LAPORAN PRAKTIKUM MATAKULIAH FITOPATOLOGI

PEMBUATAN PREPARAT NEMATODA

Oleh :

Isnainy Dinul Mursyalati Yus

A352150021

Diampuh oleh Dosen :

Dr. Supramana

Asisten praktikum :

Hagia Sophia Khairani

MAYOR FITOPATOLOGI

DEPARTEMEN PROTEKSI TANAMAN

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

1. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Nematoda merupakan kelompok hewan yang mempunyai ukuran mikron

sehingga tidak dapat diamati dengan mata secara langsung dan hanya dapat diamati

dengan menggunakan mikroskop. Untuk dapat mengamati nematoda, maka harus

dilakukan isolasi atau ekstraksi nematoda dari habitatnya di tanah. Nematoda yang

ada dalam tanah perlu dilakukan pengamatan dan teknik tertentu agar nematoda bisa

diamati, baik dalam keadaan hidup atau mati, serta bersifat parasit ataupun non

parasit.

Penggunaan preparat dapat berupa preparat asli yakni preparat yang

menggunakan bagian yang masih hidup, atau dapat berupa preparat dalam bentuk

awetan. Preparat nematoda digunakan untuk mengamati struktur dan morfologi

nematoda, baik nematoda parasit maupun non parasit. Pembuatan preparat untuk

nematoda dimaksudkan karena ukuran tubuh nematoda yang sangat kecil dan rentan

hancur bila tidak segera diamati.

Nematoda parasit tanaman dapat diekstrak dari tanah dan tanaman dengan

banyak cara. Tipe nematoda tertentu atau pada bagian khusus tanaman, ada beberapa

metode lebih efektif daripada yang lain. Ada banyak cara yang dapat digunakan

untuk mengisolasi nematoda dari habitatnya, yakni teknik corong Bearmann, teknik

inkubasi akar, teknik maserasi atau filtrasi, teknik penyabutan, teknik penyaringan,

teknik dua botol Erlenmeyer, teknik ilustrasi (M. Luc, 1988).

1.2 Tujuan

Tujuan dari praktikum ini adalah untuk mengetahui metode pembuatan

preparat semi-permanen nematoda.

2. METODE

2.1 Waktu dan Tempat

Praktikum fitopatologi untuk materi nematoda dilaksanakan pada tanggal 8

Oktober 2015 di Laboratorium Pendidikan Departemen Proteksi Tanaman Fakultas

Pertanian Institut Pertanian Bogor.

2.2 Bahan dan Alat

Bahan yang digunakan dalam praktikum ialah suspensi hasil ekstraksi

nematoda, larutan FAA, parafin dan tisu. Sedangkan alat yang digunakan dalam

praktikum ialah mikroskop, kaca preparat dan cover glass, cup borer, glass wool, alat

pancing nematoda, pipet serta kamera.

2.3 Metode Pengamatan

Metode yang digunakan dalam praktikum ini, yaitu :

Siapkan suspensi hasil ekstraksi nematoda yang telah difiksasi

Buat lingkaran parafin dengan menggunakan cup borer yang telah dipanaskan kemudian tempelkan ke kaca preparat. Tunggu beberapa detik, lalu tetesi larutan

FAA (1 tetes)

Pancing/packing beberapa ekor nematoda (3-5 ekor nematoda) dengan posisi

anteriornya sejajar satu sama lainnya.

Susun glass wool pada 3 bagian. Hal ini untuk memudahkan pengamatan nematoda nantinya.

Tutup kaca preparat dengan cover glass. Panaskan kaca preparat tersebut diatas api bunsen atau pada

alat hot plate. Setelah parafin mencair tunggu beberapa detik sampai nantinya parafin akan

menutup pinggiran dari kaca preparat.

Catat hasil identifikasi dan dokumentasikan

3. HASIL DAN PEMBAHASAN

Nematoda parasit tanaman akan berkembang didalam air, yang juga didalam

tanah atau dalam tanaman, untuk bergerak dan menjadi tidak aktif atau mati bila tidak

ada air. Beberapa spesies masuk ke dalam fase dorman ketika kekurangan atau

temperaturnya menurun dan dan bertahan hidup pada jangka waktu yang lama di

beberapa kondisi. Hal inilah yang menyebabkan perlu dilakukannya pembuatan preparat

pada nematoda. Dengan pembuatan preparat permanen nematoda, banyak pengamatan

yang dapat dibuat dalam struktur bias seperti bagian kepala, saluran pencernaan, lubang

ekresi dan spikula (Ravichandra, 2014).

