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Reducción del recuento de bacterias en la leche cruda Una guía de las oportunidades que le brinda la citometría de flujo

Libro electrónico

Junio de 2017

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PrólogoDurante décadas, una tecnología analítica llamada citome-tría de flujo ha jugado un papel fundamental a la hora de mejorar la calidad higiénica de la leche cruda y, hoy en día, su importancia no hace sino crecer. En concreto, los nuevos desarrollos con la tecnología están abriendo caminos para más pruebas higiénicas in situ cuando se recibe la leche cru-da en la industria láctea o incluso en la granja.

Con la perspectiva de disfrutar de más pruebas rápidas a lo largo de la cadena de suministro, los días de las muestras con una calidad higiénica mala con numerosos cientos de miles de bacterias por ml podrían estar, literalmente, con-tados.

En este libro electrónico, pretendemos ponerle al día de los desarrollos de la citometría de flujo con artículos, una información técnica fácil de seguir y entrevistas en vídeo.

Esperamos que lo encuentre útil para el esfuerzo continuo que se está llevando a cabo en toda la industria por reducir los niveles de bacterias en la leche cruda.

FOSS

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Artículo: Derrota de las bacterias en la leche 4

La ventaja que supone la citometría de flujo 6

El interior de un instrumento de citometría de flujo 7

Pruebas del recuento de bacterias de gran volumen en el laboratorio 8

Recuento de bacterias con pulsar un botón en la industria láctea 9

Qué debe buscar en una solución de citometría de flujo 11

Soluciones de citometría de flujo de FOSS 13

Índice

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Artículo:

Derrota de las bacterias en la lecheLa última batalla ganada en la lucha constante por reducir el recuento de las bacterias en la leche cruda lo constituye una nueva aprobación oficial para el análisis del recuento de bacterias en la leche cruda con la citometría de flujo.

A pesar de que una muestra de leche cruda hoy tiene exactamente el mismo aspecto que tenía hace 50 años, el recuento de bacterias con casi total seguridad será mucho más bajo.

Esto son buenas noticias para los consumidores y los productores lácteos, ya que la calidad bacteorológica de la leche es un parámetro importante para los procedimientos de tratamiento térmico, la predicción de la vida útil y la determinación de la adecuación de la leche cruda para el procesamiento de distintos productos.

Durante décadas, los niveles medios de bacterias en la leche cruda han ido bajando progresivamente en todo el mundo, desde cientos de miles de Unidades Formadoras de Colonias (UFC) por mililitro en la década de los 70 a menos de 10 000 UFC por mililitro hoy en día. En muchos países, los productores consiguen, de manera sistemática, 5000 ufc/ml en sus entregas de lecha cruda.

Los instrumentos de citometría de flujo dieron sus primeros pasos en la década de los 80 y ahora el método está aprobado por la EUR-RL en Europa y la NCIMS/FDA en EE. UU.

Sin embargo, la batalla para reducir los niveles de bacterias sigue en marcha, con el análisis rápido del recuento de bacterias que emplea la tecnología de citometría de flujo ocupando una prominente primera línea.

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La importancia de las pruebas de citometría de flujoLos métodos de citometría de flujo se aplicaron por vez primera al análisis de la leche cruda a principio de la década de los 80 como una forma de automatizar y acelerar el proceso analítico tradicional.

El método tradicional proporciona una indicación de la calidad a partir de las Unidades Formadoras de Colonias, mientras que la citometría de flujo ofrece la misma indicación, pero se basa en el número de bacterias individuales ofrecido en menos de 10 minutos, en comparación con los dos o tres días que se tarda con el recuento de la concentración de gérmenes.

Los resultados rápidos han resultado ser importantes, ya que detectar incumplimientos en la higiene de la leche cruda en una fase temprana es algo fundamental para minimizar el impacto en la calidad de la leche cruda. Aunque la pasteurización matará la mayoría de las bacterias, sus metabolitos pueden provocar olores y las enzimas continúan sus actividades, lo que desemboca en defectos en el producto y en la reducción de la vida útil. Con una información más rápida, los ganaderos pueden conocer posibles problemas, permitiendo así la corrección a tiempo de fugas, limpieza o refrigeración insuficientes en el sistema de ordeño, o problemas de salud en el ganado.

Mayor aceptaciónNo resulta sorprendente que la citometría de flujo haya atraído el interés entre los laboratorios analíticos de la leche como un método rápido para calcular el recuento de bacterias, sobre todo porque cada vez son más los países más estrictos en cuanto a la calidad de la leche y cada vez han sido más las normativas nacionales, cada vez más exigentes, en materia de calidad higiénica que han entrado en vigor.

Sin embargo, las aprobaciones oficiales han ido más lentas. Podríamos pensar que algo que acelerase el análisis de las bacterias se adoptaría de forma rápida. Pero la aceptación y la aprobación es un proceso complicado y lleva en marcha durante unos 35 años.

