lezione snupe 2
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La più frequente malattia ereditaria cronica che colpisce indifferentemente i maschi e le femmine appartenenti prevalentemente alla razza bianca
La Fibrosi CisticaLa Fibrosi Cistica
Etnia Incidenza Freq.eterozigosi
Caucasici 1/2500 1/25 (4%)
Ebrei Ashkenazi 1/3300 1/29
Ispanici(America latina)
1/8000 1/46
Africani Americani 1/15000 1/65
Asiatici Americani 1/30000 1/150
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Cenni storiciCenni storici• 1936: per la prima volta vengono messi in relazione disfunzioni pancreatiche e respiratorie• 1938: le prime osservazioni anatomo-patologiche in autopsia forniscono una prima descrizione della malattia
• 1953: rilevazione di eccessi di cloruro di sodio nel sudore
• 1983: osservazione dettagliata degli epiteli respiratori FC mediante microscopia
• 1989: individuazione della molecola che, se difettata, causa FC: CFTR
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Proteina CFTRProteina CFTR““CCysticystic FFibrosis ibrosis TTransmembraneransmembrane RRegulatoregulator””
• Superfamiglia dei trasportatori ABC (ATP Binding Cassette) trasporto attivo primario
•Proteina trans membrana
• 1480 Aminoacidi
• Canale per il passaggio di ioni Cloro
• Presente negli epiteli secretori: ghiandole sudoripare, naso, bronchi, pancreas, intestino e dotti deferenti.
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CFTR: strutturaCFTR: struttura““CCysticystic FFibrosis ibrosis TTransmembraneransmembrane RRegulatoregulator””
• MSD-1 e MSD2: porzioni trans membrana (alfa-eliche idrofobiche)
• NBD-1 e NBD-2: domini ATPasici
• R: dominio regolatore
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CFTR: regolazioneCFTR: regolazione““CCysticystic FFibrosis ibrosis TTransmembraneransmembrane RRegulatoregulator””
1) Quando la proteina non lega i cofattori il canale è chiuso da R
2) Quando l’ATP si lega ai domini NBD e la PKA fosforila R il canale è aperto
Passaggio di ioni cloro dal lato citosolico a quello extracellulare delplasmalemma
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CFTR e Fibrosi CisticaCFTR e Fibrosi Cistica
L’aumento della concentrazione di ioni sodio e cloro all’interno della cellula compromette
l’attività secretoria epiteliale
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Principali sintomi FCPrincipali sintomi FC
Apparato respiratorio
(epitelio polmonare)
•Tosse frequente
•Catarro
•Stanchezza
•Infezioni respiratorie
Apparato digerente
(epitelio intestinale)
•Insufficienza pancreatica
•Maldigestione
•Malnutrizione
•Occlusioni intestinali
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CFTR: mutazioniCFTR: mutazioni1200 mutazioni diverse, con incidenza variabile
La mutazione più diffusa nella popolazione caucasica è la ∆F508:
Popolaz. anglosassoni: 70%
Popolaz. mediterranea: 50%
Wild type
DNA GAA AAT ATC ATC TTT GGT GTT TCC
Proteina Glu Asn Ile Ile Phe Gly Val Ser
Posizione 504 505 506 507 508 509 510 511
Fibrosi cistica ∆F508
DNA GAA AAT ATC AT- --T GGT GTT TCC
Proteina Glu Asn Ile Ile Gly Val Ser
Posizione 504 505 506 507 508 509 510
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CFTR: classi di mutazioniCFTR: classi di mutazioni
Classe I: sintesi assente della proteina
Classe II: compromissione del trasporto intracellulare
Classe III: difetti della regolazione (∆F508)
Classe IV: alterazioni a livello dei tratti transmembrana che riducono la conduttanza del canale
Classe V: mutazioni che non alterano la funzione della proteina ma ne riducono i livelli di sintesi
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Gene CFTRGene CFTR““CCysticystic FFibrosis ibrosis TTransmembraneransmembrane RRegulatoregulator””
• 250.000 paia di basi
• localizzato sul cromosoma 7
Segue il modello dell’eredità mendeliana
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EreditàEredità autosomicaautosomica recessivarecessiva
Allele CFTR wild type: dominante
Allele CFTR “mutato”: recessivo
Chi eredita due copie mutate (Omozigoti) manifesta i sintomi
Chi eredita una sola copia mutata (Eterozigoti) non ha nessun sintomo
(Portatore sano)
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DiagnosiDiagnosi
valutazione di [Na+] e [Cl-] nel sudoreTest del sudore
Screening neonataleDeterminazione della tripsina nel sangue
lattasi nel meconio
