lezioni 17&18-11-11
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ALEXIS CARREL (inizio anni ‘60):
Le cellule sono entità immortali; la loro morte è un evento
patologico legato a grossolane perturbazioni dell’omeostasi.
LEONARD HAYFLICK:
Le cellule invecchiano e muoiono fisiologicamente.
J. KERR (’65):
Descrisse un nuovo tipo di morte cellulare con caratteristiche
diverse da quelle della necrosi, che definì con il termine
APOPTOSI (dal greco: caduta delle foglie dagli alberi o dei
petali dai fiori).
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NECROSI es. ischemia /ipossia
• Riduzione fosforilazione ossidativa
• Riduzione attività pompa sodica di membrana ATP-dipendente
• Rigonfiamento cellulare
• Metabolismo cellulare energetico alterato e riduzione
del pH intracellulare
• Esaurimento dei depositi di glicogeno
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NECROSI es. ischemia /ipossia
Aumento della concentrazione intracellulare di Calcio
Attivazione di enzimi quali, fosfolipasi, proteasi,endonucleasi, con conseguente diminuzione di fofolipidi,distruzione delle proteine, danno alla cromatina
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CARIOLISI CARIORESSI
Differenze tra necrosi e apoptosi
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Fasi dell’apoptosi:
1. Disgregazione del nucleolo
2. Taglio lamina
3. Condensazione e taglio della cromatina in frammenti di
180-200 paia di basi
4. Migrazione dei granuli compatti di cromatina
degradata verso la periferia del nucleo e verso lamembrana plasmatica dove vengono circondati da
evaginazioni della membrana che conferiscono alla
cellula un aspetto a bolla (blebbing)
5. Le blebs si staccano dal corpo cellulare trascinando consé citoplama e materiale cellulare-corpi apoptotici-
fagocitosi
Durata del processo: 1-2 hr
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APOPTOSI
E’ un processo fisiologico di eliminazione dellecellule danneggiate, invecchiate, potenzialmentedannose per l’architettura dell’intero tessuto-organo o cellule non più utili all’organismo.
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Le cellule degli organismi pluricellulari non esprimono
tutti i geni in loro possesso, ma attivano di volta in volta“pacchetti di geni specifici”, cui corrispondono specifici“programmi cellulari”: la morte per apoptosi rappresentauno di questi programmi, alla pari del differenziamento edella divisione cellulare e comporta, come gli altri
programmi, una complessa rete di segnalazione inter-cellulare e un processo decisionale interno alla cellulastessa, nel quale vengono soppesate le varie opzionipresentate dai segnali che giungono alla cellula.
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L’apoptosi è molto importante nell’:
EMBRIOGENESI
INVOLUZIONE ORMONO-DIPENDENTE
OMEOSTASI CELLULARE
IMMUNITA’ CELLULO-MEDIATA
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INVOLUZIONE ORMONO-DIPENDENTE
• distruzione cellule endometriali durante il ciclo mestruale
•Atresia dei follicoli ovarici nella menopausa
•Regressione della mammella dopo lo svezzamento
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IL PROGRAMMA APOPTOTICO
SI AVVALE DI MOLECOLESPECIFICHE, I CUI GENI SONO
ALTAMENTE CONSERVATI
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The model organism
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S. Brenner riuscì ad indurre mutazioni di specifici geni
del genoma di C.elegans utilizzando EMS (etil metano
sulfonato). Mutazioni a geni diversi determinavano effetti
specifici sullo sviluppo degli organi. La combinazione
dell’analisi genetica e l’osservazione delle divisioni
cellulari al microscopio pose le basi alle scoperte
successive.
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Mapping the cell lineage
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Identification of “death genes”
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ced - 3ced - 4
ced - 9
Pro- apoptotici
Anti-apoptotici
(ced Caenorabdis elegans death)
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Brenner, Sulston, Horvitz
Nobel per la Fisiologia e Medicina 2002
Hanno dimostrato che lo sviluppo degli organi e lamorte cellulare programmata sono regolatigeneticamente. Essi hanno identificato i geni chiave cheregolano la morte cellulare programmata in C.elegans edimostrarono che i geni corrispondenti esistono anchenegli animali superiori, incluso l’uomo. Come quasi sempre accade, l’evoluzione ha però complicato il meccanismo a mano a mano che si saliva verso
organismi più complessi, sostituendo a un gene prototipo tutta una famiglia di geni con proprietà simili ma non del tutto sovrapponibili.
