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8/22/2019 largebeads.pdf

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V o l . 5 1 , N o . 5P P L I E D AN D ENVIRONMENTAL M I C R O B I O L O G Y , May 1 9 8 6 , p . 1 0 8 9 - 1 0 9 80 0 9 9 - 2 2 4 0 / 8 6 / 0 5 1 0 8 9 - 1 0 $ 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t 1 9 8 6 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

A l g i n a t e B e a d s as S y n t h e t i c I n o c u l a n t C a r r i e r s f o r Slow R e l e a s e o fB a c t e r i a T h a t A f f e c t P l a n t G r o w t h t tYOAV BASHAN

D e p a r t m e n t o f P l a n t G e n e t i c s , T h e Weizmann I n s t i t u t e o f S c i e n c e , R e h o v o t 7 6 1 0 0 , I s r a e lR e c e i v e d 2 6 November 1 9 8 5 / A c c e p t e d 2 6 F e b r u a r y 1 9 8 6

U n i f o r m s y n t h e t i c b e a d s were d e v e l o p e d as c a r r i e r s f o r t h e b a c t e r i a l i n o c u l a t i o n o f p l a n t s . The b e a d s aremade o f s o d i u m a l g i n a t e a n d s k i m m i l k a n d c o n t a i n a l a r g e r e s e r v o i r o f b a c t e r i a l c u l t u r e w h i c h r e l e a s e s t h eb a c t e r i a a t a s l o w a n d c o n s t a n t r a t e . T h e b e a d s ar e b i o d e g r a d a b l e and p r o d u c e no e n v i r o n m e n t a l p o l l u t i o n .T h e s t r e n g t h o f t h e b e a d s , t h e r a t e o f b a c t e r i a l r e l e a s e , a n d t h e t i m e o f t h e i r s u r v i v a l i n t h e s o i l can b e c o n t r o l l e db y s e v e r a l h a r d e n i n g t r e a t m e n t s . The f i n a l p r o d u c t , l y o p h i l i z e d b e a d s , i s s i m p l e t o us e an d i s a p p l i e d t o t h es e e d s c o n c o m i t a n t l y w i t h s o w i n g . T h e r e l e a s e d b a c t e r i a ar e a v a i l a b l e f o r r o o t c o l o n i z a t i o n i m m e d i a t e l y a t s e e dg e r m i n a t i o n . D r y b e a d s c o n t a i n i n g b a c t e r i a ca n b e s t o r e d a t a m b i e n t t e m p e r a t u r e o v e r a l o n g p e r i o d w i t h o u tl o s s o f b a c t e r i a l c o n t e n t ; s t o r a g e r e q u i r e s a l i m i t e d space, and t h e q u a l i t y c o n t r o l o f a number o f b a c t e r i a i nt h e b e a d i s s i m p l e . The l e v e l o f p l a n t i n o c u l a t i o n w i t h b e a d s was s i m i l a r t o t h a t w i t h p r e v i o u s l y u s e d p e a ti n o c u l a n t s , b u t t h e f o r m e r m e t h o d y i e l d e d more c o n s i s t e n t r e s u l t s , as t h e f r e q u e n c y o f i n o c u l a t e d p l a n t s wasmuch h i g h e r . T h e f o r m e r m e t h o d p r o v i d e s a d i f f e r e n t a p p r o a c h f o r i n o c u l a t i o n o f p l a n t s w i t h b e n e f i c i a lr h i z o s p h e r e b a c t e r i a .

I n o c u l a t i o n o f p l a n t s w i t h n o n s y m b i o t i c r h i z o s p h e r e b a c -t e r i a f o r c r o p i m p r o v e m e n t i s a c o m p l i c a t e d t a s k . I n m o s ts t u d i e s r e p o r t e d t o d a t e , v a r i a b l e a n d i n c o n s i s t e n t r e s u l t sw e r e o b t a i n e d ( 1 , 1 5 , 1 7 , 1 8 , 2 3 - 2 5 ) . S i n c e t h e m o d e s o fa c t i o n o f t h e s e b a c t e r i a a r e a s y e t u n k n o w n ( 2 2 ) , a n ya p p l i c a t i o n m e t h o d w i t h u n c e r t a i n e f f i c i e n c y may b e a c r u -c i a l f a c t o r d e t e r m i n i n g s u c h i n c o n s i s t e n t r e s u l t s .I n o c u l a t i o n o f l e g u m e s w i t h t h e i r s y m b i o t i c r h i z o b i a ( 2 7 ) ,a w o r l d w i d e - c o m m o n p r a c t i c e f o r t h e l a s t s e v e r a l d e c a d e s , i sc a r r i e d o u t b y t w o m a i n m e t h o d s : ( i ) d i r e c t i n o c u l a t i o n w i t hb a c t e r i a l c u l t u r e , e . g . , d i p p i n g s e e d s i n a b a c t e r i a l s u s p e n -s i o n , a e r i a l s p r a y i n g o f b a c t e r i a , o r s p r e a d i n g t h e b a c t e r i a i nt h e s o w i n g f u r r o w b y v a r i o u s d r i p s y s t e m s m o u n t e d o n t h es o w i n g d r i l l a n d ( i i ) u s e o f v a r i o u s s o l i d - p h a s e b a c t e r i a li n o c u l a n t s b a s e d o n o r g a n i c m a t e r i a l s ( m a i n l y p e a t v a r i a n t s ) ,i n c l u d i n g o r g a n i c g r a n u l a r p a r t i c l e s . B o t h m e t h o d s a r e i n e x -p e n s i v e , e a s y t o u s e , a n d h a v e s i m p l e f o r m u l a t i o n p r e p a r a -t i o n s , b o t h f o r t h e f a r m e r a n d t h e b a c t e r i a i n d u s t r y .D u r i n g t h e l a s t d e c a d e t h e r e h a s b e e n a n i n cr e a se d i n t e r e s ti n s y n t h e t i c b e a d s o f v a r i o u s m a t e r i a l s a n d d i m e n s i o n s f o ri m m o b i l i z a t i o n o f m i c r o o r g a n i s m s a n d c e l l s a n d e n z y m e s ,a n t i b o d i e s , a n d o t h e r p r o t e i n s . T h e m a i n p u r p o s e o f t h e s eb e a d s was t o i m m o b i l i z e o r e n t r a p t h e t a r g e t o r g a n i s m o rp r o t e i n s f o r a l o n g p e r i o d t o c o l l e c t p r o d u c t s p r o d u c e d b yt h e e n t r a p p e d l i v i n g m a t e r i a l . R e l e a s e o f t h e i m m o b i l i z e dl i v i n g m a t e r i a l was c o n s i d e r e d a d i s a d v a n t a g e o f t h e s y s t e m( 4 , 5 , 7 , 8 , 1 2 , 1 3 , 1 6 , 2 0 , 2 1 , 2 6 ) . A f e w r e p o r t s s u g g e s t e d t h eu s e o f s e v e r a l p o l y m e r g e l s f o r e n t r a p p i n g f u n g i a n d b a c t e r i af o r u s e a s a g r i c u l t u r a l i n o c u l a n t s ( 9 , 1 1 , 1 4 , 1 9 ) .T h e p u r p o s e o f t h i s s t u d y was t o d e v e l o p b e a d s a s ab a c t e r i a l s l o w - r e l e a s e s y n t h e t i c i n o c u l a n t c a r r i e r w h i c h c a ns u b s t i t u t e f o r t h e o r g a n i c i n o c u l a n t s .

MATERIALS AND METHODSC h e m i c a l s . S o d i u m a l g i n a t e was o b t a i n e d f r o m BDH,P o o l e , E n g l a n d , i o t a - c a r r a g e e n a n was f r o m S i g m a C h e m i c a lt P a t e n t a p p l i e d f o r .t T h i s p a p e r w as w r i t t e n f o r t h e memory o f t h e l a t e A v n e r B a s h a nf o r h i s c o n s t a n t e n c o u r a g e m e n t a n d i n t e r e s t i n t h i s s t u d y .

C o . , S t . L o u i s , M o . , a n d s k i m m i l k was f r o m D i f c oL a b o r a t o r i e s , D e t r o i t , M i c h . A l l o t h e r c h e m i c a l s w e r e o fa n a l y t i c a l g r a d e a n d w e r e o b t a i n e d f r o m v a r i o u s c o m m e r c i a ls o u r c e s .B a c t e r i a . A z o s p i r i l l u m b r a s i l e n s e Cd (ATCC 2 9 7 1 0 ) wasu s e d a s a m o d e l o r g a n i s m t h r o u g h o u t t h e s t u d y . P s e u d o m o -n a s s p . s t r a i n 8 4 3 1 3 was u s e d i n some e x p e r i m e n t s .P l a n t s a n d g r o w t h c o n d i t i o n s . P l a n t s o f common w h e a t( T r i t i c u m a e s t i v u m c v . D e g a n i t ) w e r e u s e d a s t h e m o d e lp l a n t o r g a n i s m s . S e e d s w e r e o b t a i n e d f r o m Z e r a i m G e d e r aC o . , I s r a e l . S e e d s were s u r f a c e d i s i n f e c t e d b y i m m e r si n gt h e m i n 1% N a O C l f o r 3 m i n a t room t e m p e r a t u r e , t h o r -o u g h l y w a s h e d i n t a p w a t e r , a n d i m b i b e d f o r 3 h i n t a p w a t e r .S o w i n g was e i t h e r o n w e t f i l t e r p a p e r ( W h a t m a n n o . 1 ) i np e t r i d i s h e s o r i n p o t s c o n t a i n i n g s o i l . P l a n t i n g i n p o t s w a s a ta d e p t h o f 0 . 5 cm w i t h two t o f o u r p l a n t s p e r 5 - l i t e r p o t .C u l t u r e c o n d i t i o n s , b a c t e r i a l e n t r a p m e n t w i t h i n s o l i d i f i e db e a d s , a n d s e e d c o a t i n g . A . b r a s i l e n s e Cd was c u l t u r e d i nn u t r i e n t b r o t h ( D i f c o ) i n a r o t a r y s h a k e r ( 2 0 0 r p m ) a t 3 0 2 0 C f o r 2 4 t o 4 8 h t o a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 1 0 9 C F U / m l .E n t r a p m e n t o f b a c t e r i a w i t h i n b e a d s was c a r r i e d o u t u n d e rs t e r i l e c o n d i t i o n s i n a l a m i n a r f l o w h o o d w i t h o r g a n i c p o l y -m e r s w h i c h w e r e gamma i r r a d i a t e d w i t h 2 . 5 m e g a r a d s b yu s i n g a c o b a l t - 6 0 s o u r c e a t t h e Weizmann I n s t i t u t e o f S c i -e n c e , R e h o v o t , I s r a e l . T h e b a c t e r i a l c u l t u r e was a s e p t i c a l l ym i x e d w i t h 2% ( w t / v o l ) s o d i u m a l g i n a t e p o w d e r a n d s t i r r e dg e n t l y f o r 1 h . I n a l g i n a t e - s k i m m i l k b e a d p r e p a r a t i o n s , 1 0 %( w t / v o l ) s t e r i l i z e d s k i m m i l k was a p p l i e d p r i o r t o t h e a l g i n a t et r e a t m e n t . T h e o b t a i n e d m i x t u r e was s t i r r e d f o r 1 / 2 t o 2 h t oe n s u r e c o m p l e t e d i s s o l u t i o n o f a l l i n g r e d i e n t s . T h e m i x t u r ewas a d d e d d r o p w i s e w i t h t h e a i d o f a 1 0 - m l s t e r i l e s y r i n g ei n t o g e n t l y s t i r r e d , s t e r i l i z e d 0 . 1 M C a C l 2 a t r o om t e m p e r a -t u r e , a n d b e a d s i m m e d i a t e l y f o r m e d i n t h e C a C l 2 s o l u t i o n .T h e r e s u l t i n g a l g i n a t e b e a d s ( m e a n d i a m e t e r , 2 mm) e n -t r a p p e d t h e b a c t e r i a l c e l l s . T h e b e a d s were m a i n t a i n e d i n t h es o l u t i o n a t r o om t e m p e r a t u r e f o r an a d d i t i o n a l 1 t o 3 h t oo b t a i n r e g u l a r s o l i d b e a d s . T h e C a C l 2 s o l u t i o n w as t h e np u m p e d o u t , a n d t h e b e a d s wer e w a s h e d t w i c e w i t h s t e r i l -i z e d t a p w a t e r . A f t e r w a s h i n g s , t h e b e a d s wer e i n c u b a t e d i nf r e s h n u t r i e n t b r o t h medium f o r an a d d i t i o n a l 2 4 h f o r P .