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Diagnosi: test del sudoreDiagnosi: test del sudore
Stimolazione della sudorazione mediante
inoforesi
Condizioni normali [Na+] e [Cl-] < 40 mEq/l
Fibrosi cistica [Na+] e [Cl-] > 70 mEq/l
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Diagnosi: screening Diagnosi: screening neonataleneonatale
Saggio immunologico per rilevare la quantità di tripsina
Goccia di sangue prelevata in terza giornata
MeconioDeterminazione dei livelli di
lattasi
I livelli di entrambi questi enzimi risultano aumentati nei pazienti FC per la ridotta funzionalità
pancreatica
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CFTR e Fibrosi CisticaCFTR e Fibrosi Cistica
L’aumento della concentrazione di ioni sodio e cloro all’interno della cellula compromette
l’attività secretoria epiteliale
Infezioni delle vie respiratorie causate da Infezioni delle vie respiratorie causate da patogeni opportunistipatogeni opportunisti
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Principali responsabili delle infezioni croniche Principali responsabili delle infezioni croniche a carico dei pazienti FC:a carico dei pazienti FC:
Pseudomonas aeruginosaStaphylococcus aureus
Burkholderia cepacia complexHaemophilus influenzae
Ralstonia pickettiiBurkholderia gladioli
Alcaligenes xylosoxidans
Coenye et al, 2001
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Principali responsabili delle infezioni croniche Principali responsabili delle infezioni croniche a carico dei pazienti FC:a carico dei pazienti FC:
Pseudomonas aeruginosaStaphylococcus aureus
Burkholderia cepacia complexHaemophilus influenzae
Ralstonia pickettiiBurkholderia gladioli
Alcaligenes xylosoxidans
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Burkholderia: origineBurkholderia: origine
Clinica:polmone dei pazienti FC
Ambientale:Suolo
RizosferaAcqua
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B. cepaciaB. cepacia complexcomplex: tassonomia: tassonomiaA causa dell’alto grado di omologia A causa dell’alto grado di omologia genomica genomica
l’l’identificazioneidentificazione di questi patogeni risulta di questi patogeni risulta molto difficoltosamolto difficoltosa
B. pyrrociniaIXB. anthinaVIIIB. ambifariaVIIB. dolosaVIB. vietnamiensisVB. stabilis IVB. cenocepaciaIIIB. multivoransIIB. cepaciaI
SpecieSpecieGenomovarGenomovar
III-AIII-BIII-CIII-D
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Burkholderia cepaciaBurkholderia cepacia complex complex ((BccBcc))
La colonizzazione delle vie aeree da B. cepaciae la conseguente infezione polmonare
“sindrome da cepacia ” sono la più importante causa di malattia tra i pazienti affetti da
Fibrosi CisticaCoenye et al, 2001
Cura: Terapia antibiotica mirata
Identificazione tempestiva del Identificazione tempestiva del patogenopatogeno
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ScopoSviluppo di un test diagnostico rapido per la discriminazione di
specie e genomovars di Burkholderia cepacia complex
nella routine clinica
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Microbiologia del Bcc
Entrambi questi ospedali pediatrici ospitano un Centro
Fibrosi Cistica
Biologia molecolare applicata ai
microrganismi
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Identificazione e/o tipizzazione
Identificazione e/o tipizzazione
PCR specifiche 16S PCR specifiche 16S rDNArDNA
Test Test fenotipicifenotipici
RFLP del gene RFLP del gene recArecA
Analisi del contenuto Analisi del contenuto in acidi grassiin acidi grassi
16S 16S rDNA rDNA RFLPRFLP
RAPDRAPDAFLPAFLP
Analisi del Analisi del proteomaproteoma
SDSSDS--PAGEPAGE
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Analisi di restrizione di Analisi di restrizione di recArecA::•amplificazione via PCR di un tratto del gene recA:si ottiene un frammento di circa 1000 pb dai solibatteri del complex utilizzando i primer BCR1 e BCR2
Mahenthiralingam et al, 2000
Prodotto di amplificazione
Elettroforesi su gel di agarosio
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Taglio con l’enzima di restrizione HaeIII ed elettroforesi su gel per visualizzare i profili ottenuti:
Mahenthiralingam et al, 2000
Gvr x Gvr zGvr y
Si ottengono profili di restrizione diversi per la presenza di polimorfismi puntiformi all’interno della
sequenza riconosciuta dall’enzima di restrizione.