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LE 3 FASI DELL’APOPTOSI:
Induzione
Esecuzione
Riconoscimento e Fagocitosi
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La cellula riceve di continuo informazioni (cross talk ),segnali e stimoli che ne condizionano la sopravvivenza.
Segnali di sopravvivenza e segnali di morte vengonointegrati all’interno della cellula.
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I diversi stimoli che sopraggiungono alla cellulasembrano seguire 2 distinte vie di segnalazione:
una attivata da “segnali di morte” che giungono aspecifici recettori di superficie (VIA RECETTORIALE)
una attivata da “segnali endogeni” e regolata dalmitocondrio (VIA MITOCONDRIALE)
Entrambe le vie convergono nell’attivazione di proteasispecifiche dette CASPASI. Questo evento segna l’inizio della fase di esecuzione . L’attivazione delle caspasi è
determinato da un evento proteolitico e determina a suavolta un’ulteriore cascata di eventi proteolitici enucleolitici preordinati, che amplificano il segnale eportano alle tipiche modificazioni morfologichedell’apoptosi. Tale fase richiede ATP.
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APOPTOSOMA, Complesso di origine mitocondrialecomprende:
un adattatore (APAF-1) una pro-caspasi iniziatrice (pro-caspasi 9)
Una molecola di citocromo C
Una molecola di ATP
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Fas, ora classificato come CD95,è
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DED
, ,una proteina di superficieappartenente alla superfamiglia deirecettori del TNF-NGF
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Fas, ora classificato come CD95,è
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DED
una proteina di superficieappartenente alla superfamiglia deirecettori del TNF-NGF
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INDUZIONE
Ligando-Recettore-Adattatore-Procaspasi-Caspasi
ESECUZIONE
Caspasi (proteasi):
Taglio del DNA
Taglio proteine strutturali del nucleo
Taglio proteine del citoscheletro
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Prima però che le caspasi effettrici entrino in azione,rendendo irreversibile il cammino verso la mortecellulare, deve essere completata la fase di induzione,durante la quale vengono soppesati i segnali chegiungono alla cellula. Infatti, una cellula riceve segnali dimorte (per via recettoriale o endogeni), ma nel frattempopuò ricevere segnali di sopravvivenza veicolati da fattoridi crescita, da citochine o da integrine e molecole diadesione.
3 MODULATORI
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Mammiferi
(anti-apoptotici) Bcl-2, BclxL
(pro-apototico) Bax, Bad, Bak
Nel particolare “gioco a scacchi” che si gioca nella cellula (tra fattoripro- e anti-apoptotici), le due vie opposte schierano i propri “pezzi” sulla membrana esterna del mitocondrio. Alla fine, vinceranno i più
numerosi: la preponderanza di modulatori anti-apoptotici , manterràintegra la membrana mitocondriale, mentre la preponderanza dimodulatori pro-apoptotici determinerà nel mitocondrio l’apertura dimegapori, che causeranno la caduta del potenziale mitocondriale e lafuoriuscita di sostanze pro-apoptotiche.
3. MODULATORI
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bcl-2 ced-9
E’ stato il primo gene dell’apoptosi ad
essere studiato nell’uomo, isolato da
una leucemia di tipo B
(B Cell Leukemia-2)
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4. EFFETTORI
I complessi che si formano a livello dei domini recettoriali (e gliapoptosomi) operano dei tagli nelle pro-caspasi iniziatrici , che in tal modo si
attivano. Si tratta di enzimi proteolitici (proteasi) il cui centro reattivo ècaratterizzato da una Cisteina e che tagliano i loro bersagli a valle di unabreve sequenza di quattro aa, l’ultimo dei quali è un residuo di acido Aspartico .
I due spezzoni della molecola si uniscono a formare un dimero; le caspasi
iniziatrici formano tetrameri (due molecole di caspasi, ciascuna costituitada due spezzoni) dopo aver perso una porzione regolatrice. Tipicamente, lecaspasi iniziatrici (2,8,9,10) attivano le caspasi effettrici (3,6,7), ma possonoanche essere attivate da queste ultime (amplificazione del segnale).
Non tutte le caspasi sono coinvolte nell’apoptosi; alcune svolgono altricompiti, come la caspasi 1 che regola l’attività dell’interleuchina 1β (una
citochina proinfiammatoria).
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VIA DI SEGNALAZIONE RECETTORIALE
VIA DI SEGNALAZIONE MITOCONDRIALE
La fase di esecuzione sembra essere comune a tutte oquasi le vie d’innesco. A differenza del C. elegans , in cuiè presente la singola caspasi CED3, nell’uomo sono
state identificate almeno 10 di tali proteine.
