E

Questa tavola illustra quattro specie,appartenenti a phyla diversi, che pro-ducono alcune delle neurotossine de-scritte in questo articolo. Qui sopra, ilgasteropode COMES purpurascens in unasequenza di caccia ai danni di un pe-sce pagliaccio. In alto a destra, il fami-gerato mamba verde africano. Qui afianco, lo scorpione Centruroides exiii-eauda, produttore di a-neurotossine. Inbasso, un anemone di mare cattura ungamberetto paralizzandolo con il suoveleno. Oltre all'uso scientifico, alcunedi queste tossine stanno trovando appli-cazioni terapeutiche.

Le neurotossine presinapticheOltre a chiarire le basi molecolari della trasmissione dell'impulsonervoso, lo studio di questi potenti veleni prodotti da varie specie

di animali permette di formulare ipotesi sul loro significato evolutivo

di Michela Matteoli e Cesare Montecucco

N

elle moderne battaglie per ilcontrollo di una città o di unanazione, la conquista delle

stazioni radiotelevisive, delle sedi deigiornali e delle centrali telefoniche co-stituisce un passaggio strategico fon-damentale per il successo finale. Que-sto perché in organismi estremamentecomplessi e distribuiti nel territorio, co-me sono le società moderne, l'elabora-zione e la trasmissione delle informa-zioni rivestono un ruolo vitale. Qualco-sa di molto simile avviene in natura damolti milioni di anni nelle interazionifra organismi diversi che vivono negliambienti più svariati.

Lo sviluppo della vita animale nelcorso dell'evoluzione biologica è statoaccompagnato dall'aumento del nume-ro delle cellule e dalla loro specializza-zione in tessuti dotati di proprietà spe-cifiche. Anche i metazoi più semplicidotati di locomozione autonoma pos-siedono un sistema nervoso funzionai-mente simile a quello degli animali piùevoluti, caratterizzato dalla presenza ditre tipi di neuroni: motoneuroni che in-nervano i muscoli e ne provocano lacontrazione, neuroni sensitivi che rice-vono segnali e li inviano al centro e in-terneuroni che fanno da tramite tra idue precedenti. Questi neuroni sonoconnessi tra loro e con i muscoli dastrutture anatomiche specializzate perlo scambio di segnali, le sinapsi. Dopola comparsa dei primi metazoi, il corsodell'evoluzione animale si è fatto estre-mamente rapido e ha generato un'innu-merevole varietà di organismi provvistidi sistemi nervosi via via più complessisino ad arrivare ai cento miliardi dineuroni e al milione di miliardi di si-napsi del sistema nervoso dell'uomo.Questa proliferazione incredibile nonha cambiato il ruolo della sinapsi: essaè rimasta il sito dove le informazionipassano da una cellula all'altra.

La produzione di armi da utilizzarsicontro altre specie in azioni di difesa odi offesa è una strategia di sopravvi-

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venza molto comune in natura ed è sta-ta adottata da un enorme numero dispecie: dai procarioti all'uomo. Questearmi, che in biologia sono denominatetossine, sono dirette verso i bersagli piùdiversi e quando agiscono, come nellamaggior parte dei casi, interferendo conla funzione sinaptica, assumono il no-me di neurotossine. In effetti, se lo sco-po è quello di alterare il comportamen-to o la sopravvivenza della specie ani-male nemica, quale bersaglio miglioredel luogo dove le informazioni si inte-grano e si scambiano? E fra tutte le di-verse sinapsi, quale miglior bersagliodelle giunzioni neuromuscolari, dovel'impulso nervoso causa la contrazionedel muscolo? Un perfetto coordinamen-to motorio è alla base della sopravvi-venza di un animale: basta un suo mini-mo deficit perché esso non riesca a evi-tare i pericoli.

La sinapsi è la regione anatomica-mente specializzata dove un segnaleelettrico generato in un neurone vieneconvertito in uno di tipo chimico cheraggiunge la cellula innervata stimolan-dola. Tale passaggio d'informazione av-viene grazie all'attivazione coordinata esequenziale di una serie di proteine, cia-scuna potenziale bersaglio di qualchetossina. Per capire il modo d'azione del-le neurotossine a bersaglio presinaptico- oggetto di questo articolo - è necessa-rio fornire gli elementi essenziali dellafisiologia della giunzione neuromusco-lare (si veda la figura a pagina 94), allacui comprensione hanno contribuitoproprio gli studi sul meccanismo d'a-zione delle neurotossine stesse.

Tra le due facce della membrana pla-smatica del neurone a riposo esiste unadifferenza di potenziale di 60-70 milli-volt, dovuta essenzialmente all'azionedi una pompa - che idrolizza ATP (ade-nosintrifosfato, l'onnipresente combu-stibile cellulare) per trasferire ioni so-dio fuori della cellula e ioni potassiodentro la cellula - e al fatto che lamembrana è circa dieci volte più per-

meabile al potassio che al sodio. Lafuoriuscita di potassio dalla cellula creaun potenziale negativo verso l'internoche può venire innalzato (iperpolariz-zazione) o abbassato fino a valori posi-tivi (depolarizzazione) durante l'attivitàneuronale. L'eccitazione di un moto-neurone consiste nella depolarizzazionedi una sua porzione che si trasmette alcorpo cellulare e poi lungo l'assone fi-no al terminale presinaptico e quindi almuscolo. Una depolarizzazione dellamembrana plasmatica induce l'aperturadi canali specifici, che mediano l'entra-ta massiccia nella cellula di ioni sodiolungo il gradiente di concentrazione. Sigenera così un potenziale d'azione,cioè una variazione del potenziale dimembrana, che raggiunge valori positi-vi (fino a + 45 millivolt). Il consistenteafflusso di ioni sodio all'interno fa flui-re lungo l'assone una corrente che de-polarizza le regioni vicine, causando asua volta l'apertura di canali per il so-dio adiacenti e così via. Questo mecca-nismo fa sì che il potenziale d'azione sitrasmetta inalterato lungo l'assone -che può raggiungere la lunghezza dimetri nei motoneuroni periferici deglianimali più grandi - con velocità di de-cine di metri al secondo.

