lectures 2-4 pharm biotech 2016users.auth.gr/pchristo/teaching/lectures 2-4_pharm... ·...
TRANSCRIPT
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
ΧρήστοςΠαναγιωτίδης,Ph.D.ΚαθηγητήςΚυτταρικής/ΜοριακήςΒιολογίαςΕργαστήριοΦαρμακολογίας,ΤομέαςΦαρμακογνωσίας/ΦαρμακολογίαςΤμήμαΦαρμακευτικής, ΣχολήΕπιστημώνΥγείας,ΑριστοτέλειοΠανεπιστήμιοΘεσσαλονίκης54124Θεσσαλονίκη
ΦαρμακευτικήBιοτεχνολογίαΔIAΛEΞΕΙΣ2-4
EIΣAΓΩΓHΣΤΗΝΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΤΟΥΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΟΥDNAΚΑΙΣΤΙΣ
ΕΦΑΡΜΟΓΕΣΤΗΣ
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
ΣύγχρονηΒιοτεχνολογίακαιΓενετικήΜηχανική
α)ΗσύγχρονηΒιοτεχνολογίαξεκίνησεσχεδόνπαράλληλαμετηνανάπτυξητωντεχνολογιώνγενετικήςμηχανικήςπουεπέτρεψαντηναπομόνωση,τροποποίηση,εισαγωγήκαιέκφρασητμημάτωνγενετικούυλικού.β)Τα«εργαλεία»πουέχειαναπτύξειηγενετικήμηχανικήμαςεπιτρέπουν:•Ναταυτοποιούμε τογονίδιοπουκωδικοποιείτηνπρωτεΐνητουενδιαφέροντος•ΝακόβουμετηναλληλουχίατουDNAπουπεριέχειαυτήντηναλληλουχίατουγονιδίου•Νακλωνοποιούμε τογονίδιααυτόσεένανκατάλληλοφορέα,π.χ.πλασμίδιο ήβακτηριοφάγο•Ναπροσδιορίζουμετηναλληλουχίατουγενετικούυλικού•Ναχρησιμοποιούμετουςφορείςαυτούςγιαναμεταφέρουμετογονίδιοτουενδιαφέροντοςσεάλλουςοργανισμούς,όπωςτοβακτήριοEscherichiacoliήκαισεκύτταραθηλαστικώνπουαναπτύσσονταισεκυτταροκαλλιέργειες κλπ.•Ναεπάγουμε(διεγείρουμε)τακύτταρααυτάγιαναενεργοποιήσουμετηνέκφρασητουγονιδίουκαιτηνπαραγωγήτηςτηςπρωτεΐνητουενδιαφέροντος.•Ναεκχυλίσουμεκαινακαθαρίσουμετηνπρωτεΐνηγιαθεραπευτικήχρήση.
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
Παραγωγήμεγάλωνποσοτήτωνπρωτεϊνώνμεκλωνοποίησηγονιδίωνσεφορείςέκφρασης
Ιδιότητεςτωνφορέων pGEX1. Ισχυρόςκαιρυθμιζόμενις
υποκινητής(Tac promoter)2. Παρουσίαγονιδίουlac Iq3. Ετικέτα(tag)GST
(θειοτρανσφεράση τηςγλουταθειόνης)
Παράδειγμα:Οιβακτηριακοί φορείςέκφρασηςpGEX("Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase” (1988) Smith,D.B.andJohnson,K.S.,Gene 67,31-40)
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
DNAμπορείνααπομονωθείείτεαπόκύτταραήαπόιστούςπροκειμένουναμελετηθεί• ΠΡΟΣΟΧΗ:
ΤοDNA είναιέναΤΕΡΑΣΤΙΟ μόριο(ακόμηκαιτο DNAτωνσχετικάμικρώνβακτηριακώνγονιδιωμάτωνείναιαρκετάμεγάλο) πουείναιεξαιρετικάευαίσθητοστημηχανικήκαταπόνηση,δηλαδήμπορείπολύεύκολανα«σπάσει»σεμικρότεραθραύσματακατάτηδιάρκειατωνεργαστηριακώνχειρισμών.
