lavanda je biljka s područja sunčanih kamenjara zapadnog dijela

Sveučilište u ZagrebuPrehrambeno-biotehnološki fakultet

Preddiplomski studij Prehrambena tehnologija(Nutricionizam)

Kristina Greblo5276/N

ANTIOKSIDATIVNO I ANTIMIKROBNO

DJELOVANJE ETERIČNOG ULJA I EKSTRAKATA

LAVANDEZAVRŠNI RAD

Modul: Začinsko i aromatsko bilje

Mentor: dr. sc. Verica Dragović-Uzelac, izv.prof.

Zagreb, 2009.

ANTIOKSIDACIJSKO I ANTIMIKROBNO DJELOVANJE ETERIČNIH ULJA I EKSTRAKATA LAVANDE

DOKUMENTACIJSKA KARTICAZavršni rad

Sveučilište u Zagrebu

Prehrambeno-biotehnološki fakultet

Preddiplomski studij Prehrambena tehnologija (Nutricionizam)

Zavod za prehrambeno-tehnološko inženjerstvo

Laboratorij za procese konzerviranja i preradu voća i povrća

ANTIOKSIDATIVNO I ANTIMIKROBNO DJELOVANJE ETERIČNOG ULJA I

EKSTRAKATA LAVANDE

Kristina Greblo, 5276/N

Sažetak: U etanolnim i acetonskim ekstraktima sušene lavande s četiri različita područja

Republike Hrvatske: (Vižinada, Fužine, Hvar, Donja Bistra) istraživani su ukupni fenoli,

flavonoidi, neflavonoidi, antioksidacijski kapacitet te antimikrobna aktivnost. Ukupni fenoli i

flavonoidi određeni su spektrofotometrijski, antioksidacijski kapacitet DPPH i FRAP

metodom, dok je antimikrobno djelovanje (ekstrakata i eteričnih ulja lavande) provedeno na

bakterijama Staphyloccocus aureus i Escherichia coli. Prema rezultatima istraživanja tlo i

klimatski uvjeti značajno utječu na količinu fenolnih spojeva lavande, a u ukupnoj količini

fenola prevladavaju neflavonoidi. Lavanda s primorskog područja RH sadrži značajno veće

količine fenolnih spojeva, te ima veći antioksidacijski kapacitet i antimikrobno djelovanje.

Eterična ulja imaju značajnu antimikrobnu aktivnost, čak značajno veću u odnosu na ekstrakte

lavande.

Ključne riječi: lavanda, eterična ulja, fenolni spojevi, antioksidacijski kapacitet,

antimikrobna aktivnost

Rad sadrži: 48 stranica, 18 slika, 4 tablice, 73 literaturnih navoda, 3 priloga

Jezik izvornika: hrvatski

Rad je u tiskanom i elektronickom (pdf format) obliku pohranjen u: Knjižnica

prehrambeno-biotehnološkog fakulteta, Kačićeva 23, Zagreb

Mentor: dr. sc. Verica Dragović-Uzelac, izv.prof.

Pomoć pri izradi: Sanja Lončarić, inž., Maja Repajić, asistent

Rad predan: 17. srpanj 2009.

1


BASIC DOCUMENTATION CARDFinal work

University of Zagreb

Faculty of Food Technology and Biotechnology

Undergraduate studies Food Technology, (Nutrition)

Department of food technology engineering

Laboratory for technology of fruit and vegetables preservation and processing

ANTIOXIDANT AND ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF ESSENTIAL OILS AND

EXTRACTS OF LAVANDER

Kristina Greblo, 5276/N

Abstract: In ethanolic and aceton extracts of dry lavender from 4 different region Republic of

Croatia (RH) (Vižinada, Fužine, Hvar, Donja Bistra), total phenols, flavonoids, non-

flavonoids, antioxidant capacity and antimicrobial activity were investigated. Total phenols

were determined spectrophotometricly, antioxidant capacity with DPPH and FRAP methods;

while the antimicrobial effect (of extracts and essential oils) was conducted on

Staphyloccocus aureus and Escherichia coli bacteria’s. According to the obtained results, soil

and climate conditions remarkable influenced on amount of phenolic compounds of lavender,

and in total phenols non-flavonoids were predominant. Lavender from coastal region of RH

contained higher amounts of phenolic compounds; had higher antioxidant capacity and

antimicrobial activity. Essential oil had remarkable antimicrobial activity, even remarkable

higher compare to lavender's extracts.

Keywords: lavander, essential oils, polyphenols, antioxidant capacity, antimicrobial activity

Thesis contains: 48 pages, 18 figures, 4 tables, 73 references, 3 supplements

Original in: Croatian

Final work in printed and electronic (pdf format) version is deposited in: Library of the

Faculty of Food Technology and Biotechnology, Kačićeva 23, Zagreb

Mentor: PhD. Verica Dragović-Uzelac, Associated Professor

Technical support and assistance: Sanja Lončarić, ing., Maja Repajić, asistant.

Thesis delivered: 17 July 2009

2


SADRŽAJ

1. UVOD..................................................................................................................................................................1

2. TEORIJSKI DIO............................................................................................................................................ 2

2.1. LAVANDA (Lavandula angustifolia)..........................................................................................................22.1.1. Osnovne karakteristike lavande...........................................................................................................22.1.2. Raznolikost vrsta.................................................................................................................................32.1.3. Rasprostranjenost................................................................................................................................62.1.4. Kemijski sastav svježe lavande i eteričnog ulja lavande.....................................................................72.1.5. Djelovanje i upotreba svježe lavande i eteričnog ulja lavande............................................................8

2.2. FENOLNI SPOJEVI.................................................................................................................................102.2.1. Flavonoidi.........................................................................................................................................102.2.2. Fenolne kiseline i srodni spojevi.......................................................................................................12

2.2.2.1. Hidroksicimetne kiseline...........................................................................................................122.2.2.2. Hidroksibenzojeve kiseline........................................................................................................13

2.2.3. Fenolni spojevi lavande.....................................................................................................................14

2.3. ANTIOKSIDACIJSKI KAPACITET..........................................................................................................15

2.4. METODE ODREĐIVANJA ANTIOKSIDACIJSKOG KAPACITETA.......................................................15

2.5. ANTIMIKROBNA AKTIVNOST................................................................................................................172.5.1. Antimikrobna aktivnost lavande.......................................................................................................172.5.2. Test mikroorganizmi korišteni u istraživanju....................................................................................18

2.5.2.1. Staphylococcus aureus...............................................................................................................182.5.2.2. Escherichia coli.........................................................................................................................18

3. EKSPERIMENTALNI DIO............................................................................................................................ 19

3.1. MATERIJALI............................................................................................................................................19

3.2. METODE RADA.......................................................................................................................................193.2.1. Ekstrakcija fenolnih spojeva.............................................................................................................203.2.2. Određivanje ukupnih fenola i flavonoida..........................................................................................213.2.3. Određivanje antioksidacijskog kapaciteta.........................................................................................25

3.2.3.1. DPPH (2,2-difenil-pikrilhidrazi) metoda...................................................................................253.2.3.2. FRAP (eng. Ferric Reducing Antioxidant Power) metoda.........................................................27

3.2.4. Određivanje antimikrobne aktivnosti................................................................................................30

4. REZULTATI............................................................................................................................................... 31

5. RASPRAVA............................................................................................................................................... 37

5.1. FENOLNI SPOJEVI U EKSTRAKTU SUŠENE LAVANDE......................................................................37

5.2. ANTIOKSIDACIJSKI KAPACITET EKSTRAKTA SUŠENE LAVANDE...................................................39

5.3. ANTIMIKROBNO DJELOVANJE ETERIČNIH ULJA I EKSTRAKTA LAVANDE...................................40

6. ZAKLJUČAK.............................................................................................................................................. 42

7. LITERATURA......................................................................................................................................................43

3


1. UVOD

Lavanda (Lavandula officinalis Chaix) je biljka s područja sunčanih kamenjara

zapadnog dijela Sredozemlja, poznata pod narodnim imenima: lavandula, lavendl, lefendel; a

pripada porodici usnača (Lamiaceae). Već u srednjem vijeku bile su poznate vrste lavande

koje se i danas uzgajaju. Prvi zapis o biljci Lavandula angustifolia Mill potječe iz XIII.

stoljeća pa se to vrijeme smatra početkom širenja te vrste u srednjoj Europi. Uzgoj hibrida

Lavandula intermedia počinje u XVI. stoljeću. Danas postoji više od 30 podvrsta i hibrida ove

plemenite biljke sa raznim bojama cvijetova. Lavanda (Lavandula angustifolia) originalna je

biljka iz koje su stoljećima ljudi stvarali razne hibride i podvrste. Ona je ljubičaste boje te je

vrlo prepoznatljiva i intenzivnog mirisa, najčešće je viđamo na mediteranu kako raste na

svom prirodnom staništu, no raširena je i u unutrašnjosti Francuske i Engleske.

Lavanda je bogat izvor različitih skupina fenolnih spojeva (fenolnih kiselina i

flavonoida) kojima se pripisuju antioksidativna, antimikrobna, antiseptička, protuupalna i

druga svojstva. Količina fenolnih spojeva u biljnim vrstama značajno ovisi o brojnim

faktorima kao što su vrsta tla, ekološki i klimatski uvjeti i sl. Lavandino eterično ulje u

farmaciji se uglavnom primjenjuje kao sastojak različitih linamenata za utrljavanje kod

reumatizma, lumbaga, bolova u mišićima i zglobovima. Ima antiseptičko i analgetsko

djelovanje, a u aromaterapiji, lavanda se koristi za mnoge vrste kožnih upala. Ulje lavande se

koristi kao komponenta za okus prehrambenih proizvoda, uključujući i alkoholna i

bezalkoholna pića, aromatičnim octovima, pečenim namirnicama, bombonima, smrznutim

mliječnim desertim, gelatini i pudinzima

Stoga je cilj ovog rada bio odrediti količinu ukupnih fenola i flavonoida u

ekstraktima sušene lavande s različitih područja Republike Hrvatske te usporedti kojim se

otapalom postiže bolja ektrakcija (30%-tnom vodenom otopinom etanola ili 30%-tnom

vodenom otopinom acetona). Cilj je također bio odrediti antioksidativno i antimikrobno

djelovanje eteričnog ulja i ekstrakata lavande. Ukupni fenoli određeni su

spektrofotometrijski primjenom Folin-Ciocalteu metode, antioksidacijski kapacitet

određivan je primjenom DPPH i FRAP metode. Antimikrobno djelovanje etanolnih

ekstrakata sušene lavande te eteričnih ulja, provedeno je na mikroorganizmima

Staphylococcus aureus i Escherichii coli.

4


2. TEORIJSKI DIO

2.1. LAVANDA (Lavandula angustifolia)

2.1.1. Osnovne karakteristike lavande

Lavanda je od davnina bila jedna od najomiljenijih aromatičnih ljekovitih biljaka. U

Novom zavjetu Sveti Marko govori o eteričnom ulju lavande, kao o vrlo vrijednom ulju.

Rimljani su lavandom davali ugodan miris kupeljima pa odatle i njeno ime, koje potječe od

riječi lavare, što znači prati se. Za vrijeme Plinija, rimljani su lavandu koristili kao ljekovito

svojstvo (Upson T, Andrews S., 2004). U antici je osim mirisa, lavanda bila cijenjena i zbog

svog umirujućeg i dezinficirajućeg djelovanja, a u srednjem vijeku i renesansi lavanda se

posipala po podu kuća i crkvama kako bi odagnala kugu. Domaćice su je stavljale u ormare i

ladice da odjeći podari ugodan miris i otjera moljce. Poznati talijanski travar Matiolli iz 16. st.

naročito ju je preporučivao kod bolesti mozga, kao što su epilepsija, apopleksia, spazma i

paraliza. Smatra se da lavanda djeluje čak i na lavove i tigrove u zoološkim vrtovima pa pod

njezinim utjecajem postaju pitomi (Anonimus 1.).

Lavandula angustifolia raste kao višegodšnji niski polugrm, visok, 20-60 (80) cm, s

mnogo uspravnih izdanaka. Listovi su uski, linearno

duguljasti, slični listovima ružmarina. Mladi su

listovi savinuta ruba i dlakavi, a poslije su plosnati i

goli. Sitni su cvjetovi modroljubičaste boje, a

razvijaju se u cvatovima u gornjem dijelu izdanaka.

