laporan akhir penelitian dosen muda - unud
TRANSCRIPT
1
LAPORAN AKHIRPENELITIAN DOSEN MUDA
SKRINING AKTIVITAS PROTEASE PADA GETAHTANAMAN (LABU SIAM, LIDAH BUAYA DAN TALAS)
SERTA PERBANDINGANNYA TERHADAP GETAH PEPAYA
Tahun ke 1 dari rencana 1 tahun
Ketua/Anggota Tim
Ketut Ratnayani, S.Si., M.Si. (NIDN 0009067105)
A.A.I.A.Mayun Laksmiwati, S.Si., M.Si. (NIDN 0008056702)
JURUSAN KIMIAFAKULTAS MIPA
UNIVERSITAS UDAYANA
Nopember, 2014
2
3
RINGKASAN
Enzim protease secara komersial dapat diproduksi dari tumbuhan, hewan,dan mikroba. Pemanfaatan protease getah diharapkan dapat meningkatkan nilaikomersial getah yang selama ini dianggap sebagai limbah dari produk tanamantersebut. Getah pepaya(sebagai sumber enzim protease papain yang telah dikenal)dan (buah nanas yang dikenal mengandung protease bromelain) memilikikemiripan sifat yaitu dapat menyebabkan rasa gatal bila bersentuhan dengan kulit.Sifat getah yang dapat menyebabkan rasa gatal ini juga dapat kita temukan padabeberapa getah tanaman lain yang sering kita manfaatkan yaitu labu siam(Sechium edule(Jacq.) Sw.), talas(Colocasia esculenta(L.)Schott), dan lidahbuaya(Aloe vera L.).
Berdasarkan latar belakang tersebut, maka perlu dilakukan penelitian untukmelakukan skrining aktivitas protease untuk membuktikan apakah benar getahtanaman (labu siam, talas dan lidah buaya) tersebut memiliki aktivitas protease.Dalam penelitian ini juga dilakukan penentuan uji aktivitas protease dari getahpepaya sebagai pembanding, sehingga secara relatif dapat dibandingkan aktivitasprotease dari masing-masing getah tanaman tersebut dibandingkan getah pepaya.Satu Unit Aktivitas Protease(U/mL) dinyatakan sebagai jumlah enzim yang dapatmengkatalisis reaksi hidrolisis kasein dan menghasilkan warna setara dengan satumikromol tirosin pada setiap menit kondisi percobaan.
Hasil pengujian aktivitas protease dengan metode Anson menunjukkanbahwa getah talas, labu siam dan melinjo positif memiliki aktivitas protease,sedangkan lidah buaya menunjukkan hasil negatif. Berdasarkan hasil perhitungandiperoleh aktivitas protease dari tanaman talas dan labu siam yaitu 0,0123 U/mL;0,0264 U/mL dan 0,3032 U/mL. Dengan demikian getah tanaman talas dan labusiam dapat digunakan sebagai sumber protease alternatif dengan rasioperbandingan aktivitas protease terhadap getah pepaya berturut-turut sebesar(1 : 74,75) dan (1 : 34,82).
4
PRAKATA
Puji syukur atas segala rahmat Hyang Widhi Wasa sehingga laporan
penelitian ini dapat terselesaikan pada waktunya. Penelitian yang berjudul ”
Skrining Aktivitas Protease Pada Getah Tanaman (Labu Siam, Lidah Buaya dan
Talas) Serta Perbandingannya Terhadap Getah Pepaya” ini merupakan penelitian
yang merupakan peneliti pemula yang berhasil mendapat kepercayaan untuk
didanai oleh dana Dosen Muda 2014. Dana penelitian ini sangat bermanfaat
untuk merangsang kami sebagai dosen-dosen baru untuk lebih aktif menjalankan
salah satu tri dharma perguruan tinggi yakni bidang penelitian.
Melalui kesempatan ini kami mengucapkan terima kasih yang sebesar-
besarnya atas bantuan dan kerjasama berbagai pihak sehingga penelitian ini
dapat terlaksana sebagai mana diharapkan yaitu :
- LPPM Universitas Udayana, dan Dirjen Dikti atas bantuan dana dan
berbagai fasilitasnya.
- Laboratorium Bersama FMIPA UNUD dan Laboratorium Analisis Teknologi
Pangan FTP UNUD bantuan fasilitas dan kerjasamanya.
- A.A.Septri Juwarni atas kerja keras, pemikiran dan kerjasamanya.
Laporan penelitian ini masih jauh dari sempurna, sehingga kami
mengharapkan saran dan kritik dari berbagai pihak agar menjadi lebih baik.
Nopember, 2014
Peneliti
5
DAFTAR ISI
HALAMAN PENGESAHAN.......................................................................2
RINGKASAN................................................................................................3
PRAKATA.....................................................................................................4
DAFTAR ISI..................................................................................................5
DAFTAR TABEL ........................................................................................6
DAFTAR GAMBAR................................................................................... 7
DAFTAR LAMPIRAN.................................................................................8
BAB 1. PENDAHULUAN...........................................................................9
BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA..................................................................12
BAB 3. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITAN ..................................15
BAB 4. METODE PENELITIAN..............................................................16
BAB 5. HASIL DAN PEMBAHASAN.....................................................23
BAB 6. KESIMPULAN DAN SARAN................................................... 32
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................... 33
LAMPIRAN.............................................................................................. 35
6
DAFTAR TABEL
Tabel 4.1. Tahap penambahan/perlakuan dalam pembuatan kurva standar tirosin
Tabel 4.2 Tahap penambahan/perlakuan dalam penentuan aktivitas protease.
Tabel 5.1 Karakteristik getah tanaman pepaya, labu siam, talas, dan lidah buaya
hasil penyadapan.
Tabel 5.2 Ciri fisik ekstrak protease kasar getah tanaman
Tabel 5.3 Jumlah tirosin sebelum inkubasi, sesudah inkubasi dan hasil
hidrolisis
Tabel 5.4 Hasil uji aktivitas ekstrak protease kasar getah tanaman
Tabel 5.5 Perbandingan aktivitas protease getah tanaman talas dan labu siam
terhadap getah pepaya
7
DAFTAR GAMBAR
Gambar 5.1 Cara penampungan getah dari buah pepaya muda
Gambar 5.2.Cara penampungan getah dari talas dan labu siam
Gambar 5.3 Ekstrak protease kasar getah tanaman pepaya , talas dan labu siam
Gambar 5.4. Kurva standar tirosin
8
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Instrumen
Lampiran 2.Personalia Peneliti
Lampiran 3. Publikasi(Jurnal)
Lampiran 4. Kurva Penentuan panjang gelombang maksimum
Lampiran 5. Pembuatan Kurva Standar Tirosin
Lampiran 6. Perhitungan Aktivitas Protease Getah Pepaya, Talas dan Labu siam
9
BAB 1PENDAHULUAN
Protease merupakan enzim yang mengkatalisis reaksi hidrolisis protein
menjadi monomernya yaitu asam amino. Penjualan enzim ini mencapai 60%
penjualan enzim dunia (Rao et al., 1998). Indonesia merupakan salah satu negara
yang memanfaatkan enzim ini dalamindustri, namun kebutuhan akan enzim ini
masih dipenuhi dari impor 122,3 ribu ton pada tahun 2001 (Sutandi, 2003).
Protease secara komersial dapat diproduksi dari tumbuhan, hewan, dan mikroba.
Protease yang diisolasi dari tumbuhan memiliki keunggulan yaitu memiliki
aktivitas dan stabilitas yang tinggi pada berbagai variasi pH, temperatur, inhibitor
serta ion logam (Mehnoush et al., 2011). Secara ekonomi, protease dari hewan
harganya relatif lebih mahal, sedangkan protease darimikroba belum sepenuhnya
dapat menggantikan peran protease tumbuhan untuk tujuan tertentu(Witono,
2008).
Protease pada tanaman dapat diperoleh dari bagian getah, buah, daun, akar
dan batang tanaman. Getah merupakan cairan dari jaringan tumbuhan yang secara
umum mengandung alkaloid, terpenoid, fenolik, protein, protease, protease
inhibitor,kitinase, lektin(Agrawal and Konno, 2009) serta vitamin, karbohidrat,
dan asam amino bebas (Vierstra, 1996). Berdasarkan penelitian yang dilakukan
oleh Oseni and Ekperigin(2013) ditemukan bahwa bagian getah tumbuhan
Calotropis procera(Sodom apple) memiliki aktivitas protease yang jauh lebih
tinggi dibandingkan bagian tanaman lain (akar, batang muda, daun, buah).
Kelebihan lainnya yaitu proses isolasi enzim dari getah relatif lebih sederhana dan
efisien, mengingat enzim protease getah merupakan enzim ekstraselular sehingga
proses isolasinya dapat dilakukan tanpa tahap pemecahan/lisis sel tumbuhan.
Selain itu juga dapat diperoleh isolat enzim yang relatif lebih murni karena dapat
dihindari adanya pencampuran enzim lain yang sebagian besar adalah intraselular
sehingga tahap isolasi menjadi lebih singkat. Pemanfaatan protease getah
diharapkan dapat meningkatkan nilai komersial getah yang selama ini dianggap
sebagai limbah dari produk tanaman tersebut.
10
Getah pepaya (Carica papaya) merupakan salah satu sumber enzim
papain(suatu jenis protease) yang telah dikenal dan banyak dimanfaatkan dalam
berbagai industri seperti pelunakan daging, deterjen, industri makanan, industri
fotografi, dan sebagai bahan aktif krim pembersih kulit (Rani, et al., 2012). Getah
pepaya dapat menyebabkan rasa gatal bila bersentuhan dengan kulit. Selain itu
buah nanas yang telah dikenal mengandung protease bromelain dan getah mangga
yang telah dilaporkan memiliki kandungan serin dan sistein protease (Saby et al,.,
2003 dalam Agrawal and Konno, 2009) juga memiliki ciri yang mirip dengan
getah pepaya yaitu dapat menyebabkan rasa gatal. Sifat getah tanaman yang dapat
menyebabkan rasa gatal ini juga dapat kita temukan pada beberapa getah tanaman
yang sering dimanfaatkan dalam kehidupan sehari-hari yaitu labu siam (Sechium
edule(Jacq.) Sw.), talas(Colocasia esculenta (L.) Schott), dan lidah buaya(Aloe
vera L.). Reaksi gatal yang disebabkan getah tanaman tersebut, kemungkinan
besar disebabkan oleh keberadaan enzim protease.
