Isolasi DNA Darah

1. Tujuan

Mengisolasi DNA dari darah vena dengan menggunakan kit Wizard genomic DNA

purification.

2. Alat dan Bahan

a. Alat

1.) Microcentrifuge tube 1,5 ml

2.) Micropipet 0,5-10 µl, 10-100 µl, 100-1000 µl

3.) Tip biru

4.) Tip kuning

5.) Tip putih

6.) Vortex

7.) Microcentrifugator

8.) Inkubator

9.) Spuit disposable 5 ml

b. Bahan

1.) Wizard ® Genomic DNA Purification Kit 100 isolations All 20, yang terdiri dari :

a.) Cell Lysis Solution

b.) Nuclei Lysis Solution

c.) Protein Precipitation Solution

d.) DNA Rehydration Solution

e.) Rnase Solution

2.) Isopropanol

3.) Alkohol 70 %

4.) Heparin

5.) Darah Vena 5 ml

3. Cara Kerja

Ada empat (4) tahap dalam proses isolasi/purifikasi DNA dari sel:

a. Melisiskan sel dengan cell Lysis Solution

b. Melisiskan inti sel dengan Nuclei Lysis Solution, kemudian (optional)

menguraikan/merusakan molekul RNA dengan Rnase solution.

c. Mempresipitasikan protein dengan Protein Precipitation Solution.

d. Mengkonsentrasikan DNA genom yang diperoleh.

Urutan Cara Kerja :

1.) Masukan 900 µl Cell Lysis Solution ke dalam tabung microcentrifuge steril.

2.) Tambahkan 300 µl darah dan tabung diputar bolak-balik 5-6 kali untuk homogenasi.

3.) Inkubasi campuran di atas selama 10 menit dalam suhu ruang (bolak-balik 2-3 kali

selama inkubasi).

4.) Sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm pada suhu ruang selama 2 menit.

5.) Buang supernatan tanpa mengganggu pellet.

6.) Tambahkan 600 µl Cell Lysis Solution ke pellet dan vortex sebentar.

7.) Ulangi tahap 4 dan 5 sampai pellet terlihat putih.

8.) Tambahkan 300 µl Nuclei Lysis Solutio ke pellet. Pipet larutan 5-6 kali untuk

melisiskan sel darah putih dan inti sel. Larutan harus benar-benar jadi kental. Jika

masih terlihat butiran-butiran kecil setelah pencampuran, inkubasi campuran tersebut

pada suhu 37 o C sampai butiran tersebut hilang.

9.) Optional : Tambahkan 1,5 µl Rnase Solution dan campurkan dengan cara membolak

balik tabung. Inkubasi campuran pada suhu 37 o C selama 15 menit, lalu dinginkan

pada suhu ruang.

10.) Tambahkan 100 µl Protein Precipitation Solution ke dalam lisate dan vortex selama

20 detik. Setelah divortex, akan terlihat butiran-butiran protein halus.

11.) Sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 4 menit pada suhu ruang. Akan

terlihat pellet dengan warna cokelat terang. Bila supernatan masih berwarna cokelat,

ambil supernatan tersebut, pindahkan ke tabung microcentrifuge bersih, ulangi langkah

10 dan 11.

12.) Pindahkan supernatan ke dalam tabung microcentrifuge bersih yang sudah berisi 1 ml

isopropanol.

13.) Bolak balik tabung secara perlahan sampai terlihat benang-benang putih halus (DNA).

14.) Untuk optimalisasi, simpan tabung pada suhu - 20 o C selama 1 jam.

15.) Sentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm pada suhu ruang selama 3 menit. Akan

terlihat pellet putih.

16.) Buang supernatan, cuci dengan 400 µl alkohol 70 % dingin.

17.) Sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 3 menit pada suhu ruang, sampai

DNA berubah menjadi transparan.

18.) Buang supernatan, kering anginkan DNA pada suhu ruang.

19.) Larutkan DNA dengan 100 µl Rehydration Solution.

20.) Rehidrasi DNA pada suhu 65 o C selama 1 jam atau pada suhu 4 o C overnight.

21.) Simpan DNA pada suhu – 20 o C.

Deoxyribonucleic acid (DNA) isolasi adalah proses ekstraksi DNA dari berbagai sumber. Sumber untuk isolasi DNA sangat beragam. Pada dasarnya dapat diisolasi dari organisme hidup atau mati. Sumber-sumber umum untuk isolasi DNA meliputi seluruh darah, rambut, sperma, tulang, kuku, jaringan, noda darah, air liur, bukal (pipi) kapas, sel epitel, urin.

Metode yang digunakan untuk mengisolasi DNA tergantung pada sumber, umur, dan ukuran sampel. Meskipun berbagai metode yang digunakan ada beberapa kesamaan di antara mereka. Secara umum, mereka bertujuan untuk menyajikan DNA terpisah dalam inti sel dari komponen seluler lainnya.

Isolasi DNA biasanya dimulai dengan lisis atau rusaknya jaringan atau sel. Proses ini sangat penting untuk penghancuran struktur protein dan memungkinkan untuk pelepasan asam nukleat dari inti. Lisis dilakukan dalam larutan garam, deterjen yang mengandung protein denaturasi atau protease (enzim mencerna protein), seperti proteinase K. Hal ini mengakibatkan kerusakan sel dan melarutkan membran. Isolasi DNA adalah sebuah proses yang sederhaSejumlah kit pemurnian DNA menggunakan prinsip-prinsip komersial yang sama tapi reagen berbeda. Dalam kit komersial solusi lisis umum mengandung: natrium klorida, trometamin (juga dikenal sebagai Tris), yang merupakan buffer untuk mempertahankan pH konstan, asam ethylenediaminetetraacetic (EDTA) yang mengikat ion logam, dan natrium sulfat dodesil (SDS) yang adalah deterjen. Sebuah enzim yang umum digunakan dalam ekstraksi DNA adalah proteinase K.