Izdanci su više na svojim dijelovima obrasli lišćem,

dok se na vrhu razvijaju cvatovi koji oblikom

podsjećaju na klasove (pršljenove). Lavandula se,

spontano križa, pa postoje mnogi križanci, podvrste,

varijeteti i forme. Lavanda najbolje uspijeva u toploj

sredozemnoj klimi. Raste na suhim i toplim

obroncima, a uspijeva i na kamenitom tlu (Kuštrak,

2005.)

Slika 1. Detaljniji prikaz

nadzemnog dijela lavande (Anonimus 2.)

Tablica 1. Sistematika lavande (L. angustifolia)

5


TAKSONOMIJA

CARSTVO Plantae

RAZRED Magnoliofita

KLASA Magnoliopsida

RED Lamiales

FAMILIJA Lamiaceae

ROD Lavandula

2.1.2. Raznolikost vrsta

Danas postoji više od 30 podvrsta i hibrida ove plemenite biljke sa raznim bojama

cvijetova te ljudi ponovno uviđaju njeno značenje, te se zbog trendova zdravog življenja i

povratka prirodi sve više komercijalno koristi u zapadnim zemljama.

Lavanda (Lavandula angustifolia) originalna je biljka iz koje su stoljećima ljudi stvarali

razne hibride i podvrste. Ona je ljubičaste boje te je vrlo prepoznatljiva i intenzivnog mirisa,

najčešće je viđamo na mediteranu kako raste na svom

prirodnom staništu, no raširena je i u unutrašnjosti

Francuske i Engleske. Varijacije u mirisu, boji, veličini,

teksturama podvrsta lavande čine tu biljku vrlo

zanimljivom i raznovrsnom.

Slika 2. Lavandula angustifolia

''Vunasta'' lavanda najbolje prihvaća suho tlo, a njeni tamno ljubičasti cvjetovi rastu u kasno

ljeto kada ostale lavande već venu.

Lavanda Budrovka (Lavandula hybrida) je najpoznatiji hibrid, tzv. lavandini, koja vrlo

dobro može rasti i u kontinentalnim dijelovima. Dobiveni križanjem lavande, intenzivnog

mirisa, s više cvjetova, rastu brže i veće, te se kao takvi lavandini sve više koriste.

Allardi Lavender je oblik francuske lavande za koji se drži da je križana sa Lavandulom

latifoliom, Spike lavandom.

6


Španjolska lavanda ima tamno ljubičasti cvijet u obliku ananasa i tamnozeleno lišće. Raste

nisko i široko te se brzo širi. Često se krivo naziva i francuska lavanda budući da raste i u

Francuskoj.

Francuska lavanda ima sivkaste listove s oštrim rubovima.

Cvjetovi su joj veliki i grubog oblika.

Slika 3. Francuska lavanda

Žuta lavanda ima vrhove cvjetova izrazito žute boje. Listovi su joj također žućkasto-zelene

boje, a raste više u visinu.

Slatka lavanda je specifična. Ima najzelenije listove, najveća je, najbrže raste, te ima duge

cvjetove. Najčešće se koristi za ukrašavanje vrtova.

Goodwin Creek siva lavanda je hibrid Francuske lavande sa

nižim rastom i tamnijim ljubičastim cvijetom koji se nalazi na

dužoj stabljici. Dobar je u vrtu za granične ili rubne redove.

Slika 4. Goodwin Creek siva lavanda

Engleske lavande

Engleske lavande (Lavandula angustifolias) uključuju Englesku, Munstead, Hidcote,

Hidcote Pink, Jean Davis, Sarah i Vera te cvatu sredinom ili krajem proljeća. Prestaju cvati

početkom ljeta i izgledaju odlično u cvatu. Poslije šišanja ostaju kao kompaktna lopta ili

živica sa egzotično mirisnim listovima tijekom ostatka godine. Kao i sve ostale Lavande, ne

podnosi lošu odvodnju vode ili visoku vlažnost.

Engleska lavanda ima velike listove i visoka je. Robusno raste i ima odličnu boju i miris.Ova

biljka ima pelud i cvijeta u isto vrijeme kao i Lavandula angustifolia.

Munstead lavanda dobila je ime po domu poznate dizajnerice vrtova Gertrude Jekyll.

Najbolje podnosi vrućine od svih engleskih lavandi.

7


Hidcote lavanda je poznata po svojoj tamno ljubičastoj boji.

Manja je od Munsted sorte i voli hladniju klimu te lako može

odumrijeti tijekom vrućih ljetnih mjeseci. Kao i većina engleskih

lavandi, nije toliko otporna na sušu ili vrućinu kao lavandini.

Slika 5. Hidcote lavanda

Hidcote Pink lavanda ima pastelno ružičast cvijet koji izgleda najbolje kad je sađen u većoj

grupi i gledan sa udaljenosti radije nego iz bliza.

Jean Davis lavanda također ima pastelno ružičasti cvijet. Teško je

razlikovati Hidcote pink i Jean Davis. Ipak, razlika je u okusu.

Cvijet sa aromom voća razlikuje Jean Davis od ostalih lavandi.

Nažalost, Jean Davis je teže uzgajati od Munsteada.

Slika 6. Jean Devis lavanda

Sarah lavanda je jedna od manje poznatih Lavandula angustifolia. Vrlo malena biljka sa

kratkim cvjetnim vrhovima i malim, ali zamjetno tamno plavim ljubičastim cvjetovima. Vrlo

je prikladna za prozorske žardinjere i uzgoj u kontejnerima.

Vera lavanda je ona za koju se drži da je prava engleska lavanda. Još ju zovi i Prava lavanda

ili Fina lavanda. Najbolja kvaliteta ulja dolazi od biljaka uzgojenih na visinama između 800 i

1500 metara na obroncima planina u središnjoj Europi. Tvrdi se da je ona najbolja lavanda za

medicinske i aromaterapijske svrhe.

Grosso lavandin se uzgaja za dobivanje ulja koje se koristi najviše u kozmetičkoj industriji.

Njegovi listovi su lagano ljubičaste boje što ga čini i pogodnim za ukras.

Abriali lavandin, je najstariji hibrid, manjeg rasta nego grasso, te je korišten prije njega.

Nizozemski lavandin ima cvjetove boje grejpa, kojima pogoduje više sunca.

Fred Boutin lavandin, izrazitog mirisa, srebrnkastog lišća i ljubičastog cvijeta, dugo raste i

cvate, također se više koristi za ukrašavanje vrtova.

8


Grappenhall lavandin je visokog i brzog rasta, te se isto tako brzo i širi.

Veliki Hidecote lavandin ima tamnoljubičaste skupine cvjetova, u krajoliku izgleda

impresivno.

Provence lavandin sa svojim dugim i mekim cvjetovima, koji se lagano otkidaju sa stabljike i

najviše se koriste sušeni, vrlo čest u komercijalnoj proizvodnji. (Anonimus 2.)

2.1.3. Rasprostranjenost

Lavanda je rasprostranjena po cijelom području Sredozemlja. Samoniklih biljaka nema

dovoljno, pa se lavanda intenzivno uzgaja. Najpoznatiji su nasadi lavande, ali i lavandina

(križanci), u Južnoj Francuskoj (Provansi), gdje se lavandino eterično ulje proizvodi u velikim

količinama. Uzgaja se u Francuskoj, Albaniji, Bugarskoj, Mađarskoj, Italiji, Španjolskoj,

zemljama bivše Jugoslavije (Hrvatska, Crna Gora, Srbija, itd.), Kini, Rusiji, Moldaviji,

Argentini, Nizozemskoj, Velikoj Britaniji, Sjedinjenim Američkim Državama, i Australiji

(Teuscher i sur.,2006.; Blumenthal, 1998.; Bown, 2001.) Lavanda se u Dalmaciji počela

uzgajati poslije Prvoga svjetskog rata. Postojale su kulture prave lavande, ali i križanaca na

otocima Hvaru, Braču i Visu. Danas je glavno područje uzgoja otok Hvar na selima Grablje i

Brusje. Uzgaja se ''domaća levanda'', koja je križanac između Lavandula angustifolia Mill. i

Lavandula latifolia Vill., poznata pod nazivom Lavandula hybrida Reverchon, a na tržištu

kao lavandin. Grmovi tog križanca su veći od polugrmova Lavandula latifolia, a znatno veći

od polugrmova vrste Lavandula angustifolia. Lavandula hybrida Reverchon razvija polugrm

oblika polukugle, koji u dobi od 10 godina ima visinu do 1 m i širinu do 2 m, dok je polugrm

prave lavande upola manji. Godine 1948. otkriven je na Hvaru jedan križanac tamnozelenih

listova i izrazito plavih cvjetova, ali nije se razlikovao samo morfološki od Lavandula hybrida

Reverchon nego mu je i ulje bilo finijeg mirisa. Taj je križanac nazvan Lavandula hybrida

Reverchon II ili plava lavanda. Danas je taj križanac na tržištu poznat pod nazivom Lavandula

budrovka (prema Budroviću, u kojeg je križanac otkriven). Zbog toga što je lavanda tako

dugo kultivirana kroz povijest, nasadi lavande su uglavnom hibridi i identifikacija je veoma

teška.

9


Slika 7. Rasprostranjenost lavande na području RH

2.1.4. Kemijski sastav svježe lavande i eteričnog ulja lavande

Lavandula officinalis sadrži 1-3% eteričnog ulja u kojem je vodeća sastavnica

linalilacetat. Uz eterično ulje u cvijetu ima približno 12% ružmarinske kiseline i drugih

derivata, zatim kumarina: umbelferona i herniarina, flavonoida i fitosterola.

Eterično ulje lavande sadrži 30-50% linaliacetata, a u uljima iznimne kakvoće taj je sadržaj

može biti i do 60%. Od drugih sastavnica ulje sadrži visok postotak slobodnog (-) –linalola

(40%), kao i manje količine kamfora, borneola i izoborneola te bornilacetat.

Prava lavanda, Lavandula angustifolia sadrži ulje visoke kakvoće kada raste na vrlo visokoj

nadmorskoj visini. Varijetet koji raste u tim uvjetima poznat je pod nazivom ''petite lavande'',

a ako raste na nižoj nadmorskoj visini, sadrži ulje lošije kvalitete, a na tržištu je poznat pod

nazivom ''lavandin'' ili ''gross lavande'' (Trease i Evans,1973).

Glavne komponente parne destilacije dobivene plinskom kromatografijom, prikazane

su u Tablici 2. Kao što je s većinom eteričnih ulja, konačni test za kvalitetu biti će

organoleptička (okus ili miris) svojstva.

10


Tablica 2. Kemijski sastav eteričnog ulja lavande

Svojstva ulja lavande i lavandina

Angustifolia Lavandin

Specifična težina

0.876-0.892 0.885-0.897

Kemijski profil

Kamfor 0.5-1% 4-11%

Cariofilen 3-12%

Cineole 1-2% 5-10%

Linalool 30-49% 30-40%

Linalil acetat 30-45% 20-30%

Ocimen 2.5-6%

2.1.5. Djelovanje i upotreba svježe lavande i eteričnog ulja lavande

U drevnoj Perziji, Grčkoj i Rimu, razne vrste lavande navodno su se koristile za

dezinfekciju bolnice i bolesničkih soba (Blumentha i sur., 2000). U indijskim medicinskim

tekstovima spominje se lavanda kao dio psihijatrijskih formula (Blumenthal i sur, 2000.). U

narodnoj medicini, pripravci lavande koristili su se protiv nadimanja, bolova u trbuhu, kao

diuretik. Cvjetovi i ulje lavande korišteni su kod upala grla, astme, upale sinusa i sl. (Keville i

Green, 1995.). Svježa lavanda dodaje se u džem, sladoled, ocat, biljne čajeve (Onstad, 1996).

Sadašnji Njemački Standard License (GSL) odobrava internu upotrebu čaja sa cvijetom

lavande za liječenje poremećaja kao što su nemir i nesanica, problemi sa cirkulacijom te

probleme u gornjem djelu abdomena kao što su crijevne tegobe, Roemheld sindrom, nadutost

i nelagoda (Braun, 2005).