Diverse caratteristiche possono au-mentare la velocità e il rendimento del-la trasmissione del segnale. Mentre in-vertebrati come il calamaro hanno svi-luppato assoni giganti (fino a 1 milli-metro di diametro), i vertebrati ottengo-no velocità di conduzione ugualmenteelevate, e con risparmio di spazio pre-zioso, isolando i propri assoni per mez-zo della guaina mielinica (uno strato dinatura lipidica che rende l'assone inat-taccabile dalla maggior parte delle tos-sine tranne che nelle zone, i nodi diRanvier, dove si interrompe). Il poten-ziale d'azione cessa perché l'elevatadepolarizzazione chiude i canali per ilsodio (Na) e apre canali specifici per ilpotassio (K). Questa azione combina-ta dei canali, insieme con la funzione

Qui sopra, fotografia al microscopio elettronico di una sezione longitudinale delterminale motorio di rana. Il terminale è coperto da processi di una cellula diSchwann e contiene mitocondri, neurofilamenti e una vasta popolazione di vesci-cole sinaptiche. Gli addensamenti scuri sono le zone attive, sede del rilascio di ace-tilcolina, cui corrispondono le pieghe post-giunzionali della membrana muscolare(cortesia Numa lezzi). In alto, giunzione neuromuscolare di rana, colorata con a-bungarotossina coniugata a fluoresceina allo scopo di rivelare la distribuzione deirecettori per l'acetilcolina.

MUSCOLO

FILAMENTI DI ACTINA

ACETILCOLINA

NODO DI RANVIER

MICROTUBULI

VESCICOLESINAPTICHE

CONTENENTIACETILCOLINA

dell'enzima Na/K-ATPasi, ristabiliscerapidamente il potenziale di riposo,rendendo possibile la trasmissione diun altro impulso. Una volta raggiunto ilterminale sinaptico, il potenziale d'a-zione determina il rilascio nello spaziointersinaptico di acetilcolina, un media-tore chimico che si lega a recettori spe-cifici presenti sulla cellula muscola-re, causandone una forte depolarizza-zione (si veda l'articolo La chimicadella comunicazione cerebrale di J. P.Changeux in «Le Scienze» n. 305, gen-naio 1994).

LA GIUNZIONENEUROMUSCOLARE

La microfotografia nella pagina afronte mostra una giunzione neuro-muscolare di rana e fa vedere come es-sa sia piena di vescicole chiare, alcunedelle quali sono legate a zone specializ-zate della membrana presinaptica. lezone attive, riconoscibili come adden-samenti scuri. Ciascuna di queste vesci-cole, dette vescicole sinaptiche, con-tiene alcune migliaia di molecole diacetilcolina che vi rimangono segregate

Microfotografia di una giunzione mu-scolare e rappresentazione schematicadei suoi organelli interni. L'assone delmotoneurone è coperto da una guai-na mielinica interrotta ai nodi di Ran-vier, e termina formando un bottonegiustapposto alla membrana del mu-scolo. I canali per il sodio e per il po-tassio sono presenti in tutte le porzio-

ni della membrana non rivestite damielina. I canali per il calcio

sono localizzati nelle zoneattive, dove sono legate

vescicole sinaptiche checontengono acetilcolina.La maggior parte del-le vescicole è legata aimicrofilamenti di ac-tina e costituisce unariserva che può esseremobilizzata in seguitoall'aumento della con-

centrazione citosolica dicalcio. L'acetilcolina rila-sciata dalle vescicole do-po fusione con la mem-brana presinaptica vienecaptata dal recettore del-l'acetilcolina, che si apree lascia passare gli ioni,depolarizzando la mem-brana muscolare. Questadepolarizzazione si tra-smette ad altre zone delmuscolo causandone lacontrazione.

perché convertite in forma protonatadall'acidità generata dalla pompa pro-tonica ad ATP. Quando la membranasinaptica si depolarizza, si ha l'apertu-ra di canali, anch'essi concentrati nellezone attive, che dipendono dal voltag-gio e sono specifici per lo ione calcio.Ciò provoca l'immediato ingresso diquesto ione lungo l'elevatissimo gra-diente di concentrazione esistente fraesterno e interno, che ne innalza la con-centrazione a 100-300 micromoli. Il le-game di alcuni ioni calcio a siti proteicidell'apparato di neuroesocitosi, ancora

non identificati, provoca la fusione del-le vescicole con la membrana presi-naptica e il rilascio dell'acetilcolinanello spazio intersinaptico. Tutti questipassaggi si svolgono in soli 200-300microsecondi; evidentemente, tutto èpronto e non si attende che il segna-le dato dal calcio. L'esocitosi della ve-scicola sinaptica è rapidamente seguitadalla sua endocitosi, cioè dalla richiu-sura del collo che la unisce alla mem-brana presinaptica, e il ciclo riprende.

La maggior parte delle vescicolepresenti all'interno del terminale si-naptico, circa 100 milioni, non entra inquesto ciclo di eso-endocitosi e fungeda riserva. Ricerche eseguite da PaulGreengard, Flavia Valtorta, Fabio Ben-fenati e collaboratori hanno chiaritoche queste vescicole sono legate a mi-crofilamenti di actina mediante la pro-teina sinapsina e che tale legame èreversibile e controllato dal suo sta-to di fosforilazione. Nel neurone in cuisi succedono continuamente potenzia-li d'azione, la concentrazione intrasi-naptica di calcio aumenta necessaria-mente, provocando tra l'altro la fosfo-rilazione della sinapsina con conse-guente distacco delle vescicole sinapti-che dai microfilamenti e loro immis-sione in ciclo.

Il rilascio dell'acetilcolina da partedel motoneurone non solo è localizzato,ma è anche quantizzato: ciascun quantocorrisponde al contenuto di una vesci-cola sinaptica. Un potenziale d'azionepresinaptico tipico causa la fusione di100-200 vescicole, che riversano damezzo a un milione di molecole di ace-tilcolina sulle pieghe post-giunzionali,dove sono concentrati i suoi recettorispecifici (sino a 10 000 per micrometroquadrato). Tali recettori sono canali io-nici, formati da cinque subunità che at-traversano la membrana muscolare. Es-si possono esistere, come hanno di-mostrato Jean-Pierre Changeux e colla-boratori all'Istituto Pasteur di Parigi,negli stati chiuso, aperto e desensibiliz-zato. I recettori per l'acetilcolina sononormalmente chiusi e non lasciano pas-sare ioni, ma il legame del neurotra-smettitore li fa aprire, permettendo ilrapido passaggio degli ioni monovalen-ti. Ciò provoca una forte depolarizza-zione della membrana muscolare conconseguente apertura dei canali per ilsodio e generazione di un potenzialed'azione che fa contrarre la fibra mu-scolare. I recettori per l'acetilcolinanon sono sensibili al voltaggio e, sino aquando l'acetilcolina rimane legata, re-stano aperti. Tuttavia, la concentrazio-ne di acetilcolina nello spazio intersi-naptico cala rapidamente non solo perdiffusione e ricattura da parte del moto-neurone, ma soprattutto perché le pie-

ghe della membrana muscolare sonoricche di acetilcolinesterasi, l'enzimache inattiva l'acetilcolina. Ciò favori-sce la chiusura del canale e si ritornaalla situazione precedente allo stimolo.