Labu siam sebagai salah satu tanaman subtropis yang sering digunakan
sebagai bahan makanan mengandung getah yang diperkirakan memiliki aktivitas
proteasekarena memiliki getah yang lengket dan gatal yang secra empiris dapat
digunakan untuk membersihkan garis hitam pada tumit. Talas sebagai tumbuhan
herba menahun penghasil umbi yang umum dikonsumsi mengandung getah/cairan
yang juga menimbulkan rasa gatal jika bersentuhan dengan kulit. Secara
tradisional cairan akar digunakan sebagai obat bisul, sementara getah daunnya
digunakan sebagai obat untuk menghentikan pada luka dan bengkak(Miswinda,
2011). Ekstrak batang dan umbi talas dapat digunakan dalam pengolahan daging
kerbau agar menjadi empuk (Roxas, 2013). Lidah buaya sebagai tanaman yang
banyak digunakan dalam bidang pangan dan pengobatan mengandung getah dari
daunnya yang memiliki ciri berwarna kuning dan pahit serta dapat menyebabkan
reaksi gatal bila bersentuahn dengan kulit(Daffy, 2013). Secara empiris, getah
lidah buaya sering digunakan untuk pencahar, dan perawatan luka bakar.
Berdasarkan latar belakang tersebut, serta berdasarkan penelitian Lavinka
dan Dong (2013) yang melaporkan bahwa iritasi kulit yang disebabkan oleh
11
protease dapat memicu terjadinya rasa gatal pada kulit, maka dipandang perlu
dilakukan penelitian untuk melakukan skrining aktivitas proteaseuntuk
membuktikan apakah benar getah tanaman (labu siam, talas dan lidah buaya) yang
diduga mengandung enzim proteasetersebut memiliki aktivitas protease. Di
samping itu dalam penelitian ini juga akan dilakukan penentuan aktivitas protease
dari getah pepaya(yang telah dikenal mengandung protease papain) sebagai
pembanding, sehingga secara relatif dapat dibandingkan aktivitas protease dari
masing-masing getah tanaman tersebut apakah lebih tinggi atau lebih rendah
dibandingkan getah pepaya. Aktivitas protease ditentukan dengan cara
mereaksikan ekstrak protease kasar dengan substrat kasein selama 30 menit.
Aktivitas protease (U/mL) dinyatakan dalam unit aktivitas yaitu satu unit (U)
dinyatakan sebagai jumlah enzim yang dapat mengkatalisis reaksi hidrolisis
kasein dan menghasilkan warna setara dengan 1 mikromol tirosin pada setiap
menit kondisi percobaan.
1.1. Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang di atas timbul permasalahan sebagai berikut:
1. Apakah getah tanaman labu siam, talas dan lidah buaya memiliki aktivitas
protease?
2. Bagaimnakah perbandingan aktivitas protease getah tanaman tersebut
terhadap aktivitas protease getah pepaya.
12
BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
2.1.Protease Tanaman
Sel tumbuhan memiliki lebih dari 10.000 jenis protein yang beberapa di
antaranya mungkin tidak berfungsi ataupun rusak sehingga tidak diperlukan lagi
oleh tumbuhan. Protein yang tidak dibutuhkan inilah yang akan menjadi substrat
untuk didegradasi oleh protease menjadi monomernya yaitu asam amino bebas
dan peptida rantai pendek yang nantinya akan digunakan lagi dalam metabolisme
tumbuhan misalnya untuk mensintesa protein baru.Degradasi protein pada
tumbuhan ini berfungsi untuk peremajaan sel, yaitu setiap 4 - 7 hari sebagian
protein yang menyusun sel tumbuhan tersebut diganti (Hopkin and Norman,
2004).
Protease pada tanaman dapat berasal dari getah, buah, akar dan batang
tanaman.Salah satu contoh penelitian yang menggunakan bagian-bagian tanaman
sebagai sumberprotease yaitu pada getah, akar, batang muda, batang tua, daun dan
buah dari tanaman Calotropisprocera(Sodom apple) yang memiliki aktivitas
protease berturut-turut sebesar 0,052 U/mL ;0,0344 U/mL; 0,0148 U/mL; 0,0148
U/mL; 0,0147 U/mL; 0,0141 U/mL dan 0,0118 U/mL(Oseni dan Ekperigin,
2013).
2.2.Protease Getah Tanaman
Getah berupa emulsi lengket yang keluar dari jaringan tanaman yang
terluka dan memiliki peran dalam pertahanan tanaman terhadap serangan serangga
herbivora, parasit dan patogen(Vierstra, 1996). Getah merupakan cairan dari
jaringan tumbuhan yang secara umum mengandung alkaloid, terpenoid, fenolik,
protein, protease, protease inhibitor, kitinase, lektin(Agrawal and Konno, 2009)
serta vitamin, karbohidrat, dan asam amino bebas (Vierstra, 1996). Selain itu
getah juga mengandung mineral, gula,hormon dan air.Sebagai salah satu metabolit
sekunder, konsentrasi protease pada getah dan eksudat lebihbesar daripada daun
(Agrawal dan Kono, 2009).
13
Protease dari getah beberapa tanaman yang telah diteliti yaitu getah pepaya
(Rao et al.,1998), getah pinus (Williams et al, 1968), getah kipas cinde(Asclepias
curassavica L.) (Liggieri et al., 2009), getah biduri (Calontropis gigantea)
(Witono, 2008), getah Euphorbia synudenium, getah Ricinus commanis, getah
Jatropha curcas dan getah Euphorbia triucalli (Borde et al.,2013).
2.3.Ekstraksi Protease kasar dari Getah Tanaman
Ekstraksi bertujuan untuk memisahkan enzim dari sumbernya yaitu tanaman,
hewan, maupun mikroba. Adapun kelebihan enzim dari tanaman di antaranya
adalah terjaganya ketersediaannya atau bisa dipanen berulang-ulang.
Ekstraksi protease dari getah dapat dilakukan dengan cara menambahkan
larutan buffer, yang bertujuan untuk menjaga pH lingkungan sehingga
diharapkan mampumeminimalkan denaturasi dan inaktivasi enzim. Buffer dapat
ditambah beberapa bahan kimia dengan tujuan untukmencegah kerusakan enzim
(Elfi, 2011). Bahan kimia yang bisa ditambahkan di antaranya EDTA, dan sistein
(Liggieri et al., 2009) serta NaOH untuk mencegah terjadinya reaksi oksidasi
(Ortiz et al.,1980 dalam Puig et al., 2008).
2.4.Uji Aktivitas Protease
Jumlah enzim dalam ekstrak jaringan tertentu dapat diuji secara kuantitatif
dalamhal pengaruh katalitik yang dihasilkannya. Enzim biasanya diuji
aktivitasnya pada pH optimum, pada suhu yang mudah dipergunakan dalam
kisaran 25 sampai 38oC, dengan konsentrasi substrat yang mendekati jenuh. Pada
keadaan ini, kecepatan reaksi awalbiasanya sebanding dengan konsentrasi enzim,
sedikitnya pada kisaran konsentrasi enzim tertentu (Lehninger, 1990).
Aktivitas protease dapat ditentukan dengan melakukan uji kaseinolitik atau
menguji aktivitas protease dengan memanfaatkan kasein sebagai substrat pada
suhu, pH, dan lama waktu tertentu. Reaksi hidrolisis yang terjadi selanjutnya
dapatdihentikan dengan menambahkan larutan TCA (asam trikloroasetat)
sehingga enzim dan sisa substrat menjadi terdenaturasi, kecuali produk hasil
14
hidrolisis yang berupa sama amino (salah satunya yaitu tirosin). Tirosin yang
larut dalam campuran reaksi tersebut selanjutnya dipisahkan dari enzim dan sisa
substrat dengan cara disentrifugasi dan ditentukan serapannya dengan
menggunakan metode Anson (Satwika, 2010). Penentuan kadar tirosin pada
metode Anson dilakukan dengan teknik kolorimetrik, yaitu memanfaatkan
serapan dari kompleks biru yang terbentuk akibat reaksi antara tirosin dengan
reagen Folin-Ciocalteu pada pH basa(Folin and Ciocalteu, 1927).
15
BAB 3TUJUAN DAN MANFAAT PENELITAN
3.1.Tujuan Penelitian :
Penelitian ini bertujuan :
1. Untuk mengetahui apakah getah tanaman labu siam, talas dan lidah buaya
memiliki aktivitas protease.
2. Untuk mengetahui perbandingan aktivitas protease getah tanaman tersebut
terhadap aktivitas protease getah pepaya.
3.2. Manfaat Penelitian:
1. Dapat memberikan informasi ilmiah tentang alternatif sumber protease dari
getah tanaman lain selain getah pepaya serta perbandingan aktivitas proteasenya
dalam memecah substrat protein(kasein).
16
BAB 4METODE PENELITIAN
4.1.Bahan Penelitian
Bahan obyek penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah getah
dari tanaman labu siam, talas, lidah buaya dan pepaya.
Bahan-bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini meliputi aquades,
tirosin, kasein, K2HPO4 0,05 M, KH2PO4 0,05 M, NaOH 0,3 M, Na2CO3 0,5 M,
TCA (Asam Trikloroasetat) 0,11 M, dan reagen Folin-Ciocalteau.
4.2.Alat Penelitian
Alat –alat yang digunakan meliputi peralatan gelas, alat sentrifugasi, pH
meter, vortex, lemari pendingin, termos es, botol vial, neraca analitik, pipet
mikro, botol semprot, spatula, pisau stainles steel, inkubator, dan
spektrofotometer UV-Vis.
4.3.Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Analisis Hasil Pertanian Fakultas
Teknologi Pertanian Universitas Udayana dan Laboratorium Bersama FMIPA
Universitas Udayana.
4.4.Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian diskriptif-eksploratif yang bertujuan
untuk mengetahui apakah getah dari tanaman labu siam, talas, lidah
buaya memiliki aktivitas protease serta perbandingannya dengan getah pepaya.
Penelitian ini diharapkan mampu memberikan informasi awal tentang aktivitas
protease pada getah dari tanaman labu siam, talas, dan lidah buaya.
4.5.Pengambilan Sampel Getah
Getah tanaman disadap dengan cara yang sesuai dengan karakteristik
tanaman tersebut. Getah pepaya diperoleh dari melukai buah pepaya yang masih
muda dengan menggunakan pisau stainles steel pada kedalaman 1-2 mm, getah
yang menetes keluar segera ditampung dengan botol vial. Sedangkan getah
tanaman talas, labu siam dan lidah buaya diperoleh dari membelah umbi talas,
buah labu siam dan daun lidah buaya dengan menggunakan pisau stainles steel.
Getah yang keluar namun tidak menetes ini diambil dengan menggunakan
bantuan pisau stainles steel dan ditampung dalam botol vial. Sampel getah yang
didapatkan ini disimpan dalam termos es untuk meminimalkan efek oksidasi dan
denaturasi protein.