ΕΠΟΜΕΝΩΣ
üΤο«κόψιμο»τουDNA σεμικρότεραθεραύσματαμπορείναβελτιώσειτημηχανικήτουσταθερότητα καινααπλοποιήσειτοχειρισμότου
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
Πωςμπορούμενα«κόψουμε»τοDNAσεμικρότεραθραύσματα;
METHXPHΣHEIΔIKΩNENZYMΩN
✍YΠAPXOYNΠPOΫΠOΘEΣEIΣ;
✔NAI,TAENZYMAAYTAΘAΠPEΠEINAΔIAΣΠOYNTODNAΠANTAΣTIΣIΔIEΣAΛΛHΛOYXIEΣOIOΠOIEΣEINAIEKTΩN
ΠPOTEPΩNΓNΩΣTEΣ
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
ΕργαλείαστηνΦαρμακευτικηΒιοτεχνολογία– ΓενετικήΜηχανική
Ενδονουκλεάσες περιορισμού:•Αυτάταένζυμαπροέρχονταιαπόβακτήριαόπουχρησιμοποιούνταιωςμηχανισμόςάμυναςενάντιαστουςιούς(βακτηριοφάγους)πουταπροσβάλλουν,αποικοδομώντας τοDNAτωνεισβολέων.Υπάρχουνεκατοντάδεςτέτοιεςενδονουκλεάσες περιορισμούπουτιςχρησιμοποιούμεσανμοριακάψαλίδιαγιανακόψουμετοDNAσεσυγκεκριμένεςθέσειςκαινααπομονώσουμεταγονίδιαDNAλιγάση:•Τοένζυμοαυτόχρησιμοποιείταιφυσιολογικάστηναντιγραφήαλλάκαιστηνεπιδιόρθωση«σπασμένου»DNA.ΜπορείναχρησιμοποιηθείκαιγιατηνενσωμάτωσηνέωνγονιδίωνστοDNA.Πλασμίδια:•ΕίναικυκλικάDNA.Μπορούνναδιαμορφωθούνγιαναμεταφέρουνταγονίδιατουενδιαφέροντοςήανασυνδυασμένο DNA.Βακτηριοφάγοι(ήφάγοι):•Είναιιοίπουμολύνουνταβακτήρια.Οιβακτηριοφάγοιμπορούνναδιαμορφωθούνγιαναμεταφέρουνταγονίδιατουενδιαφέροντοςήανασυνδυασμένο DNA.
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
Τιείναιοιενδονουκλεάσες περιορισμού;
Οιενδονουκλεάσεςπεριορισμούείναιενδονουκλεάσεςοιοποίεςαναγνωρίζουνσυγκεκριμένεςπαλινδρομικές
αλληλουχίεςστοDNA,τοοποίοδιασπούνπάνταστιςίδιεςπροκαθορισμένεςθεσεις.
Θαδείξουμεμερικάπαραδείγματαστιςεπόμενεςδύοδιαφάνειες
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
Περισσότερεςενδονουκλεάσες περιορισμού
EcoRI
HaeIII
AluI
NotI
HindIII
θέσηδιάσπασης Σακχαροφωσφορικός σκελετός
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
Απόπουπροέρχονταιοιενδονουκλεάσες περιορισμού;
✔Οιενδονουκλεάσεςπεριορισμούαπομονώθηκαναρχικάαπόβακτήρια.Είναισυστατικάενός
μηχανισμούάμυναςτωνβακτηρίωνενάντιασεεισβολήξένουγενετικούυλικού,π.χ.απόμόλυνση
μεκάποιονβακτηριοφάγο.
