Sınıf Enzim En sık görülen tür

Sınıf A KPC, SME, IMI, NMC, GES

Enterobacteriaceae(P. aeruginosa’da nadir)

Sınıf B

(metallo-b-laktamaz)

IMP, VIM, GIM, SPM, IND, NDM-1

P. aeruginosa

Enterobacteriacea

Acinetobacter spp.

Sınıf D OXA Acinetobacter spp.

Enterobacteriaceae (OXA-48)

Karbapenem direnç mekanizmaları

Ayrıca

Sınıf A GSBL’ler (CTX-M) + geçirgenlikte azalma

Sınıf C (Yüksek düzey AmpC) + geçirgenlikte azalma

Bu mekanizmalar ertapenem >>meropenem veya imipenem

KARBAPENEMAZLAR

Saptanmaları çok önemli çünkü GSBL (+) se ilk tedavi seçeneği

Bu direnç mekanizmalarını edinen bakteriler tüm karbapenemlere dirençli olacaktır fakat testlerde duyarlı gözükebilirler.

Plazmid ve integron kökenliler kolayca yayılmakta infeksiyon kontrolü için saptanmaları gereklidir

GSBL (+) lerde atlanmamalı!

Metallo-beta-laktamazlar

• Karbapenemleri ve aztreonam hariç tüm beta-

laktam ajanları parçalayabilen enzimlerdir.

• Stenotrophomonas maltophilia, Aeromonas,

Chryseobacterium: tür özelliğidir

• P. aeruginosa, A. baumannii, S. marcescens’de

plazmid ve integron kökenliler bildirilmiştir:

IMP-1-IMP-28; VIM-1- VIM-26, SPM-1, NDM-

1, IND 1-7

• Enterobacteriaceae’de daha nadir ama var

Metalloenzim tanımlanması

Tanımlanmalarında aktif bölgedeki Zn iyonuna bağlanarak enzimi inaktive eden EDTA, DPA, tiyol gibi bileşikler kullanılır.

MBL Etest™

İmipenem

/EDTA ile

MİK’de

>8 veya >3

log2

dilüsyon

azalma

www.ijmm.org

Sonuçlar türe, gen

ekspresyon düzeyine,

klona göre değişebilir.

MBL EtestTM

Yalancı pozitiflik=EDTA

Membran geçirgenliğini arttırır

Diğer metalloenzimleri inhibe eder

OprD ekspresyonunu azaltan Zn’yi bağlar

OXA tipi enzimlerle çapraz reaksiyon-Acinetobacter

OXA-48,KPC, ESBL ile Yalancı Pozitiflik

Yalancı negatiflik

Besiyerindeki çinko düzeyi etkiler.

Gen ekspresyonuna bağlı olarak karbapenem MĠKleri stripin dışında kalabilir: Enterobacteriaceae: DPA, MEM/EDTA

A.baumannii atlıyor: Tiyol bileşikleri

Ikonmidis JCM 2008; Loli A AAC 2008Segal, Elisha JAC 2005; Giske CMI 2010; ChuYW IJAA 2005

IP 4-256 mg/L; IPI 1-64 mg/L

Duyarlılık Özgüllük PPV NPV

1 94 95 - -

2(Çin) 85.7 100 100 98.8

3(Belçika) 100 86.4 86.9 100

1- Walsh T JCM 2002; suş koll. ; 2-Qu TT: Çin 21 VIM-2 ve IMP-9 P.a 3-Berges L JAC 2007: Belçika 2004-2005 587 P.aeruginosa (42 MBL pozitif- çoğu VIM);

55

Besiyerinin etkisi- Zn+2 etkisi

Acinetobacter spp. CI 17-

9-45 (IMP-1 pozitif)

Zn2+ uygun

Zn2+

Isosensitest agar (%9-Çok büyük hata)

Mueller Hinton Agar

Etest ÇDS KD

MBL (27)

MHA 4 12 3

MHA+Zn 27 18 26

VIM-2 içeren P.aeruginosa izolatlarında, besiyerine Zn+2 eklenmesinin etkisi

Giakkoupi P et al JCM 2008;46:1568

Belirsiz

Pozitif

OXA-tipi karbapenemazlar

Serin beta-laktamazlardır

Klavulanik asit ile inhibe olmazlar

Ġn vitro olarak NaCl ile inhibe olurlar

Karbapenemleri genellikle düşük düzeyde etkilerler

3. Kuşak sefalosporinleri etkilemezler*

En sık Acinetobacter spp. Fakat Enterobacteriaceae’de de yayılmaya başladı.

Klebsiella Pneumoniae Carbapenemase (KPC)

Sınıf A beta-laktamazlar (KPC 2-11)

Karbapenemler ve 3. Kuşak sefalosporinler dahil olmak üzere TÜM beta-laktamlara dirence yol açar

Özellikle ABD’de Enterobacteriaceae üyelerinde bildirilmiş---- Tüm dünya

Saptanması güç: imipenem ve meropenem (S) olabilir; ertapenem daha iyi bir göstergedir.