4.6.Preparasi Ekstrak Protease Kasar
Ekstrak protease kasar didapatkan dari hasil pemisahan enzim dari getah
tanaman. Proses ekstraksi dilakukan pada suhu 4-6oC untuk meminimalkan efek
denaturasi enzim (Ishartani et al., 2011). Kondisi ini secara teknis dicapai dengan
cara mengusahakan semua proses pencampuran dan perlakuan pada tahap
ekstraksi yang sedapat mungkin dilakukan dalam penangas es (ice bath).
Sebanyak 1 mL sampel getah tanaman dilarutkan dengan 4 mL buffer
fosfat 0,05 M (pH 7,0). Selanjutnya campuran disentrifugasi pada kecepatan 7000
rpm selama 10 menit hingga terbentuk dua lapisan yaitu supernatan dan
endapannya (residu). Supernatan yang dihasilkan lalu dipisahkan dari endapannya
yang sebagian besar mengandung getah dan komponen selain protein. Supernatan
18
(ekstrak protease kasar) yang telah dipisahkan dari endapan ini siap untuk
digunakan sebagai sampel dalam uji aktivitas protease. Ekstrak protease kasar
selanjutnya disimpan dalam suhu 4oC.
4.7.Uji Aktivitas Protease
4.7.1.Pembuatan Larutan Stok Tirosin 1,10 mM
Larutan standar tirosin 1,10 mM dibuat dengan melarutkan 10 mg tirosin
kedalam 20 mL aquades, setelah itu campuran dihangatkan hingga tirosin larut
sempurna. Larutan tirosin selanjutnya dipindahkan secara kuantitatif ke dalam
labu ukur 50 mL. Larutan diencerkan hingga tanda batas dengan menggunakan
aquades.
4.7.2.Pembuatan Kurva Standar Tirosin
Kurva standar tirosin dibuat dengan menggunakan larutan stok tirosin 1,10
mM dengan variasi konsentrasi yaitu 6,875; 13,75; 27,5; dan 55,0 µM. Larutan
stok tirosin 1,10 mM dimasukkan masing-masing sebanyak 0,05; 0,1; 0,2 dan 0,4
mL ke dalam botol vial b, botol vial c, botol vial d dan botol vial e dengan
menggunakan pipet mikro. Sedangkan untuk larutan blanko (botol vial a), tidak
dilakukan penambahan larutan stok tirosin 1,10 mM. Setelah itu, sebanyak 2,0;
1,95; 1,9; 1,8; dan 1,6 mL aquades berturut-turut dimasukkan ke dalam botol vial
a, botol vial b, botol vial c, botol vial d dan botol vial e. Selanjutnya, sebanyak 5,0
mL larutan Na2CO3 0,5 M dan 1 mL reagen Folin-Ciocalteu ditambahkan pada
masing-masing botol vial yang telah berisi larutan tirosin dan blanko. Masing-
masing larutan tersebut dihomogenkan lalu diinkubasi pada suhu 37oC selama 30
menit. Setelah 30 menit, salah satu larutan standar tirosin diukur absorbansinya
dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 500 nm
- 900 nm. Panjang gelombang yang menunjukkan nilai absorbansi tertinggi
digunakan sebagai gelombang maksimum (λmaks).
Setelah didapatkan panjang gelombang maksimum (λmaks), semua larutan
standar tirosin dan blanko diukur absorbansinya menggunakan spektrometer UV-
Vis pada λmaks. Nilai absorbansi yang didapatkan digunakan untuk membuat kurva
kalibrasi, yaitu dengan memplotkan nilai absorbansi terhadap konsentrasi tirosin.
Tabel 4.1 menunjukkan tahap penambahan/perlakuan dalam pembuatan kurva
standar tirosin.
Tabel 4.1. Tahap penambahan/perlakuan dalam pembuatan kurva standar tirosin
Penambahan/perlakuanBlankoStandar
Standar1
Standar2
Standar3
Standar4
Botol vial A b C d e
Larutan stok tirosin (mL) 0,0 0,05 0,1 0,2 0,4
Aquades (mL) 2,0 1,95 1,9 1,8 1,6Na2CO3 (mL) 5 5 5 5 5Reagen Folin-Ciocalteu (mL) 1 1 1 1 1Inkubasi pada 37oC (menit) 30 30 30 30 30
Diukur absorbansinya pada panjang gelombang λmaks
Konsentrasi tirosin (µM) 0 6,875 13,75 27,5 55,0
4.1.8.2.Penentuan Aktivitas Ekstrak Protease Kasar
Metode penentuan aktivitas enzim diperoleh dari Anson (dalam
Esmelrada, 2008) yang telah dimodifikasi. Dua buah tabung sentrifugasi
disiapkan. Tabung 1 digunakan untuk penentuan aktivitas protease sampel
(ekstrak protease kasar), sedangkan tabung 2 digunakan untuk larutan blanko.
20
Sebanyak 2,5 mL larutan kasein 0,65% (b/v) di pra-inkubasi pada suhu
37oC selama 4 menit dalam tabung 1. Setelah 4 menit, sebanyak 0,5 mL ekstrak
protease kasar ditambahkan ke dalam tabung 1, lalu campuran ini divortex dan
inkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit. Pada akhir inkubasi reaksi hidrolisis
dihentikan dengan menambahkan 2,5 mL larutan TCA 0,11 M, setelah itu
campuran divortex dan didiamkan selama 5 menit. Campuran selanjutnya
sentrifugasi pada kecepatan 7000 rpm selama 10 menit hingga terbentuk dua
lapisan yaitu endapan dan supernatan. Supernatan yang diperoleh dari tabung 1
ditentukan kadar tirosinnya secara kolorimetrik.
Sebagai blanko, sebanyak 2,5 mL larutan kasein 0,65% (b/v) dimasukkan
kedalam tabung 2 dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit. Setelah 30
menit, 2,5 mL larutan TCA 0,11 M ditambahkan ke dalam tabung 2 dan divortex.
Ke dalam campuran tersebut ditambahkan 0,5 mL ekstrak protease kasar dan
didiamkan selama 5 menit. Campuran selanjutnya disentrifugasi pada kecepatan
7000 rpm selama 10 menit hingga terbentuk dua lapisan. Lapisan supernatan yang
diperoleh selanjutnya ditentukan kadar tirosinnya secara kolorimetrik. Larutan
blanko ini berfungsi sebagai pengkoreksi kemungkinan adanya tirosin bebas yang
bukan merupakan hasil hidrolisis protein selama 30 menit waktu inkubasi dan
senyawa lain yang menyerap pada panjang gelombang berdekatan dengan λmaks.
Penentuan kadar tirosin secara kolorimetrik dilakukan dengan
menggunakan reagen Folin-Ciocalteau. Masing-masing sebanyak 1,0 mL
supernatan yang didapatkan dari tabung 1 dan tabung 2 ditempatkan dalam tabung
baru yang berbeda. Setelah itu, ke dalam masing-masing tabung ditambahkan 2,5
mL Na2CO3 0,5 M lalu divortex serta didiamkan selama 10 menit. Selanjutnya
campuran ditambahkan 0,5 mL reagen Folin-Ciocalteau lalu campuran dibiarkan
selama 30 menit. Setelah 30 menit, larutan dibaca absorbansinya menggunakan
spektrofotometer UV-Vis pada λmaks. Data absorbansi diplotkan pada kurva standar
tirosin untuk mengetahui konsentrasi tirosin hasil hidrolisis yang terdapat pada
tabung 1 dan tabung 2. Konsentrasi tirosin dalam sampel yang telah didapatkan
selanjutnya digunakan untuk menentukan kadar tirosin (µmol). Tabel 3.2
menunjukkan tahap penambahan/perlakuan dalam penentuan aktivitas protease.
Tabel 4.2 Tahap penambahan/perlakuan dalam penentuan aktivitas protease.
Penambahan/perlakuanTabung 2(Blanko)
Tabung 1(Sampel)
Kasein 0,65% (b/v)(telah dipra-inkubasi) 2,5 mL 2,5 mLEkstrak protease kasar 0,5 mL 0,5 mLDiinkubasi pada suhu 37oC 30 menit 30 menitTCA 0,11 M 2,5 mLa 2,5 mLb
Didiamkan 5 menit 5 menitDisentrifugasi 7000 rpm 10 menit 10 menitSupernatan yang akan ditentukan kadar tirosinnya 1,0 mL 1,0 mLNa2CO3 0,5 M 2,5 mL 2,5 mLReagen Folin-Ciocalteau 0,5 mL 0,5 mL
Diukur absorbansinya pada λmaks
Keterangan : a menunjukkan larutan tersebut dimasukkan sebelum penambahan ekstrak proteasekasar, sedangkan b menunjukkan larutan tersebut dimasukkan sesudah penambahan ekstrakprotease kasar.
Aktivitas protease (U/mL) dinyatakan dalam unit aktivitas, yaitu satu unit
(U) dinyatakan sebagai jumlah enzim yang dapat menghidrolisis substrat (kasein)
dan menghasilkan warna setara dengan 1 µmol produk tirosin (181 µg) setiap
menit waktu inkubasi pada kondisi percobaan tersebut.
1 ( ) =Aktivitas protease (U/mL) ditentukan dengan menggunakan rumus yaitu:
22
Aktivitas protease (U/mL) = ××Keterangan :
= total volume yang digunakan dalam uji aktivitas protease sampel (meliputi
volume kasein 1%, estrak protease kasar dan TCA) (5,5 mL)
= volume sampel ekstrak protease kasar yang digunakan ( 0,5 mL)
= volume supernatan yang digunakan dalam penentuan kadar tirosin secara
kolorimetrik ( 1 mL)
t = waktu inkubasi (30 menit)
BAB 5HASIL DAN PEMBAHASAN
5.1 Determinasi Sampel Tanaman
Hasil deteminasi yang dilakukan oleh Balai Konservasi Tumbuhan Kebun
Raya ‘Eka Karya’ Bali-LIPI menunjukkan tanaman pepaya, talas, labu siam dan
lidah buaya yang digunakan dalam penelitian ini berturut-turut termasuk ke
dalam jenis Carica papaya L., Xantosoma sagittifolium (L.) Schott, Sechium
edule (Jacq.) Sw. dan Aloe vera (L.) Burm.f. Bukti hasil determinasi ditunjukkan
pada Lampiran 1. Determinasi tanaman penting dilakukan untuk memastikan
ketepatan pemilihan tanaman yang digunakan sebagai sampel dalam penelitian
ini.
5.2.Ekstraksi Protease Kasar dari Getah Tanaman Pepaya, Talas, LabuSiam, Lidah Buaya
Ekstraksi protease kasar dari getah tanaman, diawali dari pengumpulan
sampel getah atau yang sering disebut dengan proses penyadapan. Proses
penyadapan getah tanaman harus disesuaikan dengan karakteristik tanaman yang
akan disadap, hal ini disebabkan perbedaan jumlah getah yang diproduksi oleh
tanaman satu dengan yang lainnya. Berikut merupakan proses penyadapan getah
tanaman pepaya, talas dan labu siam yang dilakukan dalam penelitian ini.