1 0 8 9


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A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .

F I G . 1 . L y o p h i l i z e d a l g i n a t e - s k i m m i l k b e a d s mixed w i t h wheats e e d b e f o r e s o w i n g .

f l u o r e s c e n s a n d 4 8 h f o r A . b r a s i l e n s e i n t h e r o t a r y s h a k e r a t3 0 2 C t o a l l o w b a c t e r i a t o m u l t i p l y i n si de t h e b e a d s . Thent h e b e a d s were washed t w i c e a n d c o l l e c t e d . The wet b e a d sw e r e k e p t a t 4 1 C i n h e r m e t i c a l l y s e a l e d f l a s k s u n d e rm o i s t c o n d i t i o n s f o r s ev er a l d a y s .

T h i n l a y e r s o f washed b e a d s ( a f t e r m u l t i p l i c a t i o n ) s o a k e di n a s m a l l amount o f t a p w a t e r i n f l a s k s w e r e i m m e d i a t e l yf r o z e n a t - 7 0 C b y d i p p i n g t h e f l a s k s i n a b a t h c o n t a i n i n g d r yi c e i m m e r s e d i n t e c h n i c a l - g r a d e e t h a n o l . A f t e r f r e e z i n g , t h eb e a d s were l y o p h i l i z e d t o c o m p l e t e d r y n e s s a n d k e p t u n t i lusage i n h e r m e t i c a l l y s e a l e d f l a s k s c o n t a i n i n g s i l i c a g e l ( F i g .1 ) . S u r f a c e - d i s i n f e c t e d w h e a t s e e d s were i m m e r s e d i n a s o l u -t i o n c o n t a i n i n g 2% ( w t / v o l ) a l g i n a t e d i s s o l v e d i n 1 0 9 CFU o fA . b r a s i l e n s e Cd pe r m l i n s t e r i l e s a l i n e ( 0 . 8 5 % N a C I ) f o r 5 s ,p u l l e d o u t , i m m e d i a t e l y i m m e r s e d i n 0 . 1 M C a C l 2 f o r 3 0 s ,a n d washed t h r e e t i m e s i n s t e r i l e t a p w a t e r . The a l g i n a t e -c o a t e d s e e d s were a i r d r i e d a t 3 0 + 2 C i n a f o r c e d - d r a f to ven, l y o p h i l i z e d as p r e v i o u s l y d e s c r i b e d f o r d r y b e a d s , o rm a i n t a i n e d u n d e r a p p r o x i m a t e l y 100% r e l a t i v e h u m i d i t y i ns e a l e d p e t r i d i s h e s a t 4 1C.

H a r d e n i n g o f b e a d s c o n t a i n i n g i m m o b i l i z e d b a c t e r i a . T h er a t e o f b a c t e r i a l r e l e a s e a n d b e a d d e g r a d a t i o n i n s o i l wasc o n t r o l l e d b y h a r d e n i n g t h e b e a d s b y u s i n g t h e f o l l o w i n gm e t h o d s .( i ) A p o r t i o n o f 1 0 0 b e a d s c o n t a i n i n g i m m o b i l i z e d b a c t e r i awas a d d e d t o 2 0 m l o f 0 . 1 M g l u t a r a l d e h y d e ( a q u e o u ss o l u t i o n ) a n d g e n t l y s t i r r e d f o r 2 . 5 h a t 3 0 2 C . E x c e s sg l u t a r a l d e h y d e was r e m o v e d b y w a s h i n g w i t h t a p water a t1 0 C . To t h i s p r e p a r a t i o n , 1 0 0 mg o f g e l a t i n ( 3 0 0 b l o o m ,S i g m a ) was a d d e d w i t h an a d d i t i o n a l 2 0 m l o f 0 . 2 Mg l u t a r a l d e h y d e ( a q u e o u s s o l u t i o n ) , a n d t h e m i x t u r e was

g e n t l y s t i r r e d f o r 1 h a t 3 0 + 2 C . T h e e x c e s s g e l a t i n a n dg l u t a r a l d e h y d e were r e m o v e d a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( 2 6 ) .( i i ) S o d i u m m e t a p e r i o d a t e ( 5 m g ) was a d d e d t o 5 g o fs o d i u m a l g i n a t e d i s s o l v e d i n 1 2 5 m l o f d i s t i l l e d w a t e r a n ds t i r r e d a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 1 h . A n o t h e r 5 g o f s o d i u ma l g i n a t e a n d 1 0 m l o f c u l t u r e s u s p e n s i o n ( c o n t a i n i n g a p p r o x -i m a t e l y 1 0 9 C F U / m l ) w e r e m i x e d w i t h t h e s o d i u mm e t a p e r i o d a t e - a l g i n a t e s u s p e n s i o n . T h e o b t a i n e d s l u r r y wasa d d e d d r o p w i s e i n t o 0 . 1 M C a C l 2 , a n d t h e b e a d s f o r m e dw e r e i n c u b a t e d f o r 1 h a t 4 1 M C . T h e b e a d s w e r e t h e nw a s h e d i n d i s t i l l e d w a t e r a n d i n c u b a t e d i n 4 0 0 m l o f 0 . 5 %( v o l / v o l ) p o l y e t h y l e n e i m i n e h y d r o c h l o r i d e i n 0 . 1 M C a C l 2( p H 7 . 0 0 . 2 ) f o r 2 4 h a t 4 M C . F i n a l l y , t h e b e a d s werew a s h e d a g a i n w i t h t a p w a t e r a n d s t o r e d w e t a t 4 1 C ( 4 ) .( i i i ) B e a d s ( 5 g ) c o n t a i n i n g i m m o b i l i z e d b a c t e r i a weres u s p e n d e d i n 1 0 0 m l o f 0 . 5 % ( v o l / v o l ) p o l y e t h y l e n e i m i n e -h y d r o c h l o r i d e i n 5 0 mM C a C l 2 ( p H 7 . 0 0 . 2 ) w i t h g e n t l es t i r r i n g a n d k e p t f o r 2 4 h a t r o om t e m p e r a t u r e . T h e b e a d sw e r e r i n s e d i n w a t e r a n d i n c u b a t e d i n 1 0 0 m l o f 0 . 0 5 %( v o l / v o l ) g l u t a r a l d e h y d e d i s s o l v e d i n 1 0 mM s o d i u m p h o s -p h a t e ( p H 7 . 0 0 . 2 ) a t room t e m p e r a t u r e f o r 1 0 m i n w i t hs t i r r i n g . T h e b e a d s w e r e t h e n w a s h e d w i t h t a p w a t e r a n ds t o r e d a t 4 1 C i n a minimum amount o f w a t e r ( 4 ) .

S o l u b i l i t y o f b e a d s . To d i s s o l v e t h e a l g i n a t e b e a d s f o rb a c t e r i a l c o u n t s , b e a d s w e r e i m m e r s e d i n v a r i o u s c o n c e n -t r a t i o n s o f p o t a ss i u m p h o s p h a t e b u f f e r ( 0 . 0 6 , 0 . 2 , a n d 0 . 4 M ;pH 6 . 8 0 . 1 ) , k n o w n f o r i t s a b i l i t y t o d i s s o l v e a l g i n a t e g e l s( 7 ) ( o n e b e a d p e r 1 m l o f b u f f e r i n a t e s t t u b e ) , a n d i n c u b a t e df o r 3 0 t o 6 0 m i n ( d e p e n d i n g o n g e l t y p e ) a t 3 0 2 C . Tof a c i l i t a t e t h e s o l u b i l i t y , t h e b e a d s w e r e v i g o r o u s l y s h a k e n ona V o r t e x m i x e r ( V o r t e x - G e n i e S c i e n t i f i c I n d u s t r i e s ) . T h er e l e a s e d b a c t e r i a w e r e c o u n t e d b y t h e p l a t e c o u n t m e t h o d o na n u t r i e n t a g a r p l a t e ( D i f c o ) .S l o w r e l e a s e o f e n t r a p p e d b a c t e r i a . A p o r t i o n o f 2 0 w a s h e db e a d s c o n t a i n i n g i m m o b i l i z e d b a c t e r i a w a s t r a n s f e r r e d i n t o7 5 m l o f s t e r i l e s a l i n e s o l u t i o n ( 0 . 8 5 % [ w t / v o l ] N a C l ) a n dg e n t l y s h a k e n a t 3 0 2 C f o r 2 4 h . T h e n t r i p l i c a t e s a m p l e s o f0 . 5 m l o f s a l i n e s o l u t i o n were c o l l e c t e d , a n d t h e n u m b e r o fr e l e a s e d b a c t e r i a w a s d e t e r m i n e d b y t h e p l a t e c o u n t m e t h o do n n u t r i e n t a g a r p l a t e s . T h e n t h e b e a d s w e r e r i n s e d t w i c ew i t h s t e r i l e t a p w a t e r a n d t r a n s f e r r e d i n t o a f r e s h s a l i n es o l u t i o n , a n d t h e p r o c e d u r e w a s r e p e a t e d a f t e r a n a d d i t i o n a l2 4 h . A f t e r w a r d s , t h e b e a d s w e r e k e p t a t 4 1 C u n d e r a t h i nl a y e r o f w a t e r , a n d t h e p r o c e d u r e w a s r e p e a t e d a f t e r 3 0 d a y so f t h i s i n c u b a t i o n .P e a t i n o c u l a n t p r e p a r a t i o n . P e a t i n o c u l a n t w a s p r e p a r e db y t h e m e t h o d o f T h o m p s o n ( 2 7 ) . F o r p r e p a r a t i o n o f 1 0 0 g o fi n o c u l a n t , 4 5 g o f g r o u n d p e a t ( 4 0 m e s h , N i t r a g i n ; N i t r a g i nM i l . ) w a s t h o r o u g h l y m i x e d w i t h 5 g o f CaCO3 a n d 2 0 m l o ft a p w a t e r ( f i n a l p H , 6 . 8 ) i n p o l y e t h y l e n e b a g s s e a l e d w i t hc o t t o n p l u g . T h e b a g s w e r e gamma i r r a d i a t e d ( 2 . 5m e g a r a d s ) , a n d 3 0 m l o f a 2 4 - h - o l d b a c t e r i a l c u l t u r e ( a p p r o x -i m a t e l y 5 x 1 0 9 C F U / m l ) w a s a s e p t i c a l l y a d d e d t o e a c h b a g ,m i x e d , a n d i n c u b a t e d f o r a n a d d i t i o n a l 7 d a y s a t 3 0 2 C .E v e r y 2 d a y s t h e p e a t w a s m i x e d b y s h a k i n g t h e b a g s . T h ef i n a l n u m b e r o f b a c t e r i a i n t h e i n o c u l a n t r a n g e d f r o m 5 x 1 0 7t o 5 x 1 0 8 C F U / g o f i n o c u l a n t . T h e b a g s w e r e s t o r e d f o r u pt o a n a d d i t i o n a l 7 d a y s a t 4 M C . A t 1 d a y b e f o r e p l a n ti n o c u l a t i o n , t h e b a g s w e r e t r a n s f e r r e d t o 3 0 2 0 C .I m m o b i l i z a t i o n o f b a c t e r i a i n i o t a - c a r r a g e e n a n . A s o l u t i o no f 1 . 5 % s t e r i l e i o t a - c a r r a g e e n a n w a s a s e p t i c a l l y d i s s o l v e d i nb a c t e r i a l s u s p e n s i o n w i t h g e n t l e s t i r r i n g , a n d t h e m i x t u r ew a s a d d e d , a s d e s c r i b e d i n t h e f o r m a t i o n o f a l g i n a t e b e a d s ,t o 0 . 1 M M g C l 2 s o l u t i o n a n d l e f t i n t h e s o l u t i o n f o r a f u r t h e r3 0 m i n ( 2 6 ) .S c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p y . F o r e a c h o b s e r v a t i o n w i t h