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LIMITI DELLA TECNICAL’uso del solo HaeIII non consente di distinguere ognigenomovar, ma solo di creare dei pattern di profili direstrizione
Mahenthiralingam et al, 2000
Necessità di confrontare un profilo con tutti i profilipossibili
Disponibilità di una banca di ceppi aggiornata
Tempi considerevoli per l’ottenimento dei risultati
Necessità che il polimorfismo puntiforme genomovarspecifico generi o faccia scomparire un sito direstrizione
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SNuPESNuPESingle Nucleotide Primer Extension
1. Amplificazione via-PCR di un frammento genico2. Purificazione del templato di PCR3. Reazione di estensione del primer specifico con
dideossinucleotidi marcati con fluorocromi di colore e peso molecolare diversi
4. Purificazione del prodotto di reazione5. Elettroforesi capillare con identificazione di colore
e posizione del fluorocromo incorporato
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STEP PRELIMINARI
Analisi delle sequenze del gene scelto alla ricerca di polimorfismi puntiformi (SNP):
CGCACTGAAGTTCTACTCGTCGGTGCGTCTCGATATCCGCCGGATTGGCTCGATCGCACTGAAGTTCTACTCGTCGGTGCGTCTCGATATCCGCCGGATAGGCTCGAT
CGCACTGAAGTTCTACTCGTCGGTGCGTCTCGATATCCGCCGGATCGGCTCGAT Specie xSpecie ySpecie z
Disegno di primer specifici sulla base degli SNP individuati
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Amplificazione perPCR della regione contenente
il polimorfismo
T5’ 3’
A 5’3’
Il polimorfismo puntiforme precedentemente individuato, se genomovar-specifico, permette di discriminare tra loro i vari genomovar in base al
diverso fluorocromo incorporato
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Denaturazione
T5’ 3’
A 5’3’Il polimorfismo puntiforme precedentemente
individuato, se genomovar-specifico, permette di discriminare tra loro i vari genomovar in base al
diverso fluorocromo incorporato
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Annealing
T5’ 3’
A 5’3’Il polimorfismo puntiforme precedentemente
individuato, se genomovar-specifico, permette di discriminare tra loro i vari genomovar in base al
diverso fluorocromo incorporato
![Page 32: lezione SNuPE 2](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022042518/5528fc175503467a2e8b45bf/html5/thumbnails/32.jpg)
Primer extension effettuata sul prodotto di amplificazione
T5’ 3’
T5’
A3’
Il polimorfismo puntiforme precedentemente individuato, se genomovar-specifico, permette di discriminare tra loro i vari genomovar in base al
diverso fluorocromo incorporato
![Page 33: lezione SNuPE 2](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022042518/5528fc175503467a2e8b45bf/html5/thumbnails/33.jpg)
Elettroforesi capillareElettroforesi capillareSi visualizza così un picco di colore diverso a seconda del dideossinucleotide incorporato, di posizione nota in quanto è nota la lunghezza del frammento (primer specifico + 1 ddNTP)
GATATCCGCCGGATCGGCTCGATCGCACTG Specie x
Specie zGATATCCGCCGGATAGGCTCGATCGCACTG
GATATCCGCCGGATTGGCTCGATCGCACTG Specie y