11


Lavandulae aeteroleum – lavandino eterično ulje

Ulje se dobiva parnom destilacijom svježih (u praksi i uvenulih) cvjetova, odnosno

vršaka stabiljke s cvatovima vrste Lavandula angustifolia Mill.(Lavandula vera De Candolle)

Lamiaceae. Lavandino ulje je bezbojna ili žućkasta tekućina, karakteristična ugodna mirisa i

aromatična, ljuta i nagorka okusa (Kuštrak, 2005.).

Lavandino eterično ulje u farmaciji se uglavnom primjenjuje lokalno. Djeluje kao

rubefacijens, pa je sastojak različitih linamenata za utrljavanje kod reumatizma, lumbaga,

bolova u mišićima i zglobovima. Ulje ima antiseptičko i analgetsko djelovanje, pa je sastojak

i različitih ljekovitih masti i alkohola (protiv akni, dermatitisa, ekcema, prhuti u vlasištu,

psorijaze, uboda kukaca i protiv ušiju), ( Lawles, 1999.). U aromaterapiji, lavanda se koristi

za mnoge vrste kožnih upala, uključujući i ugrize kukaca, opeklina, upala, kao i za iscjeljenje

malih posjekotina (Keville, Green,1995; Schnaubelt,1998.). Ulje lavande se koristi kao

komponenta za okus prehrambenih proizvoda, uključujući i alkoholna i bezalkoholna pića,

aromatičnim octovima, pečenim namirnicama, bombonima, smrznutim mliječnim desertim,

gelatini i pudinzima (Leung i Foster, 1996.). Eterično ulje posjeduje umirujuće mirise koji se

koriste za mnoge mirise u kozmetici, šamponima, industrijskim prozvodima.

12


2.2. FENOLNI SPOJEVI

Fenolni spojevi su široko rasprostranjeni u biljnom kraljevstvu. Tkivo biljke može

sadržavati do nekoliko grama po kilogramu fenolnih spojeva. Vanjski čimbenici kao što su

mikrobiološke infekcije i ultraljubičasto zračenje induciraju njihovu sintezu (Anonimus 3).

Biosinteza fenolnih spojeva u biljkama najčešće se odvija preko acikličkih

međuprodukata koji nastaju u biosintetskom putu šikiminske kiseline (Harborne, 1980).

Biosinteza fenola u biljnim vrstama odvija se preko cijelog niza kompleksnih biokemijskih

reakcija, a biosintetski put nastajanja fenolnih spojeva opisali su brojni autori (Haddock i sur.,

1982; Harborne, 1988; Macheix i sur., 1990; Dixon i Paiva, 1995; Strack, 1997).

Prema kemijskoj strukturi dijele se na:

flavonoide,

fenolne kiseline i srodne spojeve.

2.2.1. Flavonoidi

Flavonoidi su skupina polifenolnih spojeva koji se nalaze u mnogim biljkama, koncentrirani u sjemenkama, koži ili kori voća, kori drveća, lišću i cvijeću. Velik broj ljekovitih biljaka sadrži flavonoide koji imaju izraženu

antioksidacijsku i antiradikalsku aktivnost (Rice-Evans i sur.,1995; Bors i sur., 1990). Zato

se flavonoidima pripisuju i mnoga terapijska djelovanja, npr. antibakterijsko, protuupalno, antialergijsko, antimutageno, antiviralno i antikancerogeno (Harborne, Williams, 2000.; Havsteen, 1983; Pathak i sur., 1991.), a znatno utječu na boju i okus hrane. Do danas je identificirano više od 6400 flavonoida.

Najraširenija je skupina flavonoida čija se temeljna struktura sastoji od C15 (C6-C3-C6)

flavonskog kostura (Aherne i O’Brien, 2002; Hollman i Arts,2000) odnosno dva benzenska

prstena (A i B) povezana piranskim prstenom (C) koji sadrži kisik (slika 4.). Flavonoidi se

međusobno razlikuju prema stupnju oksidacije centralnog piranskog prstena, izuzev halkona

kod kojih je piranski prsten otvoren (Macheix i sur., 1990; Harborne, 1988). Prema topljivosti

13


dijele se na lipofilne i hidrofilne flavonoide (Harborne i Baxter, 1999), a najčešće su prisutni u

obliku O- i C- glikozida (Harborne, 1994).

Slika 8. Osnovna struktura i skupine flavonoida

Flavonoidi se ovisno o broju i položaju vezanih hidroksilnih skupina (slika 4.), stupnju

nezasićenosti i stupnju oksidacije centralnog C-prstena dijele u brojne podskupine (Harborne i

Baxter, 1999):

flavonoli,

flavonol glikozid,

flavoni,

izoflavoni,

flavanoli,

flavanoni,

procijanidini,

dihidrohalkoni,

antocijanidini i

antocijan glikozidi.

14


2.2.2. Fenolne kiseline i srodni spojeviFenolne kiseline dijele se na:

hidroksicimetne kiseline (C6-C3),

hidroksibenzojeve kiseline (C6-C1) i

njihovi derivati.

Razlika u strukturi između pojedinih hidroksicimetnih i hidroksibenzojevih kiselina posljedica

su stupnja hidroksilacije i metilacije aromatskog prstena (Macheix i sur., 1990).

2.2.2.1. Hidroksicimetne kiseline

Hidroksicimetne kiseline i njihovi derivati (Slika 9.) značajna su skupina fenolnih

spojeva prisutnih u voću. U prirodi uglavnom dolaze u različitim konjugiranim oblicima te

kao esteri. (Macheix i sur., 1990).

Slika 9. Kemijska struktura hidroksicimetnih kiselina (Macheix i sur., 1990)

15

HIDROKSICIMETNE KISELINE:

1.ferulinska R1=R2= R4=HR3=OHR4=OCH3

2.p- kumarinska R1=R2=HR3=OH

3.kava R1=R2=HR3= R4=OH

4.sinapinska R1=HR3=OHR4= R2=OCH3


2.2.2.2. Hidroksibenzojeve kiseline

Hidroksibenzojeve kiseline, osnovne strukture C6-C1 (Slika 10.) nastaju izravno iz

benzojeve kiseline i obično su prisutne kao slobodne kiseline. Najčešće su prisutne u

topljivom obliku, konjugirane šećerima ili organskim kiselinama (Schuster i Hermann, 1985;

Strack, 1997).

Slika 10. Kemijska struktura hidroksibenzojevih kiselina (Robards i sur., 1999)

16

HIDROKSIBENZOJEVE KISELINE

1.galna R1=R2=R3=OH

2.protokatehinska R1=H R2=R3=OH

3.vanilinska R1=H R2=OHR3=OCH3

4.siringinska R2=OHR1=R3=OCH3


2.2.3. Fenolni spojevi lavande

Važnost i uloga fenolnih spojeva neiscrpna je tema brojnih istraživanja koja su počela

prije više od 50 godina i koja se provode i danas, a potvrdila su pozitivne učinke na ljudsko

zdravlje (Yi i sur., 2005; Gabrielska i sur., 1999; Hulme, 1953). O fenolnim spojevima

lavande u literaturi je dostupno malo podataka. Razlog tome je vjerojatno činjenica da se

lavanda većim dijelom upotrebljava za proizvodnju eteričnih ulja, te fenolni spojevi koji su

nehlapljivi zaostaju u otpadu. Količina fenolnih spojeva u različitim frakcijama koje zaostaju

kao otpad pri proizvodnji eteričnih ulja lavandina za potrebe parfemske industrije istraživali

su (Torras-Claveria i sur. 2007). Isti autori istraživali su sastav otpada lavandina primjenom

LC/MS/MS te su identificirali 23 fenolna spoja. Iz skupine hidroksibenzojevih kiselina

određena je protokatehinska kiselina, a iz skupine hidroksicimetnih kiselina i derivata

određeni su slijedeći spojevi: kumarinska kiselina-O-glukozid 1, kafeinska kiselina,

ferulinska kiselina-O-glukozid 1, kumarinska kiselina-O-glukozid, trihidroksicimetna

kiselina-O-glukozid, 3-kafeoilkina kiselina (klorogenska kiselina), kafeinska kiselina-O-

glukozid 1, ferulinska kiselina-O-glukozid 2, kafeinska kiselina-O-glukozid 2, ružmarinska

kiselina, ružmarinska kiselina metilester. U frakcijama istraživanim u navedenom radu

oređeni su i spojevi iz skupine flavonoida i to uglavnom flavoni te manje flavonoli i flavanoni

(uglavnom prisutni u obliku glikozida). Iz skupine flavonol glikozida određen je kvercetin-3-

O-glukozid (izokvercitrin), a iz skupine flavanon glikozida identificiran je eriodictiol-O-

heksozid. Veći broj spojeva identificiranih u lavandinu su iz skupine flavon glikozida i to:

luteolin-O-heksozid 1, krizoeriol-O-heksozid, apigenin-O-heksozid, luteolin-O-heksozid 2,

krizoeriol-O-glukuronid, luteolin-O-glukuronid 1, luteolin-O-glukuronid 2, apigenin, luteolin-

O-glucuronide. Također je u istom istraživanju utvrđeno da identificirani fenolni spojevi

pokazuju značajnu antioksidativnu aktivnost. Usporedbom sa drugim biljnim vrstama

(origano, kadulja, menta i sl.) koje se smatraju dobrim izvorom fenolnih spojeva lavandin

sadrži značajno manju količinu fenolnih spojeva. Prema jednom od istraživanja koja su

prethodno provedena, kava i u Lavandula vera MM od fenolnih spojeva određeni su

kafeinska i ružmarinske kiselina, te je istovremeno utvrđena veća antioksidativna aktivnost

ružmarinske kiseline u odnosu na kafeinsku kiselinu (Kovatcheva i sur. 2000).

17


2.3. ANTIOKSIDACIJSKI KAPACITET

Antioksidansi su molekule koje mogu donirati jedan elektron ili vodikov atom nekom

reaktivnom, slobodnom radikalu. Vrše ulogu neutralizacije slobodnih radikala i na taj način

štite ljudski organizam od mogućih bolesti, ali i usporavaju kvarenje hrane bogate lipidima

(Kinsella i sur., 1993; Pryor, 1991).

Tvari kao što su vitamin C, E, karoten, fenolni spojevi, estrogeni biljnog podrijetla

imaju antioksidativnu sposobnost (Gey i sur., 1991; Ziegler, 1991; Gaziano i sur., 1992), a

prirodni izvor antioksidacijskih tvari su uljarice, cjelovite žitarice, povrće, voće, lišće, korijen,

mirodije i zeljaste biljke (Ramarathnam i sur., 1995; Cullen i sur., 1997; Kamat i sur., 2000;

Devasagayam i sur., 2001; Nigris i sur., 2003; Negi i Jayaprakasha, 2003). Sintetički

antioksidansi također usporavaju lipidnu peroksidaciju, međutim njihova upotreba kao

dodataka prehrani i terapeutskih posrednika je spriječena zbog njihove moguće toksičnosti.

Fenolni spojevi su grupa sekundarnih aromatskih metabolita biljke, za koje se zna da

posjeduju višestruke biološko djelovanje kao što su antioksidativna aktivnost (Dapkevicious i

sur.,1998, Proestos i sur., 2005) i antimikrobna aktivnost (Rauha i sur., 2000).

2.4. METODE ODREĐIVANJA ANTIOKSIDACIJSKOG KAPACITETA

Da bi se odredio antioksidacijski kapacitet razvijen je velik broj metoda koje se

temelje na različitim mehanizmima obrambenog sistema antioksidanasa, poput uklanjanja ili

inhibicije slobodnih radikala ili kelacije metalnih iona, koji bi u suprotnom doveli do

nastajanja slobodnih radikala.

Zbog kompleksnih oksidacijskih procesa, potrebno je više metoda za određivanje

antioksidacijskog kapaciteta, jer na osnovi samo jedne metode, dobivene rezultate ne možemo

točno interpretirati i konačno ih potvrditi. Za određivanje antioksidacijskog kapaciteta koriste

se direktne metode (ORAC metoda, određivanje antioksidacijskog kapaciteta s -karotenom)

i indirektne metode (DPPH, FRAP).

Neke od metoda koje se koriste za određivanje antioksidacijskog kapaciteta, a

korištene su i u ovom istraživanju su:

18


DPPH (radikal 2,2-difenil-2-pikrilhidrazil-‘hvatač slobodnih radikala’)

metoda – jedna od najstarijih indirektnih metoda koja se temelji na

sposobnosti ekstrakta da smanji aktivnost DPPH radikala, a reakcija se prati

promjenom apsorbancije pri 517 nm (Parkash, 2001).

FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power – antioksidativna moć redukcije

željeza) metoda – jednostavna i brza, indirektna metoda, koja se temelji na

redukciji Fe3+ iona u Fe2+ ion u prisutnosti antioksidanta. Nastali Fe2+ ioni u

prisutnosti 2,4,6-tripiridil-s-triazina (TPTZ reagens) tvore obojen kompleks,

koji ima apsorbcijski maksimum pri 593 nm. Reakcija se odvija u kiselom

mediju (Benzie i Strain, 1996; Connor i sur., 2002).

19


2.5. ANTIMIKROBNA AKTIVNOST

U farmaceutskim oblicima namijenjenim za oralnu i vanjsku primjenu, biljni pripravci

pokazuju široki spektar djelovanja među kojima je jedno od važnijih antimikrobno.

Djelovanje na različite mikroorganizme predmet je mnogih današnjih znanstvenih

istraživanja, koja su najviše potaknuta činjenicom da je obilna uporaba antibiotika tijekom

više od pola stoljeća dovela do rezistencije mikroorganizama na često primjenjivana

antimikrobna sredstva (Anonimus 4.).

2.5.1. Antimikrobna aktivnost lavande

Prema različitim istraživanjima, proučavana su i ispitivana različita antimikrobna

svojstva eteričnih ulja i njihovih sastojaka iz različitih biljaka (Carson et al., 1995; 1996; Garg

and Dengre, 1986; Inouye et al., 1983; Jain and Kar, 1971; Jansen et al., 1987; Larrondo et al.,

1995; Nenoff et al. 1996; Pattnaik et al., 1995, 1996; Rios et al., 1987; 1988; Sherif et al.,

1987.), način djelovanja i potencijalne koristi od eteričnih ulja, uz povratak korištenja

tradicionalnih pristupa i očuvanja zaštitnih svojstava hrane. Eterično ulje lavande rabi se u

prehrambenoj industriji, kao aroma i prirodni konzervans jer ima jako antimikrobno

djelovanje (djeluje na 9 sojeva bakterija, 5 puta je djelotvornije od fenola) (Kuštrak, 2005.).

U istraživanju Evendri i sur (2005), prikazano je kako biljni sastojci ili ekstrakti, mogu vršiti

antimutageni efekt te mogu pomoći u spriječavanju raka ili drugih bolesti, povezanih s

pojavom mutacije. Dokazan je dominantan sastav linalil acetata, linalola i terpinen-4-ola u

lavandi. Dosadašnja istraživanja također svjedoče o djelovanju biljnih polifenola (flavonoida,

tanina) kao inhibitora raznih enzimskih sustava odgovornih za metabolizam ksenobiotika,

(Wall et al., 1990; Yen and Chen, 1994). Isti autori navode da fenolni spojevi lavande djeluju

kao antioksidansi.

20


2.5.2. Test mikroorganizmi korišteni u istraživanju

2.5.2.1. Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus (slika 11.) je bakterija koja pripada poroci Microccaceae, rod

Staphylococcus i najvažnija je stafilokokna vrsta koja je dobila ime po zlatno-žuto obojenim

kolonijama. Predstavnici toga roda su aerobi ili fakultativni anaerobi.

Kuglasti oblik, kombiniran čvrstom gram-pozitvnom staničnom stjenkom, omogućuje im

preživljavanje i rast u okolišu s visokim osmotskim tlakom, što im omogućuje preživljavanje i

rast u sekretima nosa i na koži (Duraković, 1996.)

S. aureus sintetizira velik broj toksina koji pridonose patogenosti te bakterije povećavajući na

taj način njezinu sposobnost da napadne tijelo ili oštećeno tkivo.

Neki od njih su:

α-toksin – hemolizira i ubija leukocite

enterotoksini – uzrokuju akutna otrovanja hranom

(Kučišec-Tepeš, 1994.)

Slika 11. Staphylococcus aureus

2.5.2.2. Escherichia coli

Escherichia coli (slika 12.) je gram negativni bacil (štapić), fakultativni anaerob koji pripada

obitelji Enterobacteriaceae ili crijevne bakterije koje se nalaze u probavnom sustavu u ljudi i

životinja. Među važnim predstavnicima iz obitelji Enterobacteriaceae još se nalaze

Salmonella, Shigella, Proteus, Yersinia, Erwinia i Enterobacter.

Enterobakterije obuhvaćaju pokretljive i nepokretljive vrste. Mnoge vrste imaju pile koje

pomažu da se pričvrste na membranu sluznice. Specijalizirane kratke dlačice tzv. Seks pili,

pomažu u izmjeni genetičkog materijala među stanicama, zbog čega

postaju otporne na djelovanje antibiotika.E. Coli se koristi u svim

temeljnim biološkim istraživanjima. Njezina prisutnost u vodi i hrani

je važna jer je pouzdani pokazatelj fekalnog onečišćenja. Najčešće se

smatra patogenim mikroorganizmom (Duraković, 1996.).

Slika 12. Escherichia coli

21


3. EKSPERIMENTALNI DIO

3.1. MATERIJALI

U istraživanju je korištena suha lavanda i eterična ulja lavande sa četiri područja

Republike Hrvatske: Vižinada, Fužine, Hvar, Donja Bistra. Uzorci s područja Istre pripadaju

vrsti budrovki, ubranih početkom srpnja 2008. godine, uzorci s Hvara su obična lavanda

(hibridna) i budrovka, iz berbe 2008. s nasada starih tri godine. Vrsta lavande uzgajana na

području Fužina je Lavandula angustifolia. Berba ovih uzoraka provedena je tijekom druge

polovice srpnja, 2008. godine a nasadi su stari dvije godine. U Donjoj Bistri uzgaja se

lavandin, vrijeme berbe je srpanj, 2008 godine. Lavanda sa svih područja sušena je na

tradicionalan način, u prozračnim prostorijama, na propuhu, buketićima obješenim prema

dolje. Eterična ulja sa svih područja dobivena su destilacijom vodenom parom.

Analiza navedenih uzoraka provedena je krajem 2008. i početkom 2009. godine. Sušenim

buketićima lavande uklonjene su stabiljke te je ona usitnjena prije same analize.

3.2. METODE RADA

Tijekom istraživanja u ekstraktu sušene lavande određivani su:

Ukupni fenoli

Ukupni flavonoidi

Antioksidacijski kapacitet (DPPH i FRAP metodom)

Antimirobna aktivnost (ekstrakata i eteričnih ulja lavande)

22


3.2.1. Ekstrakcija fenolnih spojeva

Princip određivanja:

Ekstrakcija fenolnih spojeva provedena je pomoću dvaju otapala: 30%-tna vodena

otopina etanola, 30%-tna vodena otopina acetona, uz refluks u vodenoj kupelji pri temperaturi

60°C te u trajanju 30 minuta.

Postupak određivanja:

Odvaže se 1g uzorka s točnošću 0,1 g u Erlenmeyerovu tikvicu s ubrušenim grlom,

volumena 100 ml, zatim se doda 40 ml 30% etanola (ili 30 % acetona) te ručno

homogenizira. Stavi se u vodenu kupelj na 60ºC uz refluks, 60 minuta. Nakon provedene

ekstrakcije sadržaj se profiltrira u odmjernu tikvicu volumena 50 ml i nadopuni otapalom

korištenim za ekstrakciju do oznake. Dobiveni ekstrakti koriste se za određivanje ukupnih

fenola, flavonoida i antioksidacijskog kapaciteta. Na istom uzorku provedena su dva paralelna

mjerenja. Ekstrakti su čuvani pri 4 oC do analize.

Aparatura i pribor:

1. staklene boce volumena 1l,

2. menzura volumena 500 ml,

3. analitička vaga (METTLER),

4. vodena kupelj, zagrijana na 60oC

5. pipete, volumena 5 ml, 10ml, 20 ml,

6. staklena čaša.

Reagensi:

1. 96%-tni etanol,

2. 30 %-tna vodena otopina etanola,

3. 100%-tni aceton,

4. 30 %-tna vodena otopina acetona,

5. destilirana voda.

23


3.2.2. Određivanje ukupnih fenola i flavonoida

Princip određvanja ukupnih fenola:

Ukupni fenoli određeni su spektrofotometrijski u etanolnom i acetonskom ekstraktu

uzorka mjerenjem nastalog intenziteta obojenja pri valnoj duljini 760 nm. Metoda se bazira na

kolornoj reakciji fenola s Folin-Ciocalteu reagensom. Folin-Ciocalteu reagens je smjesa

fosfowolframove i fosfomolibden kiseline, a pri oksidaciji fenolnih spojeva ove kiseline

reduciraju se u volfram-oksid i molibden-oksid koji su plavo obojeni (Ough i Amerine, 1988).

Aparatura i pribor:

1. Erlenmeyerove tikvice, volumena 50 ml,

2. Erlenmeyerove tikvice s ubrušenim grlom, volumena 50 ml


4. filter papir,

5. lijevak.

6. kivete,

7. spektrofotometar (UV UNICAM HELIOS ),

8. automatska pipeta, volumena 1000ml.

Reagensi:

1. 30%-tna vodena otopina etanola,

2. 30%-tna vodena otopina acetona,

3. Folin – Ciocalteu reagens,

4. zasićena otopina natrijeva karbonata (m/v), Na2CO3,

Priprema: 200 g anhidrida natrijeva karbonata se otopi u 800 mL vruće

destilirane vode, u odmjernoj tikvici volumena 1000 mL, a zatim ohladi na

sobnu temperaturu. Doda se nekoliko kristalića natrijeva karbonata, te se

nadopuni destiliranom vodom do oznake. Pripremljena otopina treba odstajati

24 sata te se nakon toga profiltrira.

24



U Erlenmayerovu tikvicu, volumena 25 ml, otpipetira se 0,25 ml uzorka, 15 ml

destilirane vode, 1,25 ml Folin – Ciocalteu reagensa (potrebno ga je razrijedit neposredno

prije mjerenja u omjeru 1:2). Nakon 3 minute, doda se smjesi 3,75 ml zasićene otopine

natrijeva karbonata te otapalom korištenim za ekstrakciju nadopuni do oznake.

U slijepu probu, umijesto uzorka dodaje se isti volumen destilirane vode.

Nakon toga, tikvice se termostatiraju u vodenoj kupelji na 50ºC, 30 minuta te izmjeri

apsorbancija pri valnoj duljini od 760nm.

Izrada baždarnog pravca:

Iz pripremljene otopine galne kiseline rade se razrjeđenja, u odmjernim tikvicama

volumena 100 mL, tako da koncentracije galne kiseline iznose: 0, 50, 100, 150, 250, 500

mg/L.

Razrjeđenja se prirede tako što se u odmjerne tikvice volumena 100 mL redom doda:

0, 1, 2, 3, 5 i 10 mL otopine galne kiseline i nadopuni destiliranom vodom do oznake.

Iz svake tikvice se otpipetira 0,5 mL uzorka u odmjerne tikvice volumena 50 mL te se

postupa po propisu za određivanje ukupnih fenola.

Baždarni pravac se nacrta pomoću računala pri čemu se na apscisu nanesu

koncentracije galne kiseline (mg/L), a na ordinatu vrijednosti apsorbancija mjerene pri 765

nm.

Račun:

Koncentracija ukupnih fenola izračuna se prema jednadžbi pravca koja se dobije

pomoću programa Excel.

U ovom radu izračunata jednadžba pravca glasi:

y = 0,0009 x

R2 = 0,99

gdje je: y – apsorbancija pri 765 nm

x – koncentracija galne kiseline (mg/L)

R2 – koeficijent determinacije

25


Princip određvanja ukupnih flavonoida :

Temelj određivanje flavonoida je svojstvo flavonoida da s aluminijevim kloridom

(AlCl3) tvore kompleks. Intenzitet obojenja proporcionalan je količini prisutnih flavonoida.

Flavonoidni fenolni spojevi se određuju iz acetatnog i etanolnog ekstrakta.

Aparatura i pribor:

1. automatska pipeta,

2. pipete, volumena 1 ml, 2 ml, 10 ml, 25 ml,

3. čaša, volumena 50 ml,


5. kivete,

6. vorteks,

7. centrifuga,

8. epruvete,

Reagensi:

1. otopina natrijeva nitrita (1:20), NaNO2,

Priprema: 0.5 g natrijeva nitrita, NaNO2, se otopi u destiliranoj vodi, u

odmjernoj tikvici volumena 10 mL, te nadopuni destiliranom vodom do

oznake.