Il funzionamento della sinapsi neuro-muscolare dipende dunque dalla fulmi-nea e coordinata azione di svariate pro-teine che fanno parte delle membraneplasmatiche del nervo e del muscolo edell'apparato di esocitosi. Ciascuna diesse è il potenziale bersaglio di una tos-sina che, alterando la funzionalità si-naptica, finisce per compromettere lasopravvivenza dell'intero organismo.

Ma una sinapsi può venire alterata siaper sovrastimolazione sia per inibizio-ne. E proprio eccitazione e inibizionesono le due modalità opposte seleziona-te da organismi diversi per l'attività del-le loro tossine. Molti animali produconoveleni che contengono più tossine chehanno come bersaglio diverse proteinedell'ospite: evidentemente vogliono es-sere ben sicuri del risultato! Di questacomplessità si era reso ben conto, già

nel 1782, l'abate Felice Fontana, che sichiedeva se e come fosse possibile sepa-rare i componenti dei veleni animali. Atutt'oggi non si può certo dire di cono-scere tutti i componenti dei veleni pro-dotti in natura. Tuttavia, grazie alle nuo-ve tecniche microanalitiche e di biologiamolecolare, nuove tossine vengono sco-perte continuamente e ne vengono defi-niti gli effetti sugli organismi, sui tessutie sulle cellule in coltura.

TOSSINE DIRETTECONTRO I CANALI PER IL SODIO

Nel veleno di molte specie di inver-tebrati terrestri (scorpioni e ragni) emarini (gasteropodi del genere Conus,e attinie o anemoni di mare) sono pre-senti peptidi, di lunghezza variabile da17 a 70 amminoacidi, che si leganospecificamente ai canali del sodio. Ne-gli ultimi anni si sono ottenute molteinformazioni sulla struttura di questo ti-po di canale, grazie soprattutto al la-voro del gruppo di William Catterall a

CANALEPER IL POTASSIO

CANALEPER IL SODIO

a a

CANALE aa a

PER IL CALCIO aa a a Q»

RECETTOREDELL'ACETILCOLINA

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n

Seattle e dello scomparso Sasako Nu-ma a Kyoto. La proteina isolata da cer-vello di ratto è un eterotrimero di circa329 chilodalton (kDa), composto dallesubunità: a (260 kDa), p, (36 kDa) e P,(33 kDa). La prima contiene il canaleper il sodio voltaggio-dipendente, men-tre le altre due hanno ruolo regolatorio.Sembra che gli analoghi canali di altritessuti consistano della sola subunità a(cuore) o a più f3 (muscolo scheletri-co). Questa variabilità di composizione,assieme al fatto che esistono diversi ge-ni per la subunità a, genera una grandevarietà di canali per il sodio, caratteriz-zati da proprietà elettrofisiologiche efarmacologiche diverse. L'esistenza dimolte isoforme è una caratteristica ditutte le proteine canale ed è probabil-mente legata alla necessità di modulareun'attività chiave per il motoneurone.La subunità a è composta di quattrodomini distinti, ma strutturalmente o-mologhi fra di loro, ed è molto similein specie diverse. Questo spiegherebbeperché su di essa si trovi il sito di lega-me di molte tossine specifiche per il ca-nale del sodio, il che allarga la varietàdi prede sensibili a un certo veleno.

Il genere Conus - ben noto ai colle-zionisti di conchiglie - comprende circa500 specie di gasteropodi marini chepredano vermi, molluschi e pesci cattu-randoli mediante un arpione, fissato al-l'estremità di una proboscide estroflet-tibile, che inietta loro un veleno para-lizzante che agisce entro 1-2 secondi. Iveleni prodotti dalle varie specie di Co-nus sono complesse miscele di cono-tossine, peptidi composti da 10-30 resi-dui amminoacidici ricchi di cisteine.L'enorme varietà di tali residui fa sìche queste tossine leghino specifica-mente canali di vario tipo. Le p-co-notossine riconoscono selettivamenteil canale per il sodio e ne bloccanol'apertura, causando una paralisi flacci-da dovuta alla mancata generazione delpotenziale d'azione del neurone. Il sitodi legame delle p.-conotossine, ricchedi arginina, è lo stesso di piccole neuro-tossine guanidiniche, come la tetrodo-tossina contenuta nel pesce fugu, famo-sa e rischiosa prelibatezza della cucinagiapponese (per la struttura delle tossi-ne qui menzionate si veda l'articolo Lastruttura delle tossine degli animali ve-lenosi di André Menez in «Le Scienze»n. 305, gennaio 1994). A un altro sitodel canale, localizzato fra le subunità ae p si legano le a-neurotossine pro-dotte da molte specie di scorpioni chevivono in Europa o Nord Africa (peresempio, Buthus europaeus) e neuro-tossine prodotte da attinie o anemoni dimare come Anemonia sulcata e Antho-pleura xanthogrammica. È stato pro-prio mediante l'uso di neurotossine di