✄ΓιατίοιενδονουκλεάσεςπεριορισμούδενδιασπούνκαιτοDNAτουβακτηρίουπουτιςπαράγει;
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
ΧημικέςτροποποιήσειςτουDNA τωνβακτηρίωνπουπαράγουνενδονουκλεάσες
περιορισμούτοπροστατεύουναπόενδονουκλεολυτική πέψηαπόαυτές
ΜεθυλιωμένοDNA
ΜημεθυλιωμένοDNA
Η EcoRIδεμπορείναδιασπάσειτομεθυλιωμένο DNA
ΜημεθυλιωμένοDNA
ΔιάσπασητουDNA
«κολλώδη»άκρα
ΕνδονουκλεάσηπεριορισμούEcoRI
EcoRIμεθυλάση
ΕνδονουκλεάσηπεριορισμούEcoRI
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
ΚΑΙΜΕΤΑΤΗΝΚΟΠΗΤΙ;
ΠωςαναλύεταικαιπωςχρησιμοποιείταιτοDNAμετάτηνπέψητουμεενδονουκλεάσες
περιορισμού;
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
Hλεκτροφορητική ανάλυσητουDNA
κοντόθραύσμα
μεσαίου-μεγέθουςθραύσμα
κοπήμεενδονουκλεάσηπεριορισμού
κοπήμεενδονουκλεάσηπεριορισμού
κοπήμεενδονουκλεάσηπεριορισμού
DNA
Μεγαλύτερομέγεθος
μικρότερομέγεθος
ΔίκλωνοπλασμιδιακόDNA
ΠέψημεEcoRI ΠέψημεHindIII
Αρχή
Τέλος
Εμφάνισηφιλμ
εμφανισμένοαυτοραδιογράφημαφύλλοφωτογραφικού
χαρτιού
πηκτήαγαρόζηςζεύγηνουκλεοτιδίων(Χ10
00)
201086
2
+
-
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
ΗσημασίατουμάρτυραμεγέθουςθραύσματοςDNAστηνηλεκτροφόρηση
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
Ταστάδιατηςηλεκτροφορητικής ανάλυσηςσεπηκτέςαγαρόζης
μικροπιπέτακαλώδια
τροφοδοτικό
Α)καλούπισχηματισμούτηςπηκτής Β)Ηαγαρόζη «χύνεται»στοκαλούπισχηματισμούπηκτής Γ)τοποθέτησηπλαστικής
«χτένας»γιατονσχηματισμόοπών(πηγαδάκια)στηνεπιφάνειατηςπηκτής
πηγαδάκια
ταινία
διάλυμααγαρόζης
καλούπι
Γυάλινηεπιφάνεια
βάσηστήριξης
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
Ταστάδιατηςπροετοιμασίαςγιαηλεκτροφόρηση σεπηκτέςαγαρόζης
α)Ηαγαρόζη «χύνεται»στοκαλούπισχηματισμούπηκτήςστοοποίοέχειήδητοποθετηθείκαιηχτένασχηματισμούπηγαδιών
α)Μετάτηστερεοποίησητηςαγαρόζης καιτηναπομάκρυνσητηςχτέναςσχηματισμούπηγαδιών,τοκάθεδείγμαDNAτοποθετείται(«φορτώνεται»)σεξεχωριστόπηγαδάκι
γ)Μετάτηντοποθέτησητωνδειγμάτωνησυσκευήενώνεται,μεχρήσηκαλωδίων,μετοτροφοδοτικόκαιξεκινάηηλεκτροφόρηση μεπαροχήρεύματοςσυγκεκριμένηςτάσης.
