le système de sécrétion de type ii chez v. cholerae melissa petiti m2 mbvb sécrétion des...

Le système de sécrétion de type II

chez V. cholerae

Melissa PETITIM2 MBVB

Sécrétion des facteurs de virulence et relation bactéries-

hôtes

Vibrio cholerae

Bactérie gram – 1 flagelle polaire Sécrétion de la

toxine cholérique

Introduction

Figure 1 : V. cholerae observées au microscope électronique

Le système de sécrétion de type 2

Prise en charge des protéines après translocation dans le périplasme via Sec/Tat

Complexe inséré dans les deux membranes

Analogie avec le Pilus de type IV

Introduction

Figure 2 : Modèle de sécrétion des protéines via le SST2Chez P. aeruginosa (Voulhoux et al. 2001)

Modèle du SST2 chez V. cholerae

Complexe protéique codé par les gènes eps

EpsD : sécrétine EpsE : ATPase de trafic EpsG : pseudopilus ( + Eps HIJK ) EpsM, L, C et F :

plateforme de membrane interne

Introduction

Figure 3 : Modèle du SST2 chez V. cholerae

2001 : le complexe SST2 est localisé au pôle cellulaire

Figure 4 : Localisation des protéines de fusion pGFP-EpsL et pGFP-EpsM (Scott et al. 2001)

Figure 5 : Microscopie à fluorescence en temps réel pour la protéine de fusion pGFP-EpsM (Scott et al. 2001)

Partie 1

EpsM est-elle localisée au pôle de la cellule ?

Observer la localisation cellulaire des protéines codées par les gènes eps

Fusion des protéines d’intérêt à la GFPExpression à partir d’un plasmide avec et sans induction dans une souche mutante

1 : Localisation cellulaire de la protéine pGFP-EpsM

La distribution native d’EpsM n’est pas aux pôles cellulaires

Induction à l’IPTG : Foyers de fluorescence aux pôles de la cellules

Sans induction :Fluorescence visible à la périphérie de la cellule

1 : Localisation cellulaire De la protéine pGFP-EpsM

Figure 6 : Localisation cellulaire de la protéine chimère pGFP-EpsM dans une souche mutante epsM

Localisation des protéines chimères exprimées à partir du chromosome

Observer la localisation cellulaire des protéines GFP-Eps produites à partir du chromosome

copies chromosomiques des gènes eps remplacées par les copies fusionnées à la GFP

(souches gfp-epsC et gfp-epsM)vérifier la production des protéinesvérifier la fonctionnalité du système avec ces

fusions

Partie 2

Les protéines de fusion GFP-EpsM

et GFP-EpsC sont produites

Figure 7 : Western blot indiquant la production des protéines chimères

2 : Localisation des protéines chimères

exprimées à partir du chromosome

1 : souche WT2: gfp-epsM

1 : souche WT2: gfp-epsC






GFP-EpsCGFP-EpsM








GFP-EpsM

EpsC

GFP-EpsC

EpsM



Les fusions gfp-epsC et gfp-epsM sont fonctionnelles

Mesure de l’activité des protéases sécrétées par V. cholerae via le SST2.

Les protéines de fusion sont des composants fonctionnels du SST2



Tableau 1 : Mesure de l’activité protéase des souches WT et possédant les fusions

Les protéines chimères sont localisées à la périphérie cellulaire

GFP-EpsM : 3,2 foyers / cellule

GFP-EpsC : 5,3 foyers / cellule



Figure 8 : localisation cellulaire des protéines de fusion GFP-EpsC et GFP-EpsM produites à partir du chromosome

Les foyers de fluorescences correspondent-ils aux complexes

SST2 ?

Observer la co-expression des protéines natives et chimères.

souche gfp-epsM + pEpsM souche gfp-epsC + pEpsC

Partie 3

Construction de souches dans lesquelles l’opéron eps est sous le contrôle d’un promoteur inductible

Introduction des fusions gfp-epsC et gfp-epsM sur le chromosome

PBAD::eps gfp-epsC

PBAD:: eps gfp-epsM

Les protéines natives ont remplacé les protéines chimères dans le complexe

Signal GFP diffus dans les cellules Absence de foyers distincts de fluorescence

3 : Les foyers de fluorescence correspondent-ils aux complexes

SST2 ?

