BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Transformasi adalah penyisipan materi genetik eksternal yang berupa

fragmen DNA, baik DNA kromosom maupun DNA plasmid ke dalam sel.

Transformasi bakteri mula‐mula diperkenalkan oleh Frederick Griffith pada tahun

1982, berdasarkan kenyataan bahwa suatu bakteri dapat melepaskan fragmen

DNA‐nya ke dalam suatu medium yang kemudian akan masuk ke dalam sel

bakteri yang laindalam kultur tersebut. Di alam, fragmen DNA tersebut biasanya

dilepaskan oleh sel bakteri yang mati atau mengalami autolisis. Namun, terdapat

sel lain yang ternyata memang melepaskan fragmen DNA pada saat pertumbuhan

karena adanya gen tra.

Pada percobaan ini, akan dilakukan transformasi pada E. coli yang sensitif

terhadap ampisilin dengan plasmid yang mengandung gen resisten ampisilin. Jika

transformasi yang dilakukan berhasil dengan baik, maka E. coli tersebut akan

mengekspresikan gen resisten ampisilin sehingga dapat bertahan hidup pada

media yang mengandung ampisilin.

1.2 Tujuan Praktikum

1.2.1 Mengetahui tahapan transformasi plasmid pLGO yang mengandung

gen GFP pada transforman berupa bakteri E. Coli

1.2.2 Mengetahu prinsip kerja transformasi plasmid pGLO.

1.2.3 Mengasah keterampilan bekerja dalam bidang molekuler.

1.3 Rumusan Masalah

Berdasarkan tujuan yang tercantum, rumusan masalah yang dapat

dikemukakan meliputi :

1.3.1 Bagaimana tahapan transformasi plasmid pLGO yang mengandung

gen GFP pada transforman berupa bakteri E. Coli?

1.3.2 Bagaimana prinsip kerja transformasi plasmid?

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Transformasi

Transformasi DNA dapat terjadi secara alami maupun buatan.

Transformasi secara alami, biasanya terjadi pada sebagian siklus hidup setiap

mikroorganisme khususnya bakteri. Terjadi trasnformasi secara alami berkaitan

dengan konsisi kompeten sel selama sel tumbuh. Kondisi ini biasanya terjadi

menjelang fase sel stasioner dimana sel mencapai densitas tertinggi sepanjang

pertumbuhannya. Kompeten sel sangat memungkinkan DNA luar masuk kedalam

sel bakteri. Transformasi DNA secara alami, frekuensinya sangat rendah

dikarenakan adanya syarat tertentu seperti kontak antar sel, homologi dari DNA

yang bersangkutan, adanya proses modifikasi dalam inang, kondisi morfologi dan

perlunya gen khusus untuk proses konjugasi (Brown, 1986).

Selain itu juga Brown memaparkan bahwa transformasi adalah penyisipan

materi genetik eksternal yang berupa fragmen DNA, baik DNA kromosom

maupun DNA plasmid ke dalam sel. Transformasi bakteri mula‐mula

diperkenalkan oleh Frederick Griffith pada tahun 1982, berdasarkan kenyataan

bahwa suatu bakteri dapat melepaskan fragmen DNA‐nya ke dalam suatu medium

yang kemudian akan masuk ke dalam sel bakteri yang lain dalam kultur tersebut.

Di alam, fragmen DNA tersebut biasanya dilepaskan oleh sel bakteri yang mati

atau mengalami autolisis. Namun, terdapat sel lain yang ternyata memang

melepaskan fragmen DNA pada saat pertumbuhan karena adanya gen tra. Pada

percobaan ini, akan dilakukan transformasi pada E. coli yang sensitif terhadap

ampisilin dengan plasmid yang mengandung gen resisten ampisilin. Jika

transformasi yang dilakukan berhasil dengan baik, maka E. coli tersebut akan

mengekspresikan gen resisten ampisilin sehingga dapat bertahan hidup pada

media yang mengandung ampisilin.