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
Χειρισμόςτουδείγματοςπουπρόκειταινααναλυθείμεηλεκτροφόρηση
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
Χειρισμόςτηςπηκτήςαγαρόζης μετάτοτέλοςτηςηλεκτροφόρησης
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
Ηλεκτροφορητικές μέθοδοιχρησιμοποιούνταικαιστονπροσδιορισμότωνDNA αλληλουχιών
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
ΔιαδικασίααλληλούχισηςDNAμετημέθοδοτουSangerπουβασίζεταιστηχρήση
διδεοξυνουκλεοτιδίων
Διδεοξυαδενοσίνη (ddATP)
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
ΑυτοματοποιημένοςπροσδιορισμόςτηςαλληλουχίαςτουDNA
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
Ηπρώτηαλληλούχιση πλήρουςγονιδιώματοςεπιτεύχθηκετο1995γιατοDNAτουβακτηρίουHaemophilus influenza
Σταθμοίστηναλληλούχιση γονιδιωμάτων
1996: Πρώτηαλληλούχιση τουευκαρυωτικού γονιδιώματος (ζυμομύκητας–Saccharomycescerevisiae)
1998: Πρώτηαλληλούχιση γονιδιώματος πολυκύτταρουευκαρυώτη (Caenorhabditiselegans)2000: Aλληλούχιση γονιδιωμάτων Drosophilamelanogaster &Arabidopsisthaliana2004: Πλήρηςαλληλούχιση τουανθρώπινουγονιδιώματος
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
ΗγνώσητηςαλληλουχίαςτωνβάσεωντουDNAεπιτρέπειτονπροσδιορισμότωνπεριοχώνπουκωδικοποιούνπρωτεΐνες
πλαίσιαανάγνωσης
πλαίσιαανάγνωσης
πλαίσιαανάγνωσης
πλαίσιαανάγνωσης
DNA
DNA
ΦοράδιαβάσματοςτηςαλληλουχίαςτηςπάνωαλυσίδαςτουDNA
ΦοράδιαβάσματοςτηςαλληλουχίαςτηςπάνωαλυσίδαςτουDNA
ΦοράδιαβάσματοςτηςαλληλουχίαςτηςκάτωαλυσίδαςτουDNA
ΦοράδιαβάσματοςτηςαλληλουχίαςτηςκάτωαλυσίδαςτουDNA
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
Hδιαδικασίατηςκλωνοποίησης
ΚΟΠΗΜΕΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΗΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ
θραύσμαDNA πουθακλωνοποιηθεί
ΟΜΟΙΟΠΟΛΙΚΗΣΥΝΔΕΣΗΜΕΤΗΝDNAΛΙΓΑΣΗ
δίκλωνοκυκλικόπλασμιδιακό DNA
ανασυνδυασμένο DNA
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
Πολλαπλασιασμόςτωναντιγράφωνενόςγονιδίουμεκλωνοποίηση
βακτηριακόκύτταρο καλλιέργειαγιατον
πολλαπλασιασμότωνβακτηριακών κυττάρων
Μετάαπόλύσητωνβακτηριακών κυττάρωναπομονώνονταιμεγάλεςποσότητεςDNA
Τοανασυνδυασμένοπλασμιδιακό DNAεισάγεταιστοβακτηριακό κύτταρο
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
Aπαραίτητες ιδιότητεςενόςπλασμιδιακούφορέακλωνοποίησης
1. Aλληλουχίες έναρξηςαντιγραφής(ORI)2. Γονίδιοπουεπιτρέπειεύκοληεπιλογή(π.χ.
αντίστασησεαντιβιοτικό)3. Aλληλουχίες πουεπιτρέπουνκοπήαπόαρκετές
ενδονουκλεάσες περιορισμού(polylinker)4. (Υποκινητής πουεπιτρέπειρυθμιζόμενη
έκφραση)
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
Γενωμικές &cDNA Bιβλιοθήκεςχρωμοσωμικό DNA
γονίδιοΑ γονίδιοΒγονίδιοΒ γονίδιοΑ
εξόνιο ιντρόνιο μη-μεταγραφόμενοDNA
ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ
ΠΕΨΗΜΕΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΗΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ
ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗΤΟΥ DNA
ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΗΜΕΤΑΓΡΑΦΗ&ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗDNA
ΣΥΡΡΑΦΗ(ΜΑΤΙΣΜΑ)ΤΟΥ RNA
mRNAs
RNAμετάγραφα
θραύσματαDNA
γενωμικοί κλώνοιDNAσεγενωμική βιβλιοθήκη cDNA κλώνοισεβιβλιοθήκη cDNA
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
Κατασκευήγενωμικών βιβλιοθηκών
DNA ανθρώπουΠΕΨΗΜΕ
ΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΗΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ
ΤΑΘΡΑΥΣΜΑΤΑΤΟΥDNAΕΝΣΩΜΑΤΩΝΟΝΤΑΙΣΕ
ΠΛΑΣΜΙΔΙΑ
εκατομύρια θραύσματαγενωμικού DNA
ΕΙΣΑΓΩΓΗΤΩΝΠΛΑΣΜΙΔΙΩΝΣΕΒΑΚΤΗΡΙΑ
ανασυνδυασμένα μόριαDNA
γενωμική βιβλιοθήκη
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
ΔιαδικασίαπαρασκευήςcDNA
ιστός,π.χ.εγκέφαλος
λύσητωνκυττάρωνκαι απομόνωση
mRNA
mRNA
υβριδισμόςμεεκκινητή polydT
mRNAκατασκευήαντιγράφουDNAμε
χρήσηαντίστροφηςμεταγραφάσης
κατεργασίαμεάλκαλι γιανααποικοδομηθεί τοRNA
Το3’άκροτουcDNAσχηματίζει
θηλειά
σύνθεσησυμπληρωματικήςαλυσίδαςDNA μεDNA-πολυμεράση,ηθηλειάτου
3’άκρουδραωςεκκινητής
δίκλωνοcDNA αντίγραφοτουαρχικούmRNA
κατεργασίαμενουκλεάση πουαποικοδομεί μονόκλωνοDNA γιανα
αποικοδομηθεί ηθηλειά
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
ΠροσανατολισμένηκλωνοποίησητουδίκλωνουcDNAσεπλασμιδιακόφορέα
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
Bιβλιοθήκες DNAμπορούννακατασκευασθούνκαισεβακτηριοφάγους
λυτική οδόςλυτική οδόςσχηματισμόςπροφάγου (λυσιγονία)
βακτηριακό κύτταρο
βακτηριακό χρωμόσωμα
βακτηριφάγοςλάμδα
τοDNAτουφάγουκυκλοποιείται
πρόσδεσητουφάγου στονξενιστήκαι«ένεση»τουιικού DNA
σύνθεσητωνιικώνπρωτεϊνώνπου
χρειάζονταιγιατοσχηματισμόνέωνιών
ΤαχείααντιγραφήτουDNA τουλφάγου και
πακετάρισμασεπλήρειςιούς
λύσητουκυττάρουκαιαπελευθέρωση
μεγάλωνποσοτήτωννέωνιών
βήμαενεργοποίησης
ΕνσωμάτωσητουDNAτουλφάγου στοχρωμόσωματου
ξενιστή
κυτταρικήδιαίρεση
τοενσωματωμένοDNA τουλφάγουαντιγράφεταιμαζίμετοχρωμόσωματουξενιστή
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
Τακοσμίδιαείναιπλασμιδιακοίφορείςκλωνοποίησηςπουπεριέχουνμίαήδύοθέσεις“cos”. (Ηθέση cos είναιμίααλληλουχίαπερίπου200bp πουπροέρχεταιαπότονφάγολκαιηοποίαείναιαπαραίτητηγιατο«πακετάρισμα»τουDNA σεσωματίδιαφάγου).
Πωςκλωνοποιούμετο DNAσεένακοσμίδιο;1.Χρησιμοποιούμετηθέσηπολλαπλήςκλωνοποίησης(polylinker)γιαναενθέσουμε
θραύσματαDNA πουέχουνδημιουργηθείμεπέψημεενδονουκλεάσεςπεριορισμού.
2.ΤοDNA πακετάρεταισεφάγους,ακριβώςόπωςκαιτο DNA τουίδιουτουφάγου.3.Τακοσμίδιαπολλαπλασιάζονταιμέσασταβακτηριακάκύτταραόπωςκαιτα
πλασμίδια(δηλ.φέρουνγονίδιαπουπροσδίδουνστακύτταρααντίστασησεαντιβιοτικό).
4.Τακοσμίδιααπομονώνονταιακριβώςόπωςκαιταπλασμίδια.
Τοπλεονέκτηματουςείναιότιμπορούννα«πακετάρουν»μέσαστην«κεφαλή»τουφάγουμεγαλύτερασεμέγεθοςθραύσματαDNA (40-55kbofDNA,δηλ.σεκοσμίδιαμεγέθους~5kb μπορούμεναεισάγουμεενθέματα33-50kb).