U d i iù i t ti b li d ll i ff tt i i è ICAD
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Uno dei più importanti bersagli delle caspasi effettrici è ICAD,l’inibitore di CAD (Caspase Activated Dnase), un’endonuclesi specifica dell’apoptosi. Una volta liberatasi dall’inibitore grazieall’azione delle caspasi, CAD effettua tagli al doppio filamento nella
regione internucleosomica della cromatina, rendendosi cosìresponsabile della frammentazione del DNA, tipica dell’apoptosi.(Altre due nucleasi sono attive nell’apoptosi: ENDO G e AIF , chefuoriescono dal mitocondrio insieme agli altri fattori pro-apototici).
Il taglio proteolitico effettuato dalle caspasi attiva alcune molecole
e ne inattiva altre: il fine è quello di portare alla frammentazione dellacellula mantenendone integra la membrana plasmatica. Verrannoquindi inattivate le molecole coinvolte nella riparazione del DNA (es.PARP ), mentre vengono attivate acinus (responsabile dellacondensazione della cromatina) e la trans-glutaminasi , una molecola
che rende più resistente la membrana cellulare.
5 INIBITORI (IAP)
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• Le caspasi non devono assolutamente attivarsi per eventi casuali, per cuisono di norma complessate con inibitori naturali, endogeni, che devonoessere rimossi.
• cytokine response modifier A (CrmA) protein inibisce la caspasi 8 e dunqueprotegge le cellule dall’apoptosi attivata da CD95 o dal recettore di TNF
• cellular FLICE-inhibitory protein (c-FLIP) è capace di modulare l’attivazione della pro-caspasi 8 e dunque previene l’apoptosi mediata dai “recettori dimorte”
• Heat Shock Proteins (HSP) proteggono la cellula dall’apoptosi, legando
molecole come il citocromo c, l’APAF-1 o le caspasi.
5. INIBITORI (IAP)
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Smac/Diablo inattivano gli
inibitori delle caspasi
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6. INDUTTORI
Appartengono alla categoria degli INDUTTORI un insiemeeterogeneo di molecole, in grado di indurre apoptosi attraverso la via
mitocondriale, determinando uno sbilanciamento tra modulatori anti-e pro-apoptotici a favore dei secondi.
reaper, hid e grim di Drosophila , sono induttori che si attivano inbase a un “orologio interno”, ancora sconosciuto. Sembrano attivare
il rilascio del citocromo c dal mitocondrio
p53 , si attiva quando la cellula non riesce a compiere correttamentele tappe del ciclo cellulare a causa di danni al DNA. Se il dannopersiste, p53 induce la sintesi di un modulatore pro-apoptotico, bax ,che si localizza sulla membrana mitocondriale e favorisce l’apertura dei megacanali.
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Meccanismi di riconoscimento delle cellule apoptotiche da parte dei macrofagi.
Recettore delle asialoglicoproteine: sulle membrane di alcuni tipi cellulari (es. epatociti) durante il processo apoptotico vengonoesposti alti livelli di glicoproteine desialilate che vengono riconosciute dalle cellule circostanti mediante il recettore delleasialoglicoproteine
Recettore della vitronectina (VnR)/CD36: é il sistema più complesso e meglio caratterizzato, utilizzato dai macrofagi derivati daimonociti. Al sistema di riconoscimento partecipano tre molecole: i) Trombospondina : molecola trimerica, adesiva, prodotta e secretadal macrofago, che funziona da "ponte molecolare" tra corpo apoptotico e complesso VnR/CD36; ii) VnR : presente sulle membranedel macrofago, é un eterodimero che appartiene alla famiglia delle integrine, molecole di membrana implicate nelle funzioni diadesione e ancoraggio cellulare; iii) CD36 : molecola di superficie, tipicamente espressa dai monociti, dai macrofagi e dalle piastrine,la cui funzione fisiologica non é ancora ben determinata. Non é ancora stata identificata la molecola riconosciuta sul corpo apoptoticoda parte di questo complesso recettoriale.
Recettore della fosfatidilserina (PS): normalmente i residui di PS sono situati sulla faccia citoplasmatica della membrana; nelle
cellule apoptotiche l'asimmetria del foglietto lipidico viene persa in seguito all'attivazione di un enzima specifico (" scramblase ") chetrasloca i residui di PS sulla faccia esterna della membrana.