I
posizione
I
posizione
I
posizione
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Individuazione di più polimorfismiIndividuazione di più polimorfismi
0.2 0.4 0.6 10.8 1.2 1.4 1.6 2.01.8 2.42.2 Kbp
Specie 1 A C T G C
Specie 2 A G A C T
Specie 3 C A G T A
Specie 4 G T C A G
Specie 5 T A C G T
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Progettazione di un set di Progettazione di un set di primerprimer
0.2 0.4 0.6 10.8 1.2 1.4 1.6 2.01.8 2.42.2 Kbp
Specie 1 A C T G C
Specie 2 A G A C T
Specie 3 C A G T A
Specie 4 G T C A G
Specie 5 T A C G T
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Reazione Reazione SNuPE SNuPE in in MultiplexMultiplex
Specie 1
0.2 0.4 0.6 10.8 1.2 1.4 1.6 2.01.8 2.42.2 Kbp
A CGTC
AG T C G
0.2 0.4 0.6 10.8 1.2 1.4 1.6 2.01.8 2.42.2 Kbp
Specie 4
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Elettroforesi capillareElettroforesi capillareI
posizione
I
posizione
A C T G C
G T C A GTGCATSpecie
5
GACTGSpecie 4
ATGACSpecie 3
TCAGASpecie 2
CGTCASpecie 1
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Gene gyrB come marcatore molecolare
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Ricerca delle sequenze disponibili nelle banche dati
Disponibilità di una sola sequenza dell’intero gene gyrB di B. cenocepacia, ceppo J2315
Score EAllineamento significativo prodotto dalla sequenza: (bits) Value
gi|52208053|emb|BX571965.1| Burkholderia pseudomallei strai... 2252 0.0 gi|52426793|gb|CP000010.1| Burkholderia mallei ATCC 23344 c... 2228 0.0 gi|19909532|dbj|AB014891.1| Burkholderia cepacia gyrB gene ... 1848 0.0 gi|19909684|dbj|AB014967.1| Burkholderia cepacia gyrB gene ... 1509 0.0 gi|19909686|dbj|AB014968.1| Burkholderia cepacia gyrB gene ... 1495 0.0
![Page 40: lezione SNuPE 2](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022042518/5528fc175503467a2e8b45bf/html5/thumbnails/40.jpg)
Progettazione dei Progettazione dei primerprimer per l’amplificazione per l’amplificazione del gene del gene gyrBgyrB
3 sequenze di B. cepacia prese da banche dati
25 sequenze di altri Proteobatteri quali Bordetella, E.coli, Neisseria, Nitrosomonas, Ralstonia, Salmonella, Xanthomonas
+
Dall’analisi del multiallineamento di queste sequenze sono state individuate le regioni conservate del gene
gyrB
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Primer per l’amplificazione del gene gyrB
E’ STATO COSI’ POSSIBILE DISEGNARE UN SET DI 10 PRIMER.
FORWARD• gyr1
• PC2
• PC3
• PC4
REVERSE• PC5r
• PC6r
• PC7r
• PC8r
• PC9r
• PC10r
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TEST DEI PRIMERTEST DEI PRIMER
2 4 5r7r
8r
10r
0.2 0.4 0.6 10.8 1.2 1.4 1.6 2.01.8 2.42.2
1 3 6r
9r
Kbp
gyrB
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TEST DEI PRIMERTEST DEI PRIMERCeppo LMG 16654, B. cenocepacia III-B
PC5r PC6r PC8r PC9r
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 M = Marker
1,5,9,13 = gyr1
2,6,10,14 = PC2
3,7,11,15 = PC3
4,8,12,16 = PC4
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TEST DEI PRIMERTEST DEI PRIMER
2 4 5r7r
8r
10r