Kοσμίδια
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
• Τοκοσμίδιο«κόβεται»μετηνενδονουκλεάσηBglII σεθέσηκοντάστηθέσηcos.• Το γενωμικόDNA«κόβεται»μετηνενδονουκλεάση Sau3A(μερικήυδρόλυση),που
δημιουργείσυμβατά«κολλώδη»άκραμετηνBglII. Ταθραύσματατακατεργαζόμαστεμεαλκαλικήφωσφατάση(ΓΙΑΤΙ;)
• ΤοDNA δότηςσυνδέεταιμετοDNAδέκτη(κοσμίδιο)μετηνDNAλιγάσηδημιουργώνταςενσειράσυνδέσεις.ΤοDNAκαθαρίζεταιμεβάσητομέγεθος.
• ΤοDNA «πακετάρεται»σεφάγους.
Kλωνοποίησησεκοσμίδια- Παράδειγμα
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
ΤοDNAτωνκοσμιδίων«πακετάρεται»σεγραμμικήμορφή
Θραύσμαπροςκλωνοποίηση(35-55bp,κομμένομεBamHI)
Προσθήκηλιγάσης καιATP
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
Πολύπλοκεςγενετικέςκατασκευέςμπορούνναγίνουνμεδιαδοχικέςκλωνοποιήσεις
θραυσμάτωνDNAπλασμιδιακός φορέας
πρώτοένθεμα
δεύτεροένθεμα
τρίτοένθεμα
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
ΠΩΣMΠOPOYMENATAYTOΠOIHΣOYMEAΠOIKIEΣΠOYΠEPIEXOYNANAΣYNΔYAΣMENOYΣΦOPEIΣKΛΩNOΠOIHΣHΣAΠO
AYTEΣΠOYΠEPIEXOYN«AΔEIOYΣ»ΦOPEIΣ;
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
Διάκρισημπλε-λευκώναποικιώνγιατονεντοπισμόανασυνδυασμένωνφορέων
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
Eντοπισμός ανασυνδυασμένων φορέωνμεβάσητηνέκφρασηενόςγονιδίουθανάτου
Nsi I*
Hind
III
Asp7
18 I
Kpn
IEcl1
36 II
Sac I
Bam
H I
Spe
IEcoR
IPst I
EcoR
VNo
t IXho
INsi I*
Xba
IDra
IIApa
IBstB
I
pZErO™-2.13.3 kb
Stu IPlaclacZα ccdB
f1 ori
Apo I†
BspH I
SnaB I
Comments for pZErO™-2.1 3297 nucleotides
Lac Promoter/Operator Region: bases 95-216M13 Reverse Priming Site: bases 205-221LacZα ORF: bases 217-558Sp6 Priming Site: bases 239-256Multiple Cloning Site: bases 269-381M13 (-20) Forward Priming Site: bases 415-430M13 (-40) Forward Priming Site: bases 434-450Fusion Joint: bases 559-567ccdB Lethal Gene ORF: bases 568-870f1 origin: bases 895-1307Kanamycin Resistance ORF: bases 2116-1322ColE1 origin: bases 2502-3175
ColE1Kanamycin
Afl III
* The two Nsi I sites in theMCS are the only sites inthe vector.
† There are two tandemApo I sites at thislocation. Apo I alsorecognizes the EcoR Isite.
Sp6
A-160319
The sequence of pZErO™-2.1 has been compiled from information in sequence databases, publishedsequences, and other sources. This vector has not been completely sequenced. If you suspect an error in thesequence, please contact Invitrogen's Technical Services Department.
