le lipoproteine: ruolo delle hdl e di abca1 (atp-binding...
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Le lipoproteine:Ruolo delle HDL e di ABCA1
(ATP-binding cassette transporter A1)nel trasporto inverso del colesterolo
(RCT)
Le lipoproteineAssociazione dei lipidi del plasma (colesterolo, trigliceridi e fosfolipidi) con apolipoproteine
Funzione principale: trasporto dei lipidi e delle sostanze idrofobiche nel sangue ai vari tessuti e organi.
Struttura globulare, differiscono per densità, composizione lipidica e porzione apolipoproteica.
Sintetizzate principalmente nel fegato e nell’intestino
Classificazione delle lipoproteine
CM VLDL IDL LDL HDL
CM = chilomicroni, tra le lipoproteine hanno < densità e > diametro. Raccolgono i TG e il colesterolo a livello dell’intestino tenue. Sono presenti pressochè solo dopo i pasti .VLDL = (very low density lipoproteins) raccolgono TG e CE a livello del fegatoIDL = (intermediate density lipoproteins) ciò che resta delle VLDL dopo che hanno dato TG al tessuto adiposo e muscolareLDL = (low density lipoproteins) ciò che resta delle IDL, definite colesterolo “cattivo”HDL = (high density lipoproteins) definite colesterolo “buono”Apo = apolipoproteina TG=triglyceride CE= cholesteryl ester
Maggiore proteina
ApoBApoA-I (70%)ApoA-II (20%)ApoA-IV, ApoC,ApoD, ApoE (10%)
ApoB100ApoC-III ApoE
Maggior lipide
TG TG CE CE CE
Mediante ultracentrifugazione sono separate in base alla loro diversa densità:
Principali siti di formazione delle HDL
Il destino dei lipidi nel plasma
Via Esogenariguarda il metabolismo dei lipidi introdotti conla dieta, è legata all’azione dei CM
Via Endogenaha inizio con la secrezione di VLDL da parte del fegato
Contribuiscono ai livelli lipidici circolanti
Via del Trasporto inverso del colesterolo (RCT)catalizza il ritorno del colesterolo al fegato dove viene secreto sotto forma di sali biliari. Il ruolo centrale di questo processo è svolto dalle HDL
Proprietà delle HDL nel plasma umano
Numerosi studi epidemiologici hanno mostrato che la concentrazione di HDL-C è inversamente correlata al rischio delle malattie cardiovascolari (CVD) (Gotto & Brinton 2004; Barter P. et al 2007; Tall A.R. 2008)
Fattori associati con il metabolismo delle HDL sono cardioprotettivi
Le HDL prevengono CVD principalmente rimuovendo il colesterolo dalle cellule dei tessuti periferici e trasportandolo al fegato
CVD sono una delle principali cause di morte nei paesi Occidentali
Caratteristiche delle due sottoclassi di HDL2 e HDL3 umane
Eterogeneità delle HDL nel plasma umanoUltracentrifugazione: due subfrazioni, HDL2 e HDL3
Corsa elettroforetica su gel di Poliacrilamide non denaturante: cinque sottopopolazioni differenti:HDL 2b, HDL2a, HDL3a, HDL3b, HDL3c
Eterogeneità delle HDL nel plasma umano
a: microscopio elettronico: particelle discoidali e sfericheElettroforesi su gel d’agarosio: particelle con migrazione α, la più rappresentata nel plasma ( forma matura di HDL) , particelle con migrazione pre-β ( forma immatura di HDL)b: composizione apolipoproteica: particelle che contengono apo A-Ie altre che contengono apo A-I e apo A-II;
a b
Metabolismo delle HDLConsiste in formazione, arricchimento,
deplezione, scambio di lipidi e apoproteine
Apo A-I : necessaria per la biosintesi e il metabolismo delle HDL
ABCA1 LCAT : Lecitin cholesterol Acyltransferase, genera colesterolo estere
SR-B1: recettore “scavenger”di classe B e tipo 1
CETP: cholesterol ester transfer protein
PLTP: Phospholipid transfer protein
LPL : lipasilipoproteica
HL: lipasi epatica
EL : lipasi endoteliale
Cubulina
Apo A-I Povera di lipidi
Membrana cellulare
PL
ABCA1
Apo A-I HDL discoidalepre β-migranti
(forma immatura )
FC
FC trasferito dalla membrana cellulare
LCATCE
ApoAI-HDLSferica α-migranti(forma matura)
Formazione di particelle mature α-HDLStep 1. Step 2.