1 0 9 0 B A S H AN


3/10

ALGINATE BEADS AS INOCULANT CAR R I E R S FOR B A C T E R I AT A B L E 1 . E f f e c t o f v a r i o u s t r e a t m e n t s o f s e e d s c o a t e d w i t h a l g i n a t e o n t h e s u r vi va l o f A . b r a s i l e n s e i n t h e c o a t i n g m a t r i x a n d o ns e ed g e r mi n a t io n

N o . o f b a c t e r i a s u r v i v i n g i n t h e s e e d c o a t i n g m a t r i x % S e e d g e r m i n a t i o nT r e a t m e n t o f s ee ds A . b r a s i l e n s e a f t e r 1 0 0 h a f t 1 0 0 h a f t e r A f t e r t r e a t m e n t , a tA . b r a s i l e n s e a s e c o n d a r y b a c t e r i a l O t h e r b a c t e r i a t r e a t e r s e c o n d a r y n o r m a l m o i s t u r em u l t i p l i c a t i o n b t r e a t m e n t m u l t i p l i c a t i o n b c o n d i t i o n s c

A i r d r i e d ( 2 . 1 0 . 1 1 ) x 1 0 1 ( 9 . 7 0 . 1 1 ) x 1 0 ' ( 2 . 8 0 . 2 ) x 1 0 3 0 8 0 2 8 9 2L y o p h i l i z e d ( 4 . 8 0 . 2 1 ) x 1 0 ' ( 7 . 2 0 . 3 6 ) x 1 0 6 ( 3 . 1 0 . 4 ) x 1 0 3 0 0 7 3Wet ( 4 . 3 0 . 7 6 ) x 1 0 4 ( 8 . 5 0 . 1 9 ) x 1 0 8 ( 4 . 6 0 . 4 ) x 1 0 5 9 2 4 9 2 3 9 2 3A i r d r i e d w i t h o u t A . b r a s i l e n s e NDd ND ( 2 . 6 0 . 3 ) x 1 0 3 0 8 3 2 8 8 3L y o p h i l i z e d w i t h o u t A . ND ND ( 3 . 4 0 . 4 ) x 1 0 3 0 0 8 3b r a s i l e n s eN o t c o a t e d o r t r e a t e d ND ND ( 3 . 9 0 . 6 ) x 1 0 4 0 ND 9 1 2

a I n o c u l u m l e v e l o f 1 0 9 C F U / m l ; 2 0 s ee ds w e r e c o a t e d w i t h 1 m l o f s o l u t i o n .b S e e d s w e r e s h a k e n f o r 2 4 h a t 2 5 2 C i n n u t r i e n t b r o t h .c S e e d s w e r e p l a c e d o n w e t f i l t e r p a p e r i n P a r a f i l m - s e a l e d p e t r i d i s h e s .d ND, N o t d e t e r m i n e d .

s c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p y , 1 0 b e a d s w e r e f i x e d f o r 5 h i n5% g l u t a r a l d e h y d e s o l u t i o n ( i n d i s t i l l e d w a t e r ) , w a s h e d t h r e et i m e s i n 0 . 2 M c a c o d y l a t e b u f f e r ( p H 7 . 2 ) , f i x e d a g a i n f o r 1 hi n 1% O S 0 4 , w a s h e d t h r e e t i m e s i n c a c o d y l a t e b u f f e r , a n dt h e n d e h y d r a t e d w i t h e t h a n o l a t t h e f o l l o w i n g c o n c e n t r a -t i o n s : 50% f o r 3 0 m i n , 70% f o r 3 0 m i n , 70% f o r 1 0 h , 100% f o r3 0 m i n , a n d 1 0 0 % f o r 6 0 m i n . T h e w h o l e p r o c e d u r e w a sc a r r i e d o u t a t 4 1 C . T h e s a m p l e s w e r e d r i e d i n a c r i t i c a lp o i n t d r y e r ( T o u s i m i s R e s e a r c h C o r p . ) i n F r e o n a n d l a t e ru n d e r a CO2 a t m o s p h e r e . T h e d r i e d s a m p l e s w e r e s t u c k t os t u b s , c o v e r e d w i t h g o l d , a n d e x a m i n e d u n d e r a P h i l i p s SEM5 0 5 s c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p e a t 1 0 t o 1 5 k V . L y o p h i -l i z e d b e a d s w e r e n o t f i x e d a n d w e r e t r e a t e d a s d r y b e a d sa f t e r c r i t i c a l p o i n t d r y e r t r e a t m e n t .I n o c u l a t i o n o f p l a n t s b y b e a d s . I n o c u l a t i o n b y b e a d s w a sc a r r i e d o u t i n p e t r i d i s h e s a n d p o t s . F o r p e t r i d i s h i n o c u l a -t i o n , d i s i n f e c t e d w h e a t s e e d s g e r m i n a t e d o n w e t f i l t e r p a p e r( W h a t m a n n o . 1 ) w e r e i n o c u l a t e d b y a s e p t i c a l l y p l a c i n gt h r e e b e a d s p e r s e e d l i n g n e a r t h e g r o w i n g r o o t s . F o r p o ti n o c u l a t i o n , 1 0 b e a d s p e r p o t ( 4 t o 5 b e a d s p e r s e e d ) w e r em i x e d w i t h s e e d s b e f o r e s o w i n g o r b e a d s a l o n e w e r e p l a c e di n a s e a l e d d e l i c a t e n y l o n - c l o t h b a g a n d b u r i e d n e a r t h es e e d s , a p p r o x i m a t e l y 5 - c m d e e p i n t h e f o l l o w i n g s o i l s o rs u b s t r a t e : v e r m i c u l i t e , b r o w n - r e d d eg r a di n g s a n d s o i l( R e h o v o t , C e n t r a l I s r a e l ) , l o e s s r a w s o i l ( K i b b u t z N i r - A m ,N o r t h e r n N e g e v , I s r a e l ) , a n d a l l u v i a l s o i l ( K i b b u t z N e g b a ,N o r t h e r n N e g e v , I s r a e l ) . S o i l s e i t h e r i n t h e i r n a t u r a l s t a t e o rgamma s t e r i l i z e d ( 2 . 5 m e g a r a d s ) w e r e m a i n t a i n e d n e a r f i e l dc a p a c i t y . W h e a t p l a n t s ( t w o p e r p o t ) w e r e g r o w n a n d u n d e r -g r o u n d d r i p i r r i g a t e d w i t h r e g u l a r w a t e r d a i l y . A f t e r i n o c u -l a t i o n , t h e s u r f a c e o f e a c h p o t was c o v e r e d w i t h a l a y e r o f 2t o 3 cm o f a d r y s t e r i l e v e r m i c u l i t e a b o v e t h e d r i p l e t p o s i t i o n ,w h i c h r e s u l t e d i n a d r y s t e r i l e v e r m i c u l i t e l a y e r m a i n t a i n e df o r s e v e r a l w e e k s t o a v o i d t h e q u i c k c o n t a m i n a t i o n o f p o t s .A g r o u p o f f i v e p o t s was s a m p l e d w e e k l y . T h e b a g s w e r eo p e n e d , a n d t h e b e a d s w e r e e x a m i n e d u n d e r a s t e r e o s c o p i cl i g h t m i c r o s c o p e f o r d e g r a d a t i o n w i t h t h e f o l l o w i n g s c a l e : 0 ,n o d e g r a d a t i o n ; 1 , s l i g h t v i s i b l e d e g r a d a t i o n on b e a d e d g e s ;2 , o n e - h a l f t o t h r e e - f o u r t h s o f t h e b e a d s were d e g r a d e d ; 3 ,t h e b e a d s w e r e f u l l y d e g r a d e d t o t h e e x t e n t t h a t t h e y weren o t f o u n d i n t h e n y l o n b a g . I n a d d i t i o n , b a c t e r i a l i n o c u l a t i o no f r o o t s was e s t i m a t e d a s e x p l a i n e d i n t h e f o l l o w i n g s e c t i o n .E s t i m a t i o n o f r o o t b a c t e r i z a t i o n a n d s o i l b a c t e r i a l p o p u l a -t i o n . R o o t b a c t e r i z a t i o n was e s t i m a t e d b y s e v e r a l m e t h o d s :( i ) d i r e c t o b s e r v a t i o n s o f r o o t s w i t h a s c a n n i n g e l e c t r o nm i c r o s c o p e ; ( i i ) q u a l i t a t i v e e s t i m a t i o n b y c r u s h i n g r o o t s i n af i n e g l a s s h o m o g e n i z e r ( K o n t e s C o . , V i n e l a n d , N . J . ) i n 0 . 0 6

M p o t a s s i u m p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 6 . 8 ) a n d c o u n t i n g t h eCFUs o n n u t r i e n t a g a r m e d i u m . T h i s m e t h o d i s n o t q u a n t i -t a t i v e b e c a u s e t h e b a c t e r i a t e n d t o f o r m m a s s i v e a g g r e g a t e so n r o o t s , a n d t h os e c a n n o t b e d i s s o l v e d b y t h e h o m o g e n i z e r ;( i i i ) c o u n t b y t h e i m p r o v e d s e l e c t i o n t e c h n i q u e ( 3 ) ; ( i v ) c o u n tb y t h e r e c e n t l y d e v e l o p e d e n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n ta s s a y t e c h n i q u e ( H . L e v a n o n y , Y . B a s h a n , a n d Z . E .K a h a n a , F E M S S y m p . M i c r o b . C o m m u n i t i e s S o i l , p .7 7 - 7 7 a , 1 9 8 5 ) .S o i l b a c t e r i a w e r e e s t i m a t e d b y v i g o r o u s l y s h a k i n g 1 . 0 g o fs o i l ( i n t r i p l i c a t e ) i n 1 0 0 m l o f 0 . 0 6 M p o t a s s i u m p h o s p h a t eb u f f e r ( p H 6 . 8 ) i n E r l e n m e y e r f l a s k s f o r 1 h a t 2 5 + 2 C ( 2 0 0s t r o k e s p e r m i n ) . T h e h o m o g e n a t e was i m m e d i a t e l y s e r i a l l yd i l u t e d b y 1 0 - f o l d d i l u t i o n s , p l a t e d o n n u t r i e n t b r o t h m e -d i u m , a n d i n c u b a t e d f o r 7 2 h a t 2 5 + 2 C . B a c t e r i a l CFUsw e r e t h e n d e t e r m i n e d .E x p e r i m e n t a l d e s i g n a n d s t a t i s t i c a l a n a l y s i s . A l l e x p e r i -m e n t s w e r e r e p e a t e d t w o t o e i g h t t i m e s a n d , u n l e s s o t h e r -w i s e n o t e d , w i t h 1 0 r e p l i c a t e s i n e a c h . T h e r e p l i c a t e s ,a r r a n g e d i n a r a n d o m i z e d d e s i g n , c o n s i s t e d o f p o t , b e a d ,E r l e n m e y e r f l a s k , t u b e , o r m i c r o w e l l . T h e r e s u l t s g i v e n a r ef r o m a r e p r e s e n t a t i v e e x p e r i m e n t . T h e s i g n i f i c a n c e i s g i v e nw i t h t h e d e s i g n a t e d s t a n d a r d e r r o r .