24
Pengumpulan sampel getah pepaya relatif lebih mudah dilakukan
dibandingkan dengan tanaman talas dan labu siam, hal ini disebabkan tanaman
pepaya memproduksi relatif lebih banyak getah dibandingkan keempat tanaman
lainnya. Gambar 5.1 menunjukkan cara penampungan getah pepaya yang menetes
dari luka buah pepaya muda.
Gambar 5.1 Cara penampungan getah dari buah pepaya muda
Pengumpulan getah umbi (talas), buah (labu siam) dan daun (lidah buaya) harus
dilakukan dengan bantuan pisau stainles steel, hal ini disebabkan getah dari ketiga
tanaman ini tidak menetes. Cara pengaplikasian pisau stainles steel untuk
mengumpulkan getah pada permukaan tanaman setelah dibelah ditunjukkan pada
Gambar 5.2.
(a) (b) (c)Gambar 5.2 Cara pengumpulan getah talas (a), labu siam (b) dan lidah buaya (c)
dengan pisau stainles steel
Ekstrak protease kasar selanjutnya disimpan dalam termos es untuk
meminimalkan denaturasi enzim. Proses pengambilan sampel getah dan
ekstraksinya pada masing-masing getah dilakukan sebanyak tiga kali pengulangan.
Ekstrak protease masing-masing getah tanaman ditunjukkan oleh Gambar 5.3.
Tabel 5.1 Karakteristik getah tanaman pepaya, labu siam, talas, dan lidah buaya hasilpenyadapan
Getah Tanaman Karakteristik getah yang teramati
Pepaya Putih susu, tidak kental, mudah mengering
Talas Putih keunguan, kental, mudah mengering
Labu Siam Tidak berwarna, tidak kental, mudah mengering
Lidah Buaya Bening kekuningan, kental, tidak mudah mengering
(a) (b)
(c) (d)Gambar 5.3 Ekstrak protease kasar getah tanaman pepaya (a), talas (b),
labu siam (c) dan lidah buaya (e)
Ciri - ciri ekstrak protease kasar getah tanaman pepaya, talas, labu siam, dan lidah buaya
ditunjukkan dalam Tabel 5.2.
Tabel 5.2 Ciri fisik ekstrak protease kasar getah tanaman
Ekstrak Protease Kasar GetahTanaman
Ciri fisik yang teramati
PepayaTidak berwarna, bening, tidak kental, tidakberbuih
TalasBerwarna putih keunguan, keruh, tidak kental,tidak berbuih
Labu Siam Tidak berwarna, bening, tidak kental, berbuih
Lidah Buaya Berwarna orange, keruh, kental, tidak berbuih
26
5.2.Pengujian Aktivitas Ekstrak Protease Kasar Getah Tanaman Pepaya,Talas dan Labu Siam
Sebelum melakukan uji aktivitas ekstrak protease kasar getah tanaman,
dilakukan penentuan panjang gelombang maksimum larutan standar tirosin dan
pembuatan kurva standar tirosin. Panjang gelombang maksimum ditentukan
dengan mengukur absorbansi larutan standar tirosin 55,0 µM dari panjang
gelombang 500 nm hingga 900 nm, panjang gelombang yang memberikan
absorbansi tertinggi digunakan sebagai panjang gelombang maksimum. Panjang
gelombang maksimum (λ maks) tirosin yang didapatkan yaitu 729,6 nm dengan
absorbansi 0,6811. Spektrum UV-Vis pada penentuan panjang gelombang
maksimum ditunjukkan pada Lampiran 2.
Pada pembuatan kurva standar tirosin, konsentrasi standar divariasikan
menjadi 6,875; 13,75; 27,5 dan 55,0 µM. Persamaan regresi linier kurva standar
tirosin adalah 0,0123x + 0,0102, dengan koefisien regresi linier 0,9995. Kurva
standar tirosin dapat dilihat pada Gambar 5.4
Gambar 5.4 Kurva standar tirosin
Jumlah asam amino (tirosin) hasil hidrolisis digunakan untuk menentukan
aktivitas protease getah tanaman. Semakin banyak tirosin hasil hidrolisis maka
y = 0,0123x + 0,0102r = 0,9995
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0 10 20 30 40 50 60
Abs
orba
nsi
Konsentrasi (µM)
semakin besar aktivitas protease ekstrak protease kasar getah tanaman atau
semakin banyak pula molekul protein yang dipecah menjadi monomer
penyusunnya. Tirosin yang terbentuk dipisahkan dari protein enzim dan sisa
substrat dengan melakukan sentrifugasi, setelah itu supernatan yang dihasilkan
dapat ditentukan konsentrasinya (µM) tirosin secara kolorimetrik pada λ maks
(729,6 nm) dengan menggunakan reagen Folin-Ciocalteu dalam kondisi basa. Nilai
absorbansi yang didapatkan lalu dikolerasikan terhadap kurva standar tirosin.
Banyaknya molekul tirosin (µmol) selanjutnya dihitung dengan mengkonversikan
konsentrasi tirosin hasil hidrolisis (µM). Jumlah tirosin sebelum inkubasi, sesudah
inkubasi dan hasil hidrolisis dapat dilihat pada Tabel 5.3.
Jumlah tirosin sampel (setelah inkubasi) rata-rata, ekstrak protease kasar getah
pepaya sebesar 0,8268 ± 0,0441 mol, talas sebesar 0,0378 ± 0,0005 mol, labu
siam sebesar 0,0507 ± 0,0034 mol. Jumlah tirosin sampel rata-rata jika diurutkan
dari yang terbesar hingga terkecil yaitu getah pepaya, labu siam dan talas. Jumlah
tirosin sampel sangat mempengaruhi besarnya aktivitas protease kasar getah,
semakin besar perbedaannya dengan jumlah tirosin blanko maka semakin besar
pula aktivitas proteasenya.
Jumlah asam amino (tirosin) hasil hidrolisis digunakan untuk menentukan
aktivitas protease getah tanaman. Semakin banyak tirosin hasil hidrolisis maka
semakin besar aktivitas protease ekstrak protease kasar getah tanaman atau
semakin banyak pula molekul protein yang dipecah menjadi monomer
penyusunnya. Tirosin yang terbentuk dipisahkan dari protein enzim dan sisa
substrat dengan melakukan sentrifugasi, setelah itu supernatan yang dihasilkan
dapat ditentukan konsentrasinya (µM) tirosin secara kolorimetrik pada λ maks
(729,6 nm) dengan menggunakan reagen Folin-Ciocalteu dalam kondisi basa. Nilai
absorbansi yang didapatkan lalu dikolerasikan terhadap kurva standar tirosin.
28
Banyaknya molekul tirosin (µmol) selanjutnya dihitung dengan mengkonversikan
konsentrasi tirosin hasil hidrolisis (µM). Pada penelitian ini kondisi basa dicapai
dengan penambahan Na2CO3 0,5 M. Jumlah tirosin sebelum inkubasi, sesudah
inkubasi dan hasil hidrolisis dapat dilihat pada Tabel 5.3.
Tabel 5.3 Jumlah tirosin sebelum inkubasi, sesudah inkubasi dan hasil hidrolisis
GetahTanaman
PengulanganJumlah tirosin ( mol)
Sebelum Inkubasi(Blanko)
Sesudah Inkubasi(Sampel)
Hasil Hidrolisis
Pepaya 1 0,3323 0,8528 0,52052 0,3137 0,7759 0,46223 0,3284 0,8518 0,5234
Rata-rata 0,3248 ±0,0098 0,8268 ± 0,0441 0,5020 ± 0,0345
Talas 1 0,0316 0,0376 0,00602 0,0315 0,0375 0,00603 0,0302 0,0384 0,0082
Rata-rata 0,0311 ± 0,0008 0,0378 ± 0,0005 0,0067 ± 0,0013
Labu Siam 1 0,0386 0,0531 0,01452 0,0356 0,0522 0,01663 0,0341 0,0468 0,0127
Rata-rata 0,0361 ± 0,0023 0,0507 ± 0,0034 0,0146 ± 0,0019
Lidah Buaya 1 0,1090 0,1001 -0,00892 0,1013 0,0967 -0,00463 0,1045 0,0886 -0,0159
Rata-rata 0,1049 ± 0,0038 0,0951 ± 0,0059 -0,0098 ± 0,0057
Tabel 5.4 Hasil uji aktivitas ekstrak protease kasar getah tanaman
Jenis GetahTanaman
PengulanganAktivitas ProteasePermililiter Getah(U/mL)
Rata-Rata AktivitasProtease PermililiterGetah (U/mL)
Pepaya 1 0,9542 0,9194 ± 0,06272 0,84703 0,9570
Talas 1 0,0110 0,0123 ± 0,00232 0,01103 0,0150
Labu Siam 1 0,0266 0,0264 ± 0,00302 0,02933 0,0233
Lidah Buaya 1 -0,0163 -0,0179 ± 0,01042 -0,00843 -0,0291
Hasil pengujian aktivitas ekstrak protease kasar getah tanaman pepaya, talas,
labu siam, dan lidah buaya ditunjukkan pada Tabel 5.4. Hasil uji aktivitas protease
ekstrak protease kasar getah pepaya, talas, labu siam dan lidah buaya menunjukkan
bahwa getah pepaya, talas dan labu siam memiliki aktivitas protease yang
besarnya berturut-turut 0,9194 ± 0,0627 Unit/mL; 0,0123 ± 0,0023 Unit/mL; dan
0,0264 ± 0,0030 Unit/mL. Bila diurutkan aktivitas keempat getah tanaman yang
terbukti memiliki aktivitas protease dari aktivitas tertinggi ke aktivitas rendah
berturut-turut yaitu getah pepaya, getah labu siam dan getah talas. Namun ekstrak
protease kasar getah lidah buaya tidak menunjukkan adanya aktivitas protease
bahkan aktivitas proteasenya memiliki nilai minus yaitu -0,0179 ± 0,0104
Unit/mL. Hal ini disebabkan karena jumlah tirosin sesudah inkubasi (sampel) lebih
sedikit dibandingkan jumlah tirosin sebelum inkubasi (blanko) atau semakin lama
waktu inkubasi maka semakin berkurang jumlah tirosin yang terdapat dalam
campuran. Berkurangnya tirosin selama waktu inkubasi dalam penentuan aktivitas
protease ekstrak kasar lidah buaya kemungkinan dapat disebabkan oleh adanya
aktivitas enzim tirosinase yang mungkin ada dalam ekstrak protease kasar getah
lidah buaya. Berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan oleh Pinilih (2012),
tepung lidah buaya pada konsentrasi rendah memilki peran sebagai aktivator
aktivitas enzim tirosinase. Peran lidah buaya sebagai aktivator aktivitas enzim
inilah yang menyebabkan meningkatnya aktivitas tirosinase dalam penentuan
aktivitas getah lidah buaya pada penelitian ini. Tirosinase merupakan enzim yang
mengkatalisa reaksi pembentukan melanin dari molekul tirosin. Gambar 5.6
menunjukkan reaksi sintesis melanin dari tirosin oleh bantuan tirosinase.