1. Formazione di apoA-I povere di lipidi e genesi di preβ-migranti, promuovono l’efflusso di FC (free cholesterol) attraverso ABCA1
2. Interazione delle preβ-migranti con LCAT e formazione delle α-migranti
CE
Importanza della formazione delle particelle pre-ββββ migranti (step 1)
Frazione di HDL3 + chimasi umana Efflusso dicolesterolo
HDL3 contengono particelle α-migranti e β-migranti (6%)
0%Nell’intima vasale quando si ha una secrezione di chimasi ad opera di must-cellule attivate, il colesterolo non viene rimosso: conseguente formazione di “foam-cells” e alto rischio di aterosclerosi ( Favari E, et al., 2004)
CE
HDL sferiche α-migranti
LCAT CE
Prodotto di fusione instabile
ApoAI poveradi lipidi
Stabile
CE
CE
Step 3.
CE
Step 4.
apoAI-HDL discoidale
FegatoapoAII-HDL discoidale
LCAT CE
apoAI-HDL sferica CE
apoAI/AII-HDL sferica
3. Rimodellamento delle HDL ad opera di LCAT
4. Meccanismo di incorporazione dell’apoA-II nelle apoA-I HDL
Formazione di particelle mature α-HDL
PLTP
Trasporto inverso del colesterolo (RCT)Componente delle membrane eucariotiche, precursore degli acidi biliari e degli ormoni steroidei
Quasi tutte le cellule animali lo sintetizzano a partire dall’acetil-CoA, ma solo gli epatociti e le cellule steroidogeniche riescono a catabolizzarlo in sali biliari e ormoni steroidei
Le cellule lo acquisiscono anche dalle lipoproteine circolanti
Se in eccesso all’interno delle cellule diviene citotossico
L’RCT è il meccanismo che serve per rimuovere l’eccesso dai tessuti periferici
I principali componenti che prendono parte al RCT sono le HDL , ABCA1 e apo A-I
Famiglia degli ABC-trasportatori
Ampia famiglia i cui membri sono tutti proteine integrali di membrana che utilizzano ATP come fonte di energia per trasportare metaboliti attraverso le membrane.
Sono raggruppati in sette sottoclassi : ABCA, ABCB, ABCC, ABCD, ABCE, ABCF, ABCG. Nell’uomo sono stati individuati 49 ABC-trasportatori, 13 fanno parte della sottoclasse ABCA.
Strutturalmente vengono suddivisi in due gruppi: 1) Trasportatori “interi” hanno due unità strutturali simili legate covalentemente2) Gli “emi”-trasportatori una singola unità strutturale.
ABCA1
Trasportatore meglio caratterizzato, espresso in modo ubiquitario, soprattutto nel fegato, intestino, polmoni, tessuti fetali. Si trova nella membrana cellulare, dei lisosomi e dell’apparato di Golgi.
Mutazioni nel gene causa Malattia di Tangier (Fredrickson, 1960)malattia rara ereditaria autosomiale caratterizzata da bassi livelli di HDL e di ApoAI, accumulo di esteri di colesterolo nei macrofagi con conseguente sviluppo di aterosclerosi precoce.(Bodzioch et al., 1999; Brooks-Wilson et al.,1999; Rust et al.,1999)
Media l’efflusso di colesterolo e fosfolipidi in maniera unidirezionale verso specifici accettori extracellulari poveri di lipidi. L’accettore preferenziale è Apo A-I, ma possono fungere da accettori anche Apo A-II, Apo E, Apo C-I, Apo C-II, Apo C-III, Apo A-IV.