0.2 0.4 0.6 10.8 1.2 1.4 1.6 2.01.8 2.42.2
1 3 6r
9r
Kbp
1-5 +1-6 +
3-9 +
4-92-9
1-9 +
++
1-10 _
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Coppia di primer gyr1-PC9r
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
7) Mi 5 gvr IV
8) TVV75 gvr V
9) LMG 18941 gvr VI
10) MCI 7 gvr VII
11) LMG 16670 gvr VIII
12) ATCC15958 gvr IX
1) LMG 1222 gvr I
2) LMG 18822 gvr II
3) LMG 16656 gvr III-A
4) LMG 16654 gvr III-B
5) LMG 19230 gvr III-C
6) So1 gvr III-D
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OTTENIMENTO SEQUENZEOTTENIMENTO SEQUENZE
Abbiamo ottenuto 69 SEQUENZE del gene gyrB, della lunghezza di circa
1850bp
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4FC + 2A6B. pyrrocinia2 A2B. anthina
1 FC +1 A2B. ambifaria2 FC2B. dolosa
1 FC + 2 A3B. vietnamiensis3 FC3B. stabilis8 FC8B. cenocepacia III-D
2 A2B. cenocepacia III-C
15 FC +2 A17B. cenocepacia III-B
6 FC6B. cenocepacia III-A
10 FC +1 A11B. multivorans4 FC + 2 A6B. cepacia
OrigineSequenze prodotte
Genomovar
LEGENDA:
FC = fibrosi cistica
A = ambientale
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Analisi delle sequenze Analisi delle sequenze nucleotidiche nucleotidiche del gene del gene gyrBgyrB
gvrI 757 TTGGAAGAGTTCCTGCTTGAAACGCCGATCGACGCGAAGATTATTTGCGGGAAGATTGTT 816 gvrII 668 CTCGAGGAGTTCCTCCTCGAAACGCCGAACGACGCGAAGATCATCTGCGGGAAGATCGTC 727 gvrIII-A 767 CTCGAAGAGTTCCTGCTCGAAACGCCGATCGACGCGAAGATCATCTGCGGGAAGATCGTT 826 gvrIII-B 658 CTGGAAGAGTTCCTGCTCGAAACGCCGATCGACGCGAAGATCATCTGCGGGAAGATCGTC 717 gvrIII-C 751 CTGGAAGAGTTCCTGCTCGAGACGCCTATCGACGCAAAGATCATTTGCGGGAAGATCGTC 810 gvrIII-D 676 CTGGAAGAGTTCCTGCTGGAGACGCCGATCGACGCGAAGATCATCTGCGGGAAGATCGTT 735 gvrIV 650 CTGGAAGAGTTCCTGCTCGAAACGCCGATCGACGCGAAGATCATCTGCGGGAAGATTGTT 709 gvrV 760 CTCGAAGAATTCCTGCTCGAAACGCCGACCGACGCGAAGATCATCTGCGGGAAGATCGTC 819 gvrVI 748 CTCGAGGAGTTCCTGCTGGAAACGCCGATCGACGCGAAGATCATCTGCGGGAAGATCGTC 807 gvrVII 763 CTGGAAGAGTTCCTGCTCGAAACGCCGCTCGATGCGAAGATCATCTGCGGGAAGATCGTC 822 gvrVIII 788 CTGGAAGAGTTCCTTTTGGAAACGCCGATCGACGCGAAGATCATCTGCGGGAAGATCGTT 847 gvrIX 761 CTGGAAGAGTTCCTGCTGGAAACGCCGCTCGACGCGAAGATCATCTGCGGGAAGATCGTC 820
Polimorfismo puntiforme genomovar specifico
Sono stati individuati più di 400 SNPs e di questi ne sono stati selezionati sei
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Localizzazione dei Localizzazione dei SNPsSNPs scelti nella scelti nella sequenza del gene sequenza del gene gyrBgyrB
gyrBPosizione
Nomegyr1 PC6r PC9r
900508 989 1028 1068 1168
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Profili Profili SNuPE SNuPE attesiattesi
gyrBPosizione
Nomegyr1 PC6r PC9r
900508 989 1028 1068 1168
GvrI G C G A C GGrvII G A A T C G GvrIIIa G A G A C GGvrIIIb G C G A C GGvrIIIc G T G A C GGvrIIId G A A A C GGvrIV A C G A C GGvrV G C G G C GGvrVI G C A T C GGvrVII G C A A C GGvrVIII G C G A T GGvrIX G C A A C C
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Set di Set di primer primer per per SNuPESNuPE
Nome
Sequenza 5’-3’ Taglia (basi)