Dari empat tanaman bergetah gatal yang diuji aktivitasnya pada
penelitian ini, tiga diantaranya terbukti memiliki aktivitas protease, ketiga getah
30
tersebut yaitu getah pepaya, labu siam, dan talas, sedangkan lidah buaya tidak
menunjukkan adanya aktivitas protease. Hal ini menunjukkan bahwa getah
tanaman yang dapat menyebabkan rasa gatal berpotensi memiliki aktivitas
protease. Seperti yang telah diketahui sebelumnya bahwa iritasi kulit yang
disebabkan oleh protease selanjutnya dapat memicu terjadinya rasa gatal pada kulit
(Lavinka dan Dong, 2013). Namun, rasa gatal yang disebabkan oleh getah
tanaman dapat disebabkan pula oleh senyawa iritan lainnya seperti asam oksalat
(Koswara, 2013), enzim selain protease (enzim amilase, lipase, urease, selulase,
katalase) (Cleapss, 2007) dan lainnya. Kandungan enzim pada lidah buaya
meliputi alkaline fosfatase, amilase, karboksipeptidase, katalase, siklooksidase,
siklooksigenase, lipase dan okidase (Hamman, 2008). Enzim-enzim yang terdapat
dalam getah lidah buaya ini yang menjadi menyebabkan rasa gatal.
Gambar 5.6 Sintesis melanin (Canovas et al., 1982)
5.2.Perbandingan Aktivitas Protease Getah Tanaman Talas dan Labu Siamterhadap Getah Pepaya
Berdasarkan hasil uji aktivitas protease getah tanaman pepaya, talas dan labu
siam maka persentase perbandingan aktivitas protease getah tanaman talas, labu
siam, relatif terhadap getah pepaya ditunjukkan oleh Tabel 5.5.
Tabel 5.5 Perbandingan aktivitas protease getah tanaman talas dan labu siam terhadapgetah pepaya
Getah tanaman yang dibandingkan terhadapgetah pepaya
Perbandingan aktivitas
Talas(1 : 74,75)
Labu siam (1 : 34,82)
Perbandingan aktivitas protease getah labu siam dan getah talas terhadap
getah pepaya berturut-turut hanyalah (1 : 34,82) dan (1 : 74,75), walaupun
aktivitas protease kedua getah tanaman ini kecil namun ketersediaan tanaman ini
sangat melimpah. Badan Pusat Statistik (2013) menyatakan bahwa produksi labu
siam dari tahun 2000 hingga tahun 2012 mengalami peningkatan dan menurut
Kementerian Perdagangan Republik Indonesia (2013), Indonesia merupakan salah
satu produsen talas dunia. Melimpahnya produksi talas dan labu siam
menyebabkan kedua tanaman ini berpotensi sebagai sumber protease alternatif.
Hal ini juga didukung dari nilai aktivitas protease getah talas (0,0123 U/mL) atau
labu siam (0,0264 U/mL) yang mendekati nilai aktivitas protease relatif getah
tanaman sodom apple (Calotropis procera (Ait.) R.Br. (Asclepiadaceae)) yang
hanya sebesar 0,052 U/mL. Tanaman sodom apple merupakan tanaman yang
sering digunakan dalam proses pengendapanan susu (milk clotting) atau
pembuatan keju (Oseni and Ekperigin, 2013).
32
BAB 7KESIMPULAN DAN SARAN
7.1 Simpulan
Berdasarkan hasil penelitian dan pembahasan menghasilkan simpulan sebagai
berikut :
1. Hasil pengujian aktivitas protease dengan metode Anson menunjukkan bahwa
getah tanaman talas dan labu siam positif memiliki aktivitas protease,
sedangkan lidah buaya menunjukkan hasil negatif.
2. Berdasarkan hasil perhitungan diperoleh aktivitas protease dari tanaman talas
dan labu siam yaitu 0,0123 U/mL dan 0,0264 U/mL .
3. Dengan demikian getah tanaman talas dan labu siam dapat digunakan sebagai
sumber protease alternatif dengan rasio perbandingan aktivitas protease
terhadap getah pepaya berturut-turut sebesar (1 : 74,75) dan (1 : 34,82).
7.2 Saran
Berdasarkan hasil penelitian dapat disarankan beberapa hal sebagai berikut:
1. Perlu penelitian lebih lanjut tentang kondisi optimum aktivitas protease getah
tanaman talas dan labu siam.
DAFTAR PUSTAKA
Agrawal, A.A., and Konno, K., 2009, Latex: A Model for Understanding Mechanisms,Ecology, and Evolution of Plant Defense Against Herbivo, Annual Review odEcology, Evolution, and Systematics, 40:311-331
Borde, V., Pawar, D., and Thorat, D., 2013, Detection of protease from latex producingplant by X-ray film by DOT-BLOT method, International Journal of CurrentMicrobiology and Applied Sciences Vol II No. 12, 369-375
Daffy, 2013, Manfaat Lidah Buaya untuk Kesehatan Kulit,<http://www.infokesehatankulit.com/2013/01/manfaat-lidah-buaya-untuk-kesehatan.html>,diakses tanggal 2 Desember 2013
Elfi, 2011, Pemurnian Protease dari Daun Mengkudu (Morinda citrifolia L.),Tesis, IPB, Bogor.
Hopkins, W.G., dan Norman, P.A.H., 2004, Introduction to plant physiology 3rdEdition, John Wiley & Sons, Inc., USA
Lavinka, P.C., and Dong, X., 2013, Molecular signaling and targets from itch: lessonsfor cough, BioMed Central, 1-13
Lehninger, A.L., 1990, Dasar-dasar Biokimia Jilid 1, a.b. Thenawidjaja, M., Erlangga,Jakarta
Liggieri, C., Obregon, W., Trejo, S., and Priolo, N., 2009, Biochemical analysis of apapain-like protease isolated from the latex of Asclepiascurassavica L., ActaBiochim Biophys Sin, Vol 4, 154-162
Mehrnoush, A., Mustafa, S., Sarker, M.Z.I., and Yazid, A.M.M.Y., 2011, Optimizationof the Conditions for Extraction of Serine Protease from Kesinai Plant(Streblus asper) Leaves Using ResponseSurface Methodology, Molecules, 16,9245-9260
Oseni, O.A., and Ekperigin, M.M., 2013. Distribution of proteolytic and milk clottingenzymes in the plant of Sodom apple Calotropis procera (Ait.) R.Br.(Asclepiadaceae), International Journal of Biotecnology Research Vol I(2),024-027
Pinilih, Putri, 2012, Pengaruh Tepung Lidah Buaya (Aloe Vera Linn.) TerhadapAktivitas Enzim Tirosinase, Tesis, Institut Pertanian Bogor, Bogor
Puig, A., Gil, I., and Sanchez, O., 2008, Evaluation of Drying Techniques MeasuringProteolyticActivity of Papain Obtained from Unripe Fruit and Skin Juice,Chemical Engineering Transaction, Vol. 14, 345-350
Rao, M.B., Tanksale, A.M., Ghatge, M.S., and Deshpande, V.V., 1998, Molekular andBiotecnological Aspect of Microbial Protease, Microbiology and Molecular
34
Biology Riviews, 597-635
Sutandi, C., 2003, Analisis Potensi Enzim Protease Lokal, Skripsi, Institut PertanianBogor, Bogor
Vierstra, RD., 1996, Proteolysis in plants: mechanism and functions, Plant Mol Biol, 32: 275
Williams, D.C., Sgarbieri, V.C., and Whitaker, J.R., 1968, Proteolitic Activity in theGenus Ficus, Plant Physiol, 43, 1083-1088
Witono, Y., 2008, Deklorofilasi Ekstrak Protease dari Tanaman Biduri (Calotropisgigantea) dengan Absorban Celite, Berk. Penel Hayati, 13, 115-121
LAMPIRAN
Lampiran 1. Foto Instrumen yang digunakan (Inkubator)
36
Lampiran 2.Personalia Tenaga Peneliti
1. Ketua Peneliti
a. Nama lengkap dan Gelar : Ketut Ratnayani, Si.Si., M.Si.
b. NIDN : 0009067105
c. Instansi Asal : Jurusan Kimia FMIPA UNUD
d. Bidang Ilmu : Kimia/ Bidang minat Biokimia
e. Alokasi Waktu : 10 jam/minggu
f. Uraian Tugas : -Penyusunan Proposal
-Evaluasi danPembahasan hasil
-Penyusunan Laporan
- Penyusunan Publikasi
2. Anggota Peneliti I :
a. Nama lengkap dan Gelar : A.A.I.A. Mayun Laksmiwati, Si.Si., M.Si.
b. NIDN : 0008056702
c. Instansi Asal : Jurusan Kimia FMIPA UNUD
d. Bidang Ilmu : Kimia/ Bidang minat Biokimia
e. Alokasi Waktu : 5 jam/minggu
f. Uraian Tugas : -Penyusunan Proposal
-Analisis Sampel
-Penyusunan Laporan
3. Mahasiswa Yang Terlibat
a. Nama lengkap dan Gelar : A.A.Ayu Septri Juwarni
b. NIM : 1008105010
c. Instansi Asal : Jurusan Kimia FMIPA UNUD
d. Bidang Ilmu : Kimia/ Bidang minat Biokimia
e. Alokasi Waktu : 5 jam/minggu
f. Uraian Tugas : -Pengumpulan Sampel
-Pembuatan Reagen/Bahan Penelitian
-Analisis Sampel, Penyusunan Laporan
38
Lampiran 3Publikasi (Jurnal Kimia, ISSN 1907-9850)
UJI AKTIVITAS PROTEASE GETAH LABU SIAM DAN TALAS SERTAPERBANDINGANNYA TERHADAP GETAH PEPAYA
Ketut Ratnayani, A.A. Ayu Septri Juwarni, A.A.I.A. Mayun Laksmiwati dan I.G.A. Kunti SriPanca Dewi
Jurusan Kimia, FMIPA Universitas Udayana, Bukit Jimbarane-mail : [email protected]
ABSTRAKGetah pepaya (Carica papaya L.) yang dikenal luas sebagai sumber protease (papain) dapatmenimbulkan rasa gatal jika bersentuhan dengan kulit. Beberapa getah tanaman lain yang dapatmenimbulkan rasa gatal yaitu getah labu siam dan talas yang diduga kuat memiliki kandunganenzim protease. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan uji aktivitas protease pada getahtanaman talas (Xantosoma sagittifolium (L.) Schott) dan labu siam (Sechium edule (Jacq.) Sw.),serta melakukan perbandingan aktivitasnya terhadap getah pepaya. Sampel getah talasdikumpulkan dari umbi, sedangkan labu siam dan pepaya diambil dari buah. Uji aktivitasprotease dilakukan secara spektrofotometri (metode Anson) menggunakan substrat kasein.Hasil pengujian aktivitas protease menunjukkan bahwa getah talas dan labu siam positifmengandung protease namun dengan nilai aktivitas yang lebih rendah daripada getah pepaya,yaitu masing-masing sebesar 0,0123 U/mL dan 0,0264 U/mL. Sehingga getah tanaman talas danlabu siam berpotensi sebagai sumber protease alternatif. Perbandingan aktivitas protease tersebutterhadap getah pepaya berturut-turut (1 : 74,75) dan (1 : 34,82).