2. otopina aluminijeva klorida (1:10) (m/v), AlCl3,

Priprema: 5 g aluminijeva klorida, AlCl3, se otopi u destiliranoj vodi, u

odmjernoj tikvici volumena 50 mL, te nadopuni destiliranom vodom do

oznake.

3. 1 M otopina natrijeva hidroksida, NaOH,

4. 30 %-tna vodena otopina etanola (v/v)

26



U kivete se otpipetira 0,5 ml uzorka, 2 ml destilirane vode, 0,15 ml otopine natrijeva

nitrita (1:20), pričeka se 5 minuta te doda 1,5 ml otopine aluminijeva klorida (1:10), ponovo

pričeka 6 minuta te doda 1M NaOH, nakon čega nastaje mliječno bijelo zamućenje. Smjesa u

kiveti dobro se promiješa pomoću vorteksa te stavi na centrifugiranje pri 10000 o/min

tijekom 10 minuta. Dobiveni supernatant odekantira se u epruvete te izmjeri apsorbancija pri

valnoj duljini od 450 nm prema slijepoj probi koja sadrži sve kemikalije osim uzorka.


Iz pripremljene otopine rutina rade se razrjeđenja, u odmjernim tikvicama volumena 5

mL, tako da koncentracije rutina iznose: 50, 100, 150, 200 i 250 mg/100 mL.

Razrjeđenja se prirede tako što se u odmjerne tikvice volumena 5 mL redom doda: 1,

2, 3, 4 i 5 mL otopine rutina i nadopuni 30 %-tnom vodenom otopinom etanola do oznake.

Iz svake tikvice se otpipetira 1 mL uzorka u odmjerne tikvice volumena 10 mL te se

postupa po propisu za određivanje flavonoida.

Baždarni pravac se nacrta pomoću računala pri čemu se na apscisu nanesu

koncentracije rutina (mg/100 mL), a na ordinatu vrijednosti apsorbancija mjerene pri 510 nm.

Račun:

Koncentracija flavonoida izračuna se prema jednadžbi pravca koja se dobije pomoću

programa Excel.

U ovom radu izračunata jednadžba pravca glasi:

y = 0,0029 x

R2 = 0,99

gdje je:

y – apsorbancija pri 510 nm

x – koncentracija rutina (mg/100 mL)


27


3.2.3. Određivanje antioksidacijskog kapaciteta

3.2.3.1. DPPH (2,2-difenil-pikrilhidrazi) metoda


Za određivanje antioksidacijskog kapaciteta određenog spoja ili ekstrakta iz prirodnog

izvora DPPH-metodom, prati se reakcija između stabilnog radikala 1,1-difenil-2-

pikrilhidrazila (DPPH•), i uzorka u kojem se mjeri antioksidacijska aktivnost. Redukcija

DPPH• sa antioksidantom (AH) prati se smanjenjem apsorbancije pri valnoj duljini od 517nm.

DPPH• + AH DPPH-H + A•

Ova se metoda temelji na redukciji stabilnog radikala DPPH•, koji radi nesparenog elektrona

pokazuje jaku apsorpciju u vidljivom dijelu elektromagnetskog spektra. Sparivanjem

elektronskog para stabilnog radikala DPPH• u prisutnosti elektron donora (antioksidant, koji

hvata slobodne radikale), ljubičasta se boja mijenja u žutu. Nastali spoj ima smanjeni intezitet

apsorpcije u vidljivom dijelu spektra, a rezultirajuće obezbojenje je u stehiometrijskom

odnosu s brojem sparenih elektrona.

Aparatura i pribor:

1. automatska pipeta 1000 ml,

2. odmjerna tikvica, volumena 50ml, 100 ml,


4. pipete 2 ml, 5 ml,

5. lijevak,

6. kivete,

7. epruvete,

8. spektrofotometar (UV UNICAM HELIOS ).

Reagensi:

1. metanol,

2. 0,5 mM otopina 2,2-difenil-pikrilhidrazil radikal, DPPH,

28


Priprema: 0,02 g DPPH kvantitativno se prenese u odmjernu tikvicu od 100

mL, otopi sa metanolom i nadopuni do oznake.


U epruvetu se otpipetira 2 ml fenolnog ekstrakta, dobivenog pri određivanju ukupnih

fenola, 2 ml metanola, 1 ml 0,5 mM otopine DPPH, dok se u drugu otpipetira 4 ml metanola i

1 ml 0,5 mM otopine DPPH koja predstavlja kontrolni uzorak. Za slijepu probu, uzima se

otopina metanola.

Epruvete stoje u mraku 20 minuta, nakon čega se izmjeri apsorbancija pri 517nm.

Na istom uzorku, provedena su dva paralelna određivanja.

Izrada baždarnog pravca za DPPH metodu:

Za pripremu baždarnog pravca pripremi se 30 mM otopina Troloxa (6-hidroksi-

2,5,7,8-tetrametilkroman-2-karbonska kiselina) tako što se odvaže 0,7509 g Troloxa. Odvaga

se otopi u metanolu i nadopuni metanolom do oznake u odmjernoj tikvici od 100 mL.

Od 30 mM otopine Troloxa prirede se razrjeđenja u odmjernim tikvicama od 25 mL u

koncentracijama od 0,3 mM, 0,5 mM, 1 mM i 1,5 mM.

Iz svake tikvice otpipetira se 200 µL razrijeđene otopine Troloxa, 3,8 mL metanola i 1

mL 0,5 mM otopine DPPH. Epruvete stoje 20 minuta u mraku na sobnoj temperaturi te se

mjeri apsorbancija na 517 nm uz metanol kao slijepu probu.

Iz izmjerenih vrijednosti apsorbancije nacrta se baždarni pravac pomoću računala tako

što se na apscisu nanesu koncentracije Trolox otopine (mM), a na ordinatu izmjerene

vrijednosti apsorbancija pri 517 nm.

Račun:

Na temelju podataka dobivenih u ovom radu jednadžba baždarnog pravca glasi:

y = -0,00124 x + 1,203124

R2 = 0,99

gdje je:


29


x – koncentracija Trolox otopine (mM)


3.2.3.2. FRAP (eng. Ferric Reducing Antioxidant Power) metoda


Antioksidacijski kapacitet u ispitivanim uzorcima određen je prema metodi koju su prethodno

opisali Connor i sur. (2002) uz određene modifikacije. Metoda se temelji na sposobnosti

ekstrakta da reducira Fe ione u Fe ione u otopini 2,4,6-tripiridil-s-triazina (TPTZ) pri

nižem pH. Redukcija se prati mjerenjem promjene apsorbancija pri 595 nm. Rezultati su

izraženi kao µmol Fe ekvivalenta (FE)/mL uzorka.

Aparatura i pribor:

1. odmjerna tikvica, volumena 10ml, 50 ml, 100 ml,

2. automatska pipeta,

3. pipeta 2 ml, 5 ml, 10ml, 25 ml, 50 ml,

4. čaša, volumena 50 ml,


6. kivete,

7. spektrofotometar (UV UNICAM HELIOS ).

Reagensi:

1. 40 mM vodena otopina klorovodične kiselina, HCl

Priprema: 330 µL 12 M HCl (konc. HCl = 35 %) razrijedi se u odmjernoj

tikvici od 100 mL destiliranom vodom te nadopuni do oznake.

2. 0,3 M acetatni pufer, pH 3,6

Priprema: 1,55 g natrijevog acetata trihidrata otopi se u 8 mL ledene octene

kiseline u odmjernoj tikvici od 500 mL i nadopuni destiliranom vodom do

oznake.

30


3. 20 mM otopina željezovog(III)-klorida, FeCl3

Priprema: 0,0541 g FeCl3 × 6 H2O otopi u 10 mL destilirane vode, otopina se

priprema svježa.

4. 10 mM otopina 2,4,6-tripiridil-s-triazina, TPTZ

Priprema: 0,0312 g TPTZ otopi se u odmjernoj tikvici od 10 mL sa 40 mM

HCl te se istom klorovodičnom kiselinom nadopuni do oznake. Otopina se

uvijek priprema svježa tj. na dan određivanja.

5. 20 mM otopina FeSO4 × 7H2O,

6. 30 %-tna vodena otopina etanola,

7. 30 %-tna vodena otopina metanola.

Priprema FRAP reagensa:

Pomješa se 50 mL acetatnog pufera, 5 mL TPTZ reagensa i 5 mL FeCl3 (omjer

10:1:1).

Priprema uzorka:

Ekstrakti fenola, dobiveni prilikom određivanja ukupnih fenola, razrijede se u omjeru

1:10.


U odmjernu tikvicu od 10 ml otpipetira se 240 µL destilirane vode, 80 µL uzoraka te

2080 µL FRAP reagensa. Zatim, dobro promješati, pripremiti kupelj na 37ºC te ostaviti 5

minuta. U slijepu probu otpipetirati sve osim uzorka, a umjesto njega, dodati 30%-tnu vodenu

otopinu etanola.

Nakon 5 minuta, izmjeri se apsorbancija pri 595 nm.


Za izradu baždarnog pravca pripreme se standardne otopine FeSO4 × 7H2O, tako da

koncentracije u odmjernim tikvicama iznose: 0, 25, 100, 250, 500 i 750 mM. Postupak je isti

31


kao i za uzorak, samo što se umjesto uzorka dodaju priređene koncentracije otopine FeSO4 ×

7H2O.

Iz izmjerenih vrijednosti apsorbancija nacrta se baždarni pravac pomoću računala tako

što se na apscisu nanesu koncentracije standardne otopine FeSO4 × 7H2O (mM), a na ordinatu

izmjerene vrijednosti apsorbancija pri 595 nm.

Račun:

Na temelju podataka dobivenih u ovom radu jednadžba baždarnog pravca glasi:

y = 0,00053372 x

R2 = 0,99

gdje je:


x – koncentracija standardne otopine FeSO4 × 7H2O (mM)


32


3.2.4. Određivanje antimikrobne aktivnosti


Antimikrobno djelovanje frakcija lavande, dobivenih različitim načinima ekstrakcije

ispitano je na test mikroorganizmima koji pripadaju Zbirci mikroorganizama Laboratorija za

Opću mikrobiologiju i mikrobiologiju namirnica na Prehrambeno-biotehnološkom fakultetu

Sveučilišta u Zagrebu: Staphylococcus aureus 3048, Escherichia coli 3014.

Aparatura i pribor:

1. mikrotitarske pločice,

2. mikropipete,

3. čitač mikrotitarskih pločica.

Za određivanje antimikrobne aktivnosti korišteni su ekstrakti lavande korišteni za

određivanje ukupnih fenola.


U jažice mikrotitarske pločice dodano je 240 µL ekstrakta ili eteričnog ulja lavande i

10 µL test mikroorganizma prethodno uzgojenog u hranjivom bujonu.

Antibakterijsko djelovanje određenih ekstrakata i eteričnih ulja lavande na test

mikroorganizme, tijekom 24 h uzgoja pri 37 °C, određivano je spektrofotometrijskim

mjerenjem prividne apsorbancije pri valnoj duljini 620 nm pomoću čitača mikrotitarskih

pločica (Tecan, Sunrise). Razlika u prividnoj apsorbanciji kontrole (nacijepljen hranjivi bujon

s test mikroorganizmom bez dodanih ekstrakata i eteričnih ulja lavande) i uzoraka s dodanim

ekstraktima i eteričnim uljima lavande mjera je inhibicije rasta test mikroorganizma. Slijepe

probe su bili uzorci pripremljeni bez dodatka mikroorganizama.

33


4. REZULTATI

U ovom radu istraživanja su provedena na uzorcima lavande sa četiri različita područja

RH. Uzorci sa primorskog područja, Hvara i Istre, brani su početkom srpnja, dok su uzorci sa

kontinentalnog područja, Fužine i Donja Bistra, brani krajem srpnja.

Prilikom istraživanja određivani su ukupni fenoli i flavonoidi spektrofotometrijski te

antioksidacijski kapacitet primjenom dviju različitih metoda: redukcijom željezovog iona

(FRAP) te uporabom 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) radikala. Također, određena je i

antimikrobna aktivnost ektrahiranih uzoraka lavande te eteričnih ulja lavande. Prilikom

ekstrakcije, korištena su dva različita otapala, 30% vodena otopina etanola te 30% vodena

otopina acetona.