2.2 PCR (Polymerase Chain Reaction)

Teknik PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan teknik untuk

keperluan amplifikasi DNA secara in vitro yang seringkali mempunyai

sensitivitas dan spesifisitas tinggi. Amplifikasi DNA secara in vitro dengan PCR

terdiri atas beberapa siklus yang setiap siklusnya terdiri dari 3 tahap yaitu tahap

denaturasi, pelekatan (annealing) dan pemanjangan (elongasi). Tahap denaturasi

adalah pembentukan DNA utas tunggal dari DNA utas ganda (putusnya hidrogen

dari kedua utas tunggal DNA yang komplementer) yang umumnya terjadi pada

suhu _ 95oC. Tahap annealing yaitu pelekatan primer yang terjadi pada suhu 35-

65oC, bergantung panjang pendeknya oligonukleotida primer yang digunakan.

Sedangkan tahap pemanjangan primer terjadi sebagai hasil aktivitas polimerisasi

oleh enzim Taq polimerase, yang pada umumnya dilakukan pada suhu 70oC

(Griffin dan Griffin 1993; Madigan et al. 1997). Teknik ini banyak dilakukan

untuk keperluan deteksi atau identifikasi cepat bakteri patogen (Madigan et al.

1997).

Teknik PCR-RFLP gen 16S-rRNA dikembangkan untuk mengetahui

keragaman bakteri dengan cara mengamplifikasi gen 16S-rRNA menggunakan

primer universal domain bakteria (Marchesi et al. 1998). Adanya keragaman

genetik ini dapat dilihat dengan membandingkan profil DNA hasil amplifikasi

(dalam hal ini gen 16S-rRNA) setelah didigesti dengan enzim restriksi tertentu

(Suwanto 1995). Perbedaan profil DNA (jumlah dan ukuran pita DNA yang

terbentuk pada gel elektroforesis) menunjukkan adanya keragaman genetik.

Teknik PCR adalah suatu teknik biologi molekuler untuk memperbanyak

sekuen DNA tertentu (lebih dari 100 juta kopi) dengan waktu relatif singkat

(beberapa jam), oleh karena itu teknik ini bisa disebut amplifikasi DNA. Dengan

PCR, molekul DNA dapat diperbanyak sampai jutaan kopi dalam tabung reaksi.

Beberapa primer yang dapat digunakan untuk mengamplifikasi gen 16SrRNA

(Marchesi et al. 1998), diantaranya adalah 27f dan 149r. Namun kedua primer

tersebut belum dapat mengamplifikasi sampel bakteri yang berasal dari beragam

sumber seperti sedimen laut dalam, bakteri rongga mulut, dan bakteri yang

diisolasi dari ephiliton (bakteri yang berasosiasi dengan batu pada habitat air

mengalir). Selain itu ada pula primer 63f dan 1387r yang telah diuji coba berhasil

mengamplifikasi gen 16S-rRNA dari berbagai sumber diantaranya sedimen laut

dalam.

Karakterisasi bakteri patogen pada tingkat subspesies menjadi suatu studi

yang sangat penting untuk mempelajari segala sesuatu yang berhubungan dengan

epidemologi penyakit. Metode karakterisasi bakteri dapat dilakukan dengan

menggunakan analisis fenotip yaitu dengan mempelajari sifat fisiologis atau

biokimianya maupun analisis genotipik secara molekuler. Seringkali hasil uji

biokimia atau fisiologis tersebut sangat dipengaruhi oleh faktor lingkungan

ataupun kondisi sel itu sendiri karena perbedaan ekspresi gen. Untuk karakterisasi

galur-galur dalam suatu spesies perlu dilihat sifat yang paling mendasar dan relatif

stabil yaitu dengan analisis genotipik (Suwanto 1995). Para ahli taksonomi

mikroba dewasa ini telah mengakui bahwa analisis DNA merupakan cara terbaik

untuk karakterisasi spesies dan menentukan hubungan antara organisme yang

berbeda-beda. Secara ideal, perbandingan antara galur dalam spesies dapat

dilakukan dengan menganalisis sekuen DNA seluruh genom organisme tersebut

dan kemudian membandingkannya dengan sekuen DNA dari genom organisme

lain. Namun saat ini, cara ini kurang praktis untuk analisa secara rutin (Suwanto

1995). Secara umum metode molekuler untuk keperluan pencirian dan identifikasi

bakteri dapat digolongkan menjadi metode yang berdasar pada analisis asam

nukleat atau analisis protein. Analisis profil asam nukleat mencakup analisis profil

plasmid (plasmid profilling).