Kata kunci : getah labu siam, getah talas, getah pepaya, protease.
ABSTRACTPapaya (Carica papaya L.) latex has been used commercially as a protease (papain) sources.However it can cause itching on the skin. Some other latex plant that caused itching like taro andchayote, are strongly predicted to have protease component. The research aimed to determine theprotease activity of plants latex of taro (Xantosoma sagittifolium (L.) Schott and chayote(Sechium edule (Jacq.) Sw.). Those latex then were compared with papaya latex. Latex ofpapaya and taro were collected from fruit, while latex of chayote were collected from corm. Theassay of protease activity was based on spectrofotomeric methods (Anson’s method) usingcasein as substrat.The result of protease activity assay showed that taro and chayote latex positively containsprotease but their activities were less than papaya latex that is 0.0123 U/mL and 0.0264 U/mL. Itcan be concluded that taro and chayote latex were potential as alternative protease sources, theratio of protease activity the latex with papaya latex were (1 : 74.75) dan (1 : 34.82).
Keywords : chayote latex, taro latex, papaya latex, protease
PENDAHULUANDi Indonesia, penelitian tentang penggunaan getah sebagai sumber protease masih relatif
belum banyak dilakukan, sedangkan isolasi protease pada getah lebih sederhana dan efisien. Halini disebabkan isolasi protease getah yang termasuk enzim ekstraseluler, dapat dilakukan tanpapemecahan sel tumbuhan maupun penggerusan jaringan tumbuhan. Selain itu, protease yangterkandung pada getah memiliki aktivitas yang relatif lebih tinggi dibandingkan bagiantumbuhan lainnya. Hal ini didasarkan oleh penelitian yang dilakukan oleh Oseni and Ekperigin(2013) yang mendapatkan bahwa getah Calotropis procera memiliki aktivitas protease yanglebih tinggi dibandingkan akar, batang muda, batang tua, daun, dan buahnya. Chaiwut et al.(2007) melaporkan bahwa aktivitas spesifik protease getah pepaya yaitu 4,95 U/mg dan kulitpepaya yaitu 1,07 U/mg. Getah merupakan emulsi lengket yang keluar dari jaringan tanaman
yang terluka dan secara umum mengandung terpenoid, alkaloid, protein, fenolik, proteaseinhibitor, protease, kitinase, lektin (Agrawal and Konno, 2009), asam amino, vitamin, dankarbohidrat (Vierstra, 1996).Getah pepaya merupakan salah satu sumber papain (protease) yang banyak digunakan dalamberbagai industri (Rani et al., 2012). Kandungan enzim getah pepaya yang telah diketahuimeliputi papain, kemopapain, glutamin siklotranferase, simopapain, lisosim, dan peptidase(Khrisna et al., 2008). Getah pepaya dapat menyebabkan rasa gatal bila bersentuhan dengankulit. Protease yang terkandung dalam buah nanas (bromelain) (Ramalingam et al., 2012) dangetah mangga yang telah dilaporkan memiliki kandungan serin dan sistein protease (Saby et al.,2003 dalam Agrawal and Konno, 2009) juga memiliki ciri yang mirip dengan pepaya yaitu dapatmenyebabkan rasa gatal.Reaksi gatal yang disebabkan getah tanaman pepaya, nanas, dan mangga, kemungkinan besardisebabkan oleh keberadaan protease, hal ini didukung oleh beberapa protease yang telahdiisolasi dari getah pepaya (Sigma-P3375, 2013), nanas (Sigma-B4882, 2013), dan getah pinus(Sigma-F6008, 2013) dapat menyebabkan iritasi pada mata, kulit dan sistem pernafasan. Adanyarasa gatal akibat terjadinya iritasi yang disebabkan oleh protease (Lavinka dan Dong, 2013),maka perlu dilakukan uji aktivitas protease terhadap getah beberapa tanaman yang memilikigetah penyebab rasa gatal seperti labu siam dan talas serta perbandingannya dengan aktivitasprotease getah pepaya.
MATERI DAN METODEBahan PenelitianBahan yang digunakan meliputi sampel getah (tanaman labu siam, talas dan pepaya), AsamTrikloroasetat (TCA) 0,11 M, KH2PO4 0,05 M, K2HPO4 0,05 M, kasein 0,65% (b/v), Na2CO3
0,5 M, reagen Folin-Ciocalteau dan aquades. Pada pengukuran secara kolorimetrik (denganspektrofotometer Uv-Vis digunakan L-tirosine sebagai larutan standar.
Alat PenelitianAlat –alat yang digunakan meliputi peralatan gelas, alat sentrifugasi, pH meter, vortex, lemaripendingin, termos es, botol vial, neraca analitik, pipet mikro, botol semprot, spatula, pisaustainles steel, inkubator dan spektrofotometer UV-Vis.
Cara KerjaPengambilan Sampel Getah
Getah pepaya diperoleh dengan melukai buah pepaya muda dengan menggunakan pisaustainles steel pada kedalaman 1-2 mm, getah yang menetes keluar segera ditampung denganbotol vial. Untuk getah tanaman talas dan labu siam diperoleh dari membelah umbi talas danbuah labu siam. Setelah itu, getah diambil dengan bantuan pisau stainles steel. Sebagai upayameminimalkan efek oksidasi dan denaturasi protein, sampel getah disimpan dalam termos es.
Preparasi Ekstrak Protease KasarSetiap 1 mL sampel getah tanaman ditambah 4 mL buffer fosfat 0,05 M (pH 7,0),
setelah itu campuran ini disentrifugasi selama 10 menit pada kecepatan 7000 rpm hinggaterbentuk dua lapisan yaitu supernatan dan residu. Supernatan yang didapatkan selanjutnyadipergunakan sebagai ekstrak protease kasar.
Uji Aktivitas ProteaseMetode Anson yang telah dimodifikasi digunakan untuk melakukan uji aktivitas
protease (Esmelrada, 2008). Dalam tabung sentrifugasi 1 (sampel), sebanyak 2,5 mL larutankasein 0,65% (b/v) di pra-inkubasi pada suhu 37oC selama 4 menit. Kasein (substrat) yang telahdiprainkubasi ini selanjutnya ditambah dengan 0,5 mL ekstrak protease kasar getah. Campuranini kemudian divortex dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37oC. Setelah 30 menit,sebanyak 2,5 mL TCA 0,11 M ditambahkan ke dalam campuran untuk menghentikan reaksihidrolisis. Campuran ini selanjutnya didiamkan selama 5 menit dan disentrifugasi selama 10menit pada kecepatan 7000 rpm. Supernatan yang dihasilkan ditentukan kadar tirosinnya secarakolorimetrik, yaitu sebanyak 1 mL supernatan direaksikan dengan 2,5 mL Na2CO3 dan 0,5 mL
40
reagen Folin-Ciocalteau. Larutan ini selanjutnya diukur absorbansinya menggunakanspektrofotometer UV-Vis pada 729,6 nm. Kadar tirosin hasil hidrolisis digunakan untukmenentukan aktivitas protease ekstrak protease kasar getah tanaman. Hal yang sama jugadilakukan pada tabung sentifugasi 2 (blanko), hanya saja penambahan TCA 0,11 M dilakukansebelum penambahan ekstrak protease kasar getah tanaman. Larutan blanko ini berfungsisebagai pengkoreksi kemungkinan adanya tirosin bebas yang bukan merupakan hasil hidrolisisselama waktu inkubasi. Aktivitas protease (U/mL) dinyatakan dalam unit aktivitas yaitu satu unit(U) dinyatakan sebagai jumlah enzim yang dapat menghidrolisis substrat dan menghasilkanwarna setara dengan 1 µmol produk tirosin (181 µg) setiap menit waktu inkubasi pada kondisipercobaan. ℎ ℎ ( ) = ( ) − ( )
1 ( ) = ℎ ℎ ( )Aktivitas protease (U/mL) = ××
Keterangan := total volume yang digunakan dalam uji aktivitas protease sampel (meliputi volume kasein
0,65%, ekstrak protease kasar dan TCA) (5,5 mL)= volume ekstrak protease kasar yang digunakan ( 0,5 mL)= volume supernatan yang dipergunakan dalam penentuan kadar tirosin secara kolorimetrik (
1 mL)t = waktu inkubasi (30 menit)
HASIL DAN PEMBAHASAN
Ekstraksi Protease KasarEkstraksi protease kasar dari getah tanaman diawali dari pengumpulan sampel getah.
Proses pengumpulan getah tanaman harus disesuaikan dengan karakteristik tanaman yang akandisadap, hal ini disebabkan perbedaan jumlah getah yang diproduksi oleh tanaman satu denganyang lainnya. Pengumpulan sampel getah pepaya relatif lebih mudah dilakukan dibandingkandengan tanaman talas dan labu siam, hal ini disebabkan tanaman pepaya memproduksi relatiflebih banyak getah. Sampel getah tanaman pepaya, labu siam dan talas yang didapatkan dalampenelitian ini berturut –turut berwarna putih susu, bening (tak berwarna), dan putih keunguan.Proses ekstraksi protease kasar dari sampel getah dilakukan dengan menambahkan buffer fosfatpH 7 dan disentrifugasi 7000 rpm selama 10 menit hingga terbentuk dua lapisan yaitu residu dansupernatan. Lapisan residu harus dipisahkan dari supernatan karena lapisan ini sebagian besarkomponen selain protein. Lapisan supernatan yang diperoleh selanjutnya digunakan sebagaiekstrak protease kasar. Ciri- ciri ekstrak protease kasar getah tanaman pepaya, talas, dan labusiam dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Ciri fisik ekstrak protease kasar getah tanaman yang teramatiEkstrak Protease Kasar GetahTanaman
Ciri fisik yang teramati
Pepaya Tidak berwarna, bening, tidak kental, tidak berbuihTalas Berwarna putih keunguan, keruh, tidak kental, tidak berbuihLabu Siam Tidak berwarna, bening, tidak kental, berbuih
Tabel 1 menunjukkan bahwa selain berasal dari sumber yang berbeda, masing- masingekstrak protease kasar getah tanaman yang didapatkan dalam penelitian ini memiliki juga ciriyang berbeda. Hal ini menunjukkan bahwa kemungkinan komponen kimia yang terkandungdalam ekstrak protease kasar getah tanaman pepaya, labu siam, dan talas juga berbeda.