Umumnya dalam ilmu taksonomi, spesimen nematoda akan diawetkan secara

permanen dalam gliserol, yang diletakkan diantara dua penutup preparat dalam preparat

aluminium Cobbs atau diatas kaca preparat dengan ditutup penutup preparat. Keduanya,

dengan penggunaan kaca fiber yang diameternya cocok, berguna untuk

menjaga/melindungi spesimen nematoda dari tekanan yang diakibatkan oleh penutup

preparat (Huang et al., 1984). Dalam pelaksanaan praktikum, digunakan kaca preparat

sebagai tempat pengawetan nematoda. Menghindari adanya tekanan yang ditimbulkan

oleh kaca penutup kaca preparat, maka digunakannya glass wool sebagai penahan

sehingga spesimen nematoda terhindar dari tekanan yang dapat menyebabkan struktur

spesimen rusak.

(a)

Penggunaan parafin dalam pembuatan preparat semi-permanen yang dilakukan

pada praktikum, berfungsi sebagai pembatas sampel nematoda sehingga nematoda tetap

pada posisi yang mudah untuk diamati. Sesuai dengan Huang et al., 1984, yang

menyatakan bahwa ketebalan lingkaran parafin yang cocok dapat digunakan tidak hanya

untuk penyangga penutup kaca preparat, tetapi juga untuk menahan nematoda tetap pada

posisi yang diinginkan.

Gambar 1. (a) Preparat aluminium Cobbs (b) kaca preparat dan (c) penutup kaca preparat (cover glass)

(b)

(c)

Fiksasi nematoda menggunakan larutan FAA (formalin-acetic acid-alcohol).

Larutan FAA terdiri dari bahan formalin komersil (37-40% formaldehid) sebanyak 2,4

ml, glacial acetic acid sebanyak 1,6 ml, ethyl alcohol 95% sebanyak 60 ml dan aquabides

sebanyak 80 ml. Formalin (4-5%) merupakan salah satu bahan yang paling sering

digunakan sebagai fiksatif. Efeknya terjadi pengerasan dan menyebabkan nematoda

sedikit menyusut. Kombinasi bahan menjadikan efek sebaliknya, seperti asam asetat dan

asam propionat, yang digunakan untuk menetralkan efek penyusutan yang berlebihan

(van Bezooijen, 2006).

Nematoda yang mati, struktur internalnya seperti organ kelamin bisa terhalangi

oleh permukaan granular dari usus. Nematoda dapat dibersihkan dengan menggunakan

laktofenol atau bisa juga dengan gliserol (Hooper, 1990 dalam Ravichandra, 2014).

Persiapan preparat permanen lebih mudah pada nematoda yang telah difiksasi dan

dipindahkan ke gliserin. Ada berbagai tipe preparat dan penyangga, tetapi umumnya

parafin digunakan pada kaca penutup preparat sebagai penyegel dan pemisah (van

Bezooijen, 2006).

Teknik dengan menggunakan gliserin merupakan teknik preparat permanen. Ada

dua metode dengan menggunakan gliserin, yakni pertama dengan metode gliserin-etanol

(Seinhorst, 1959 dalam van Bezooijen, 2006), yang mana dengan metode ini nematoda

dikeringkan dan diinfiltrasi dengan gliserin menggunakan dua larutan. Metode ini

memakan waktu dan digunakan untuk memindahkan individu nematoda yang akan

dijadikan awetan permanen.

Metode kedua yaitu dengan metode gliserin-formalin (Bongers, 1993 dalam van

Bezooijen, 2006), yang mana nematoda lebih dahulu di proses dalam formalin selama 6

minggu hingga menjadi keras. Setelah itu, gliserin murni ditambahkan untuk

mendapatkan campuran gliserin-formalin dengan perbandingan 1:1. Metode ini,

utamanya, digunakan secara bersamaan dalam memindahkan beberapa nematoda untuk

jadi awetan. Hasil awalnya menunjukkan bahwa metode langsung menghasilkan gambar

atau foto yang baik tetapi belum diketahui hasil dari penyimpanan jangka panjang

(struktur nematoda masih bisa dilihat dengan baik atau tidak).