2.3 Elektroforesis

Dalam kegiatan biologi molekuler, elektroforesis merupakan salah satu

cara untuk memvisualisasikan keberadaan DNA, plasmid, dan produk PCR. DNA

dapat dilihat secara langsung dan dapat ditentukan ukurannya berdasarkan

migrasinya pada gel agarose maupun gel poliakrilamid. Migrasi DNA dalam gel

disebut sebagai elektroforesis. Untuk dapat divisualisasikan, maka DNA yang

terdapat di gel diwarnai dengan ethidium bromida (EtBr), kemudian dilihat di atas

sinar ultra violet. Ethidium bromida dapat menangkap sinar ultra violet sehingga

pendaran sinar UV ini dapat terlihat. Ethidium mengikat molekul DNA, sehingga

molekul DNA dapat terlihat ketika dilihat di atas sinar ultra violet. DNA

merupakan molekul bermuatan negatif, sehingga bila diletakkan dalam medan

listrik, DNA akan bermigrasi dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan

migrasi ditentukan oleh : i) ukuran molekul DNA; ii) prosentase/kerapatan gel

yang dilalui DNA; iii) arus listrik yang diberikan untuk memigrasikan molekul

DNA. Semakin kecil ukurannya DNA akan semakin cepat migrasi DNA. Semakin

rapat media yang digunakan, semakin tinggi prosentasenya, maka semakin lambat

DNA bermigrasi. Semakin besar arus yang diberikan, maka semakin cepat DNA

bermigrasi.

Gel elektroforesis digunakan untuk memisahkan fragmen DNA

berdasarkan ukurannya. Dimana jika sentrifugasi berarti memisahkan molekul

menggunakan kekuatan gravitasi sementara gel elektroforesis berarti memisahkan

molekul dengan menggunakan kekuatan elektrik. Gel elektroforesis mengambil

keuntungan bahwa, sebagai asam organik, DNA bermuatan negatif. Ketika

diletakkan di dalam medan listrik, molekul DNA menuju ke kutub positif (anoda)

dan menjauhi kutub negatif (katoda).

Sebelum dilakukan elektroforesis, suspensi DNA terlebih dahulu harus

ditambahkan loading buffer (dye), yang berfungsi untuk i) menambah densitas,

sehingga DNA akan selalu berada di dasar sumur; ii) pewarna untuk memudahkan

meletakkan sampel DNA ke dalam sumur, iii) agar dapat bergerak ke arah anoda

dengan laju yang dapat diperkirakan sehingga dapat digunakan sebagai tanda

migrasi DNA. Pewarna yang biasa digunakan adalah bromophenol blue dan

xylene cyanol. Selain itu, pembacaan pita DNA di dalam gel yang telah diwarnai

dengan ethidium bromida di atas lampu UV yang dibandingkan dengan DNA

standar juga sering dilakukan untuk menganalisis kuantitas jumlah DNA

(Suharsono dan Widyastuti, 2006).

2.4 Spektrofotometer

Jumlah DNA dicerminkan berat molekul bukan oleh volume. Untuk

mengetahui jumlah DNA, maka DNA hasil isolasi harus dianalisis dengan

spektrofotometer UV dengan panjang gelombang 256 nm (260 nm). Kualitas

DNA yang berhubungan dengan kemurnian terhadap kontaminan protein dapat

dilihat dari perbandingan absorbansi suspensi DNA pada panjang gelombang 260

nm terhadap 280 nm. Rasio OD260/OD280 antara 1,8-2,0 mencerminkan DNA

yang relatif murni dan terbebas dari kontaminan protein. Nilai absorbansi pada

panjang gelombang 260 nm dapat dikonversikan menjadi konsentrasi, yaitu nilai 1

pada OD260 = 50 ug DNA utas ganda tiap ml (Suharsono dan Widyastuti, 2006).