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
Yβριδισμός νουκλεϊνικών οξέων
μίγμαμονόκλωνωνμορίωνDNA
υβριδισμόςσε50%φορμαμίδιοστους42˚C
υβριδισμόςσε50%φορμαμίδιο στους35˚C
ουβριδισμόςδενείναιακριβής
υβριδισμόςσε50%φορμαμίδιο στους35˚C
μονόκλωνοιDNAανιχνευτέςγιατογονίδιοΑ
μόνοτοΑσχηματίζεισταθερήδιπλήέλικα
ταΑ,CκαιEσχηματίζουνσταθερέςδιπλέςέλικες
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
TαυτοποίησηAποικιώνπουΠεριέχουνΘετικούςKλώνουςμεYβριδισμό
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
ΠΩΣMΠOPOYMENAEΠITYXOYMETHN
ANAΛYΣH/TAYTOΠOIHΣHΣYΓKEKPIMENΩN ΘPAYΣMATΩN
DNA(πριντην κλωνοποίησηήκαιμετά);
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
ΣτύπωμακατάSouthern μετάαπόανάλυσηDNAμεηλεκτροφόρησησεπήκτωμα
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
Aνίχνευση τηςμετάλλαξηςπουπροκαλείδρεπανοκυτταρικήαναιμίαμευβριδισμό
νουκλεϊνικών οξέων
πρωτεΐνη
φυσιολογικήβ-σφαιρίνη
φυσιολογικήπρωτεΐνη
μεταλλαγμένηπρωτεΐνη
παθολογικήβ-σφαιρίνημετάλλαξη
ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ
ανιχνευτήςφυσιολογικούγονιδίου
ανιχνευτήςμεταλλαγμένουγονιδίου
άτομα άτομα• Τοάτομο1έχειδύο
φυσιολογικάγονίδιαβ-σφαιρίνης
• Τοάτομο2έχειδύομεταλλαγμέναγονίδιαβ-σφαιρίνης
• Τοάτομο3έχειέναφυσιολογικόκαιέναμεταλλαγμένογονίδιοβ-σφαιρίνης
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
Χρήσηυβριδισμούνουκλεϊνικών οξέωνγιατονπροσδιορισμότηςτοπολογίαςτων
γονιδίωνσταχρωμοσώματα
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
TIKANOYMEOTANTOΔIAΘEΣIMOΓENETIKOYΛIKOΔENEINAIΔIAΘEΣIMOΣEΠOΣOTHTEΣIKANEΣΠPOΣ
ANAΛYΣH;
ΦTIAXNOYMEΠEPIΣΣOTEPOΜΕΤΗΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΤΗΣ ΑΛΥΣΙΔΩΤΗΣ
ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ(PCR)
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
ΗσημασίατηςθερμικήςσταθερότηταςτηςDNAπολυμεράσης στηδιαδικασίατηςPCR
Πολυμεράση 3’->5’εξωνουκλεάση
Πηγήκαιιδιότητες
Taq όχι ΠροέρχεταιαπότοThermus aquaticus.Οχρόνοςημιζωής τηςστους95˚Cείναι1,6ώρες
Pfu ναι ΠροέρχεταιαπότοPyrococcus furiosus.Κάνει τα λιγότερα λάθη σε σχέση µε τις υπόλοιπες θερµοσταθερές DNAπολυµεράσες
Vent ναι ΠροέρχεταιαπότοThermococcus litoralis (είναι γνωστή και ως Tliπολυµεράση). Ο χρόνοςημιζωής τηςστους95˚Cείναιπερίπου7ώρες
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
ΜοριακήδιαγνωστικήμεPCRστηνιατροδικαστική
ηλεκτροφορητική ανάλυσηεκκινητέςPCR
ομόλογαχρωμοσώματα
πατρικό
μητρικό
ΕπαναλλαμβανόμενεςαλληλουχίεςσεθέσηVNTR
άτομο A άτομο B άτομο C άτομο F
αριθμό
ςεπα
ναλήψεω
ν
Ηλεκτροφ
όρησ
η
3ζεύγηομ
όλογωνχρωμο
σωμά
των
Ηλεκτροφ
όρησ
η
VNTR:VariableNumberTandemRepeat(Μεταβλητόςαριθμόςιαδοχικώνεπαναλήψεων)