ABCA1
NBD1
NBD2
TMD1 TMD2
Walker C
Walker B
Walker A
Sav1866 (ABCA1-like) isolato da Staphylococcus aureus
(Dawson RJP, Locher KP, 2006)
Interazione tra le eliche delle due subunità e formazione di una cavità circolare, rappresenta il canale per il passaggio dei substrati
Idrolisi ATP permette alla proteina di adottare una conformazione in grado di legare il substrato dal lato citoplasmatico
TMDs: domini transmembranaICLs: loops intracellulariECLs: loops extracellulariNBDs: domini di legame dei nucleotidi 1,2,3,4,5,6: le α-eliche
Modelli per la secrezione di lipidi ABCA1- mediata
Esocitosi Retroendocitosi
colesterolo in eccesso impaccato in vescicoleche traslocano verso porzioni di membrana contenenti ABCA1
Interazione ABCA1 e apolipoproteinesi formano vescicoleendocitosi verso depositi di EC e PLesocitosi e rilascio di substrati all’esterno della cellula
Ciclo di trasporto di ABCA1
(Denis M, et al., 2004)
1. Le molecole di ABCA1 formano unità tetrameriche
4. Apo AI interagisce con la forma tetramerica mediante α-eliche anfipatiche che consistono di sequenze di 11 o 22 amminoacidi ripetuti
2. Lega i substrati lipidici e cambia conformazione
5-6. L’ATP è idrolizzatoe viene rilasciato Apo AIlipidato
3. ABCA1 scambia ADP con ATP
Regolazione di ABCA1
Ruolo importante nel metabolismo lipoproteico e nell’aterogenesi
SRB1: sterol regulatory element binding protein-1SCD: stearoyl-CoA desaturases
Effetto degli acidi grassi insaturi su ABCA1Acidi grassi insaturi riducono i livelli di mRNA e di proteina di ABCA1 in modo LXR-dipendente (studi in vivoe in vitro)
(Jiyoung Lee et al. Journal of Nutritional Biochemistry 2011)
PPARγγγγ attiva la trascrizione genica di ABCA1, LXR α e LXRβ nell HepG2
T0901317 agonista di LXRGW1929 agonista di PPARγ; GW9662 antagonista di PPARγ
I ligandi di PPARγγγγ regolano l’espressione di ABCA1 in modo PPARγγγγ-dipendente
PPARγγγγ riduce i livelli di proteina di ABCA1 e LXR β nelle HepG2
Analisi mediante western blot di ABCA1 e LXRβ
Aumento di ABCA1 dopo 24h di trattamento con T0901317 in accordo con i valori di mRNA
Diminuzione di ABCA1 e di LXRβ con GW1929discrepanza implica una regolazione post-trascrizionale sotto il controllo di PPARγ
GW1929 attiva la via MEK1/2-ERK1/2 (W.C.Huang et al., 2002)ERK1/2 è un regolatore negativo della stabilità della proteina ABCA1 nei macrofagi
PPARγγγγ media la regolazione post-trascrizionale di ABCA1 ma non dipende dalla via MEK1/2-ERK1/2
Western blot del contenutodella proteina LXRβ citoplasmatica (Cyto.) e nucleare ( Nuc.)
Agonisti di PPARγ destabilizzano il legame LXRβ-ABCA1attiva l’espressione genica in maniera LXR-dipendente
Inibendo MEK1/2-ERK1/2 si influenza lo stato fosforilativo e si abolisce la dissociazione del complesso Denis A. Mogilenko et al.,
Biochemical and Biophysical Research 2010
Overespressione di ABCA1
nel fegato
Aumento di HDL,suggerendo una significativa quantità di HDL si forma sulla superficie degli epatociti
Topi con inattivazione selettiva di ABCA1 nei macrofagi
Livelli normali di HDL-C
Sviluppo di topi Abca1-knockout fegato-specificiAbca1(-L/-L) mediante gene targeting
Southern blotGene ABCA1
Real-time PCR
Western blot
Southern blot
La ricombinazione diABCA1Era specifica per ilfegato
Efflusso lipidico in topi wt e Abca1 (-L/-L)
Topi knockout fegato-specifici per ABCA1 non hanno efflusso lipidicoApo-AI dipendente negli epatociti
Analisi dei lipidi plasmatici e delle lipoproteine
Relazione tra la proteina ABCA1 epatica e HDL-C
Si osserva un effetto genotipo dose dipendente tra l’espressione epatica della proteina ABCA1 che correla con la diminuzione della concentrazione plasmatica di HDL-C fegato specifica
Western blot
Ruolo di ABCA1 nel catabolismo delle HDL
In pazienti con TD iniettati con HDL di donatori sani queste venivano rapidamente degradate.
HDL di topi wt marcate con [125I] tyramina cellobioso per analizzare il decadimento plasmatico e l’assorbimento nei tessuti e iniettate nei 3 genotipi dei topi.
L’assorbimento di HDL-Apo AI avviene permezzo di SR-BI nel fegato, l’Apo AI rilasciatamancando ABCA1 viene degradata dal rene
Conclusioni e prospettive future
ABCA1 è la molecola chiave nella formazione delle HDL nascenti (pre-βHDL) ed è responsabile dell’assemblamento di FC e PL con Apo-AI.
Responsabile nel mantenere la concentrazione epatica di HDL attraverso la lipidazione di Apo-AI di nuova sintesi e di Apo-AI riciclate derivanti dal catabolismo di particelle di HDL.
Modelli animali e studi in vitro mostrano che ABCA1 epatico è responsabile dell’80% delle HDL plasmatiche, e ABCA1 intestinale del 30%.
ABCA1 è finemente regolato sia a livello trascrizionale che post-trascrizionaleComprendere i meccanismi di regolazione e le molecole coinvolte in questo processo saranno utili a sviluppare nuove strategie terapeutiche nella cura delle malattie cardiovascolari