R E SU L T SE f f e c t o f a l g i n a t e s e e d c o a t i n g o n s e e d g e r m i n a t i o n a n dv i a b i l i t y o f i m m o b i l i z e d b a c t e r i a . S e e d s c o a t e d w i t h a l g i n a t ew e r e t e s t e d f o r g e r m i n a t i o n a n d s u r v i v a l o f t h e b a c t e r i a i nt h e s o l i d i f i e d m a t r i x . G e r m i n a t i o n o f a i r - d r i e d c o a t e d s e e d sw a s s i m i l a r t o t h a t o f t h e u n t r e a t e d c o n t r o l s e e d s , b u t t h es u r v i v a l o f b a c t e r i a i n t h e d r i e d m a t r i x was v e r y p o o r ; l e s st h a n 1 0 0 b a c t e r i a o f a n i n i t i a l p o p u l a t i o n o f 1 0 8 b a c t e r i a p e rs e e d s u r v i v e d ( T a b l e 1 ) . L y o p h i l i z a t i o n o f c o a t e d s e e d si m p r o v e d t h e s u r v i v a l o f t h e b a c t e r i a b u t p r e v e n t e d s e e dg e r m i n a t i o n . C o a t e d s e e d s w i t h t h e i m m o b i l i z e d b a c t e r i a

u n d e r c o n d i t i o n s o f h i g h h u m i d i t y ( w i t h o u t a n y d r y i n gp r o c e d u r e ) m a i n t a i n e d t h e h i g h e s t p o p u l a t i o n o f b a c t e r i a ,b u t t h e s e e d s b e g a n t o g e r m i n a t e a n d t h u s were u s e l e s s f o rm e c h a n i c a l s o w i n g e v e n i f t h e g e r m i n a t i o n i t s e l f was u n a f -f e c t e d ( T a b l e 1 ) .D i r e c t i m m o b i l i z a t i o n o f b a c t e r i a i n t h e b e a d s d u r i n g b e a df o r m a t i o n a n d a f t e r s e c o n d a r y m u l t i p l i c a t i o n i n r e l a t i o n t oa l g i n a t e c o n c e n t r a t i o n . As b a c t e r i a wer e e n t r a p p e d i n t h ep r o c e s s o f b e a d f o r m a t i o n , most o f t h e i n i t i a l p o p u l a t i o n w asl o s t r e g a r d l e s s o f t h e a l g i n a t e c o n c e n t r a t i o n o r t h e a d d i t i o no f s k i m m i l k i n t o t h e f o r m e d b e a d s ( l e s s t h a n 1 0 2 C F U / g o fb e a d s was d e t e c t e d ) . H o w e v e r , t h e s e f e w e n t r a p p e d b a c t e -

V O L . 5 1 , 1 9 8 6 1 0 9 1


4/10


1 0

8

6- 6

a )C)

08

6

2

A

E - l I ii T I rII B

P. 4A l g i n a t e c o n c . (%)

F I G . 2 . I m m o b i l i z a t i o n a n d m u l t i p l i c a t i o n o f b a c t e r i a i n b e a d sw i t h ( A ) a n d w i t h o u t ( B ) s k i m m i l k i n r e l a t i o n t o t h e a l g i n a t ec o n c e n t r a t i o n . S y m b o l s : 0, number o f i m m o b i l i z e d b a c t e r i a ; 0,n u m b e r o f b a c t e r i a a f t e r m u l t i p l i c a t i o n . B a r s r e p r e s e n t t h e s t a n d a r de r r o r .

r i a l c e l l s c o u l d m u l t i p l y i n s i d e t h e b e a d s t o f o r m a m a s s i v eb a c t e r i a l p o p u l a t i o n , a n d i n b e a d s c o n t a i n i n g s k i m m i l k i nt h e i r b a s i c s t r u c t u r e , t h e p o p u l a t i o n i n c r e a s e d e v e n h i g h e r .An i n c r e a s e i n t h e a l g i n a t e c o n c e n t r a t i o n o f t h e b e a d sr e s u l t e d i n a d e c r e a s e i n t h e number o f t h e b a c t e r i a l popu-l a t i o n t h a t m u l t i p l i e d i n t h e b e a d s ( F i g . 2 ) . H o w e v e r , e v e n a tt h e h i g h e s t a l g i n a t e c o n c e n t r a t i o n w h i c h a l l o w e d minimums e c o n d a r y m u l t i p l i c a t i o n , t h e f i n a l number o f b a c t e r i a wass e v e r a l o r d e r s o f m a g n i t u d e h i g h e r t h a n t h e number o fb a c t e r i a d i r e c t l y i m m o b i l i z e d i n t h e b e a d s . H o w e v e r , b e a d so f h i g h a l g i n a t e c o n c e n t r a t i o n w e r e r a r e l y p r o d u c e d b e c a u s eo f t h e h i g h v i s c o s i t y o f t h e i n i t i a l a l g i n a t e s o l u t i o n . S i m i l a rr e s u l t s w e r e o b t a i n e d w i t h Pseudomonas s p .S c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p y o f b e a ds . E x a m i n a t i o n o fb e a d s a t v a r i o u s s t a g e s o f p r o d u c t i o n r e v e a l e d t h a t t h ea l g i n a t e b e a d i s a r o u n d e d s t r u c t u r e w i t h s h a l l o w g r o o v e severy 1 0 t o 1 5 , u m a n d a f e w c a v i t i e s on i t s r o u g h s u r f a c e( F i g . 3 a , b , a n d c ) . M u l t i p l i c a t i o n o f t h e b a c t e r i a i n s i d e t h eb e a d r e s u l t e d i n t h e f o r m a t i o n o f numerous b u l g e s a l l o v e rt h e b e a d s u r f a c e area ( F i g . 3 d , e , a n d f ) i n s i d e w h i c h t h eb a c t e r i a p o p u l a t i o n m u l t i p l i e d ( a r r o w s ) . F u r t h e r e x a m i n a -t i o n o f an e x p l o d e d b u l g e r e v e a l e d t h a t i t was f o r m e d o f ab a c t e r i a l m i c r o c o l o n y c o v e r e d w i t h a s o l i d i f i e d m a t r i x ( F i g .3 g ) , w h i l e t h e w h o l e e x t e r n a l s u r f a c e was c o v e r e d b y b a c t e -r i a ( F i g . 3 h ) . T h i s p a t t e r n o f m u l t i p l i c a t i o n was f o u n d i na l g i n a t e b e a d s w i t h o r w i t h o u t s k i m m i l k . W h e n t h e b e a dwas c u t i n t o a t h i c k s e c t i o n , t h e s e b u l g e s a p p e a r e d a l s oi n s i d e t h e b e a d s ( F i g . 4 b ) . A f t e r l y o p h i l i z a t i o n , a l g i n a t e