2.5 Escherichia coli

Berikut tasonomi bakteri E. coli :

Divisio : Protophyta

Classis : Schizomycetes

Ordo : Eubacteriales

Family : Eubacteriaceae

Genus : Escherichia

Spesies : Escherichia coli

Escherichia coli merupakan bakteri Gram negatif berbentuk batang

pendek, sebagian besar gerak positif dan beberapa strain mempunyai kapsul,

merupakan jasad indikator adanya jasad yang berbahaya di dalam substrat air dan

bahan makanan. Bakteri ini dapat tumbuh dengan medium nutrien sederhana dan

umumnya meragikan laktosa dengan membentuk asan dan gas (Hanahan, 1989)

2.6 pGLO

pGLO plasmid memiliki tiga gen khusus yaitu satu untuk GFP, gen untuk

resistensi antibiotik, dan regulasi gen sistem. Sistem ini dapat digunakan untuk

mengontrol ketika bakteri memproduksi protein fluorescent. Gen untuk GFP dapat

diaktifkan dalam sel dan dapat berubah dengan menambahkan arabinosa gula. Sel

yang mengalami perubahan akan muncul berwarna putih di cawan petri yang tidak

mengandung arabinosa dan berwarna hijau bila arabinosa termasuk dalam agar

nutrient media. Selain itu kita dapat menguji bahwa sel-sel telah diubah dengan

pGLO DNA dengan menumbuhkan bakteri tersebut di piring antibiotik.

Transformasi genetik melibatkan penyisipan beberapa DNA baru ke dalam sel E.

coli.Bakteri memiliki satu kromosom besar dan satu atau lebih plasmid. Plasmid

biasanya mengandung gen dengan sifat yang dapat membantu bakteri bertahan

hidup. Para ilmuwan dapat menggunakan proses yang disebut rekayasa genetika

untuk menyisipkan gen coding untuk sifat baru ke dalam plasmid. pGLO plasmid

memiliki gen GFP yang berfungsi sebagai protein fluorescent hijau dan gen yang

dapat memberikan efek resistensi bakteri terhadap antibiotik. pGlo plasmid dapat

digunakan untuk mengubah bakteri sehingga memiliki sifat baru.

Gen untuk GFP awalnya diisolasi dari ubur-ubur bercahaya Aequorea

victoria. Struktur 3-D dari GFP menyebabkannya beresonansi ketika itu terkena

radiasi ultraviolet dan mengeluarkan energi dalam bentuk cahaya tampak setelah

GFP dimasukkan ke pGlo plasmid. pGlo plasmid mengkodekan gen untuk GFP

dan laktamasebeta, yang memberikan resistensi terhadap antibiotik ampicillin.

pGlo juga menggabungkan sistem regulasi gen khusus yang dapat digunakan

untuk mengontrol ekspresi protein fluorescent dalam sel. Gen dengan mudah

dapat diaktifkan dalam sel dengan menambahkan gula arabinosa ke media nutrisi

(kontrol positif transkripsi). Seleksi untuk sel-sel yang telah diubah dengan pGlo

DNA terlihat pertumbuhan pada media selektif yang mengandung antibiotik

ampicillin (Bernhard, 2010).

BAB III

METODE PRAKTIKUM

3.1 Alat dan Bahan

a. Cawan petri diameter 5 cm, 5 buah

b. loop, 1 buah

c. pembakar spirtus, 1 buah

d. Alkohol 70% dalam botol semprot

e. batang pengaduk bentuk L

f. tip kuning (steril dengan autoklav)

g. tip biru steril (steril dengan autoklav)

h. tip putih steril (steril dengan autoklav)

i. es batu dan wadah

j. rak tabung 1.5 ml berlubang 6

k. tabung reaksi 1.5 ml steril, 6 buah (steril dengan autoklav)

l. plastik tahan panas 2 buah

m. alkohol 70% dalam wadah botol selai

n. Spidol Marker

o. Selotip

p. Lap

q. karet bulp untuk pipet pasteur steril dengan UV 4 buah

3.2 Cara Kerja

a. Memberi label pada tabung reaksi 1.5 ml dengan kode (–P) dan (+P) &

nama kelompok.

b. Membuka tutup tabung dan menggunakan pipet atau tips steril untuk

memasukkan larutan transformasi (CaCl2) yang telah disimpan dilam -

20C selama minimal 24 jam ke dalam tabung masing-masing sebanyak

250 ul.

c. Menyimpan tabung kedalam wadah es.

d. Mensterilkan loop dengan api, dan mendinginkan dengan cara

mencelupkan loop pada pinggir agar, kemudian ambil 1 koloni bakteri

yang besar (atau 2-3 koloni) dan memasukkan loop kedalam tabung (+P),

tabung dijentik-jentikkan dan diputar agar koloni bakteri tersebar merata.