Rappresentazione schematicadei canali ionici delle cellulenervose. La fila in alto mostracome la catena polipeptidicaalfa del canale per il sodio siaorganizzata in quattro dominiche attraversano la membranasei volte: il dischetto viola conla stella indica un sito di lega-me per le neurotossine localiz-zato nella porzione che con-giunge i segmenti transmem-brana S5 e S6; N e C indica-no rispettivamente il terminaleamminico e carbossilico dellacatena. Al centro, sezione dellastruttura tridimensionale delcanale, con i siti di legame del-le tossine (in viola), il canaleattraverso cui passano gli ionisodio (in rosa), le subunità be-ta e le catene di zuccheri chesporgono dalla membrana. Adestra, vista del canale dall'e-sterno della cellula, con i diver-si siti di legame per le tossine.Analogamente, la fila interme-dia mostra le quattro subunitàche compongono il canale peril potassio; al centro un model-lo di questo canale (qui aperto)in cui il segmento amminicoterminale (sferetta nera) puòfare da tappo, convertendolonella conformazione chiusa. Adestra, vista del canale potassiodall'esterno della cellula, con isiti di legame per le tossine. Lafila in basso mostra la topolo-gia transmembrana del cana-le calcio e le tre configurazio-ni che un canale può assumere:chiuso, aperto e inattivo.

scorpione africano che, nel laboratoriodi Catterall, è stata identificata per laprima volta la presenza della subuni-tà F3. Al contrario delle pi-conotossine,queste tossine non agiscono sull'attiva-zione del canale, ma ne ritardano, o ad-dirittura ne aboliscono, l'inattivazioneprovocata dalla depolarizzazione dellamembrana. La permanenza del canalenello stato aperto prolunga la durata delpotenziale d'azione di nervi e muscolicausando una paralisi eccitatoria in cui imuscoli scheletrici sono tesi e l'animaleè rigido. Lo stesso effetto è provocatodalle p-neurotossine prodotte da scor-pioni americani (come Tityus serrala-tus) o dalle p.-conotossine, che si leganoperò a un altro sito, anch'esso localizza-to fra le subunità a e p,. Ne consegueun'apertura del canale del sodio anche avalori di depolarizzazione che non han-no effetto sul canale non intossicato.

La maggior parte delle specie anima-li che producono neurotossine speci-fiche per il canale del sodio ha sceltola strategia eccitatoria, in alcuni casiproducendo sia a sia 13-neurotossine(per esempio Centruroides sculpturatuso Leiurus quinquestriatus). È possibileche la rigidità provocata da queste tos-sine renda più agevole l'ingestione del-la preda, ma è più verosimile che es-se svolgano funzione sia predatoria neiconfronti di piccoli invertebrati, di cuicausano la morte, sia difensiva nei con-fronti di animali predatori più grandi epiù mobili, che non vengono uccisi, maimparano a loro spese a stare alla largada un animale così temibile. La parali-si flaccida causata dalle pi-conotossinepuò essere compresa considerando cheesse sono prodotte da animali che cat-turano prede spesso molto più grandidi loro. Una volta agganciate e avvele-

nate, queste non possono più divinco-larsi e vengono inglobate dallo stomacoestroflettibile di Conus.

TOSSINE DIRETTE CONTROI CANALI PER IL POTASSIO

L'uso di tossine specifiche si è rive-lato di estrema utilità anche nella defi-nizione della struttura dei canali spe-cifici per lo ione potassio. La carat-terizzazione molecolare di questi ca-nali è iniziata con l'identificazione diun mutante di Drosophila melanoga-ster che prende il nome di shaker per isuoi movimenti convulsivi, presumibil-mente dovuti ad alterazioni della per-meabilità della membrana al potas-sio. La mutazione è stata poi collegataa una proteina, la cui sequenza mo-strava similarità con i domini trans-membrana dei canali per il sodio. In ef-fetti, il canale per il potassio ha un'or-ganizzazione simile, con la differen-za che i quattro domini sono costitui-ti da subunità indipendenti, piuttostoche da una singola catena. Utilizzan-

do la dendrotossina, componentedel micidiale veleno del serpentemamba verde africano, si è poiscoperto che anche il canale peril potassio comprende un'altrasubunità (di circa 39 chilodalton)con presumibili funzioni regola-torie. Questa tossina possiede unraggruppamento di cariche posi-tive responsabile del legame delsegmento a carica negativa checonnette le eliche transmembra-na 55 ed S6 e che deve necessa-riamente trovarsi all'esterno del-la cellula. In un sito parzialmentesovrapponibile a questo, si legala caribdotossina dello scorpio-ne Leiurus quinquestriatus che,similmente alla dendrotossina,causa convulsioni conseguential facilitato rilascio di neurotra-smettitore da parte di neuroniche hanno un potenziale di mem-brana abbassato. Questo esempiodimostra ancora una volta comeuno stesso animale possa produr-re varie tossine dirette contro di-versi bersagli nervosi.

Nella stessa zona in cui si le-gano dendrotossina e caribdotos-sina agiscono altre tossine pro-dotte da animali come anemonidi mare (kalicludine e kaliseptinedi Anemone sulcata), api (apami-na e peptide MCD), ragni, scor-pioni, conidi come il già citatoConus purpurascens. Un aspettointeressante, il cui significato e-volutivo non è stato ancora chia-rito, è che le dendrotossine e lekalicludine hanno sequenze di 59

amminoacidi, simili a quelle dell'inibi-tore della proteasi tripsina, prodotto dalpancreas, e che le kalicludine inibisco-no la tripsina. Si tratta di un ulterioreesempio di una modalità evolutiva mol-to frequente (si veda l'articolo La mo-dularità delle proteine nell'evoluzionedi Russell F. Doolittle in «Le Scienze»n. 304, dicembre 1993) per cui un genecodificante per un dominio proteico, ca-ratterizzato da una struttura di provatastabilità e con una specifica funzione,muta dando origine a una proteina dota-ta di una funzione tutta nuova, seppurbasata sulla stessa struttura di base.Questo è accaduto all'inibitore della tri-psina convertito, in animali diversi co-me attinie e serpenti, da inibitore di pro-teasi a inibitore specifico dei canali peril potassio.