Metode lainnya yakni pada pengawetan pada parineal patterns. Parineal patterns

merupakan salah satu karakteristik dalam mempelajari dan mengidentifikasi

Meloidogyne spp. Pada pengawetan ini digunakan laktofenol-cotton blue untuk menutupi

awetan. Pengawetan lainnya yakni pengawetan pada nematoda kista (Vulva cone of cyst

nematodes). Terlepas dari bentuk dan warna, identifikasi nematoda kista juga didasarkan

pada struktur vulva dan fenestra, serta sekeliling struktur internal dan eksternal.

Penggunaan awetan lainnya pada pengawetan melintang pada bagian tubuh nematoda

mulai pada bagian kepala hingga posterior (van Bezooijen, 2006).

Pengawetan semi permanen bisa dengan menggunakan air. Nematoda hidup lebih

mudah diidentifikasi dan dipelajari dalam media air. Dengan menggunakan air, sejumlah

struktur tubuh, seperti ujung mulut, saluran pencernaan dan lubang eksresi dapat terlihat

dengan mudah di kaca preparat, dengan cincin parafin. Penyegelan dilakukan dengan cat

kuku atau lilin (van Bezooijen, 2006). Selain itu, pada pengawetan semi permanen juga

bisa menggunakan laktofenol. Tahapan dalam penggunaan laktofenol hampir sama

dengan proses yang dilakukan dengan menggunakan gliserin. Bedanya, pemindahan

nematoda ke dalam laktofenol harus dilakukan dengan cepat. Setelah pemindahan

nematoda kedalam setetes laktofenol pada kaca preparat, kaca preparat dipanaskan dalam

pada hot plate selama setengah jam pada suhu 30ºC.

Hasil pengamatan yang dilakukan pada preparat semi-permanen, yaitu :

No. Dokumentasi Uraian

1. Tampak anterior :

Tampak posterior :

a. Bibir set off

b. Terdapat stilet yang cukup tebal

c. Stilet berbentuk stomatostilet

d. Anulasi halus

e. Bentuk ekor rounded

Klasifikasi nematoda yang ditemukan:

Kingdom : Animalia

Phylum : Nematoda

Class : Secernentea

Subclass : Diplogasteria

Ordo : Tylenchida

Famili : Pratylenchidae

Genus : Radopholus

a

b

d e

e

c

d

2. Tampak anterior :

Tampak posterior :

a. Bibir set off

b. Terdapat stilet yang cukup kuat

c. Stilet berbetuk stomatostilet

d. Anulasi halus

e. Overlapping ke arah ventral

f. Bentuk ekor rounded

Klasifikasi nematoda yang ditemukan:

Kingdom : Animalia

Phylum : Nematoda

Class : Secernentea

Subclass : Diplogasteria

Ordo : Tylenchida

Famili : Pratylenchidae

Genus : Radopholus

a

b,c

de

f

4. KESIMPULAN

Didapatkan kesimpulan yakni penggunaan preparat permanen mendapatkan hasil

yang baik (mudah untuk diidentifikasi dan gambar nampak jelas). Akan tetapi hingga

saat ini preparat permanen belum diketahui jangka waktu penyimpanannya. Sedangkan

pada praktikum penggunaan preparat semi-permanen memiliki kelebihan mudah dalam

pembuatannya dan realtif singkat dalam pengerjaannya. Hanya saja tidak dapat bertahan

lama dalam penyimpanan (cepat rusak). Dari hasil identifikasi nematoda saat praktikum,

didapat nematoda dari genus Radopholus. Hal ini karena kenampakan morfologinya

hampir menyerupai morfologi dari genus tersebut.

DAFTAR PUSTAKA

Huang, C. S. Bittencourt, C. Silva Mota E. F. S. 1984. Preparing Nematode Permanent Mounts with Adhesive Tapes. Journal of Nematology 16 (3): 341-342.

van Bezooijen, J. 2006. Method and Techniques for Nematology (revised version).

Ravichandra, N. G. 2014. Horticultural Nematology. DOI: 10.1007/978-81-322-1841-8