Pengujian Aktivitas Ekstrak Protease KasarUji aktivitas protease (metode Anson) memanfaatkan kasein 0,65% sebagai substrat.
Ekstrak protease kasar masing–masing getah tanaman diuji aktivitas proteasenya dengan caramereaksikan kasein dengan ekstrak protease getah dalam inkubator selama 30 menit, pH 7 dansuhu 37oC. Setelah 30 menit, reaksi hidrolisis kasein dihentikan dengan penambahan TCA.Setelah reaksi terhenti, dilakukan sentrifugasi untuk memperoleh supernatan yang mengandungtirosin. Kadar tirosin ditentukan secara kolorimetrik pada pH basa dengan menggunakan reagenFolin-Ciocalteu. Kondisi basa dalam penelitian ini dicapai dengan penambahan Na2CO3.Asam amino (tirosin) merupakan salah satu komponen alami penyusun getah tanaman (Vierstra,1996). Oleh karena itu, tirosin hasil hidrolisis (tirosin yang dihasilkan selama 30 menit waktuinkubasi) ditentukan kadarnya dengan mengurangi kadar tirosin setelah inkubasi (sampel)dengan kadar tirosin sebelum inkubasi (blanko). Kadar tirosin sebelum inkubasi, sesudahinkubasi dan hasil hidrolisis dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Kadar tirosin sebelum inkubasi, sesudah inkubasi dan hasil hidrolisis
GetahTanaman
PengulanganKadar tirosin ( mol)Sebelum Inkubasi(Blanko)
Sesudah Inkubasi(Sampel)
Hasil Hidrolisis
Pepaya 1 0,3323 0,8528 0,52052 0,3137 0,7759 0,46223 0,3284 0,8518 0,5234Rata-rata 0,3248 ±0,0098 0,8268 ± 0,0441 0,5020 ± 0,0345
Talas 1 0,0316 0,0376 0,00602 0,0315 0,0375 0,00603 0,0302 0,0384 0,0082Rata-rata 0,0311 ± 0,0008 0,0378 ± 0,0005 0,0067 ± 0,0013
Labu Siam 1 0,0386 0,0531 0,01452 0,0356 0,0522 0,01663 0,0341 0,0468 0,0127Rata-rata 0,0361 ± 0,0023 0,0507 ± 0,0034 0,0146 ± 0,0019
Kadar tirosin sebelum inkubasi (blanko) getah pepaya, talas, dan labu siam berturut-turut0,3248 mol; 0,0311 mol; dan 0,0361 mol menunjukkan bahwa ekstrak protease kasar getahtanaman secara alami telah mengandung tirosin bebas (sebelum dilakukan uji aktivitas protease),yang mana bila diurutkan dari kadar tirosin yang terbesar hingga terkecil berturut – turut yaitugetah pepaya, labu siam, dan talas. Kadar tirosin sampel merupakan total tirosin setelah inkubasiyang meliputi jumlah tirosin sebelum inkubasi dan jumlah tirosin hasil hidrolisis selamainkubasi. Getah pepaya, talas, dan labu siam memiliki kadar tirosin sampel berturut-turut 0,8268
mol; 0,0378 mol; dan 0,0507 mol. Semakin besar selisih kadar tirosin sampel terhadap kadartirosin blanko, maka semakin besar kadar tirosin hasil hidrolisis. Kadar tirosin hasil hidrolisisgetah tanaman dengan kadar tertinggi hingga terendah berturut-turut getah pepaya (0,5020
mol), labu siam (0,0146 mol), dan talas (0,0067 mol). Kadar tirosin hidrolisis secara tidaklangsung mencerminkan aktivitas protease, yang mana semakin tinggi kadar tirosin hasilhidrolisis maka semakin tinggi pula aktivitas protease getah tanaman.
Hasil pengujian aktivitas ekstrak protease kasar getah tanaman pepaya, talas, dan labusiam berturut-turut 0,9194 U/mL; 0,0123 U/mL; dan 0,0264 U/mL seperti yang ditunjukkanpada Tabel 3. Perbedaan nilai aktivitas protease getah tanaman pepaya, labu siam, dan talas yangdidapatkan pada penelitian ini, kemungkinan disebabkan perbedaan kadar protease, kemampuan(sifat kinetik) masing-masing protease sebagai katalis, sifat fisik (kondisi optimum), ataupunjenis protease yang terkandung dalam getah tanaman. Aryulina, dkk (2004) menyatakan bahwasetiap jenis enzim memiliki sifat yang spesifik dan sangat dipengaruhi oleh kondisilingkungannya. Ketidaksesuaian kondisi lingkungan dapat membuat turunnya aktivitas enzim,inaktifnya enzim, dan rusaknya strukur enzim. Dengan demikian, kondisi lingkungan meliputisuhu, konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, dan pH yang digunakan pada penelitian inimemberikan pengaruh yang berbeda bagi setiap jenis protease.
42
Tabel 3. Hasil uji aktivitas protease setiap mililiter getah tanaman
Jenis GetahTanaman
PengulanganAktivitas ProteasePermililiter Getah(U/mL)
Rata-Rata AktivitasProtease PermililiterGetah (U/mL)
Pepaya 1 0,9542 0,9194 ± 0,06272 0,84703 0,9570
Talas 1 0,0110 0,0123 ± 0,00232 0,01103 0,0150
Labu Siam 1 0,0266 0,0264 ± 0,00302 0,02933 0,0233
Perbandingan Aktivitas Protease Getah Tanaman Talas, Labu Siam terhadap GetahPepaya
Berdasarkan hasil uji aktivitas protease getah tanaman pepaya, talas, dan labu siam, makarasio perbandingan aktivitas protease getah tanaman talas dan labu siam relatif terhadap getahpepaya ditunjukkan oleh Tabel 4.
Tabel 4. Rasio perbandingan aktivitas protease getah tanaman talas dan labu siam terhadap getahpepaya
Aktivitas Protease Rasio Perbandingan Aktivitas Protease
Talas : Pepaya 1 : 74,75Labu siam : Pepaya 1 : 34,82
Perbandingan aktivitas protease getah labu siam dan getah talas terhadap getah pepayaberturut-turut hanya (1 : 34,82) dan (1 : 74,75), walaupun aktivitas protease kedua getah tanamanini kecil namun ketersediaan tanaman ini sangat melimpah, sehingga kedua tanaman ini dapatdigunakan sebagai sumber protease alternatif. Hal ini juga didukung dari nilai aktivitas proteasegetah talas (0,0123 U/mL) atau labu siam (0,0264 U/mL) yang mendekati nilai aktivitas proteaserelatif getah tanaman sodom apple (tanaman yang sering digunakan dalam proses pembuatankeju) yang hanya sebesar 0,052 U/mL (Oseni and Ekperigin, 2013). Hasil perbandingan aktivitasprotease getah labu siam dan talas terhadap getah pepaya pada suhu 37oC dan pH 7 secarakeseluruhan menunjukkan bahwa getah pepaya memiliki aktivitas protease yang lebih besar.Namun, tidak menutup kemungkinan pada kondisi yang berbeda aktivitas protease getah labusiam dan talas mengalami peningkatan, mengingat tiap enzim dari sumber yang berbeda(meskipun mengkalisis reaksi yang sama) akan memiliki sifat fisik (kondisi optimum) dan sifatkinetik yang spesifik.
SIMPULAN DAN SARANSimpulan
Berdasarkan hasil penelitian, dapat disimpulkan bahwa getah talas dan labu siam positifmengandung enzim protease namun dengan nilai aktivitas yang lebih rendah daripada getahpepaya, yaitu masing-masing sebesar 0,0123 U/mL dan 0,0264 U/mL. Sehingga getah tanamantalas dan labu siam berpotensi sebagai sumber protease alternatif dengan rasio perbandinganaktivitas protease terhadap getah pepaya berturut-turut (1 : 74,75) dan (1 : 34,82).SaranPerlu penelitian lebih lanjut tentang pemurnian dan karakterisasi enzim protease getah tanamantalas dan labu siam.
UCAPAN TERIMAKASIHPenulis sampaikan ucapan terima kasih kepada LPPM UNUD atas bantuan dana yang
diberikan melalui Hibah Penelitian Dosen Muda dana DIPA-PNBP dengan Kontrak Nomor :237-46/UN14.2/PNL.01.03.00/2014 serta semua pihak yang memberi dukungan dan saranhingga penelitian ini terselesaikan dengan baik.