TOSSINE DIRETTE CONTROI CANALI PER IL CALCIO

In due diversi phyla, conidi e aracni-di, si sono evolute tossine capaci dibloccare i canali specifici per il calcio

presenti in prede appartenenti ad alme-no sei phyla diversi. Queste tossine so-no particolarmente interessanti in quan-to si adattano alla varietà di canali peril calcio presenti nelle diverse specie ealle differenti isofornie della stessa spe-cie. Le attuali conoscenze sulla strut-tura dei canali per il calcio indicanoun'organizzazione simile a quella deicanali per il sodio con una catena poli-peptidica che attraversa la membrana24 volte. I quattro domini vicini defini-scono un poro acquoso centrale con unrestringimento contenente residui car-bossilici negativi che «filtrano» specifi-camente lo ione calcio privandolo dellemolecole d'acqua di solvatazione. An-che qui, isoforme diverse e l'eventualepresenza di subunità accessorie genera-no molte varianti con differenti pro-prietà elettrofisiologiche. Molte tossinesono specifiche per questi canali e nebloccano la funzione di trasporto delcalcio. Siccome è il calcio a innescarela neuroesocitosi, la conseguenza ma-croscopica del legame di queste tossineè una paralisi flaccida che immobiliz-za la preda. Se alcune tossine sono atti-ve nei confronti di più isoforme di ca-nali calcio, altre sono molto selettive,tanto che costituiscono lo strumentofarmacologico fondamentale per l'iden-tificazione del tipo di canale che vieneosservato.

Specie piscivore di Conus produco-no w-conotossine composte di 24-30amminoacidi contenenti tre ponti di-solfuro. L'iniziale caratterizzazione diqueste tossine, particolarmente labo-riosa, è stata compiuta da BaldomeroOlivera dell'Università dello Utah e daLourdes Cruz dell'Università delle Fi-lippine a Manila. Dopo aver raccoltoun gran numero di gasteropodi e aver-ne isolato i dotti veleniferi, essi han-no separato i componenti del velenomediante tecniche cromatografiche. Lasequenza amminoacidica è stata poideterminata o mediante sequenziazio-ne della proteina o del gene corrispon-dente o mediante spettrometria di mas-sa. Sulla base dei dati così ottenuti,molte conotossine vengono oggi pre-parate per sintesi chimica.

La grande varietà di conotossine pre-senti nel veleno delle varie specie diConus non è il risultato di piccole mo-difiche di una unità base, bensì di unastrategia genica che ha permesso di e-volvere rapidamente nuovi ligandi pep-tidici con varia specificità di bersa-glio. Si sono formati così peptidi diver-si sia per numero e sequenza di am-minoacidi sia per numero e posizio-ne di residui di cisteina. Le conotossi-ne w-GVIA (prodotta da Conus geo-graphus) e w-MVIIA (prodotta da Co-nus magus) sono specifiche per i canali

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Fotografia al microscopio elettronico di una sezione longitu-dinale di giunzione motoria di rana trattata con latrotossina.Il terminale e i mitocondri in essa contenuti appaiono rigonfi

e sono presenti numerose invaginazioni di membrana. Da no-tare la completa scomparsa delle vescicole sinaptiche (per

gentile concessione di Numa lezzi).

del calcio (tipo N) presenti alla giun-zione neuromuscolare. In particolare latossina prodotta da Conus magus inte-ragisce con un canale bersaglio dei re-cettori per gli oppiacei e ha una forteazione analgesica che verrà sfruttata inun farmaco allo studio per controllare ildolore in pazienti affetti da tumori allostadio terminale.

Certe specie di ragni americani pro-ducono una varietà di tossine speci-fiche per i canali del calcio della giun-zione presinaptica di insetti, che costi-tuiscono la loro dieta. Tuttavia, altrespecie, come Agelenopsis aperta, pro-ducono tossine attive anche su canaliper il calcio di vertebrati. Questa tossi-cità verso vertebrati e invertebrati, otte-nuta mediante sottili variazioni di untema strutturale unico, evidenzia unaspetto importante nella strategia di so-pravvivenza di ragni e scorpioni: il pro-duttore di veleno è allo stesso tempopredatore di insetti e altri invertebrati, epreda di vertebrati come anfibi, uccellie mammiferi. La stessa tossina, o suevarianti, è usata per uccidere piccoleprede e per rendere temporaneamenteinoffensivi gli animali più grandi. Trale tossine presenti nel veleno di Age-lenopsis aperta, la co-agatossina IVA,specifica per una famiglia di canali (ti-po P e Q) presenti nel sistema nervososia centrale sia periferico di mammife-ri, è di enorme utilità nello studio deicanali per il calcio. L'agatossina IVA, ela correlata IVB, sono formate da unasingola catena polipeptidica di 48 am-minoacidi stabilizzata da quattro pontidisolfuro. La IVB è stata la prima pro-teina per cui è stato messo in luce un

particolare tipo di modifica della strut-tura chimica che avviene dopo la suasintesi. La serina in posizione 46 vieneinvertita dalla conformazione levogiradegli amminoacidi presenti nelle pro-teine animali e vegetali, alla conforma-zione destrogira, limitata ad antibioti-ci prodotti da funghi e a pochi altri ca-si. Questa nuova strategia evolutiva inquesto caso è servita a perfezionare illegame specifico con il canale per ilcalcio, ma in altri casi potrebbe averdato origine ad attività biologiche deltutto nuove.

Anche alcune specie di serpentimamba, come Dendroaspis angusti-ceps, producono tossine specifiche per icanali del calcio, ma non dei tipi pre-senti alla giunzione neuromuscolare.Calcicludina è una di queste tossine eha la caratteristica di essere molto simi-le ad alcuni inibitori di proteasi. Essarappresenta un altro esempio di model-lo strutturale riadattatosi per svolgereattività diverse: da ligando inibitore diuna proteasi a ligando inibitore di cana-li per il calcio.

Un esempio ancor più clamoroso diquesta operazione di rimodellamento èfornito dalle neurotossine dotate di atti-vità enzimatica fosfolipasica di tipoA2, simile a quella svolta dal succopancreatico di tutti i vertebrati, compre-si i serpenti. Le fosfolipasi hanno unruolo digestivo essenziale perché cata-lizzano l'idrolisi dei fosfolipidi dellemembrane biologiche, ma sono anchepresenti nel veleno di quasi tutti i ser-penti alla cui attività emolitica contri-buiscono. Molte specie di serpenti dif-fuse in tutto il mondo, compresa la vi-

pera che vive sulle nostre Alpi (Viperaammodytes ammodytes), contengononel loro veleno tossine presinaptichederivate dalla fosfolipasi A2 per so-stituzione di alcuni residui ammino-acidici. Non conosciamo ancora il lo-ro meccanismo d'azione, ma sappiamoche, dopo una fase iniziale di stimola-zione del rilascio di neurotrasmettitore,queste neurotossine fosfolipasiche cau-sano un blocco completo e irreversibiledel rilascio di acetilcolina, con conse-guente paralisi flaccida. Sappiamo an-che che l'attività fosfolipasica non ènecessaria per la fase di stimolo, men-tre lo è nella fase di inibizione dell'at-tività sinaptica.