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
AνίχνευσηHIVμεRT-PCR
δείγμααίματοςαπόμολυσμένο
άτομο
ελάχισταιοσωμάτια HIVστονορότουμολυσμένουατόμου
Απομάκρυνσητωνκυττάρωνμεφυγοκέντρηση
Εκχύλισητουιικού RNA
γονιδιώματος
Αντίστροφημεταγραφή/ενίσχυσημε
PCR
Ηλεκτροφόρηση σεπηκτή
αίμαμημολυσμένουατόμου
χρησιμοποιείταιωςαρνητικόςμάρτυρας
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
XρήσηRT-PCRμεπολλαπλούςεκκινητέςστημοριακήδιαγνωστικήμιάςιογενούςνόσου
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
HPCRστηνκλωνοποιησηDNAκαιRNAκύτταρα
απομόνωσηRNAαπομόνωσηDNA
DNAπουθακλωνοποιηθεί
mRNAπουθακλωνοποιηθεί
Αποδιάταξη DNA/ προσθήκηεκκινητών
ΕνίσχυσημεPCRΕνίσχυσημεPCR ΕνίσχυσημεPCR
Αποδιάταξη αλυσίδων&προσθήκη2ου εκκινητή
Προσθήκη1ου εκκινητή,αντίστροφηςμεταγραφάσης
καινουκλεοτιδίων
ΕνίσχυσημεPCR
γενωμικοίκλώνοι
cDNAκλώνοι
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
ΧρήσητηςPCRπραγματικούχρόνουγιαποσοτικέςμετρήσειςγενετικούυλικού
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
Kατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεσηπλασμιδιακός φορέας
συνθετικόολιγονουκλεοτίδιο/εκκινητής πουφέρειτηνεπιθυμητήμετάλλαξη
αποδιάταξηαλυσίδωνDNA
κλωνοποιημένο φυσιολογικόγονίδιο
ΟλοκλήρωσητηςσύνθεσηςμεχρήσηDNAπολυμεράσης και
DNAλιγάσης
ΕισαγωγήσεκύτταραΑντιγραφήκαιαπομόνωσηστα
θυγατρικάκύτταρα
μεταγραφή μεταγραφή
μετάφραση μετάφραση
ταμισάκύτταραπαράγουνφυσιολογικήπρωτεΐνη
ταμισάκύτταραπαράγουνμεταλλαγμένηπρωτεΐνηπουφέρει
αλλαγήσεένααμινοξύ
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
Eισαγωγή κατευθυνόμενωντροποποιήσεωνστογενετικόυλικό
ΦυσιολογικόγονίδιοΧ
Μόνοτομεταλλαγμένογονίδιοεκφράζεται
Προσθήκηγονιδίου
Απαλειφήγονιδίου
Αντικατάστασηγονιδίου
Δενυπάρχεικανέναενεργόγονίδιο
Εκφράζεταικαιτοφυσιολογικόκαιτομεταλλαγμένογονίδιο
Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.
Kατασκευή Διαγονιδιακών Ποντικώνθηλυκόποντίκι
τροποποιημένογονίδιομεμεθόδουςγενετικήςμηχανικής
ES κύτταρασταοποίαένααπόταδύοαντίγραφατουγονιδίουέχειαντικατασταθείμετην
μεταλλαγμένημορφή
εισαγωγήτροποποιημένουγονιδίουστακύτταρα
τακύτταρασχηματίζουναποικίες
Απομονωμένοπρώιμοέμβρυο
ζευγάρωμακαιαναμονήγια3μέρες
ΈνεσηκυττάρωνESστο πρώιμοέμβρυο
πρώιμοέμβρυοπουσχηματίσθηκεμερικώςκαιαπό
κύτταραES
εισαγωγήεμβρύουσεψευδο-εγκύους
ποντικούς
αναζήτησησπάνιωναποικιώνπουπεριέχουντο
τροποποιημένογονίδιο
Διαγονιδιακός ποντικόςμεγαμετικάκύτταραταοποίαπεριέχουνκαιτροποιημένααντίγραφατουγονιδίου-στόχου
ελέγχεταιηπαρουσίατουτροποποιημένουγονιδίουσεσωματικάκύτταρααπογόνωνκαιοιθετικοίαπόγονοιδιασταυρώνονται
Γέννηση