U tablici 3. prikazani su rezultati određivanja koncentracije ukupnih fenola (UF) i

flavonoida (UFL) u uzorcima sušene lavande s četiri različita područja RH (Vižinade, Hvara,

Fužine te Donje Bistre) ekstrahirani etanolnim otapalom. Iz razlike UF i UFL dobiveni su

ukupni neflavonoidi. Rezultati su izraženi u miligramima na gram uzorka (mg/ g).

U tablici 4. prikazani su rezultati određivanja koncentracije ukupnih fenola i

flavonoida u uzorcima sušene lavande s četiri različita područja RH (Vižinade, Hvara, Fužine

te Donje Bistre) ekstrahirani 30% vodenom otopinom acetona. Iz razlike UF i UFL dobiveni

su ukupni neflavonoidi. Rezultati su izraženi u miligramima ekvivalenta galne kiseline (GAE)

na gram uzorka (mg GAE/ g).

Slika 13. prikazuje usporedne vrijednosti antioksidacijskog kapaciteta određivanog

FRAP metodom, na uzorcima osušene lavande, s četiri različita područja RH (Vižinade,

Hvara, Fužine te Donje Bistre), dobivenih ekstrakcijom 30%-tnom vodenom otopinom

etanola i 30%-tnom vodenom otopinom acetona. Rezultati su izraženi u mmol Trolox

ekvivalenta na 1 grama uzorka.

Slika 14. prikazuje usporedne vrijednosti antioksidacijskog kapaciteta određivanog

DPPH metodom, na uzorcima osušene lavande, s četiri različita područja RH (Vižinade,

Hvara, Fužine te Donje Bistre), dobivenih ekstrakcijom 30%-tnom vodenom otopinom

etanola i ekstrakcijom 30%-tnom vodenom otopinom acetona. Rezultati su izraženi u mmol

Trolox ekvivalenta na 100 grama uzorka.

Slika 15. prikazuje antimikrobno djelovanje uzoraka sušene lavande ekstrahiranih 30

% vodenom otopinom etanola na bakteriju Escherichie coli. Mjerena je apsorbancija u prvih

34


6 sati, svaka 2 sata, zatim slijedeći dan te 24 sata nakon toga. Na istom grafu, paralelno su

uspoređivani uzorci sušene lavande s četiri različita područja RH (Vižinade, Hvara, Fužine te

Donje Bistre).

Slika 16. prikazuje antimikrobno djelovanje uzoraka sušene lavande ekstrahiranih 30

% vodenom otopinom etanola na bakteriju Staphyloccocus aureus. Mjerena je apsorbancija u

prvih 6 sati, svaka 2 sata, zatim slijedeći dan te 24 sata nakon toga. Na istom grafu, paralelno

su uspoređivani uzorci sušene lavande s četiri različita područja RH (Vižinade, Hvara, Fužine

te Donje Bistre).

Slika 17. prikazuje antimikrobno djelovanje eteričnih ulja lavande na bakteriju

Escherichie coli. Mjerena je apsorbancija u prvih 6 sati, svaka 2 sata, zatim slijedeći dan te

24 sata nakon toga. Na istom grafu, paralelno su uspoređivani uzorci eteričnog ulja lavande s

četiri različita područja RH (Vižinade, Hvara, Fužine te Donje Bistre).

Slika 18. prikazuje antimikrobno djelovanje eteričnih ulja lavande na bakteriju

Staphyloccocus aureus. Mjerena je apsorbancija u prvih 6 sati, svaka 2 sata, zatim slijedeći

dan te 24 sata nakon toga. Na istom grafu, paralelno su uspoređivani uzorci eteričnog ulja

lavande s četiri različita područja RH (Vižinade, Hvara, Fužine te Donje Bistre).

35

05

1015202530354045

mm

ol F

e2+/

g

L.H. L.I. L.F. L.DB.

uzorak lavande

FRAP metoda

30% EtOH

30% Aceton


Tablica 3. ukupni fenoli i flavonoidi ektrahirani 30%-tnom vodenom otopinom etanola

UZORAKUKUPNI FENOLI

mg/gUKUPNI FLAVONOIDI

mg/gUKUPNI NEFLAVONOIDI

mg/g x ± SD x ± SD x ± SD

L.H.* 123,66±7,34 16,15±1,12 107,51

L.I.* 110,84±8,31 13,04±0,83 97,8

L.F.* 57,26±1,25 4,3±0,08 52,96

L.DB.* 44,88±1,16 4,00±0,40 40,88*L.H.=lavanda s područja Hvara; L.I.= lavanda s područja Istre; L.F.= lavanda s

područja Fužina; L.DB.= lavanda s područja Donje Bistre

Tablica 4. ukupni fenoli i flavonoidi ektrahirani 30%-tnom vodenom otopinom acetona

UZORAKUKUPNI FENOLI

mg/gUKUPNI FLAVONOIDI

mg/gUKUPNI NEFLAVONOIDI

mg/g x ± SD x ± SD x ± SD

L.H.* 113,71±7,67 15,22±0,39 98,49

L.I.* 98,73±2,45 11,99±0,31 86,74

L.F.* 52,42±0,53 4,37±0,04 48,05

L.DB.* 36,83±3,26 4,25±0,43 32,58*L.H.=lavanda s područja Hvara; L.I.= lavanda s područja Istre; L.F.= lavanda s

područja Fužina; L.DB.= lavanda s područja Donje Bistre

36

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0 2 4 6 24 48

vrijeme (sati)

A 6

20 n

m

E. coli E. coli + ekstr.LDB E. coli +ekstr. LF E. coli + ekstr.LI E. coli + ekstr.LH


Slika 13. Ukupni antioksidacijski kapacitet sušene lavande dobiven FRAP metodom

(*L.H.=lavanda s područja Hvara; L.I.= lavanda s područja Istre; L.F.= lavanda s područja

Fužina; L.DB.= lavanda s područja Donje Bistre)

Slika 14. Ukupni antioksidacijski kapacitet sušene lavande dobiven DPPH metodom

(*L.H.=lavanda s područja Hvara; L.I.= lavanda s područja Istre; L.F.= lavanda s područja

Fužina; L.DB.= lavanda s područja Donje Bistre)

37

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0 2 4 6 24 48

vrijeme (sati)

A 6

20 n

m

E. coli E. coli + uljeLDB E. coli + ulje LF E. coli + uljeLI E. coli + uljeH


Slika 15. Antimkrobno djelovanje ekstrakta lavande na bakteriju Escherichie coli

0

0,050,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0 2 4 6 24 48

vrijeme (sati)

A 62

0 nm

S. aureus S. aureus + ekstr.LDB S. aureus +ekstr. LF

S. aureus + ekstr.LI S. aureus + ekstr.LH

Slika 16. Antimkrobno djelovanje ekstrakta lavande na bakteriju Staphyloccocus aureus

Slika 17. Antimkrobno djelovanje eteričnih ulja lavande na bakteriju Escherichie coli

38

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0 2 4 6 24 48

vrijeme (sati)

A 6

20 n

m

S. aureus S. aureus + uljeLDB S. aureus + ulje LF S. aureus + uljeLI S. aureus + uljeLH


Slika 18. Antimkrobno djelovanje eteričnih ulja lavande na bakteriju Staphyloccocus aureus

5. RASPRAVA

U ovom radu cilj je bio usporediti koncentracije ukupnih fenola (UF), flavonoida

(UFL) i neflavonoida, antioksidacijskog kapaciteta i antimikrobne aktivnosti uzoraka lavande

ubranih na 4 različita područja RH. Lavanda koja je istraživana u ovom radu ubrana je

sredinom srpnja na području Hvara, Istre, Fužina i Donje Bistre. Ekstrakcija fenolnih spojeva

lavande provedena je primjenom dvaju otapala i to: 30 % vodena otopina etanola i 30 %

vodena otopina acetona, uz refluks pri 60ºC tijekom 30 minuta.

5.1. FENOLNI SPOJEVI U EKSTRAKTU SUŠENE LAVANDE

Ukupni fenoli, određivani su primjenom spektrofotometrijske metode koja se bazira na

reakciji UF sa Folin-Ciocalteu reagensom, a flavonoidi na sposobnosti da tvore kompleks sa

AlCl3 čiji intenzitet obojenja se očitava pri 450 nm. Ukupni neflavonoidi izračunati su iz

razlike UF i UFL. Rezultati spektrofotometrijskog određivanja ukupnih fenolnih spojeva

39


prikazani su u tablicama 1. i 2., a vrijednosti su izražene u mg/g suhe tvari uzorka. Dobiveni

rezultati pokazuju da postoji značajna razlika između koncentracije fenolnih spojeva lavande s

primorskog dijela Hrvatske u odnosu na lavandu s kontinentalnog dijela RH.

Najviša koncentracija ukupnih fenola, izmjerena je u uzorku lavande sa Hvara (123,66 mg/g

suhe lavande) u etanolnom ekstraktu te 113,71 mg/g u acetonskom ekstraktu. Najniža

koncentracija ukupnih fenola određena je u uzorku iz Donje Bistre (44,88 mg/g u etanolnom

odnosno 36,83 mg/g u acetonskom ekstraktu). U literaturi nema dostupnih podataka o količini

ukupnih fenola u lavandi. Prema jednom od rijetkih istraživanja određeni su različiti fenolni

spojevi u otpadu lavandina koji zaostaje nakon prerade u eterična ulja. Prema prezentiranim

podacima otpad lavandina sadrži oko 215 mg/100 g klorogenske kiseline, te 124 mg/100 g

ružmarinske kiseline (Torras-Claveria i sur. 2007). Međutim, López-Arnaldos i sur. (1997),

odredili su ružmarinsku kiselinu u staničnoj kulturi lavandina u rasponu koncentracija od

2000–3000 mg/100 g suhe tvari. Svi uzroci lavande istraživani u ovom radu sadržavali su

značajno veće koncentracije ukupnih fenola u usporedbi s rezultatima iz literature. Ukupni

fenoli u uzorcima lavande sa Hvara, ekstrahiranim 30 % etanolom, veći su za 10,37% u

odnosu na uzorke iz Istre. Uzorci lavande s kontinentalnog dijela Hrvatske također su se

međusobno razlikovali, tako što su uzorci iz Fužina sadržavali 21,62% više fenola od uzoraka

iz Donje Bistre. Najveća razlika u količini ukupnih fenola određena je između uzoraka

lavande ubranih na području otoka Hvara i uzoraka lavande s područja Donje Bistre. Uzorci

lavande sa otoka Hvara sadržavali su oko 63,71% više ukupnih fenola u odnosu na uzorke

lavande iz Donje Bistre. Ovakvi rezultati upućuju na zaključak da su mikroklimatski uvjeti

značajan faktor koji utječe na količinu biološki aktivnih spojeva u lavandi. Slični rezultati

dobiveni su ekstrakcijom 30% acetonom, gdje je koncentracija ukupnih fenola u uzorcima s

Hvara veća za 13,17% u odnosu na koncentraciju ukupnih fenola u uzorcima lavande iz Istre,

odnosno za 53.9% veća u odnosu na koncentraciju ukupnih fenola u uzorcima lavande iz

Fužina te za 67.61% u odnosu na koncentraciju UF u uzorcima lavande iz Donje Bistre. Veća

koncentracija fenolnih spojeva određena je u svim etanolnim ekstraktima, te se etanol

pokazao kao bolje otapalo za ekstrakciju fenolnih spojeva iz lavande.