Boronik asit ile inhibe olur (Amp C tipi enzimlere DĠKKAT!: kloksasilin/oksasilin inhibisyonu*

KPC üreten izolatların ertapenem duyarlılığı

0

10

20

30

40

50

60

2 4 8 16 >16

MIC (g/ml)

No

. o

f Is

ola

tes

S I R

İzolatların hepsi ertapeneme dirençli

Karbapenemaz saptanması

1. Karbapenem duyarlılığının saptanması

Arama kriteri karbapenemlerden herhangi birine (ertapenem,

imipenem, meropenem, doripenem) azalmış duyarlılık (I/R)

olmalıdır.

2. Karbapenem duyarlılığı azalmış izolatlarda Modifiye Hodge

Testi yapılması.

3. Modifiye Hodge Testi pozitif ise “ bakteri karbapenemaz

üretmektedir. Bazı karbapenemlere duyarlı gözükse de klinik

tedavi sırasında direnç gelişebilir” notu ile raporlama

4. İlgili klinik ve enfeksiyon kontrol hemşiresi uyarılır

CLSI M100-S19/S20

Karbapenemazlar: Ne zaman şüphelenelim?

Karbapenemlere duyarlılığı

azalmış (inhibisyon zonu

I/R; ERT 21 mm ve altı),

Klebsiella pneumoniae (ve

diğer Enterobacteriaceae)

Sıklıkla çoklu direnç

görülmektedir

Disk difüzyon ve E testi

Negatif kontrol

Klinik izolat

Klinik izolat

Pozitif kontrol

ATCC 25922

E.coli

Modifiye HodgeTesti

Karbapenemazların doğrulanması

Beta-laktamazlara özgü inhibitörler teste eklenerek duyarlılık düzeyinin değişimi incelenir.

MBL EDTA ve dipikolinik asit,

KPC için boronik asit,

Amp C için kloksasilin veya oksasilin

Moleküler testler ve dizi analizi Ticari testler

Miriagou V CMI 2010;16:112Thomson K AAC 2010; 48:1019

Karbapenemazlar için disk dif ve mikrodilüsyon yöntemleri en iyi yöntemler

MHT

CTX-M /AmpC aşırı üretimi + ilacın hücre içinde birikmesini engelleyen bir mekanizma (porin/pompa): yalancı pozitiflik (ertapenemde de): Enterobacterspp.DĠKKAT!

Bazı MBL(Enterobacteriaceae) yalancı negatiflik olabilir.

Otomatize sistemlerde saptama

sorunu var

KPC(+) imipenem

dirençli izolatların

ticari sistemlerce

tanınması sorun:

%6.7-%87

oranında atlanıyor

Karbapenem direnç

mekanizması belirli

izolat sayısı

Sistem/panel Karbape

nemaz

uyarısı

Karbapen

emaz

(n=39)

Karbapene

maz değil

(n=16)

Duyarlılık

(%)

Özgüllük

(%)

Phoenix

NMIC/id-76

Evet

Hayır

39

0

16

0

100 0

MicroScan

NM36

Evet

Hayır

33

6

15

1

85 6

MicroScan

NBC39

Evet

Hayır

32

7

13

3

82 19

Vitek 2AST-

N054

Evet

Hayır

29

10

10

6

74 38

Otomatize sistemler (2010)

Woodford et al JCM 2010; 48: 2999

Phoenix MicroScan

NM36

MicroScan

NBC39

Vitek 2

Positi

ve

Negati

ve

Positi

ve

Negat

ive

Positi

ve

Negati

ve

Positi

ve

Negati

ve

KPC (n=8) 8 0 8 0 8 0 8 0

MBL (IMP,VIM,or

NDM; n=20)20 0 19 1b 20 0 16 4b

OXA-48 (n=11) 11 0 6 5 4 7 5 6

E.coli/Klebsiella

spp.,ESBL,porin loss

(n=10)

10 0 10 0 8 2 8 2

Enterobacter

spp.,AmpC/ESBL,porin

loss (n=6)

6 0 5 1 5 1 2 4

2010 yılı CLSI karbapenem sınır

değerleri -M 100- S20-U (Haziran 2010)

Önceki sınır değerleri Yeni sınır değerleri

(2010)

Karbapene

m

MİK mg/L Disk (mm) MİK Disk

Ertapenem ≤2- ≥8 ≥19-≤15 ≤0.25-≥1 ≥23-≤19

İmipenem ≤ 4- ≥16 ≥16-≤13 ≤1-≥4 ≥23-≤19

Meropenem ≤4≥16 ≥16 - ≤13 ≤1-≥4 ≥23-≤19

Doripenem - - ≤1-≥4 ≥23-≤19

MHT uygulanmasına gerek yoktur

Özgüllük düşmüş, MHT uygulanmaması da sorun!

Yönteme göre karbapenem MİK’leri değişiyor. Etest –mikrodil uyumu %33 (imipenem)- %84 (ertapenem): Aynı inokulum kullanılsa bile!

Yönteme göre meropenem MİK’leri değişiyor. Etest –BMD uyumu %82; Vitek 2 %30.4 (çok büyük hata %24)