Melakukan hal yang sama pada tabung (-P). Menyimpan tabung dalam es

selama 20 menit.

e. Memasukkan 5ul (10ng/ul) larutan vektor plasmid pGLO/pGemT ke

dalam tabung (+P) saja. Menjentik-jentikkan perlahan agar plasmid dan

bakteri bercampur. Menutup rapat tabung.

f. Menyimpan kedua tabung dalam es selama 10 menit.

g. Selama menunggu tabung dalam es. Memberi label agar plat LB+amp:

(+P); agar plat LB+amp+ara: (+P); agar plat LB+amp: (-P); agar plat LB: -

(P).

h. Heat shock. Memasukkan kedua tabung ke dalam waterbath 42ºC selama

tepat 50 detik. Setelah itu bersegera masukkan tabung ke dalam es, dan

mendiamkan dalam es selama 2 menit

i. Secara aseptik memasukan medium LB cair kedalam tabung (+P) dan (-P)

masing-masing sebanyak 250 µl. Meginkubasi tabung pada suhu 37ºC

selama 15 menit.

j. Menjentik-jentikan tabung dengan jari. Secara aseptik, dengan

menggunakan tips steril, pipet 100 ul memindahkan larutan transformation

dan kontrol ke dalam medium agar plat.

k. Secara aseptik, dengan menggunakan loop steril atau batang pengaduk

kaca steril, spresd atau meratakan larutan di atas agar.

l. Mengabungkan semua cawan petri dalam satu kelompok. Meletakkan

posisi tutup cawan petri di bawah. Simpan pada suhu 37ºC selama 16-18

jam.

m. Menyimpan cawan ke dalam lemari es pada suhu 4ºC selama sedikitnya 24

jam agar warna hijau pada koloni jelas terlihat dibawah pendaran UV.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

Transformasi pada praktikum ini dilakukan dengan tujuan menyisipkan

plasmid ke dalam sel. Praktikum ini menggunakan sel E. coli sebagai sel

kompeten. Sel E. coli tersebut kemudian digunakan untuk transformasi yaitu

disisipkannya plasmid ke dalam sel tersebut. Sel yang telah ditransformasi disebut

transforman. Hasil yang diperoleh dari praktikum transformasi ini adalah koloni

E. coli dalam cawan.

Gambar 1. Koloni E. coli hasil dalam cawan LB + AMP + Ara

Sumber: Dokumentasi pribadi

Gambar 2. Koloni E.coli, tidak berpendar pada lampu UV (dark reader)

Sumber: Dokumentasi pribadi

Tabel 1. Jumlah Koloni Sel E.coli pada Media Kultur

Jenis sel

Jumlah koloni pada media

Media LB

(1)

Media LB

(2)

Media LB +

ara

(1)

Media LB

+ ara

(2)

Media LB

+ amp +

ara

Sel E.coli - - - - 1

4.2 Pembahasan

Proses transformasi yaitu memasukkan plasmid (yang merupakan vektor

yang telah disisipi gen) ke dalam sel inang. Dalam praktikum ini, plasmid yang

disisipkan ke dalam sel bakteri E. coli adalah plasmid pGLO. Plasmid pGLO

merupakan plasmid modifikasi yang telah disisipkan gen GFP yang berasal

dari ubur-ubur Aequorea victoria (Karsi, 2007). Plasmid ini memiliki ukuran 5400

pasangan basa dan membawa informasi titik ori (awal replikasi),

gen GFP, regulator araC, dan gen resistensi terhadap antibiotika ampicillin

(Clontech, 2008). Gen GFP mengode protein berpendar hijau yang dapat

berpendar jika diekspresikan oleh prokariota seperti E. coli atau eukariota

seperti Caenorhabditis elegans. Regulator AraC merupakan pengatur ekspresi

dari gen GFP. Hal ini menyebabkan operon ini baru aktif mengekpresikan protein

bila ada kehadiran L-arabinosa. Arabinosa akan membantu RNA polimerase

berikatan dengan promotor sehingga transkripsi gen terjadi (Karsi, 2007). Jika sel