b e a d s w i t h o u t s k i m m i l k s h o w e d c o n c e n t r i c l a y e r s o f d r i e ds o l i d i f i e d m a t r i x ( F i g . 4 a ) o n w h i c h d r i e d b a c t e r i a l m i c r o c o l -o n i e s a p p e a r e d ( F i g . 4 b ) . When a l g i n a t e b e a d s f o r m e d w i t hs k i m m i l k w e r e c u t , t h e r e v e a l e d i n n e r s t r u c t u r e w a s n o to r g a n i z e d b y l a y e r s b u t c o n t a i n e d v a r i o u s - s h a p e d c r o s s -l i n k a g e s a l s o c o n t a i n i n g n u m e r o u s m i c r o c o l o n i e s ( F i g . 4 ca n d e ) .D r y i n g a n d s t o r a g e e f f e c t s o n t h e s i z e o f t h e b a c t e r i a lp o p u l a t i o n i n t h e b e a d s . I n g e n e r a l , d r y i n g o f t h e b e a d sr e d u c e d t h e n u m b e r o f t h e e n t r a p p e d b a c t e r i a b y s e v e r a lo r d e r s o f m a g n i t u d e . H o w e v e r , d r y i n g t h e b e a d s b yl y o p h i l i z a t i o n c a u s e d a s m a l l e r r e d u c t i o n t h a n d r y i n g i n af o r c e d - d r a f t o v e n ( F i g . S A ) . L y o p h i l i z a t i o n o f t h e A .b r a s i l e n s e c u l t u r e y i e l d e d 0 . 0 5 t o 0 . 1 % r e c o v e r y .T h e l y o p h i l i z e d a n d w e t b e a d s s t o r e d f o r 3 m o n t h s a t 4 2 C s h o w e d n o d e c l i n e i n t h e b a c t e r i a l p o p u l a t i o n . I n t h e w e tb e a d s t h e r e w a s e v e n a s l i g h t i n c r e a s e d u r i n g t h e f i r s t 2m o n t h s , b u t l a t e r t h e p o p u l a t i o n d e c r e a se d . A l t h o u g h t h e r ew a s a d i f f e r e n c e i n t h e i n i t i a l b a c t e r i a l n u m b e r s b e t w e e nb e a d s c o n t a i n i n g a n d t h o s e n o t c o n t a i n i n g s k i m m i l k , t h es a m e t r e n d i n t h e s i z e o f t h e b a c t e r i a l p o p u l a t i o n w a so b s e r v e d ( F i g . 5 B ) .S o l u b i l i z a t i o n o f b e a d s . B e a d s w e r e s o l u b i l i z e d b y i m m e r s -i n g t h e m i n p o t a s si u m p h o s p h a t e b u f f e r o f v a r i o u s c o n c e n -t r a t i o n s . I n w e t b e a d s w i t h o u t s k i m m i l k , r a p i d s o l u b i l i z a t i o no c c u r r e d w i t h i n 3 0 m i n . When s k i m m i l k w a s i n c o r p o r a t e di n t o t h e p o l y m e r t h e t i m e r e q u i r e d f o r s o l u b i l i z a t i o n w a sd o u b l e d , a l t h o u g h i t s t i l l r e m a i n e d r e l a t i v e l y s h o r t ( l e s s t h a n1 h ) . T h e t i m e r e q u i r e d f o r s o l u b i l i z a t i o n o f l y o p h i l i z e db e a d s w a s much l o n g e r ; 1 8 h o f i n c u b a t i o n i n t h e p h o s p h a t eb u f f e r d i d n o t r e s u l t i n t o t a l s o l u b i l i z a t i o n e v e n when t h eb e a d s w e r e v i g o r o u s l y s h a k e n s e v e r a l t i m e s i n a V o r t e xm i x e r . U n d e r t h e s e c o n d i t i o n s , t h e b e a d s w e r e d e g r a d e d i n t os m a l l p a r t i c l e s b u t n o t s o l u b i l i z e d . I n c r e a s i n g t h e m o l a rc o n c e n t r a t i o n o f t h e p h o s p h a t e b u f f e r u p t o 0 . 4 M d i d n o te n h a n c e s o l u b i l i z a t i o n , a n d a d e c r e a s e i n t h e m o l a r c o n c e n -t r a t i o n f r o m 0 . 2 t o 0 . 0 6 M d e c r e a s e d t h e r a t e o f s o l u b i l i z a -t i o n . T h e i m m o b i l i z e d b a c t e r i a i n t h e b e a d s i n a l l b e a d t y p e sh a d n o e f f e c t o n t h e s o l u b i l i z a t i o n . I d e n t i c a l r e s u l t s w e r eo b t a i n e d w i t h P s e u d o m o n a s s p .H a r d e n i n g o f a l g i n a t e b e a d s . T h r e e d i f f e r e n t h a r d e n i n gt r e a t m e n t s w e r e u s e d o n s k i m m i l k a l g i n a t e b e a d s . A sc o m p a r e d w i t h t h e t o t a l s o l u b i l i z a t i o n o f u n t r e at e d b e a d s ,t h e h a r d en i n g p r o c e d u r e d e c r e a s e d s o l u b i l i z a t i o n . T h e r e w a sn o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e t h r e e h a r d e n i n g t r e a t -m e n t s . H a r d e n i n g o f t h e b e a d s h a d o n l y a m a r g i n a l e f f e c t o nb a c t e r i a l m u l t i p l i c a t i o n i n s i d e t h e b e a d s . H a r d e n i n g o f t h eb e a d s d u r i n g b e a d f o r m a t i o n s l i g h t l y d e c r e a s e d t h e n u m b e ro f i m m o b i l i z e d b a c t e r i a i n s i d e t h e b e a d, b ut a f t e r m u l t i p l i -c a t i o n n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e i n t h e b a c t e r i a l n u m b e r w a sf o u nd b e t w e e n h a r d e n e d a n d n o n h a r d e n e d b e a d s . H a r d e n i n go f b e a d s a l s o d e c r e a s e d t h e i r b i o d e g r a d a t i o n i n s o i l ( T a b l e2 ) . E f f e c t o f m a t r i x s o l i d i f i c a t i o n o n b a c t e r i a l c o l o n y m o r p h o l -o g y . A t y p i c a l c o l o n y o f A . b r a s i l e n s e Cd w a s i m m o b i l i z e da n d m u l t i p l i e d i n s i d e t h e b e a d s . A f t e r b e a d d i s s o l u t i o n a n dg r o w t h o f t h e b a c t e r i a o n a r i c h n u t r i e n t b r o t h m e d i u m ,p o l y m o r p h i c c o l o n i e s w e r e f o r m e d . I n a d d i t i o n t o t h e t y p i -c a l , d a r k p i n k , d r y c o l o n i e s o f A . b r a s i l e n s e C d , t h e r e w e r ea l s o w h i t e o r p a l e p i n k , s m o o t h - s u r f a c e d c o l o n i e s w i t h o rw i t h o u t d r y r i d g e s o r w i t h a n u n d e f i n e d b o r d e r . S u c hp o l y m o r p h i c a p p e a r a n c e o f A . b r a s i l e n s e Cd w a s r e p o r t e dp r e v i o u s l y ( 1 0 ) . T h e s e c o l o n i e s w e r e p o s i t i v e l y i d e n t i f i e d a sA . b r a s i l e n s e Cd b y t h e e n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n ta s s a y ( L e v a n o n y e t a l . , F E M S S y m p . M i c r o b . C o m m u n i t i e sS o i l , 1 9 8 5 ) .

1 0 9 2 B A S H AN


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A L GI NA TE B E A DS AS I N O C U L AN T CA R R I E R S FO R B A C T E R IAO L . 5 1 , 1 9 8 6 1 0 9 3

x x

Xa X

A v- G .0

0- m 3C0

CL D ^ a- 0 -

: 3 , *C-. 0 0

C, D0' < C D

CD C G -c J Qo* r/

C D _

"u8: 3

o _0Q0 .3,o XQn C' C D

Cr D C0 3- 0-

C : ( )o C )

3 C ) _ .o 0 - 0O C I Qq 00 c o aas

x _ . 0a F _-Oa3 3 3fD Q0 _


6/10


F I G . 4 . S c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o g r a p h s o f t h i c k - s e c t i o n c u t o f ( a ) l y o p h i l i z e d a l g i n a t e b e a d w i t h o u t s k i m m i l k , s h o w i n g l a y e r s o f t h e d r i e dp o l y m e r ( m a g n i f i c a t i o n , x 5 0 ) , ( b ) w e t b e a d i n d i c a t i n g f o r m a t i o n o f s i m i l a r i n t e r n a l b u l g e s c o n t a i n i n g b a c t e r i a ( m a g n i f i c a t i o n , x 2 , 0 0 0 ) , ( c )l y o p h i l i z e d a l g i n a t e b e a d w i t h s k i m m i l k ( m a g n i f i c a t i o n , x 2 5 ) , ( d ) l y o p h i l i z e d b u l g e s i n b e a d s w i t h o u t s k i m m i l k c o n t a i n i n g b a c t e r i a ( a r r o w s )o n t h e d r i e d p o l y m e r l a y e r s ( m a g n i f i c a t i o n , x 2 , 5 0 0 ) , a n d ( e ) l y o p h i l i z e d b u l g e s i n b e a d s w i t h s k i m m i l k c o n t a i n i n g b a c t e r i a ( a r r o w )( m a g n i f i c a t i o n , x 1 , 0 0 0 ) .F a c t o r s a f f e c t i n g b e a d s i z e . W i t h a 2 1 - g a u g e s y r i n g e( d r o p w i s e , 2 t o 3 b e a d s p e r s ) , we f o r m e d b e a d s o f v a r i o u ss i z e s , r a n g i n g f r o m 1 . 5 t o 2 . 0 mm i n d i a m e t e r . R e d u c i n g t h es y r i n g e s i z e t o 2 5 o r 2 7 g a u g e d e c r e a s e d t h e d i a m e t e r o f t h eb e a d s f o r m e d t o a minimum o f 0 . 7 t o 0 . 8 mm. F u r t h e rd e c r e a s e was i m p os si b le b e c a u s e o f t h e h i g h v i s c o s i t y o f t h ei n i t i a l a l g i n a t e s o l u t i o n . T h e s p e e d o f b e a d p r o d u c t i o n w a sl i m i t e d t o f i v e b e a d s p e r s , b u t t h e b e a d s i z e r e m a i n e dc o n s t a n t . D u r i n g t h e f o r m a t i o n o f a p p r o x i m a t e l y 5 0 0 , 0 0 0

b e a d s , t h e i r s i z e r e m a i n e d u n i f o r m a s m e n t i o n e d .B a c t e r i a l s l o w r e l e a s e f r o m b e a d s . B e a d s c o n t a i n i n g b a c t e -r i a a f t e r b a c t e r i a l s e c o n d a r y m u l t i p l i c a t i o n w e r e t e s t e d f o rt h e i r a b i l i t y t o r e l e a s e t h e b a c t e r i a . F i gu re 6 s h o w e d t h a tb e a d s e i t h e r w i t h o r w i t h o u t s k i m m i l k r e l e a s e d a b o u t 1 0 5 t o1 0 6 C F U / g o f b e a d s p e r 2 4 h f r o m i n i t i a l p o p u l a t i o n s i n t h eb e a d s o f 1 . 2 x 1 0 1 0 a n d 5 x 1 0 7 C F U / g o f b e a d s , w i t h a n dw i t h o u t s k i m m i l k , r e s p e c t i v e l y . T h e s a m p l i n g s w e r es t o p p e d a f t e r 4 8 h b e c a u s e t h e b a c t e r i a w e r e s t a r v e d , a n d t h eb e a d s w e r e s t o r e d . A f t e r s t o r a g e a t 4 + 2 C f o r a n a d d i t i o n a l3 0 d a y s , t h e b e a d s r e l e a s e d b a c t e r i a when t r a n s f e r r e d t o 3 0 2 C . H o w e v e r , t h e n u m b e r o f r e l e a s e d b a c t e r i a w a s

s m a l l e r t h a n a f t e r 4 8 h . S i m i l a r r e s u l t s w e r e o b t a i n e d w i t hP s e u d o m o n a s s p .B i o d e g r a d a t i o n o f b e a d s c o n t a i n i n g i m m o b i l i z e d b a c t e r i a i ns o i l . B a c t e r i a - f r e e b e a d s a s w e l l a s t h o s e c o n t a i n i n g b a c t e r i ae i t h e r w i t h o r w i t h o u t s k i m m i l k w e r e b u r i e d i n n y l o n n e t s i nt w o s o i l t y p e s ( l i g h t - t e x t u r e a n d h e a v y - t e x t u r e s o i l s ) a n de x a m i n e d w e e k l y f o r t h e i r b i o d e g r a d a t i o n . I n g e n e r a l , b e a d sc o n t a i n i n g s k i m m i l k w e r e d e g r a d e d a t a f a s t e r r a t e i n b o t hs o i l t y p e s ( F i g . 7A a n d B ) . D e g r a d a t i o n was more c o m p l e t ei n t h e h e a v y s o i l ( F i g . 7 B ) . P r e s e n c e o f b a c t e r i a i n s i d e t h eb e a d s d i d n o t a f f e c t t h e i r d e g r a d a t i o n . I n i n i t i a l l y s t e r i l i z e ds o i l s , b e a d s w e r e n o t d e g r a d e d f o r t h e f i r s t 3 w e e k s a n db e g a n t o d e g r a d e o n l y a f t e r 4 w e e k s ( F i g . 7 C a n d D ) . A t t h a tt i m e , t h e t o t a l b a c t e r i a l s o i l p o p ul a ti o n i n cr e as ed i n t h i ss t e r i l i z e d s o i l , p e r h a p s a s a r e s u l t o f s o i l c o n t a m i n a t i o n . I nn o n s t e r i l i z e d s o i l , t o t a l b a c t e r i a l p o p u l a t i o n r e m a i n e d c o n -s t a n t a n d was g r e a t e r i n h e a v y s o i l ( F i g . 7 E ) . The p o s s i b i l i t yo f b e a d d e g r a d a t i o n b y r o o t d e v e l o p m e n t was e l i m i n a t e d ,s i n c e r o o t s d i d n o t p e n e t r a t e t h e n y l o n n e t b a g s i n w h i c h t h eb e a d s w e r e m a i n t a i n e d . I n a d d i t i o n , when r o o t s w e r e i n o c -u l a t e d i n p e t r i d i s h e s t h e y d i d p e n e t r a t e t h e b e a d s b u t d i d n o t