Figure 9 : localisation cellulaire des protéines GFP-EpsC et GFP-EpsM dans des souches contenant respectivement les plasmides pEpsC et pEpsM

A B

Le nombre de foyers et le taux de sécrétion augmentent avec le niveau

d’expression

Figure 10 : localisation cellulaire des protéines GFP-EpsC et GFP-EpsM avec ou sans induction du promoteur pBAD

Figure 11 : quantification des foyers de fluorescence et mesure de l’activité protéase correspondante

x7


SST2 ?

Les modèles précédents sont-ils fidèles à la distribution WT des

protéines Eps

Localisation du complexe SST2 par immunofluorescence

Anticorps anti-EpsCAnticorps anti-EpsG


SST2 ?

EpsG est distribuée à la périphérie des cellules

Figure 12 : Localisation de la protéine EpsG native par immunofluorescence dans une souche WT et une souche ΔepsG


SST2 ?

WT WT

ΔepsG ΔepsG

Comment s’assemble la machinerie SST2 ?

Relation entre le cytosquelette bactérien et le SST2inhibition des filaments MreB et observer l’effet

sur le SST2 Rôle d’ancrage, d’arrimage du complexe ?

Mutations des gènes eps dans les souches gfp-epsC et gfp-epsM

observer l’effet de ces mutations sur la sécrétion des protéines

observer l’effet de ces mutations sur la localisation des protéines chimères

Partie 4

MreB forme des filaments hélicoïdaux qui structurent la cellule

4 : Comment s’assemble la machinerie SST2 ?

Figure 13 : Localisation cellulaire de MreB (Jones et al. 2001)

Le SST2 s’assemble indépendamment des filaments MreB

Figure 14 : Localisation cellulaire de GFP-EpsC et croissance bactérienne après traitement de la souche gfp-epsC au A22

Figure 15 : Effet du A22 sur le niveau de sécrétion


ExtB

Les mutations affectent la fonction du complexe SST

L’activité protéase est restaurée lorsque l’on complémente la mutation

Le complexe retrouve sa fonction de sécrétion

Tableau 2 : Mesure de l’activité protéase dans le surnageant de culture de souches mutantes et complémentées


Les mutations affectent la fonction du complexe SST

L’activité protéase est restaurée lorsque l’on complémente la mutation

Le complexe retrouve sa fonction de sécrétion

Tableau 3 : Mesure de l’activité protéase dans le surnageant de culture de souches mutantes et complémentées


EpsD est requise pour un assemblage focal d’EpsC

Figure 16 : Localisation cellulaire de GFP-EpsC dans des souches mutantes eps


ΔepsD : fluorescence diffuse

EpsM et EpsL stabilisent EpsC à la périphérie de la cellule

Figure 16 : Localisation cellulaire de GFP-EpsC dans des souches mutantes eps


ΔepsM ou ΔepsL : fluorescence aux pôles en phase stationnaire

EpsM requière EpsC pour sa localisation

Figure 17 : Localisation cellulaire de GFP-EpsM dans des souches mutantes eps


ΔepsC : fluorescence diffuse

EpsM requière EpsD et EpsCpour sa localisation



ΔepsD : fluorescence diffuse

EpsD, EpsC et EpsL sont requises pour la localisation correcte d’EpsM



Les protéines EpsM et EpsC sont partiellement colocalisées

Figure 17 : Colocalisation des protéines GFP-EpsM et mCherry-EpsC dans une souche WT de V. cholerae

11% de foyers jaunes :

complexes SST2 assemblés.

Foyers verts ou rouges :

complexes dont l’assemblage n’est pas terminé.


Enfin un premier modèle d’assemblage du SST2 !

2009 : Première publication au sujet de l’assemblage du SST2

Localisation membranaire latérale Importance de la stœchiométrie entre les

partenaires Mise en évidence d’un modèle d’assemblage

Conclusion

Modèle d’assemblage EpsD semble être l’initiateur de la

formation du complexe EpsC s’associe pour former un

complexe mais interaction directe ? EpsL et EpsM s’assembleraient

ensuite et EpsM stabiliserait cette interaction

Conclusion

Pour aller plus loin

Étude des interactions protéine/protéine physique (co-IP, double hybride)

Etude interactions protéine/protéine par fluo (dynamique)

Conclusion

Merci de votre attention !

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