Metode tertua pemurnian DNA di laboratorium, masih sering digunakan juga, mengandalkan campuran pelarut organik. Sampel yang sudah lisis dicampur dengan fenol, kloroform, dan isoamylalcohol untuk pemisahan DNA dan protein. Protein didenaturasi dengan campuran organik. Ketika sampel disentrifugasi, DNA dipertahankan dalam air lapisan, fenol di bagian bawah tabung, dan protein didenaturasi membentuk antarmuka berawan. Metode ini sangat efisien, tetapi sayangnya hanya dapat digunakan jika jumlah bahan awal cukup melimpah. Selain itu, pelarut organik yang digunakan membawa masalah kesehatan dan keselamatan. Kualitas DNA dari prosedur ini biasanya tidak cukup untuk beberapa teknik analitis lebih sensitif (terutama sequencing dan kadang-kadang PCR).

Sebuah modifikasi metode menggunakan garam tinggi (natrium klorida, NaCl) konsentrasi untuk menurunkan DNA. Setelah denaturasi protein selular yang menggunakan deterjen dan protease untuk beberapa jam atau semalam, garam ditambahkan dan dicampur dengan solusinya. Akibatnya, garam asam nukleat terbentuk dan di hadapan alkohol dapat dipulihkan dengan sentrifugasi.

Kadang-kadang, denaturasi alkali sampel digunakan untuk melepaskan DNA dari sel. Usapan bukal dan kadang-kadang noda darah dapat ditempatkan dalam tabung plastik kecil (eppendorfs) dan mengalami denaturasi dengan sodium hidroksida (NaOH). Solusi tersebut kemudian kembali ke pH netral ekuilibrasi dengan larutan buffer lebih asam dan siap untuk PCR. Meskipun metode yang cepat dan sederhana, kualitas DNA tidak selalu cukup untuk semua aplikasi.

Sebuah metode yang mirip dengan basa denaturasi adalah denaturasi panas, dicapai dengan merebus sampel. Pemanasan sampel untuk 100 ° C DNA rilis ke solusi, tetapi juga denaturasi dengan memisahkan kedua untai. Dalam beberapa kasus prosedur ini memberikan asam nukleat yang memadai yang dapat diamplifikasi dengan PCR. Namun, sebagian besar

masih ada sisa inhibitor dalam bentuk protein terdegradasi, senyawa organik lainnya, atau ion.

Sebuah metode terkait digunakan di laboratorium forensik umumnya menggunakan resin pertukaran ion Chelex yang mengikat ion logam multivalent dan ini bermanfaat dalam menghilangkan inhibitor dari DNA. Hal ini dapat digunakan dengan semua jenis sampel, termasuk darah utuh, noda darah, noda mani, kapas bukal, atau bulu. Satu-satunya perbedaan dari metode sebelumnya adalah adanya resin, yang mengikat kotoran dari solusi, sedangkan DNA yang tertinggal dalam solusi. Dengan pemusingan sampel, resin dibawa ke pellet dan terpisah.

Metode lain yang mirip dengan Chelex bergantung pada penggunaan manik-manik paramagnetik dengan kapasitas pengikatan DNA. Sampel yang lisis dan kemudian bahan padat diperlakukan dengan proteinase K. Lisat kemudian diaplikasikan ke manik-manik. Resin selanjutnya dicuci dan DNA eluen itu pada 65°C, manik-manik magnetik dipisahkan dari sampel di atas meja magnetik.

Metode lainnya untuk pemurnian DNA melibatkan berbagai macam kolom, yang dikemas dengan pertukaran ion, atau resin berbasis silika atau matriks. Kolom pertukaran Ion umumnya bermuatan positif untuk mengikat DNA bermuatan negatif; matriks silika juga diisi dan juga dapat mempertahankan DNA. Dalam aplikasi seperti DNA dari lisat seluler diharapkan untuk mengikat ke kolom. Kolom ini kemudian dicuci menggunakan solusi garam untuk menghapus materi terikat. Asam nukleat kemudian pulih dengan menggunakan air atau larutan garam pH netral untuk memecah ikatan resin-DNA.

Penggunaan kolom memungkinkan peningkatan throughput sampel, waktu yang lebih singkat dibandingkan dengan isolasi ekstraksi pelarut berbasis tradisional, peningkatan hasil panen DNA pulih, dan peningkatan kualitas DNA dimurnikan.

Selain kolom dan resin telah dijelaskan sebelumnya, ada juga resin cair yang digunakan. Prinsipnya adalah sama seperti untuk manik-manik magnetik, tapi pada langkah terakhir sampel harus berputar ke DNA terpisah dari resin.

Semua metode ini berhasil digunakan di berbagai laboratorium dan dengan berbagai contoh. Metode harus benar dipilih untuk mengoptimalkan hasil dan kualitas DNA diekstraksi.

  http://www.moleculardevices.com/pages/reagents/picopure_dna.html