1 0 9 4 B A S H A N


7/10

ALGINATE BEADS AS INOCULANT CA R R I E R S F O R B A C T E R IAT A B L E 2 . CFUs o f A z o sp i r i ll u m b r a s i l e n s e C d , d e g r e e o f b e a d s o l u b i l i t y , a n d d eg r e e o f b e a d d e gr a da t i o n o f a l g i n a t e b e a d s h a r d e n e d b ys e v e r a l p r o c e d u r e s a

N o . o f C F U b : D e g r e e o f D e g r e e o f d e g ra d a t i o nH a r d e n i n g p r o c e d u r e I m m e d i a t e l y a f t e r A f t e r s e c o n d a r y b e a d i n s o i l 6 w e e k s a f t e ri m m o b i l i z a t i o n b a c t e r i a l s o l u b i l i t y c i n o c u l a t i o n dm u l t i p l i c a t i o n

N o t t r e a t e d ( 1 . 0 5 + 0 . 0 5 ) x 1 0 2 ( 1 . 0 4 0 . 1 7 ) x 1 0 1 0 3 3G l u t a r a l d e h y d e + g e l a t i n ( 7 . 4 1 . 4 ) x 1 0 1 ( 9 . 4 0 . 1 1 ) x 1 0 9 1 . 8 0 . 2 0 . 9 0 . 1S o d i u m m e t a p e r i o d a t e + p o l y e t h y l e n e i m i n e ( 6 . 9 1 . 7 ) x 1 0 1 ( 8 . 8 t 0 . 1 9 ) x 1 0 9 1 . 4 0 . 3 1 . 2 t 0 . 2h y d r o c h l o r i d eP o l y e t h y l e n e i m i n e h y d r o c h l o r i d e + ( 9 . 1 t 0 . 0 4 ) x 1 0 ' ( 7 . 4 t 0 . 2 1 ) x 1 0 9 1 . 6 t 0 . 3 1 . 3 0 . 2g l u t a r a l d e h y d e

a F o r e a c h e x p e r i m e n t , 2 5 b e a d s a n d t h r e e r e p l i c a t e s w e r e u s e d .b T h e n u m b e r o f CFUs w a s d e t e r m i n e d i n b e a d f r a g m e n t s ; CFUs s h o u l d b e c o n s i d e r e d t h e m i n i m a l b a c t e r i a l n u m b e r .c S o l u b i l i t y s c a l e : 0 , n o s o l u b i l i t y ; 1 , v i s u a l d e t e r i o r a t i o n o f b e a d s u r f a c e ; 2 , d e t e r i o r a t i o n i n t o f r a g m e n t s ; 3 , t o t a l s o l u b i l i t y . F o r e a c h t r e a t m e n t , 1 0 0 b e a d s w e r et e s t e d .d B i o d e g r a d a t i o n s c a l e : 0 , n o d e g r a d a t i o n ; 1 , s l i g h t v i s i b l e d e g r a d a t i o n o n b e a d e d g e s ; 2 , o n e - h a l f t o t h r e e - f o u r t h s o f t h e b e a d d e g r a d e d ; 3 , f u l l d e g r a d a t i o n , t ot h e e x t e n t t h a t t h e b e a d s w e r e n o t f o u n d i n t h e n y l o n b a g . A s a m p l e o f 1 0 0 b e a d s w a s t e s t e d .c a u s e a n y a d d i t i o n a l v i s i b l e d a m a g e t o t h e m d u r i n g 4 w e e k sa f t e r i n o c u l a t i o n .I n o c u l a t i o n o f p l a n t s b y b e a d s u n d e r c o n t r o l l e d e n v i r o n -m e n t s . E x p e r i m e n t s w e r e c o n d u c t e d i n p e t r i d i s h e s c o n t a i n -i n g f i l t e r p a p e r a n d i n p o t s c o n t a i n i n g v a r i o u s t y p e s o f s o i l s

a 2 )

I C

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. 0 0a

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2 4 6 8 1 0 1 2w e e k sF I G . 5 . E f f e c t o f b e a d d r y i n g on s u r v i v a l o f b a c t e r i a i m m e d i a t e l ya f t e r d r y i n g ( A ) a n d a f t e r l o n g er p e r i o ds o f t i m e ( B ) . S y m b o l s : =,number o f b a c t e r i a i n wet b e a d s ; l 1 , number o f b a c t e r i a a f t e rl y o p h i l i z a t i o n ; E D I , number o f b a c t e r i a a f t e r a i r d r y i n g ; 0, s u r v i v a li n we t b e a d s w i t h s k i m m i l k ; 0, s u r v i v a l i n wet b e a d s w i t h o u t skimm i l k ; A , s u r v i v a l i n l y o p h i l i z e d b e a d s w i t h skim m i l k ; A, s u r v i v a l i nl y o p h i l i z e d b e a d s w i t h o u t s k i m m i l k . B a r s r e p r e s e n t t h e s t a n d a r d

e r r o r .

w i t h a m i x t u r e o f b e a d s w i t h a n d w i t h o u t s k i m m i l k a n d b yu s i n g w e t b e a d s a n d l y o p h i l i z e d b e a d s . T h e e x p e r i m e n t si n d i c a t e d t h a t p l a n t r o o t s w e r e c o l o n i z e d when b e a d s c o n -t a i n i n g b a c t e r i a w e r e u s ed . I n o c ul a t i on was b e t t e r i n a p e t r id i s h t h a n i n s o i l s . C o l o n i z a t i o n o f p l a n t r o o t s b y b e a di n o c u l a t i o n was s i m i l a r t o t h a t o b t a i n e d b y p e a t i n o c u l a t i o n .H o w e v e r , t h e v a r i a t i o n o f c o l o n i z a t i o n l e v e l b y b e a d s wass m a l l e r t h a n t h a t b y i n o c u l a t i o n w i t h p e a t ; i . e . , a l l t h e p l a n t s

I I I 11 o 0 -

v )c na

0C)0- a. 00

24 48 750h o u r s

F I G . 6 . B a c t e r i a l s l o w r e l e a s e f ro m beads w i t h t i m e . S y m b o l s :=, R e l e a s e f r o m b e a d s c o n t a i n i n g skim m i l k ; I = , r e l e a s e fr omb e a d s w i t h o u t s k i m m i l k ; 0, number of b a c t e r i a i n beads w i t h o u ts k i m m i l k ; 0, number o f b a c t e r i a i n beads with skim m i l k . Barsr e p r e s e n t t h e s t a n d a r d e r r o r .

oIl. I , I I ,

+ S l v A)

-S M3

5 1 .

9k8k7 k6k5k4 k3k

V O L . 5 1 , 1 9 8 6 1 0 9 5

I

E

I


8/10


xa )

. QC ]20

N. _

L L

0

w e e k sF I G . 7 . B i o d e g r a d a t i o n o f i m m o b i l i z e d b e a d s i n n a t u r a l l i g h t - t e x t u r e ( A ) a n d h e a v y - t e x t u r e ( B ) s o i l s a n d i n s t e r i l e l i g h t - t e x t u r e ( C ) a n dh e a v y - t e x t u r e ( D ) s o i l s a n d t h e b a c t e r i a l p o p u l a t i o n i n t h e s o i l ( E ) d u r i n g t h e c o u r s e o f e x p e r i m e n t . S y m b o l s : A , b e a d s c o n t a i n i n g b a c t e r i aa n d s k i m m i l k ; A , b e a d s w i t h s k i m m i l k a n d w i t h o u t b a c t e r i a ; 0 , b e a d s c o n t a i n i n g b a c t e r i a w i t h o u t s k i m m i l k ; 0 , a l g i n a t e b e a d s o n l y ; 0 ,s t e r i l i z e d h e a v y - t e x t u r e s o i l ; * , n a t u r a l h e a v y - t e x t u r e s o i l ; , n a t u r a l l i g h t - t e x t u r e s o i l ; V , s t e r i l i z e d l i g h t - t e x t u r e s o i l . B a r s r e p r e s e n t t h es t a n d a r d e r r o r . B i o d e g r a d a t i o n s c a l e : 0 , n o d e g r a d a t i o n ; 1 , s l i g h t v i s i b l e d e g r a d a t i o n o n b e a d e d g e s ; 2 , o n e - h a l f t o t h r e e - f o u r t h s o f t h e b e a dd e g r a d e d ; 3 , f u l l d e g r a d a t i o n t o t h e e x t e n t t h a t t h e b e a d s w e r e n o t f o u n d i n t h e n y l o n b a g .

were i n o c u l a t e d a t a b o u t t h e same l e v e l , a phenomenon t h a td i d n o t occur w i t h p e a t i n o c u l a n t . S l i g h t d i f f e r e n c e s weref o u n d b e t w e e n t h e t y p e s o f s o i l s . Wet b e a d s i n o c u l a t e dp l a n t s b e t t e r t h a n d r y ones, b u t t h e d i f f e r e n c e was n o ts i g n i f i c a n t ( F i g . 8A a n d B ) .B e a d f o r m a t i o n w i t h i o t a - c a r r a g e e n a n . I o t a - c a r r a g e e n a nb e a d s were f o r m e d b y t h e same m e t h o d as a l g i n a t e b e a d sa n d h a d a s i m i l a r appearance. H o w e v e r , t h e i r i n t e r n a l s t r u c -t u r e was w e a k . A f t e r b a c t e r i a l m u l t i p l i c a t i o n i n s i d e t h eb e a d s , 4 4 + 8 % o f t h e t o t a l n u m b e r o f t h e s e b e a d s wasf r a g m e n t e d , a n d t h e r e m a i n i n g b e a d s were v e r y f r a g i l e a n dd e t e r i o r a t e d a f t e r l y o p h i l i z a t i o n .