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ALCUNE TECNICHE DI STUDIO DELL’APOPTOSI
Microscopia Elettronica
Microscopia Ottica a fluorescenza
Elettroforesi del DNA
TUNEL
KO dei geni dell’apoptosi
LEUCEMIA LINFOCITICA
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CARIORESSI
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AUTOFAGIA o morte cellulare di tipo II
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AUTOFAGIA o morte cellulare di tipo II
Il termine “autofagia” o “autofagocitosi” deriva dal grecoe significa letteralmente “mangiare se stessi”. E’ un
processo di auto-degradazione lisosoma-mediato.
E’ considerata una risposta cellulare allo stress e viene
attivata principalmente in due condizioni:
• quando è necessario rimuovere componenti intracellularialterate• quando occorrono macromolecole essenziali e fonti dienergia in carenza di elementi nutrizionali (stress da fame)
Esistono tre tipi di autofagia: macrofagia, microfagia eautofagia chaperone-mediata.
M f i l i lt d d i
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Macrofagia: un organulo viene avvolto da una doppiamembrana di derivazione del RE
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Nella microfagia il lisosoma ingloba direttamente le regionicitoplasmatiche da degradare attraverso un complesso sistemadi invaginazioni ed evaginazioni tubuliformi della propriamembrana.
Nell’autofagia mediata da chaperonine , proteine-bersaglio
citosoliche recanti una specifica sequenza pentapeptidicavengono riconosciute e legate da una“chaperonina”
citosolica, che le trasporta sulla membrana dei lisosomi
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oltre 30 geni ATG sono stati trovati nel lievito e molti di lorosono ortologhi nei mammiferi per controllare i processidinamici di autofagia
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l 30 i ATG i i l li i l i di l
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oltre 30 geni ATG sono stati trovati nel lievito e molti di lorosono ortologhi nei mammiferi per controllare i processidinamici di autofagia quali:
(i) induzione o inizio, regolata negativamente da mTOR(bersaglio della rapamicina mammiferi);
(ii) nucleazione (formazione dell’autofagosoma), che èmediata dal complesso Beclin-1 (Atg-6) e Vps34(PI3K)
(iii) allungamento, che è un passo fondamentale nelformare il autofagosoma controllato da due sistemi diconiugazione(Atg12-Atg5 e LC3/Atg8)
(iv) la maturazione, che prevede la fusione tra
autofagosoma e lisosoma e degradazione del contenuto.
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In Dictyostelium discoideum , un’ameba difettiva del
macchinario apoptotico. In questo modello, l’autofagia è
stata convincentemente dimostrata come meccanismo dimorte cellulare in quanto una mutazione del gene ATG 1diminuisce l’autofagia e la morte cellulare per autofagia.
In Drosophila melanogaster è stato dimostrato che la morte
cellulare è tessuto-specifica: es. durante lo svilupponell’intestino si ha la morte cellulare per autofagia,mentre nelle cellule salivari per apoptosi
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Nei mammiferi non c’è una chiara evidenza di morte cellulare per
autofagia in condizioni fisiologiche
In condizioni patologiche come ipossia/ischemia è stata osservatamorte cellulare per autofagia nel cervello di topi neonati ed adulti.
La mancanza di ATG 7 nel SNC dei topi previene la morte neuronaleindotta da ipossia/ischemia
Nei topi atg Knowckout si osserva un aumento di morte cellulare perapoptosi allo stadio embrionali suggerendo una funzione anti-apoptotica per l’autofagia
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Nel riquadro in alto a sinistra si osserva una cellula sana,completamente distesa (il citoplasma è colorato in verde)con il nucleo circolare (in giallo). La cellula apoptotica(freccia bianca), al contrario si presenta piccola con
vescicole che emergono dai bordi. Il nucleo inoltre èdisomogeneo e frammentato in diversi corpuscoli (inarancione). Nel riquadro in basso invece sono rappresentatecellule in cui, in verde, è marcata la proteina autofagica LC3.Nella cellula sana (a destra) la proteina si presenta dispersain maniera omogenea nel citoplasma, nella cellula di sinistrainvece il processo autofagico è evidenziato dalla presenzadi vescicole la cui formazione è permessa proprio dallaproteina LC3.
APOPTOSI AUTOFAGIA
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APOPTOSI AUTOFAGIA
Rapido collasso degli elementi delcitoscheletro Preservazione del citoscheletrofino alla fase finale
Preservazione degli organelli finoalla fase finale
Rapida eliminazione degli organelli
Assenza di infiammazionetissutale
Assenza di infiammazionetissutale
Attivazione della caspasinecessaria
DNA frammentazione e attivazionecaspasica solo nella fase ultimadel processo
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Morte cellulare per necrosi (A) e apoptosi (B e C). La cellula in figura C è stata fagocitata da una cellula vicina
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