Koncentracije flavonoida u uzorcima lavande iz primorskih krajeva Hrvatske 3-4 puta su

veće u odnosu na uzorke iz kontinentalnih krajeva. Najveće vrijednosti, određene su u

uzorcima sa Hvara (16,15 mg/g u 30% etanolu odnosno 15,22mg/g u 30% acetonu), a

najmanje u uzorcima iz Donje Bistre (4,00 mg/g u 30% etanolu odnosno 4,25mg/g u 30%

acetonu). U etanolnom i acetonskom ekstraktu određene su podjednake koncentracije ukupnih

40


flavonoida, tako da izbor otapala nije imao značajniji utjecaj na izolaciju flavonoida iz

lavande. Zabilježena je razlika u udjelu flavonoida u uzorcima s primorskog područja u

odnosu na udio flavonoida u uzorcima s gorskog područja. Uzorci s primorskog područja

znatno su veći. Udio flavonoida u količini fenolnih spojeva u ekstraktima lavande u 30%

vodenoj otopini etanola s područja Hvara iznose 16,15%, s područja Istre 13,04%, Fužina 4,3%

dok iz Donje Bistre iznosi 4,00%. U ekstrakcijama u 30% vodenoj otopini acetona dobiven je

slijedeći udio flavonoida: 15,22% u uzorcima s Hvara, 11,99% iz Istre, 4,37% iz Fužina te

4,25% sa Donje Bistre. Nadalje, u ukupnoj količini fenolnih spojeva prevladavaju spojevi iz

skupine neflavonoida tj fenolne kiseline i njihovi derivati. Torras-Claveria i sur. (2007)

istraživali su sastav otpada lavandina primjenom LC/MS/MS te su identificirali fenolne

spojeve iz skupine hidroksibenzojevih i hidroksicimetnih kiselina te njihove derivate, dok su

iz skupine flavonoida odredili uglavnom flavone te manjim dijelom flavonole i flavanone.Svi

navedeni flavonoidi u otpadu lavandina uglavnom su prisutni u obliku glikozida.

5.2. ANTIOKSIDACIJSKI KAPACITET EKSTRAKTA SUŠENE LAVANDE

Rezultati određivanja antioksidacijskog kapaciteta prikazani su na slikama 1. i 2.

Antioksidacijski kapacitet određivani je DPPH (2,2-difenil-pikrilhidrazi) metodom i FRAP

(Ferric Reducing Antioxidant Power) metodom. DPPH metodom, praćena je reakcija između

stabilnog radikala 1,1-difenil-2-pikrilhidrazila (DPPH•), i fenolnih ekstrakata lavande.

Promjena ljubičaste boje u žutu, pokazivala je spajanje antioksidanta sa slobodnim radikalom.

Navedene promjene određene su mjerenjem apsorbancije pri valnoj duljini od 517nm.

FRAP metodom, praćena je promjena apsorbancije pri 595nm obojenog kompleksa koji

nastaje kada se reducirani ion Fe2+ nađe u prisutnosti 2,4,6-tripiridil-s-triazina (TPTZ

reagens).

Rezultati dobiveni FRAP metodom prikazani su na Slici 13. te uspoređeni prema vrsti

otapala (30%-tnoj vodenoj otopini etanola i 30%-tnoj vodenoj otopini acetona). Sukladno

koncentraciji ukupnih fenola, veći antioksidacijski kapacitet određen je u ekstraktima lavande

s područja Hvara i Istre a manji s područja Fužina i Donje Bistre. Najveće vrijednosti

antioksidacijskog kapaciteta, izmjerene su u acetonskim ekstraktima lavande s Hvarskog

41


područja (43,46 mmol Fe2+/g). Izmjerene vrijednosti, veće su za 15,37 % u odnosu na uzorke

iz Istre, 56,53% u odnosu na uzorke iz Fužina te 74,78% veće od rezultata dobivenih na

uzorcima iz Donje Bistre. U etanolnim ekstraktima, nisu utvrđene značajne razlike

antioksidacijske aktivnosti u odnosu na acetonske ekstrakte. Uzorci s Hvara, sadrže najveći

antioksidacijski kapacitet (36,67 mmol Fe2+/g), što je 9,65% veće od uzoraka iz Istre, 52,74%

od uzoraka iz Fužina te 68,67% veće u odnosu na uzorke iz Donje Bistre.

Na Slici 14. prikazani su rezultati DPPH metode. U uzorcima s Hvara (89,99 mmol

TE/100 g) i Donje Bistre (89,8 mmol TE/100 g), dobivene su najveće vrijednosti s

međusobnom razlikom od 1,41% u etanolnim ekstraktima, odnosno 0,46% u acetonskim

ektraktima. Rezultati uzorka iz Hvara veći su za 3,18% od uzoraka iz Istre u etanolnim

ekstraktima te 2,13% u acetonskim ekstraktima. U odnosu na uzorke iz Fužina, rezultati s

Hvara, veći su za 3,96% u etanolnim odnosno 3,47% u acetonskim ekstraktima. DPPH

metodom, određene su relativno velike vrijednosti antioksidacijskog kapaciteta u svim

uzorcima, te relativno male razlike u vrsti otapala.

Kombinacijom rezultata dobivenih DPPH i FRAP metodom, uočena je razlika u

antioksidacijskom kapacitetu između uzoraka s primorskog i gorskog područja što je u

korelaciji s rezultatima dobivenim pri određivanju ukupnih fenola.

42


5.3. ANTIMIKROBNO DJELOVANJE ETERIČNIH ULJA I EKSTRAKTA LAVANDE

Antimikrobna aktivnost ekstrakata lavande i eteričnh ulja lavande s četiri različita

područja RH (Hvara, Istre, Fužina i Donje Bistre) ispitana je na test mikroorganizmima

Staphylococcus aureus i Escherichia coli. Na hranjivi bujon su nacijepljeni test

mikroorganizmi, što je predstavljalo kontrolni uzorak, dok su u drugi, dodani ekstrakti

lavande i eterična ulja lavande. Prilikom određivanja korišteni su samo ekstrakti lavande u

30%-tnoj vodenoj otopni etanola no ne i acetona zbog ranije provedenih istraživanja koja su

pokazala znatno manju aktivnost ekstrakata u odnosu na eterična ulja. Razlika u apsorbanciji

prikazuje mjeru inhibicije rasta test mikroorganizma.

Rezultati istraživanja antimikrobnog učinka eteričnog ulja lavande prikazani su na slici

15., na kojima se može uočiti da je vrsta Escherichia coli jako osjetljiva na djelovanje

eteričnog ulja primorske lavande, dok je na eterična ulja gorske lavande gotovo rezistentna

kod nižih doza. Najveća aktivnost postignuta je na uzorcima s Hvara i Istre nakon 4 sata, dok

se u slijedećih 2 sata aktivnost smanjilla te se približila vrijednostima uzoraka gorske lavande.

Na Slici 16. prikazani su rezultati dobiveni djelovanjem eteričnih ulja uzoraka lavande

sa 4 kraja RH na bakteriju Staphylococcus aureus. Utvrđena je značajna antimikrobna

aktivnost na navedenu bakteriju, gdje su uzorci sa Hvara i Istre poazali najveću aktivnost.

Uzorci eteričnog ulja iz Donje Bistre pokazali su najmanju antimikrobnu učinkovitost na

Staphylococcus aureus u usporedbi sa preostalim uzorcima. Uzorci iz Istre i Hvara pokazuju

gotovo potpunu učinkovitost u posljednjih 24h.

Na Slici 17., u prvih 2 sata, svi uzorci pokazuju podjednaku aktivnost na bakteriju

Escherichia coli, nakon čega se aktivnost uzoraka lavande iz gorskih krajeva smanjuje dok se

ona iz primorskih krajeva, povećava.

Slika 18. prikazuje dobre učinke aktivnosti ektrakata na bakteriju Staphylococcus

aureus te gotovo podjednake vrijednosti svih uzoraka tijekom 48 sati.

Pri jednakoj apsorbanciji od 620 nm te na istim bakterijama, Escherichii coli i

Staphylococcus aureus, dobiveni su različiti rezultati antimikrobnog djelovanja eteričnih ulja i

ekstrakata lavande. Rezultati pokazuju 2-3 puta veće antimikrobno djelovanje eteričnih ulja,

na prethodno spomenute bakterije, u odnosu na ekstrakte lavande. Takvi rezultati ukazuju na

još jedan dokaz o antimikrobnom djelovanju eteričnog ulja lavande.

U jednoj od većih studija na ovom području, Deans i Ritchie (1987) istraženo je

pedeset eteričnih ulja na četiri koncentracije protiv niza od dvadeset i pet rodova bakterija. U

43


navedenoj studiji, lavanda se pokazala kao najučinkovitija protiv fekalnog indikatora

organizma Enterococcus faecalis. Dok, u suprotnosti, Klebsiella pneumoniae, pokazuje

najmanju djelotvornost, odnosno potiče njezin rad. Rod Bacillus prikazan je u mnogim

studijama kao jako osjetljiv na lavandu (Deans and Ritchie, 1987; Jeanfils et al., 1991; Lis-

Balchin et al., 1998). Staphylococcus aureus i Escherichia coli pokazuju upola manju

aktivnost u odnosu na bakteriju Enterococcus faecalis. Predhodno istraživanje, također

pokazuje manju antimikrobnu aktivnost ektrakata lavande u odnosu na eterična ulja.

44


6. ZAKLJUČAK

Kao učinkovitije otapalo za ekstrakciju polifenola iz sušene lavande pokazala se 30 %

vodena otopina etanola, a vrijednosti ukupnih fenola u etanolnim ekstraktima

određene su u rasponu koncentracija od 44,88 do 123,66 mg/g suhog uzorka. Najveća

koncentracija fenolnih spojeva određena je u lavandi s otoka Hvara a najmanja u

lavandi s područja Donje Bistre. Uzorci s primorskog područja sadržavali su i do tri

puta veću količinu ukupnih fenola u odnosu na uzorke s kontinentalnog dijela

Hrvatske.

Antioksidacijski kapacitet lavande određivan pomoću DPPH i FRAP metode u svim

uzorcima bio je relativno visok te u dobroj korelaciji s količinom ukupnih fenola.

Kombinacijom rezultata navednim metodama te rezultatima ukupnih fenola, može se

zaključiti da klimatski uvijeti imaju značajan utjecaj na antioksidacijski sastav

lavande.

DPPH i FRAP metodom u etanolnim i acetonskim ekstraktima, dobiveni su rezultati

bez značajnih razlika što dovodi do zaključka da antioksidacijsko djelovanje ne ovisi o

otapalu.

Eterična ulja s primorskog područja pokazuju bolje antimikrobno djelovanje na obje

bakterije (Escherichie coli i Staphiloccocus aureus.) s nešto boljim djelovanjem na

bakteriju Staphiloccocus aureus. Rezultati ekstrakata lavande bili su gotovo

podjednaki za sve uzorke na obje bakterije.

U istraživanju je također prikazano bolje djelovanje eteričnog ulja na bakterije u

odnosu na ekstrakte lavande što potvrđuje prethodno provedena istraživanja.

45


7. LITERATURA

Anonimus 1: http://www.pyrus-mm.hr/podlinkovi_priroda/lavanda.htm; 05.06.2009.

Anonimus 2: www.lavander.hr; 01.06.2009.

Anonimus 3: http://organicashitaba.com/pc.html; 29.05.2009.

Anonimus 4: http://www.aromatica.hr/hrv/page.asp?id=o_proizvodima&sub=proiz2;

01.06.2009.

Benzie, I.F.F., Strain, J.J. (1996) The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a

measure of “antioxidant power”: The FRAP Assay. Analyt. Biochem. 239, 70-76.

Blumenthal M, Busse WR, Goldberg A, Gruenwald J, Hall T, Riggins CW, Rister RS,

eds. Klein S, Rister RS, trans. The Complete German Commission E Monographs—

Therapeutic Guide to Herbal Medicines. Austin, TX: American Botanical Council;

Boston: Integrative Medicine Communications; 1998.

Blumenthal M, Goldberg A, Brinckmann J, eds. Herbal Medicine: Expanded

Commission E Monographs. Austin, TX: American Botanical Council; Newton, MA:

Integrative Medicine Communications; 2000.

Bors W, Heller W, Michel C, Saran M. Flavonoids as antioxidants: Determination of

radical scavenging efficiencies. Methods Enzymol 1990;186:343-55.

Bown D. The Herb Society of America New Encyclopedia of Herbs and Their Uses.

London: Dorling Kindersley Ltd.; 2001.

Braun R, Surmann P, Wendt R, Wichtl M, Ziegenmeyer J (eds.). Lavendelblüten. In:

Standardzulassungen für Fertigarzneimittel Text und Kommentar, mit 16.

Ergänzungslieferung. Stuttgart, Germany: Deutscher Apotheker Verlag; 2005.

Carson C.F., Cookson, B.D., Farrelly, H.D. and Riley, T.V.(1995). Susceptibility of

methicillin-resistant Staphiloccocus aureus to the essential oil of Melalenca

Alternifolia. Journal of antimicrobial Chemotheraphy 35,421-4.