DISCUSSIONB a c t e r i a l i n o c u l a t i o n o f p l a n t r o o t s w i t h b e n e f i c i a lr h i z o s p h e r e b a c t e r i a , s u c h as A z o s p i r i l l u m s p . a n d P s e u -domonas s p . , p r e s e n t s many d i f f i c u l t p r o b l e m s . B a c t e r i as h o u l d r e a c h t h e r o o t e v e n i f t h e r o o t s y s t e m i s w i d e l yd i s p e r s e d ; s o i l p a r t i c l e s a d s o r b e d t h e b a c t e r i a i n g r e a t num-

b e r s , a n d b a c t e r i a l a p p l i c a t i o n s h o u l d b e a t t h e p r e c i s e t i m en e e d e d b y t h e p l a n t s ( 6 ; Y . B a s h a n , S o i l B i o l . B i o c h e m . , i np r e s s ) . I n a d d i t i o n , i n o c u l a t i o n t e c h n i q u e s s h o u l d b e p r a c t i -c a l f o r t h e f a r m e r a n d s i m p l e t o a p p l y . I n o c u l a t i o n o fn o n i r r i g a t e d p l a n t s , s u c h a s w h e a t sown i n d r y s o i l , i s f u r t h e rc o m p l i c a t e d ; b a c t e r i a s h o u l d r e m a i n v i a b l e i n t h e d r y s o i l f o ra l o n g t i m e , u n t i l i t r a i n s , a n d s h o u l d p r o l i f e r a t e r a p i d l y a n di m m e d i a t e l y t o c o l o n i z e t h e r o o t s y s t e m o f t h e s e e d l i n g whent h e s e e d g e r m i n a t e s ( 2 ) . A l l t h e s e d i f f i c u l t i e s may e x p l a i n t h el i m i t e d c o m m e r c i a l u s e o f b a c t e r i a l i n o c u l a t i o n , e x c e p t f o rt h e l e g u m e - R h i z o b i u m s y s t e m ( 2 7 ) . To d a t e , o n l y a f e wd i f f e r e n t m e t h o d s o f i n o c u l a t i o n a r e u s e d ; t h e s i m p l e s t a n dp r i m i t i v e i n o c u l a t i o n m e t h o d i s t h e a p p l i c a t i o n o f b a c t e r i a i nl i q u i d b r o t h ( 1 , 1 8 , 2 3 , 2 5 ) o r d r i e d b a c t e r i a l c u l t u r e s o n s e e d s( 2 8 ) . More r e l i a b l e p r o c e d u r e s u s e v a r i o u s o r g a n i ci n o c u l a n t s , m o s t o f w h i c h a r e b a s e d o n p e a t ( 1 5 , 2 4 ) . T h e s ei n o c u l a n t s c a n n o t s o l v e m o s t o f t h e p r o b l e m s r a i s e d a b o v e ,t h u s r e s u l t i n g i n i n c o n s i s t e n t r e s u l t s .T h e t y p e o f b a c t e r i a l i n o c u l a n t d e s c r i b e d i n t h i s s t u d y may

1 0 9 6 BA S HAN


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ALGINATE BEADS AS INOCULANT CARRIERS FO R BACT E R IA

'I)

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F I G . 8 . L e v e l o f i n oc u la t ed b a c t e r i a i n w h e a t r o o t a f t e r i n o c u l a -t i o n w i t h wet b e a d s (A ) a n d l y o p h i l i z e d b e a d s ( B ) i n p e t r i d i s h e sc o n t a i n i n g f i l t e r paper ( =) a n d i n p o t s c o n t a i n i n g v e r m i c u l i t e( EW ) , b r o wn - r e d d e g r a d i n g s a n d s o i l ( C ), a l l u v i a l s o i l ( 1 1 1 ) , a n dl o e s s raw s o i l (E). E, L e v e l o f p l a n t i n o c u l a t i o n w i t h p e a ti n o c u l a n t . B a r s r e p r e s e n t t h e s t a n d a r d e r r o r .f u l f i l l many o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r a g o o d p r a c t i c a li n o c u l a n t . I t i s d r y , s y n t h e t i c , s i m p l e t o use, u n i f o r m ,b i o d e g r a d a b l e b y s o i l m i c r o o r g a n i s m s , a n d n o n t o x i c i n na-t u r e ; i t c o n t a i n s a l a r g e u n i f o r m b a c t e r i a l p o p u l a t i o n , pro-v i d e s f o r t h e s l o w release o f t h e b a c t e r i a f o r l o n g p e r i o d s ,causes n o e c o l o g i c a l p o l l u t i o n , may b e p r o d u c e d o n a l a r g es c a l e b y t h e proper i n d u s t r y ; a n d i t s b i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s -t i c s ca n b e e f f e c t i v e l y c o n t r o l l e d b y m a n i p u l a t i n g i t s c h e m -i c a l f e a t u r e s . T h e b e a d s ca n b e s t o r e d f o r l o n g p e r i o d s i n ar e l a t i v e l y s m a l l v o l u m e w i t h o u t a n y a p p a r e n t e f f e c t on t h es i z e o f t h e b a c t e r i a l p o p u la t i on . Q u a l i t y c o n t r o l o f b a c t e r i a ln u m b e r i s s i m p l e , a n d t h e b a c t e r i a r e l e a s e d f r o m t h e b e a d sca n i n o c u l a t e t h e p l a n t s e f f i c i e n t l y .R e c e n t l y , b y e n c a p s u l a t i o n o f s e v e r a l b i o c o n t r o l a g e n t s o fp l a n t d i s e a s e s i n an a l g i n a t e - c l a y m a t r i x , F r a v e l e t a l . ( 1 1 )s h o w e d t h a t v a r i o u s f u n g i s p e c i e s s u r v i v e d w e l l i n t h e d r ym a t r i x . H o w e v e r , c e l l s o f Pseudomonas c e p a c i a d i e d d u r i n gt h e e n c a p s u l a t i o n process, s i m i l a r t o A . b r a s i l e n s e Cd i n t h i ss t u d y . S i n c e n o s e c o n d a r y b a c t e r i a l m u l t i p l i c a t i o n o f P .c e p a c i a was i n d u c e d , i t was a s s u m e d t h a t a l g i n a t e - c l a yb e a d s w e r e n o t a s u i t a b l e c a r r i e r f o r t h i s Pseudomonass p e c i e s . I n a d d i t i o n , t h e v i a b i l i t y o f most o r g a n i s m s t e s t e dh i t h e r t o d e c r e a s e d a p p r e c i a b l y w i t h s t o r a g e t i m e . O n t h eo t h e r h a n d , s t u d i e s w i t h e n t r a p p e d R h i z o b i u m i n v a r i o u sn o n s t e r i l e p o l y m e r g e l s b y n o n s t e r i l e p r o c e d u r e s ( 9 , 1 4 )s h o w e d t h a t t h e e n t r a p p i n g process d i d n o t s i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e e i t h e r t h e number o f b a c t e r i a o r t h e i r v i a b i l i t y asshown i n t h e p r e s e n t s t u d y a n d i n t h e work o f F r a v e l e t a l .( 1 1 ) .From b i o l o g i c a l a n d a g r i c u l t u r a l s t a n d p o i n t s , t h e b e a d ss o l v e some o f t h e m a i n p r o b l e m s o f i n o c u l a t i o n o f b e n e f i c i a lr h i z o s p h e r e b a c t e r i a . T h e i r a p p l i c a t i o n c o n c o m i t a n t l y w i t hs o w i n g a n d b y t h e same d e v i c e s w i l l save a d d i t i o n a l t r e a t -ment a n d r e q u i r e s no c h a n g e i n a g r o t e c h n i c a l p r o c e d u r e s . I na d d i t i o n , t h e b e a d s r e m a i n u n d e g r a d e d i n t h e d r y f i e l d u n t i l

i t r a i n s ( Y . B a s h a n , u n p u b l i s h e d d a t a ) . A t t h i s s t a g e , t h eg e r m i n a t i o n o f t h e s e e d s w i l l b e a c c o m p a n i e d b y t h e " a w a k -e n i n g " o f t h e b a c t e r i a , w h i c h w i l l t h u s r e a c h t h e g e r m i n a t i n gs e e d a t t h e r i g h t p l a c e a n d t i m e . S i n c e t h e o p t i m a l i n o c u l a -t i o n t i m e i s n o t a l w a y s known ( B a s h a n , S o i l B i o l . B i o c h e m . ,i n p r e s s ) , t h e s l o w r e l e a s e o f t h e b a c t e r i a w i l l e n s u r e ac o n s t a n t s u p p l y o f t h e b a c t e r i a o v e r a r e l a t i v e l y l o n g p e r i o d .M o r e o v e r , t h e n u m b e r o f r e l e a s e d b a c t e r i a c a n b e c o n t r o l l e db y t h e h a r d e n i n g p r o c e d u r e . A d d i t i o n a l l y , s i n c e t h e y o u n gr o o t s w i l l b e c l o s e t o t h e b a c t e r i a l s o u r c e , t h i s may r e d u c et h e p r o b l e m o f b a c t e r i a l a d s o r p t i o n t o s o i l p a r t i c l e s ( Y .B a sh a n , u n p u bl i sh e d d a t a ) .The b i o d e g r a d a t i o n o f t h e b e a d s d e p e n d s o n s o i lm i c r o f l o r a . T h e h i g h e r t h e d e n s i t y o f t h e m i c r o f l o r a s u r -r o u n d i n g t h e b e a d , t h e f a s t e r t h e b i o d e g r a d a t i o n . B i o d e g r a -d a t i o n i s c a r r i e d o u t f r o m t h e o u t s i d e l a y e r i n w a r d , t h u ss e q u e n t i a l l y e x p o s i n g d i f f e r e n t l a y e r s o f t h e b e a d t o t h es u r r o u n d i n g s o i l u n t i l d e g r a d a t i o n o f t h e b e a d i s c o m p l e t e .E n c a p s u l a t i o n o f s e e d s w i t h a l g i n a t e - c o n t a i n i n g A .b r a s i l e n s e Cd was f o u n d i m p r a c t i c a l ; t h e r e l a t i v e l y h i g hm o i s t u r e o n t h e s e e d s r e q u i r e d t o k e e p t h e b a c t e r i a a l i v et e n d e d t o c a u s e g e r m i n a t i o n , a n d t h u s s e e d s c o u l d n o t b em e c h a n i c a l l y s o w n . When t h e b e a d s were a i r d r i e d , most o ft h e b a c t e r i a d i e d , w h e r e a s l y o p h i l i z a t i o n o f c o a t e d s e e d sk i l l e d t h e s e e d s . A d d i t i o n a l l y , a s m e n t i o n e d , t h e i m m o b i l i -z a t i o n p r o c e d u r e r e s u l t e d i n t h e d e a t h o f m o s t b a c t e r i a , a n da s e c o n d m u l t i p l i c a t i o n o f b a c t e r i a i n s i d e t h e b e a d s wasn e e d e d . S u c h m u l t i p l i c a t i o n c a n n o t b e d o n e i n t h e p r e s e n c eo f s e e d s w i t h o u t t h e b e g i n n i n g o f s e e d g e r m i n a t i o n .A l t h o u g h h i s p a p e r p r e s e n t s d a t a on two r h i z o s p h e r eb a c t e r i a , t h e s y s t e m i s c a p a b l e o f u s i n g many o t h e r b e n e f i -c i a l r h i z o s p h e r e b a c t e r i a o f t h e g e n e r a P s e u d o m o n a s , B a c i l -l u s , A z o t o b a c t e r , a n d K l e b s i e l l a ( Y . B a s h a n , u n p u b l i s h e dd a t a ) , a n d i t may b e r e c o m m e n d e d f o r t h e i n o c u l a t i o n o fr h i z o b i a a n d g r o w t h - p r o m o t i n g b a c t e r i a o f t h e g e n u s P s e u -d o m o n a s a s w e l l .To d a t e , t h e b e a d p r o d u c t i o n h a s b e e n c a r r i e d o u t on ar e l a t i v e l y s m a l l s c a l e , a n d a s c a l i n g - u p p r o c e d u r e f o r f u l lc o m m e r c i a l i z a t i o n i s n e e d e d . From t h e a n a l y s i s o f t h e a v a i l -a b l e d a t a on t h e p r e s e n t p r o c e d u r e , i t i s s u g g e s t e d t h a t t h ec o n c e p t o f b a c t e r i a l s y n t h e t i c i n o c u l a n t s o p e n s a n e w a p -p r o a c h i n t h i s f i e l d o f r e s e a r c h .