LE LATROTOSSINE

Il ragno Latrodectus multicinctus, dif-fuso nell'Europa mediterranea e meglioconosciuto col nome di vedova nera,produce una latrotossina attiva sulle si-napsi di vertebrati e due tossine spe-cifiche per invertebrati (latroinsetto-tossine). Il loro meccanismo d'azione èstato oggetto d'indagine di numerosigruppi, tra cui si sono distinti i gruppiitaliani dello scomparso Bruno Cecca-relli e di Jacopo Meldolesi del CentroCNR di farmacologia cellulare e mole-colare di Milano e di Alfonso Grassodell'Istituto di biologia cellulare delCNR di Roma. Questi studi hanno per-messo di dimostrare che la latrotossinaagisce selettivamente sui terminali ner-vosi inducendo un enorme aumento nelrilascio di neurotrasmettitore, indipen-dentemente dalla presenza di ioni cal-cio nel mezzo extracellulare. La speci-

ficità presinaptica delle latrotossine èdovuta alla presenza di specifici recet-tori, recentemente identificati che, nelcaso della giunzione neuromuscolare,sono confinati alle zone attive dellamembrana presinaptica.

La massiccia stimolazione del rila-scio di acetilcolina indotta da questetossine, e da tossine prodotte dai pescipietra, è rilevabile dall'aumento dellafrequenza dei potenziali postsinaptici inminiatura, che rimane elevata per deci-ne di minuti, per poi ridursi a zero acausa della deplezione delle vescicolesinaptiche dal terminale nervoso, indicedel fatto che queste tossine stimolano lafusione delle vescicole. L'uso della la-trotossina in combinazione con tecni-che morfologiche ed elettrofisiologicheha permesso tra l'altro di fornire unaprova della teoria vescicolare del rila-scio di neurotrasmettitore. Infatti, laperfetta corrispondenza tra potenzialipostsinaptici in miniatura e deplezionedelle vescicole sinaptiche ha dimostratoche ogni potenziale in miniatura è pro-dotto dal rilascio di un singolo quantodi neurotrasmettitore originariamenteimmagazzinato nel lume di una ve-scicola sinaptica.

Le tre latrotossine consistono di unacatena amminoacidica di circa 1400amminoacidi con poche varianti fra diloro. Ciò indica che esse derivano daun gene ancestrale comune duplicato-si e differenziatosi a formare tre tos-sine dotate della stessa attività biolo-gica, ma diretta verso specie animalidi phyla diversi. L'ipotesi più attendi-bile di questa evoluzione è quella ac-cennata in precedenza: le latroinsetto-tossine hanno scopi offensivi, mentrela latrotossina ha scopi difensivi. È danotare che in questo caso l'effetto ec-citatorio sulle prede non è controindi-cato come nel genere Conus, perché leprede della vedova nera sono di di-mensioni inferiori. Esso è invece mol-to funzionale nel trasmettere al possi-bile predatore il messaggio di «starealla larga» perché uno stimolo che ec-cita si ricorda più facilmente di unoche indebolisce.

NEUROTOSSINE PRESINAPTICHEPRODOTTE DA BATTERI

Le tossine che abbiamo visto finoraalterano in modo inibitorio o eccitato-rio il segnale presinaptico, agendo surecettori presenti sulla membrana pla-smatica del nervo. Esse agiscono dal-l'esterno della cellula nervosa e altera-no il funzionamento della molecolastessa cui si legano o di una molecola,collegata al recettore, che trasmettel'effetto all'interno della cellula. Que-sto ha anche notevoli implicazioni tera-

La microfotografia qui sopra mostraneuroni di ippocampo esposti in col-tura a tossina tetanica coniugata confluoresceina. La tossina penetra selet-tivamente nelle sinapsi (in verde) pre-senti in gran numero sul corpo cel-lulare e nei dendriti, evidenziati me-diante un anticorpo diretto contro laproteina citoscheletrica MAP2 (in ros-so). Il colore giallo è determinato dal-la sovrapposizione del segnale ver-de sullo sfondo rosso. Qui a fianco èmostrata una colonia di clostridi dal-la caratteristica forma allungata conspora subterminale.

peutiche: per esempio antisieri anti-tos-sina sono efficaci per molto tempo do-po l'entrata in circolo della tossina stes-sa e la manifestazione dei sintomi del-l'intossicazione. Infatti la tossina rima-ne all'esterno della cellula nervosa ed èquindi raggiungibile e neutralizzabiledagli anticorpi anti-tossina.

Questo non è il caso di un gruppo dineurotossine batteriche che nel corsodell'evoluzione «hanno imparato» a pe-netrare all'interno dei neuroni. Esse so-no prodotte da alcune specie di batteridel genere Clostridium. Questi batterihanno una lunga storia evolutiva, es-sendo comparsi sulla Terra prima chel'atmosfera si arricchisse di ossigeno.Per essi l'ossigeno è tossico e, con lacomparsa degli organismi fotosintetici,questi batteri si ritirarono in nicchieecologiche povere di ossigeno, comestrati profondi del terreno o fondali distagni ricchi di materiale in decomposi-zione. In presenza di ossigeno e/o incarenza di nutrienti, i clostridi genera-no spore che possono sopravvivere per

millenni in attesa di trovare un ambien-te adatto alla loro germinazione.

Con la comparsa degli animali, iclostridi hanno potuto esplorare zonediverse alla ricerca di ambienti adattialla loro crescita, ma li hanno trovatisolo in poche e circoscritte zone delcorpo dei vertebrati (per esempio, inbrevi tratti dell'intestino cieco dei ma-iali e di uccelli). Ma, morendo, un ani-male si converte in un grande fer-mentatore anaerobico ricco di nutrien-ti, un ambiente molto favorevole al-la proliferazione dei clostridi. Si trattatuttavia di un processo passivo, comepure passiva è la trasmissione dei clo-stridi ad altri organismi mediante di-spersione delle spore nell'ambiente.