Connor, A. M., Luby, J. J., & Tong, C. B. S. (2002) Variability in antioxidant activity

in blueberry and correlations among different antioxidant activity assays. J. Amer. Soc.

Hortic. Sci. 127, 238-244.

46

http://www.aromatica.hr/hrv/page.asp?id=o_proizvodima&sub=proiz2

http://organicashitaba.com/pc.html

http://www.lavander.hr/

http://www.pyrus-mm.hr/podlinkovi_priroda/lavanda.htm


Connor, A. M., Luby, J. J., & Tong, C. B. S. (2002) Variability in antioxidant activity

in blueberry and correlations among different antioxidant activity assays. J. Amer. Soc.

Hortic. Sci. 127, 238-244.

Cullen, W.J., Dulchavsky, S.A., Devasagayam, T.P.A., Venkataraman, B.V., Dutta, S.

(1997) Effect of Maharishi-4 on H2O2-induced oxidative stress in isolated rat hearts. J.

Ethnopharmacol. 56, 215–222.

Daferera, D.J., Ziogas B.N. and Polission, M.G.(2000), GC-MS analysis of essential

oils from some Greek aromatic plants and their fungitoxicity on Penicillium digitatum.

Journal of Agricultural and Food Chemistry 48, 2576-81.

Deans S.G and Ritchie G. (1987) Antibacterial properties of plant essential oils.

International Journal of Food Microbiology 5, 165-80.

Deans S.G., Kennedy A.I., Gundidza, M.G., Mavi S., Watreman P.G. and Gray A.I.

(1994a). Antimicrobial activities of the volatile oil of Heteromorpha trifoliata

{Wendl.} Eckl. & Zeyh. {Apiaceae}. Flavour and Fragrance Journal 9, 245-8.

Devasagayam, T.P.A., Kamat, J.P., Sreejayan, N. (2001) Antioxidant action of

curcumin. U: Micronutrients and Health: Molecular Biological Mechanisms,

(Nesaretnam, K., Packer, L., ured.) AOCS Press, Champaign, IL, str. 42–59.

Dixon, R.A., Paiva, N.L. (1995) Stress-induced phenylpropanoid metabolism. The

Plant Cell. 7, 1085-1097.

Dorman, H.J.D. and Deans, S.G. (2000.). Antimicrobial agents from plants:

Antibacterial activity of plant volatile oils, Journal of Applied Microbiology 88, 308-

16.

Duraković, S. (1996) Opća mikrobiologija, Prehrambeno-tehnološki inženjering,

Zagreb, str. 158, 175-177, 181-183, 190-193, 197-200, 226-233.

Evendri i sur, (2005), The antimutagenic activity of Lavandula angustifolia (lavender)

essential oil in the bacterial reverse mutation assay, Food and Chemical Toxicology 43

1381–1387

Garg, S.C. and Dengre, S.L. (1986). Antibacterial activity of essential oil of Tagetes

erecta Linn. Hindustan Antibiotic Bulletin 28,27-9.

Gaziano, J.M., Manson, J.E., Buring, J.E., Henneksen, C.H. (1992) Dietary

antioxidants and cardiovascular disease, Ann. New York Acad Sci. 669, 249-259.

47


Gey, K.F., Puska, P., Jordan, P. and Moser, U.K. (1991) Inverse correlation between

plasma Vitamin E and mortality from ischemic-heart-disease in cross cultural

epidemiology. Am. J. Clin. Nutr. 53, 326–334.

Haddock, E.A., Grupta, R.K., Al-Shafi, S.M.K., Layden, K., Haslam, E., Magnolato,

D. (1982) The metabolism of gallic acid and hexahydroxydiphenic acid in plants:

biogenetic and molecular taxonomic considerations. Phytochem. 21, 1049-1062.

Harborne JB, Williams CA. Advances in flavonoid research since 1992.

Phytochemistry 2000;55:481-504.

Harborne, J.B. (1980) Plant Phenolics. U: Encyclopedia of Plant Physiology, New

Series, vol 8, (Bell, E.A., Charlwood, B.V., ured.), Springer-Verlag, Berlin.

Harborne, J.B. (1988) The flavonoids: recent advances. U: Plant Pigments, (Goodwin,

T.W., ured.), Academic Press, London, UK, str. 299-343.

Harborne, J.B. (1994) The Flavonoids. Advances in Research Since, Chapman & Hall,

London, UK.

Harborne, J.B., Baxter, H. (1999) The Handbook of Natural Flavonoids. (John Wiley,

ured.), Chichester.

Havsteen B. Flavonoids, A class of natural products of high pharmacological potency.

Biochem Pharmacol 1983;32:1141-8.

Inouye, S., Goi, H., Miyouchi, K., Muraki, S., Ogihara, M. And Iwanami, I. (1993).

Inhibitory effect of volatile components of plants on the proliferation of bacteria.

Bokin Bobai 11, 609-15.

Jain, S.R. and Kar, A. (1971). The antibacterial activity of some essential oils and their

combinations. Plants Medica 20, 118-23.

Janssen, M.A., Scheffer, J.J.C. and Baerheim-Svendsen, A. (1987). Antimicrobial

activities of essential oils: A 1976-1986 literature review on possible applications.

Pharmaceutische Weekblad [Scientific Edition] 9, 193-7.

Jeanfils, J., Burlion, N. And Andrien, F. (1991.). Antimicrobial activities of essential

oils from different plant spacies. Landbouwtijdscbrift- Retue de l'Agriculture 44,1013-

19.

Kamat, J.P., Boloor, K.K., Devasagayam, T.P.A., Venkatachalam, S.R. (2000) Radio-

protective properties of Asparagus racemosus in vitro in rat liver mitochondria. J.

Ethnopharmacol. 71, 425–435.

48


Keville K, Green M. Aromatherapy: A Complete Guide to the Healing Art. Freedom,

CA: The Crossing Press; 1995.

Kinsella, J. E., Frankel, E., German, B., Kanner, J. (1993) Possible mechanisms for the

protective role of antioxidants in wine and plant foods. Food Technol. 47, (4), 85–89.

Kučišec-Tepeš, (1994) Specijalna bakteriologija i odabrana područja iz opće

specijalne mikrobiologije, Školska knjiga, Zagreb, str. 25-28.

Kuštrek, D., (2005) Farmakognozija- fitofarmacija, Zagreb, 289-294.

Larrondo, J.V., Agout, M. And Calvo-Torres, M.A.(1995). Antimicrobial activity of

essences from Labiatae. Micrbios 82, 171-2.

Leung AY, Foster S, eds. Encyclopedia of Common Natural Ingredients Used in

Food, Drugs, and Cosmetics. 2nd ed. New York: John Wiley and Sons, Inc; 1996.

Lis-Balchin, M. (1997.). Essential oils and aromateraphy: their modern role in healing.

Journal of the Royal Society of health 117, 324-9.

Lis-Balchin, M. And Deans, S.G. and Eaglesham, E. (1998.). Relationship between

bioactivity and chemical composition of commercial essential oils. Flavour and

Fragrance Journal 13, 98-104.

Lis-Balchin, M. And Deans, S.G.(1997.). Bioactivity of selected plant esential oils

against Listeria Monocytogenes. Journal of Applied Microbiology 82, 759-62.

Macheix, J.J, Fleuriet, A., Billot, J. (1990) Fruit Phenolics, CRC Press, Boca Raton,

Florida, USA.

Negi, P.S., Jayaprakasha, G.K. (2003) Antioxidant and antibacterial activities of

Punica granatum peel extracts. J. Food Sci. 68, 1473–1477.

Nenoff, P., Haustein, U.F. and Brandt, W.(1996). Antifungal activity of the essential

oil of Melalenca alternifolia [tea tree oil] against pathogenic fungi in vitro. Skin

Pharmacology 9, 388-94.

Nigris, F., Lerman, L.O., Ignarro, S.W., Sica, G., Lerman, A., Palinsky, W., Ignarro,

L.J., Napoli, C. (2003) Beneficial effects of antioxidants and L-arginine on oxidation-

sensitive gene expression and endothelial NO synthase activity at sites of disturbed

shear stress. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 100, 1420–1425.

Onstad D. Whole Foods Companion. White River Junction, VT: Chelsea Green

Publishing Co.; 1996.

49


Ough, C.S., Amerine, M.A. (1988) Methods for analysis of musts and wines, 2. izd.,

Johan Wiley & sons, New York, Chichester, Brisbane, Toronto, Singapore.

Parkash, A. (2001) Antioxidant activity. Analyticl. progress. 19 (2), 1-6.

Pathak D, Pathak K, Singla AK. Flavonoids as medicinal agents – Recent advances.

Fitoterapia 1991;62:371-89.

Pattnaik, S., Subramanayam, V.R., Kole, C.R. (1996). Antibacterial and antifungal

activity of ten essential oils in vitro. Microbios 86, 237-46.

Pattnaik, S., Subramanayam, V.R., Kole, C.R. and Sahoo, S. (1995). Antibacterial and

antifungial activity of essential oils from Gymbopogon: Inter-specific differences.

Microbios 84, 239-45.

Pryor, W. A. (1991) The antioxidant nutrients and disease prevention - what do we

know and what do we need to find out?. Am. J. Clin. Nutr. 53, 391–393.

Ramarathnam, N., Osawa, T., Ochi, H., Kawakishi, S. (1995) The contribution of

plant food antioxidants to human health. Trends Food Sci. Technol. 6, 75–82.

Rice-Evans CA, Miller NJ, Bolwell PG, Bramley PM, Pridham JB. The relative

antioxidant activities of plant-derived polyphenolic flavonoids. Free Radic Res

1995;22:375-83.

Rios, J. L., Recio, M.C. and Villar, A, (1987). Antibacterial activity of selected plants

employed in the Spanish Mediterranean area. Journal of Ethnopharmacology 21, 139-

52.

Rios, J. L., Recio, M.C. and Villar, A, (1988). Screening methods for natural

products with antibacterial activity: a review of the literature. Journal of

Ethnopharmacology 23, 127-49.

Robards, K., Prenzler, P.D., Tucker, G., Swatsitang, P., Glover, W. (1999) Phenolic

compounds and their role in oxidative processes in fruits. Food Chem. 66, 401-436.

Schnaubelt K. Advanced Aromatherapy: The Science of Essential Oil Therapy.

Rochester, VT: Healing Arts Press; 1998.

Schuster, B., Hermann, K. (1985) Hydroxybenzoic and hydroxycinnamic acid

derivates in soft fruits. Phytochem. 24, 2761-2764.

Sherif, A., Hall, R.G. and El-Amamy, M. (1987). Drugs, insekticides and other agents

from Artemisia. Medical Hypotheses 23, 187-93.

50


Strack, D. (1997) Phenolic metabolism. U: Plant Biochemistry, (Dey, P.M., Harborne,

J.B., ured.), Academic Press, London, UK, str. 387-416.

Teuscher E (ed), Brinckmann JA, Lindenmaier MP (translators). Medicinal Spices: A

Handbook of Culinary Herbs, Spices, Spice Mixtures and their Essential Oils.

Stuttgart, Germany: Medpharm Scientific Publishers. 2006;309-310.

Upson T, Andrews S. The Genus Lavandula. Portland, OR: Timber Press; 2004.

Vokou, D., Vareltzidou, S. And Katinakis, P.(1993.). Effects of aromatic plants on

potato storage: sprout suppresion and antimicrobial activity. Agriculture Ecosystems &

Environmet 47, 223-25.

Wall, M.E., Wani, M.C., Hughes, T.J., Taylor, H., 1990. Plant antimutagens. Basic

Life Sci. 52, 61–78.

Yen, G.C., Chen, H.Y., 1994. Comparison of antimutagenic effect of various tea

extracts (green, oolong, pouchong and black tea). J. Food Prot. 57, 54–58.

Yi, W.G., Fischer, J., Krewer, G., Akoh, C.C. (2005) Phenolic compounds from

blueberries can inhibit colon cancer cell proliferation and induce apoptosis. J. Agric.

Food Chem. 53, (18), 7320-7329.

Ziegler, R.G. (1991) Vegetables, fruits and carotenoids and the risk of cancer. Am. J.

Clin. Nutr. 53, 251–259.

51

lavanda je biljka s područja sunčanih kamenjara zapadnog dijela

Documents