ACKNOWLEDGMENTSI t h a n k S . M a r g e l f r o m t h e M a t e r i a l s R e s e a r c h D e p a r t m e n t o f t h eW e i z m a n n I n s t i t u t e o f S c i e n c e f o r h i s v a l u a b l e a d v i c e c o n c e r n i n g t h ec h o i c e o f m a t e r i a l , M . F e l d m a n f r o m my d e p a r t m e n t f o r h e l p f u ld i s c u s s i o n s , H . L e v a n o n y , O r i t Z i v , a n d D o r i F i l o n f o r e x c e l l e n tt e c h n i c a l a s s i s t a n c e , E . K l e i n f o r s c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p y , a n dY . A vi vi f o r h i s c a r e f u l c r i t i c i s m a n d e d i t i n g o f t h e m a n u s c r i p t .I am a r e c i p i e n t o f a S i r C h a r l e s C l o r e f e l l o w s h i p .

LITERATURE CITED1 . A l b r e c h t , S . L . , Y . O k o n , J . L o n n q u i s t , a n d R . H . B u r m s . 1 9 8 1 .N i t r o g e n - f i x a t i o n b y c o r n - A z o s p i r i l l u m a s s o c i a t i o n s i n a t e m p e r -a t e c l i m a t e . C r o p S c i . 2 1 : 3 0 1 - 3 0 6 .2 . B a s h a n , Y . 1 9 8 6 . E n h a n c e m e n t o f w h e a t r o o t c o l o n i z a t i o n a n dp l a n t d e v e l o p m e n t b y A z o s p i r i l l u m b r a s i l e n s e C d . f o l l o w i n gt e m p o r a r y d e p r e s s i o n o f t h e r h i z o s p h e r e m i c r o f l o r a . A p p l .E n v i r o n . M i c r o b i o l . 5 1 : 1 0 6 7 - 1 0 7 1 .3 . B a s h a n , Y . , a n d H . L e v a n o n y . 1 9 8 5 . An i m p r o v e d s e l e c t i o nt e c h n i q u e a n d medium f o r t h e i s o l a t i o n a n d e n u m e r a t i o n o fA z o s p i r i l l u m b r a s i l e n s e . C a n . J . M i c r o b i o l . 3 1 : 9 4 7 - 9 5 2 .4 . B i r n b a u m , S . , R . P e n d l e t o n , P . 0 . L a r s s o n , a n d K . M o s b a c h .1 9 8 1 . C o v a l e n t s t a b i l i z a t i o n o f a l g i n a t e g e l f o r t h e e n t r a p m e n t o fl i v i n g w h o l e c e l l s . B i o t e c h n o l . L e t t . 8 : 3 9 3 - 4 0 0 .5 . B r o d e l i u s , P . , a n d K . N i l s s o n . 1 9 8 0 . E n t r a p m e n t o f p l a n t c e l l s i n

V O L . 5 1 , 1 9 8 6 1 0 9 7


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A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .d i f f e r e n t m a t r i x . FE B S L e t t . 1 2 2 : 3 1 2 - 3 1 6 .6 . B r o w n , M. E . 1 9 7 4 . S e e d a n d r o o t b a c t e r i z a t i o n . A n n u . R e v .P h y t o p a t h o l . 1 2 : 1 8 1 - 1 9 7 .7 . C h i b a t a , I . , a n d T . T o s a . 1 9 7 7 . T r a n s f o r m a t i o n o f o r g a n i cc o m p o u n d s b y i m m o b i l i z e d m i c r o b i a l c e l l s . A d v . A p p l . M i c r o -b i o l . 2 2 : 1 - 2 7 .8 . C o t t r e l l , I . W . , a n d P . K o v a c s . 1 9 7 7 . A l g i n , p . 4 3 8 - 4 6 3 . I n H . D .G r a h a m ( e d . ) , F o o d c o l l o i d s . AV I P u b l i s h i n g C o . , W e s t p o r t ,C o n n .9 . D o m m e r g u e s , Y . R . , H . G . D i e m n , a n d C . D i v i e s . 1 9 7 9 . P o l y a c r y l -a m i d e - e n t r a p p e d R h i z o b i u m a s a n i n o c u l a n t f o r l e g u m es . A p p l .E n v i r o n . M i c r o b i o l . 3 7 : 7 7 9 - 7 8 1 .1 0 . E s k e w , D . L . , D . D . F o c h t , a n d I . P . T i n g . 1 9 7 7 . N i t r o g e nf i x a t i o n , d e n i t r i f i c a t i o n , a n d p l e o m o r p h i c g r o w t h i n h i g h l y p i g -m e n t e d S p i r i l l u m l i p o f e r u m . A p p l . E nv i r o n . M i c r o b i o l .3 4 : 5 8 2 - 5 8 5 .1 1 . F r a v e l , D . R . , J . J . M a r o i s , R . D . L u m s d e n , a n d W. J . C o n n i c k ,J r . 1 9 8 5 . E n c a p s u l a t i o n o f p o t e n t i a l b i o c o n t r o l a g e n t s i n a na l g i n a t e - c l a y m n a t r i x . P h y t o p a t h o l o g y 7 5 : 7 7 4 - 7 7 7 .1 2 . F u k u i , S . , a n d A . T a n a k a . 1 9 8 2 . I m m o b i l i z e d m i c r o b i a l c e l l s .A n n u . R e v . M i c r o b i o l . 3 6 : 1 4 5 - 1 7 2 .1 3 . H a c k e l , U . , J . K l e i n , R . M e g n e t , a n d F . W a g n e r . 1 9 7 5 . I m m o -b i l i z a t i o n o f m i c r o b i a l c e l l s i n p o l y m e r i c m a t r i c e s . E u r . J . A p p l .M i c r o b i o l . 1 : 2 9 1 - 2 9 3 .1 4 . J u n g , G . , J . M u g n i e r , H . G . D i e m , a n d Y . R . D o m m e r g u e s . 1 9 8 2 .P o l y m e r - e n t r a p p e d r h i z o b i u m a s a n i n o c u l a n t f o r l e g u m e s . P l a n tS o i l 6 5 : 2 1 9 - 2 3 1 .1 5 . K a p u l n i k , Y . , S . S a r i g , I . N u r , Y . O k o n , J . K i g e l , a n d Y . H e n i s .1 9 8 1 . Y i e l d i n c r e a s e s i n summer c e r e a l c r o p s i n I s r a e l i f i e l d si n o c u l a t e d w i t h A z o s p i r i l l u m . E x p . A g r i c . 1 7 : 1 7 9 - 1 8 7 .1 6 . K i e r s t a n , M . , a n d C . B u c k e . 1 9 7 7 . T h e i m m ob i l i z a t i o n o f m i c ro -b i a l c e l l s , s u b c e l l u l a r o r g a n e l l e s , a n d e n z y m e s i n c a l c i u m a l g i -n a t e g e l s . B i o t e c h n o l . B i o e n g . 1 9 : 3 8 7 - 3 9 7 .1 7 . K l o e p p e r , J . W . , M. N . S c h r o t h , a n d T . D . M i l l e r . 1 9 8 0 . E f f e c t so f r h i z o s p h e r e c o l o n i z a t i o n b y p l a n t g r o w t h - p r o m o t i n gr h i z o b a c t e r i a o n p o t a t o p l a n t d e v e l o p m e n t a n d y i e l d .

P h y t o p a t h o l o g y 7 0 : 1 0 7 8 - 1 0 8 2 .1 8 . M i l l e t , E . , a n d M. F e l d m a n . 1 9 8 4 . Y i e l d r e s p o n s e o f a commons p r i n g w h e a t c u l t i v a r t o i n o c u l a t i o n w i t h A z o s p i r i l l u mb r a s i l e n s e a t v a r i o u s l e v e l s o f n i t r o g e n f e r t i l i z a t i o n . P l a n t S o i l8 0 : 2 5 5 - 2 5 9 .1 9 . M u g u i e r , J . , a n d G . J u n g . 1 9 8 5 . S u r vi v al o f b a c t e r i a a n d f u n g i i nr e l a t i o n t o w a t e r a c t i v i t y a n d t h e s ol ve n t p r o p e r t i e s o f w a t e r i nb i o p o l y m e r g e l s . A p p l . E n v i r o n . M i cr o b io l . 5 0 :1 0 8 -1 1 4 .2 0 . N i l s s o n , K . , a n d K . M o s b a c h . 1 9 8 0 . P r e p a r a t i o n o f i m m o b i l i z e da n i m a l c e l l s . FEBS L e t t . 1 1 8 : 1 4 5 - 1 5 0 .2 1 . O h l s o n , S . , P . 0 . L a r s s o n , a n d K . M o s b a c h . 1 9 7 9 . S t e r o i dt r a n s f o r m a t i o n b y l i v i n g c e l l s i m m o b i l i z e d i n c a l c i u m a l g i n a t e .E u r . J . A p p l . M ic r o bi o l. B io t e c h no l . 7 : 1 0 3 - 1 1 0 .2 2 . O k o n , Y . 1 9 8 5 . A z o s p i r i l l u m a s a p o t e n t i a l i n o c u l a n t f o r a g r i c u l -t u r e . T r e n d s B io t e ch n o l. 3 : 2 2 3- 2 2 8 .2 3 . R e y n d e r s , L . , a n d K . V l a s s a k . 1 9 8 2 . U s e o f A z o s p i r i l l u mb r a s i l e n s e a s b i o f e r t i l i z e r i n i n t e n s i v e w h e a t c r o p p in g . P la n t S o i l6 6 : 2 1 7 - 2 2 3 .2 4 . S a r i g , S . , Y . K a p u ln i k, I . N u r , a n d Y . O k o n . 1 9 8 4 . R e s p o n s e o fn o n - i r r i g a t e d S o r g h u m b i c o l o r t o A z o s p i r i l l u m i n o c u l a t i o n . E x p .A g r i c . 2 0 : 5 9 - 6 6 .2 5 . S m i t h , R . L . , S . C . S c h a n k , J . R . M i l a m , a n d A . A .B a l t e n s p e r g e r . 1 9 8 4 . R e s p o n s e s o f Sorghum a n d P e n n i se t u ms p e c i e s t o t h e N 2 - f i x i n g b a c t e r i u m A z o s p i r i l l u m b r a s i l e n s e .A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 4 7 : 1 3 3 1 - 1 3 3 6 .2 6 . T a k a t a , I . , T . T o s a , a n d I . C h i b a t a . 1 9 7 7 . S c r e e n i n g o f m a t r i xs u i t a b l e f o r i m mo b il i z a t i o n o f m i c r o b i a l c e l l s . J . S o l i d - P h a s eB i o c h e m . 2 : 2 2 5 - 2 3 6 .2 7 . T h o m p s o n , J . A . 1 9 8 0 . P r o d u c t i o n a n d q u a l i t y c o n t r o l o f l e g u m ei n o c u l a h t s , p . 4 8 9 - 5 3 3 . I n F . J . B e r g e r s e n ( e d . ) , M e t h o d s o fe v a l u a t i n g b i o l o g i c a l n i t r o g e n f i x a t i o n . J o h n W i l e y & S o n s , I n c . ,Ne w Y o r k .2 8 . W i l k i n s o n , H . T . , D . M. W e l l e r , a n d J . R . A l l d r e d g e . 1 9 8 2 .E n h a n c e d b i o l o g i c a l c o n t r o l o f w h e a t t a k e - a l l w h e n i n h i b i t o r yP s e u d o m o n a s s t r a i n s a r e i n t r o d u c e d a s i n o c u l u m o n s e e d a so p p o s e d t o d i r e c t l y i n t o s o i l . P h y t o p a t h o l o g y 7 2 : 9 4 8 - 9 4 9 .

1 0 9 8 BA S HAN

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