Alcune specie di clostridi hanno per-fezionato una strategia attiva, non dissi-mile da quella degli animali predatoriveleniferi, anche se la differenza di di-mensioni fra preda e predatore è inquesto caso enorme. E, se lo scopo èquello di disporre di grandi quantità ditessuti animali anaerobi, la scelta mi-

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NEUROTRASMETTITORE

POMPA PROTONICA

CITOSOL

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SPAZIO INTERSINAPTICO CANALEPERPER IL CALCIO

RILASCIODEL NEUROTRASMETTITORE

DINAMINA

INGRESSODELLA TOSSINA

NEUROTRASMETTITORE

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CLATRINA

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DINAMINA

5

MICHELA MATTEOLI è ricercatrice presso il Centro perlo studio della farmacologia cellulare e molecolare presso ilDipartimento di farmacologia dell'Università di Milano. Dadiversi anni studia la formazione del contatto sinaptico traneuroni con particolare interesse per l'analisi dei meccanismimolecolari che regolano il rilascio di neurotrasmettitori.

CESARE MONTECUCCO è ordinario di patologia gene-rale presso l'Università di Padova e dirige il Centro del CNRper lo studio delle biomembrane di Padova. Si dedica allostudio del meccanismo d'azione molecolare e cellulare di tos-sine proteiche che causano patologie umane, e dell'uso dineurotossine nella terapia di malattie neuromuscolari.

Gli autori desiderano dedicare questo contributo al profes-sor Giovanni Felice Azzone in occasione del suo settantesi-mo compleanno. Le ricerche effettuate dagli autori sono state

finanziate dall'iniziativa Telethon Italia (grant n. 672 e 763).

MATTEOLI M., TAKEI K., PERIN MS., SUDHOF T.C. e DE CAMIL-LI P., Exo-Endocytotic Recycling of Synaptic Vesicles in De-veloping Processes of Cultured Hippocampal Neurons in«Journal of Celi Biology», 117, pp. 849-861, 1992.

MONTECUCCO C. e SCHIAVO G., Structure and Function ofTetanus and Botulinum Neurotoxins in «Quarterly Review ofBiophysics», 28, pp. 432-472, 1995.

MATTEOLI M., VERDERIO C., ROSSETTO O., IEZZI N., COCO S.,SCHIAVO G. e MONTECUCCO C., Synaptic Vesicle EndocytosisMediates the Entry of Tetanus Neurotoxin into HippocampalNeurons in «Proceedings of the National Academy of Scien-ces» , 93, pp. 13310-13315, 1996.

RAPPUOLI R. e MONTECUCCO C., Guidebook to the Use ofProtein Toxins in Celi Biology, Oxford University Press, 1997.

gliore è quella diprocurarsi grandivertebrati ucciden-doli con una pic-colissima quanti-tà di veleno cheblocchi le sinapsi.Tuttavia, il mec-canismo d'azionedelle sette neuro-tossine botuliniche(cosiddette perchécausano il botuli-smo) e della sin-gola neurotossinatetanica (che causail tetano) è unico,e le rende i piùpotenti veleni noti:ne bastano pochedecine di miliar-desimi di gram-mo per uccidereun uomo!

Le neurotossi-ne clostridiali so-no costituite da tredomini specializ-zati nello svolge-re funzioni diver-se (per una descri-zione più comple-ta della loro atti-vità e delle malat-tie che esse cau-sano si veda l'arti-colo Le basi mole-colari del tetano e del botulismo in «LeScienze» n. 304, dicembre 1993). Es-se si legano specificamente e con al-ta affinità al terminale dell'assone dimotoneuroni periferici, attraverso re-cettori la cui natura non è stata anco-ra identificata. Al contrario delle altreneurotossine presinaptiche sin qui de-scritte, il legame non sembra causarealcun danno al motoneurone, ma è se-guito dalla internalizzazione del com-plesso neurotossina-recettore nel lumedelle vescicole.

L'ingresso di queste neurotossinebatteriche nel neurone ha importanti ri-svolti cimici, in quanto la neurotossinanon può più essere neutralizzata da an-ticorpi specifici. Quindi una sierotera-pia con anticorpi anti-neurotossina te-tanica o anti-neurotossine botulinichepuò essere efficace nel prevenire l'in-tossicazione neuronale solo se gli anti-corpi sono già presenti al momento del-l'entrata della neurotossina nell'organi-smo. Questa condizione si verifica conla vaccinazione antitetanica che indu-ce la produzione di anticorpi specificipronti a entrare in azione ogniqualvoltala tossina entri in circolo.

L'efficacia dell'iniezione di antisierianti-neurotossine nel paziente che ma-

nifesta già i sintomi del tetano o del bo-tulismo è ancora tutta da provare e, sul-la base delle conoscenze attuali, assaiimprobabile. La spiegazione di questainefficacia terapeutica della sierotera-pia antitetano o antibotulismo risiedeproprio nel fatto che gli anticorpi nonsono in grado di seguire la neurotossinanel suo viaggio all'interno del neurone.Al contrario, come già accennato, lasieroterapia nei confronti delle neuro-tossine che agiscono sulla superficiedel neurone, come quelle del veleno deiserpenti, è efficace anche dopo alcunigiorni dalla manifestazione dei sintomidell'intossicazione.

A differenza delle neurotossine botu-liniche, la neurotossina tetanica nonagisce a livello del sistema nervoso pe-riferico, ma è specifica per gli inter-neuroni inibitori del midollo spinale. Èl'unica neurotossina di alto peso mole-colare che riesca a raggiungere il siste-ma nervoso centrale e lo fa, non perdiffusione, ma in un modo del tut-to particolare. Dopo il legame con lagiunzione neuromuscolare, la neurotos-sina tetanica viene indirizzata dal suorecettore entro vescicole che risalgonol'assone del motoneurone fino a scari-care la tossina nello spazio intersinapti-

co fra i dendriti dei motoneuroni e gliinterneuroni spinali inibitori. Questomovimento retroassonico della tossinadalla periferia al midollo spinale erastato già suggerito da esperimenti de-scritti nel 1892 da Alberto Bruschettinidell'Istituto di patologia generale del-l'Università di Bologna. Tale ipotesivenne da molti considerata inaccettabi-le fino a quando Martin Schwab e HansThoenen, che allora lavoravano all'U-niversità di Basilea, non osservarono almicroscopio elettronico il movimentoretroassonico e la migrazione transsi-naptica della neurotossina tetanica.