DAFTAR PUSTAKAAgrawal, A.A., and Konno, K., 2009, Latex: A Model for Understanding Mechanisms, Ecology,
and Evolution of Plant Defense Against Herbivo, Annual Review od Ecology, Evolution,and Systematics, 40:311-331
Aryulina, D., Muslim, C., Manaf, S., dan Winarni, E.W., 2004, Biologi 3, Erlangga, JakartaChaiwut, P., Nitsawang, S., Shank, L., and Kanasawud, P., 2007, A Comparative Study on
Properties and Proteolytic Components of Papaya Peel and Latex Proteases, Chiang MaiJ. Sci., 34(1), 109-118
Esmelrada, W., 2008, Optimasi Kultur pada Proses Fermentasi Kecap, Skripsi, Institut PertanianBogor, Bogor
Khrisna, K.I., Paridvani, M., and Patel, J.A., 2008, Review on nutritional, medical andpharmacological properties of Papaya (Carica papaya Linn.), Natural Product RadianceVol 7 No.4, 364-373
Lavinka, P.C., and Dong, X., 2013, Molecular signaling and targets from itch: lessons for cough,BioMed Central, 1-13
Oseni, O.A., and Ekperigin, M.M., 2013. Distribution of proteolytic and milk clotting enzymesin the plant of Sodom apple Calotropis procera (Ait.) R.Br. (Asclepiadaceae),International Journal of Biotecnology Research Vol I(2), 024-027
Ramalingam, C., Srinath, R., and Islam, N.N., 2012. Isolation and Characterization of Bromelainfrom Pineapple (Ananas Comosus) and Comparing its Anti-browning Activity on AppleJuice with Commercial Anti-browning Agents, Elixir Food Science, 45, 7822-7826
Rani, K., Rana, R., and Datt, S., 2012, Review on Latest Overview of Protease, InternationalJournal Of Current Life Sciencs, Vol 2, 12-18
Sigma-B4882, 2013, Saftey Data Sheet ,<http://www.sigmaaldrich.com/MSDS/MSDS/DisplayMSDSPage.do?country=ID&language=en&productNumber=B4882>, diakses tanggal 2Desember 2013
Sigma-F6008, 2013, Saftey Data Sheet, <http://www.sigmaaldrich.com/MSDS/MSDS/DisplayMSDSPage.do?country=ID&language=en&productNumber=F6008>, diakses tanggal 2Desember 2013
Sigma-P3375, 2013, Saftey Data Sheet, <http://www.sigmaaldrich.com/MSDS/MSDS/DisplayMSDSPage.do?country=ID&language=en&productNumber=P3375>, diakses tanggal 2Desember 2013
Vierstra, RD., 1996, Proteolysis in plants: mechanism and functions, Plant Mol Biol, 32 : 275
44
Lampiran 4. Hasil Penentuan Panjang Gelombang Maksimum
Lampiran 5. Pembuatan Kurva Standar Tirosin
46
Standar x (μ ) y (Absorbansi) x2 y2 xyBlanko 0 0 0 0 0
1 6,875 0,0955 47,26563 0,009120 0,6565632 13,75 0,1909 189,0625 0,036443 2,6248753 27,5 0,3505 756,2500 0,122850 9,6387504 55,0 0,6824 3025,000 0,465670 37,53200∑ n = 5 ∑ x = 103,125 ∑ y = 1,3193 ∑ x2 = 4017,578 ∑ y2 = 0,634083 ∑ xy = 50,45219
= ∑ = 103,1255 = 20,6250= ∑ = , = 0,2639
b = ∑ − ∑ ∑∑ 2− (∑ )2 =. , , . ,. , ( , ) = , ,, ,
b = , , = 0,0123
= += − = 0,2639 – (0,0123 x 20,6250) = 0,2639 – 0,2537 = 0,0102
Jadi persamaan regresi liniernya yaitu y = 0,0123x + 0,0102
Koefisien regresi linier (r) :
r =∑ ∑ ∑[ ∑ (∑ ) ] × [ ∑ (∑ ) ]
r =. , , . ,[ . , ( , ) ] ×[ . , ( , ) ]
r =, ,[ , , ]×[ , , ] = ,√ , × ,
r =,√ , = ,, = 0,9995
Lampiran 6. Perhitungan Aktivitas Protease Getah Tanaman
1. Getah Pepaya
Hasil pengukuran absorbansi
Keterangan Pengulangan Absorbansi Absorbansi Rata-Rata
S11 0,6647
0,66792 0,66953 0,6696
SB11 0,2774
0,26572 0,25133 0,2683
S21 0,6257
0,60672 0,59513 0,5992
SB21 0,2563
0,25142 0,27323 0,2246
S31 0,6604
0,66502 0,66723 0,6673
SB31 0,2514
0,25272 0,24263 0,2641
Keterangan :S1 : Sampel getah pepaya pengulangan 1S2 : Sampel getah pepaya pengulangan 2S3 : Sampel getah pepaya pengulangan 3SB1 : Blanko sampel getah pepaya pengulangan 1SB2 : Blanko sampel getah pepaya pengulangan 2SB3 : Blanko sampel getah pepaya pengulangan 3
a. Contoh perhitungan nilai aktivitas protease getah pepaya pada pengulangan 1
Diketahui : Abs S1 = 0,6679
Abs SB1 = 0,2657
Faktor pengenceran : = = 4V total = Vt = 4 mL= 4 x 10-3 L
y = 0,0123x + 0,0102
x =,,
48
[S1] =,, = , ,, x 4
= ,, 4 = 53,3008 x 4 = 213,2032 µM
mol tirosin S1 = [S1] x Vt = 213,2032 µM x 4 x 10-3 L = 0,8528 mol
[SB1] =,, = , ,, x 4
= ,, 4 = 20,7723 x 4 = 83,0892 µM
mol tirosin SB1 = [SB1] x Vt = 83,0892 µM x 4 x 10-3 L = 0,3323 mol
mol tirosin hasil hidrolisis pengulangan 1 = mol tirosin S1 - mol tirosin SB1
= 0,8528 mol – 0,3323 mol
= 0,5205 mol
Aktivitas protease ekstrak protease kasar getah pepaya (k):
U = = , mol = 0,01735 Unit
k =×× = , × ,, × = , ., . = 0,19085 U/mL
Aktivitas protease permililiter getah pepaya :
Diketahui : V getah = 1 mL
V buffer fosfat= 4 mL
Aktivitas protease getah pepaya = k ×= 0,19085 U/mL x
= 0,9542 U/mL
Dengan cara yang sama, maka aktivitas protease getah pepaya pengulangan 1, 2 dan 3 yaitu:
Pengulangan Aktivitas Protease (U/mL)1 0,95422 0,84703 0,9570
Rata-rata 0,9194
2. Aktivitas Protease Getah Talas
Hasil pengukuran Absorbansi
Keterangan :S1 : Sampel getah talas pengulangan 1S2 : Sampel getah talas pengulangan 2S3 : Sampel getah talas pengulangan 3SB1 : Blanko sampel getah talas pengulangan 1SB2 : Blanko sampel getah talas pengulangan 2SB3 : Blanko sampel getah talas pengulangan 3
.Pengulangan Aktivitas Protease (U/mL)1 0,01102 0,01103 0,0150
Rata-rata 0,0123
3. Aktivitas Protease Getah Labu Siam
Keterangan Pengulangan Absorbansi Absorbansi Rata-Rata
S11 0,1235
0,12582 0,12683 0,1272
SB11 0,1006
0,10752 0,10773 0,1141
S21 0,1257
0,12542 0,12143 0,1291
SB21 0,1032
0,10702 0,10793 0,1099
S31 0,1239
0,12832 0,12913 0,1318
SB31 0,1017
0,10302 0,10683 0,1004
Keterangan Pengulangan Absorbansi Absorbansi Rata-Rata
S11 0,1771
0,17352 0,17253 0,1710
SB11 0,1360
0,12902 0,12223 0,1289
50
Keterangan :S1 : Sampel getah labu siam pengulangan 1S2 : Sampel getah labu siam pengulangan 2S3 : Sampel getah labu siam pengulangan 3SB1 : Blanko sampel getah labu siam pengulangan 1SB2 : Blanko sampel getah labu siam pengulangan 2SB3 : Blanko sampel getah labu siam pengulangan 3
Pengulangan Aktivitas Protease (U/mL)1 0,02662 0,02933 0,0233
Rata-rata 0,0264
S21 0,1642
0,17072 0,17103 0,1768
SB21 0,1187
0,11972 0,12053 0,1199
S31 0,1538
0,15402 0,15173 0,1565
SB31 0,1099
0,11522 0,12713 0,1087
REKAPITULASI PENGGUNAAN DANA PENELITIAN 100%
Judul : Skrining Aktivitas Protease Pada Getah TanamanTalas, Labu Siam dan Pepaya SertaPerbandingannya dengan Getah Pepaya.
Skema Hibah : Dosen Muda (PNBP)Peneliti/PelaksanaNama Ketua : Ketut Ratnayani, S.Si., M.Si.PerguruanTinggi : Universitas UdayanaNIDN : 0009067105Nama Anggota (1) : A.A.I.A.Mayun Laksmiwati, S.Si., M.Si.Nama Anggota (2) : -Tahun Pelaksanaan : 2014Dana Tahun Berjalan : Rp.10.000.000,-Dana Mulai Diterima Tanggal : 14-8-2014
Rincian Penggunaan1.HONOR OUTPUT
KEGIATANItem Honor Volume Satuan Honor/Jam Total1. Honor Ketua (100%) 100 Jam Rp 5.000 Rp 500.0002.Honor Anggota 1 (100%) 90 jam Rp 5.000 Rp 450.0003. Mahasiswa (100%) 90 jam Rp 5.000 Rp 450.000
Sub Total : Rp 1.400.0002. BELANJA BAHANItem Bahan Volume Satuan Harga Satuan TotalBiaya sewa alat Spektrofotometer 80 kali Rp 5.000 Rp 400.000Reagen Folin 100 mL Rp 8.060 Rp 806.000Kasein 1000 mgram Rp 1.445 Rp 1.445.000Tirosin 50 gram Rp 26.700 Rp 1.335.000Na2HPO4 50 gram Rp 37.570 Rp 187.000NaH2PO4 50 gram Rp 46.420 Rp 231.200NaOH 30 gram Rp 1.750 Rp 52.500Na2CO3 15 gram Rp 2.200 Rp 33.000TCA 100 gram Rp 7.085 Rp 708.500Aquades 15 liter Rp 2.000 Rp 30.000Es Batu 13 blok Rp 1.000 Rp 13.000Aquabides 2 Liter Rp 30.000 Rp 60.000Biaya Pengumpulan dan Pembelian
Bahan Tanaman 5 Kg Rp 12.500 Rp 62.500Pembelian alat kecil habis pakai Rp 74.000
Sub Total : Rp 5.437.7003.BELANJA BARANG NON
OPERASIONAL Volume Satuan Harga Satuan TotalPajak 15% dari 100% 0,15 persen Rp 10.000.000 Rp 1.500.000Determinasi Tanaman 4 jenis Rp 25.000 Rp 100.000
52
Sub Total : Rp 1.600.0004.BELANJA PERJALANAN
LAINNYA Volume Satuan Harga Satuan TotalBiaya Perjalanan Ke Bedugul 2 kali Rp 125.000 Rp 250.000Biaya Pengumpulan Bahan
Tanaman 5 kali Rp 50.000 Rp 250.000Sub Total : Rp 500.000
5. LAIN-LAIN Volume Satuan Harga Satuan TotalBiaya Perawatan Peralatan
Laboratorium 50 kali Rp 6.000 Rp 300.000Biaya Pertemuan Tim 3 kali Rp 50.000 Rp 150.000Biaya Penyusunan Jurnal
Ilmiah(Publikasi) 1 kali Rp 200.000 Rp 300.000Biaya Penyusunan Laporan
Kemajuan & Akhir 12 kali Rp 25.000 Rp 300.000Sub Total : Rp 1.050.000TOTAL : Rp 9.987.700
Denpasar, 24 Nopember 2014Mengetahui,Ketua Lembaga Penelitian dan Ketua Peneliti,Pengabdian Kepada MasyarakatUniversitas Udayana
(Prof. Dr. Ir. I Nyoman Gde Antara, M.Eng) (Ketut Ratnayani, S.Si., M.Si)NIP:196408071992031002 NIP:197106091997022001