bakteri menghasilkan protein GFP dalam jumlah yang banyak maka pendaran

hijau terang di sinar UV juga akan menjadi semakin terang. Selain gen itu pGLO

juga mempunyai gen lain yaitu bla yang mengode enzim beta-laktamase yang

menghasilkan resistensi terhadap ampicillin pada E.coli sehingga dapat digunakan

sebagai penanda selektif (Mosher, 2002). Setelah melakukan proses transformasi

pada bakteri E. coli, dari hasil pengamatan didapatkan satu koloni bakteri E. coli

yang tumbuh pada cawan LB + Amp + Ara. Akan tetapi, setelah cawan LB +

Amp + Ara tersebut dilihat di bawah sinar UV, koloni bakteri E. coli tersebut

tidak berpendar hijau. Hal ini dikarenakan larutan vektor plasmid pGLO yang

dimasukkan terlalu sedikit yaitu sebanyak 5 μL, seharusnya vektor plasmid pGLO

yang dimasukkan lebih dari 5 μL agar plasmid tersebut berhasil disisipkan pada

sel bakteri E. coli sehingga ketika dilihat di bawah sinar UV akan menghasilkan

warna hijau yang berpendar.

BAB V

KESIMPULAN

Setelah dilakukan praktikum, mahasiswa mendapat pengetahuan baru

mengenai jalannya transformasi walau hasil yang didapat belum optimum. Setelah

melakukan proses transformasi pada bakteri E. coli, dari hasil pengamatan

didapatkan satu koloni bakteri E. coli yang tumbuh pada cawan LB + Amp + Ara.

Akan tetapi, setelah cawan LB + Amp + Ara tersebut dilihat di bawah sinar UV,

koloni bakteri E. coli tersebut tidak berpendar hijau. Hal ini dikarenakan larutan

vektor plasmid pGLO yang dimasukkan terlalu sedikit yaitu sebanyak 5 μL.

Prinsip transformasi adalah penyisipan gen asing ke dalam gen mahluk hidup

melalui suatu proses khusus, salah satunya adalah heat shock yaitu perubahan

permeabilitas dinding sel secara cepat untuk ‘memaksa’ plasmid masuk ke dalam

sel baru dan terekspresikan. Pengeskpresian plasmid pGLO ditandai dengan

resistensi terhadap antibiotic ampisilin karena adanya gen aLB dan koloni yang

berpendar di bawah UV karena gen GFP.

DAFTAR PUSTAKA

Brown, T.A. 1986. Gene Cloning : an introduction. P. 74-99. Chapman & Hall.

Clontech. 2008. GFP Variant Vectors. [Online] Tersedia: http://www.clontech.com/products/detail.asp?tabno=2&catalog_id=632312&page=all [12 Januari 2013].

Griffin, HG and Griffin, AM. 1993. DNA sequencing : Recent innovations and future trends. J. Appl. Biochem and Biotech 38: 147-159.

Hanahan, Douglas. 1983 .Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol., 166, 557

Karsi A, Lawrence ML. 2007. Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for gram-negative bacteria. J Plasmid 57(3):286-295.

Marchesi J.R., Sato T, Weightman A.J., Martin T.A.,Fry J.C., Hiom S.J., Wade W.G. 1998. Design and evaluation of useful bacterium-specific PCR primers that amplify genes coding for bacterial 16S rRNA. Appl Environ. Microbiol 64:795-9.

Mosher RH. 2002. Using pGLO to Demonstrate the Effects of Catabolite Repression on Gene Expression in Escherichia coli. Bioscene 28:17-23.

Muller, Bernhard. 2010. Transformation of pGlo into Escherichia coli. Biologie III: Diversity of Microorganisms

Suharsono dan Widyastuti, U. 2006. Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik Pengklonan Gen. Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi, IPB

Suwanto A 2002. Complication of Practical Manual. Biotrop Training Course in Microbial Biodiversity.