Recentemente siamo riusciti a capirecome la neurotossina tetanica entri neineuroni del sistema nervoso centrale:essa usa le vescicole sinaptiche comecavalli di Troia. Nel brevissimo spaziodi tempo durante il quale la vescicolasinaptica scarica all'esterno il neurotra-smettitore, il suo lume rimane in comu-nicazione con l'esterno e la neurotossi-na tetanica ne approfitta per portarsiall'interno della vescicola. La vescicolasi chiude e ricicla portandosi dentro latossina. È noto che la forza che governal'accumulo di neurotrasmettitore nellavescicola è il gradiente creato dallapompa protonica. L'acidificazione del

Schema del ciclo di esocitosi ed endocito-si delle vescicole sinaptiche e del modod'ingresso della neurotossina tetanicanei neuroni del sistema nervoso centrale.Il neurotrasmettitore si accumula nellevescicole sinaptiche (/) per l'azione con-giunta di un trasportatore e di una pom-pa protonica. Alcune vescicole si leganoa zone attive, contenenti canali per il cal-cio, mediante riconoscimento specificofra proteine della vescicola e della mem-brana (2). Segue l'assemblaggio di uncomplesso di neuroesocitosi (3) che ri-chiede idrolisi di ATP. Il meccanismo difusione delle vescicole è così pronto ascattare non appena il calcio penetri neicanali (4), che si aprono per depolarizza-zione della membrana presinaptica. Lafusione fa rilasciare il neurotrasmettito-re e pone il lume della vescicola a contat-to con l'esterno. Il recettore per la tossi-na tetanica viene così esposto e la tossinasi lega attraverso il suo dominio carbos-siterminale (in azzurro). Il collo di fusio-ne della vescicola si chiude per azionedella dinamina, come ha dimostrato Pie-tro De Camilli a Vale (5), e la vescicolaviene internalizzata nel passaggio suc-cessivo mediato da clatrina. La vescicolacontenente la tossina perde il rivestimen-to di clatrina e dinamina (6) e riprende ilciclo di acidificazione e riempimento dineurotrasmettitore. L'acidità cambia laconformazione della tossina che si inseri-sce nella membrana e trasloca nel citosolil suo dominio catalitico (in rosso).

lume della vescicola è la causa dellatraslocazione del dominio ammino-terminale della neurotossina tetanicanel citoplasma dell'interneurone spina-le, come dimostrato da Lura William-son ed Elaine Neale del National Insti-tute of Health di Bethesda in neuronispinali, e da noi in neuroni di ippocam-po e in cellule granulari del cervelletto.Quindi, per entrare nei neuroni del si-stema nervoso centrale, la neurotossina

tetanica parassitizza due funzioni fisio-logiche fondamentali della sinapsi: ilriciclo delle vescicole sinaptiche e l'ac-cumulo di neurotrasmettitore.

Non sappiamo ancora se il riciclo divescicole sinaptiche alla giunzione neu-romuscolare medi anche l'entrata delleneurotossine clostridiali a livello peri-ferico, ma il fatto che il tempo d'intos-sicazione dell'animale sotto eserciziofisico sia minore di quello dell'anima-le a riposo sembra dimostrarlo. InoltreShunji Kozaki e collaboratori dell'Uni-versità di Osaka hanno osservato che laporzione luminale della sinaptotagmi-na, una proteina transmembrana dellevescicole sinaptiche, lega la neurotossi-na botulinica di tipo B.

Patrice Boquet, allora all'Istituto Pa-steur di Parigi, Gianpietro Schiavo euno di noi (Montecucco), allora all'Isti-tuto di patologia generale dell'Univer-sità di Padova, avevano da tempo os-servato che le neurotossine clostridialicambiano conformazione all'abbassarsidel pH, diventando così capaci di pene-trare nel doppio strato lipidico dellemembrane cellulari. Ciò è seguito dallatraslocazione del dominio amminoter-minale nel citosol.

Una volta nel citoplasma, le neuro-tossine botuliniche e tetanica manife-stano la loro attività catalitica che con-siste nel tagliare specificamente in unsingolo punto VAMP, una piccola pro-teina legata alla membrana delle vesci-cole sinaptiche, oppure SNAP-25 o sin-taxina, due proteine legate alla facciacitosolica della membrana plasmatica.Il fatto che le neurotossine clostridialitaglino specificamente queste tre pro-teine, causando un blocco prolunga-to del rilascio di neurotrasmettitori, i-dentifica VAMP, SNAP-25 e sintaxinacome tre componenti essenziali del-l'apparato di neuroesocitosi. L'attivitàdi proteasi intracellulari ad alta speci-ficità di queste neurotossine, unita alla

loro selettività, spiega la loro terribilepotenza: basta che una singola mole-cola di tossina entri in una sinapsi per-ché tutte le molecole bersaglio presen-ti vengano, l'una dopo l'altra, tagliate.In tale condizione limite, passerà moltotempo prima che la funzionalità sinap-tica sia bloccata e che l'animale muoia.Tuttavia, il tempo non pare essere unproblema per i clostridi: essi stessi o leloro spore sono presenti nell'animale ein gran quantità, e da gran tempo,. nel-l'ambiente.

Le neurotossine più sofisticate - ca-paci non solo di legare un recettore, co-me fanno quelle animali, ma anche diattraversare una membrana biologicaper entrare nella cellula - sono quindiprodotte da organismi molto primitivi.Questo paradosso è peraltro meno sor-prendente se si considera che una tossi-na è il risultato di un processo evoluti-vo basato sulla generazione di tossinevarianti e sulla selezione della loro effi-cacia. I batteri, che si duplicano in po-che decine di minuti, hanno una capa-cità di generare varianti enormementepiù grande di quella di animali che han-no tempi di generazione di mesi o anni.Inoltre, i geni che codificano per leneurotossine clostridiali sono situati suelementi genetici mobili, come fagi,plasmidi o trasposoni coniugativi, chepermettono ai clostridi di scambiarselifacilmente, incrementando così le pos-sibili variazioni.

Nel passato molti eserciti hanno ac-cumulato scorte di neurotossine botuli-niche come possibili armi biologiche,ma si sono poi resi conto della diffi-coltà di iniettare i nemici a uno a uno!Al contrario, le neurotossine botulini-che sono state riscoperte da neurologi eoculisti, che le utilizzano come il mi-gliore agente terapeutico attualmentedisponibile per il trattamento di disto-nie muscolari e di molte altre sindromicolinergiche.

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