LF 1 TTGTCCTT(G/C)GT(T/C)TGCGAGCT 20 LF2 TTTTA(C/T)CGCGGCGTCGCGCAGGATCGCGTG 30 LF2(gvr6) TTTTATCGCGGCGTCGCGCAGAATCGGATT 30 LF 3 (11T)ACCTTCACGGA(G/C)AGCACGCACGACA 36 LF 4 (6T)CGACGATCTTCCCGCA(A/G)ATGATCTTCGCGTCG 38 LF 5 (12T)CGTGCTGTGCTTCACGAACAACATTCCGCAGCG 45 LF 6 (13T)ACAAGTACATC(A/G)CCGA(T/C)AACGAAATCGCGAA
GAAGGC 50
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SNuPE SNuPE (simplex) (simplex) primer primer LF2LF2
Ceppo TVV75, gvr V Ceppo LMG16654, gvr III-B
NeroNeroC
Risultato ottenuto
Risultato atteso
Nucleotide incorporato
NeroNeroC
Risultato ottenuto
Risultato atteso
Nucleotide incorporato
![Page 53: lezione SNuPE 2](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022042518/5528fc175503467a2e8b45bf/html5/thumbnails/53.jpg)
SNuPE SNuPE (simplex) (simplex) primerprimer LF4LF4
Ceppo TVV75, gvr V Ceppo LMG16654, gvr III-B
BluBluG
Risultato ottenuto
Risultato atteso
Nucleotide incorporato
VerdeVerdeA
Risultato ottenuto
Risultato atteso
Nucleotide incorporato
![Page 54: lezione SNuPE 2](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022042518/5528fc175503467a2e8b45bf/html5/thumbnails/54.jpg)
SNuPESNuPE ((MultiplexMultiplex))
LMG 1222 B-N-B-V-N-BB-N-B-V-N-BG-C-G-A-C-GMultiplexI
Risultato ottenutoRisultato attesoNucleotide incorporatoPrimergvrCeppo
![Page 55: lezione SNuPE 2](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022042518/5528fc175503467a2e8b45bf/html5/thumbnails/55.jpg)
SNuPESNuPE ((MultiplexMultiplex))
LMG16656 B-V-B-V-N-BB-V-B-V-N-BG-A-G-A-C-GMultiplexIII-A
Risultato ottenutoRisultato attesoNucleotide incorporatoPrimergvrCeppo
![Page 56: lezione SNuPE 2](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022042518/5528fc175503467a2e8b45bf/html5/thumbnails/56.jpg)
SNuPESNuPE ((MultiplexMultiplex))
LMG16654 B-N-B-V-N-BB-N-B-V-N-BG-C-G-A-C-GMultiplexIII-B
Risultato ottenutoRisultato attesoNucleotide incorporatoPrimergvrCeppo
![Page 57: lezione SNuPE 2](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022042518/5528fc175503467a2e8b45bf/html5/thumbnails/57.jpg)
SNuPESNuPE ((MultiplexMultiplex))
So1 B-V-V-V-N-BB-V-V-V-N-BG-A-A-A-C-GMultiplexIII-D
Risultato ottenutoRisultato attesoNucleotide incorporatoPrimergvrCeppo
![Page 58: lezione SNuPE 2](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022042518/5528fc175503467a2e8b45bf/html5/thumbnails/58.jpg)
SNuPESNuPE ((MultiplexMultiplex))
LMG18942 B-N-V-R-N-BB-N-V-R-N-BG-C-A-T-C-GMultiplexVI
Risultato ottenutoRisultato attesoNucleotide incorporatoPrimergvrCeppo
![Page 59: lezione SNuPE 2](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022042518/5528fc175503467a2e8b45bf/html5/thumbnails/59.jpg)
SNuPESNuPE ((MultiplexMultiplex))
LMG19467 B-N-V-V-N-BB-N-V-V-N-BG-C-A-A-C-GMultiplexVII
Risultato ottenutoRisultato attesoNucleotide incorporatoPrimergvrCeppo
![Page 60: lezione SNuPE 2](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022042518/5528fc175503467a2e8b45bf/html5/thumbnails/60.jpg)
ConclusioniConclusioni
I risultati ottenuti corrispondono a quelli attesi
Picchi inequivocabili, assenza di rumore di fondo
Applicabilità alla routine clinica
Ceppo LMG18942, gvr VI