Son varias las entidades industriales y gubernamentales implicadas, pero mucha gente necesita estar convencida de la naturaleza compleja del recuento bacteriano total de los parámetros. En concreto, la necesidad de correlacionar el método de citometría de flujo, basado en el recuento de las bacterias individuales, con el método tradicional, basado en el recuento de las Unidades Formadoras de Colonias, ha provocado muchos debates cuyos ecos siguen presentes todavía hoy.

A pesar del debate continuado, la citometría de flujo se ha convertido en el estándar industrial para el recuento de las bacterias en la leche cruda en muchos países de todo el mundo, por ejemplo, el instrumento de FOSS BactoScanTM FC+ ha conseguido la aprobación de los Laboratorios de referencia comunitarios (EU-RL) y del NCIMS/FDA en EE. UU. y, hoy en día, más del 90 % de toda la leche que hay en la UE se paga de acuerdo con los resultados del BactoScan.

Un desarrollo adicional es el uso de la citometría de flujo en instrumentos compactos para su uso en la industria láctea con el fin de comprobar la calidad higiénica de las entregas, lo cual ha supuesto el inicio de un nuevo capítulo en la batalla contra las bacterias en la leche cruda. Lea más en la página 9.

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La ventaja de la citometría de flujoAl tardar tan solo unos minutos por prueba, la citometría de flujo es mucho más rápida que el método tradicional de concentración de gérmenes que precisa de dos a tres días para generar un resultado.

Esta disponibilidad de datos analíticos es importante para la productividad de la industria láctea y el posterior uso de la leche en los pasos que vienen después en la cadena de suministro. Por ejemplo, el recuento rápido de bacterias permite detectar rápidamente los problemas higiénicos en la granja y actuar para preservar la calidad de la leche entregada a la industria láctea.

La leche con una alta carga bacteriana es una materia prima poco deseable para la producción láctea, en especial para productos tales como la mantequilla. Aunque la pasteurización mata la mayoría de las bacterias, sus metabolitos pueden provocar olores y las enzimas continúan sus actividades, lo que desemboca en defectos en el producto y en la reducción de la vida útil. Por lo tanto, la mayoría de los sistemas de pago de la leche califican la leche en función del nivel de bacterias.

Con el recuento rápido de las bacterias, los ganaderos pueden conocer posibles incumplimientos de la higiene, permitiéndoles así la corrección de fugas, limpieza o refrigeración insuficientes en el sistema de ordeño, o problemas de salud en el ganado.

La citometría de flujo también es muy sistemática. El método tradicional del recuento de la concentración de gérmenes está sujeto a variables de una prueba a otra, como la preparación de la muestra con una placa de Petri, el tiempo del período de incubación y un recuento a ojo. En comparación, la citometría de flujo es una prueba automática realizada con una máquina que cuenta con precisión, repetibilidad y reproducibilidad. Puede analizar muestras de leche cruda directamente sin calentamiento ni dilución previos, lo que podría afectar a la precisión.

Precisión superior a través del recuento individual de las bacterias

Puesto que el método de citometría de flujo cuenta todas las bacterias como células individuales y no clústeres, ofrece un rendimiento alto y uniforme, además de la reproducibilidad de los resultados. Al contrario de lo que ocurre con el método del recuento de la concentración de gérmenes, los resultados no se ven afectados por el operario y las muestras de leche cruda se pueden analizar directamente sin calentamiento ni dilución previos, lo que puede afectar a la precisión.

Precisión: Normalmente Sy,x < 0,25 unidades logarítmicas en todo el rango de medición.

Método de referencia: Concentración de gérmenes estándar (Norma IDF 100B: 1991).

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El interior de un instrumento de citometría de flujo La citometría de flujo fluorescente se utiliza para analizar las características físicas y químicas de las partículas en un fluido cuando pasa a través de una luz láser. En el contexto del análisis alimentario y agrario, proporciona un análisis rápido del recuento de bacterias y células somáticas en las muestras de leche.

Se utiliza un sistema de jeringuilla para pasar las células a través de una celda de flujo una a una, donde se exponen a un haz de luz procedente de una fuente láser

Método del recuento de bacteriasEl recuento de bacterias precisa un paso inicial de incubación para tintar las bacterias y descomponer todas las partículas, excepto las células que hay que contar.

1. Durante la incubación, las células se tin-tan con un medio de tinción específico del ADN, un tinte fluorescente.

2. Se utiliza un sistema de jeringuilla preci-so para pasarlas a través de una celda de flujo una a una, donde se exponen a un haz de luz procedente de una fuente láser.

3. El láser estimula la fluorescencia del tinte y las células tintadas emiten un pulso de luz por cada célula que pasa por el haz.

4. Un detector altamente sensible, que emi-te impulsos electrónicos, detecta la luz fluorescente.

5. Se cuentan los pulsos y se muestran en un diagrama de análisis de altura de pul-sos (PHA) en la pantalla del instrumento.

El recuento de las bacterias tarda nueve minutos y medio, incluido el elemento de incubación.

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Pruebas de gran volumen en el laboratorio Entremos en unas instalaciones modernas de análisis de leche cruda.

Por todo el laboratorio, cintas transportadoras llevan las muestras de leche hasta y desde los instrumentos analíticos con filas de viales de plástico alineados como soldados en un desfile, marchando a la perfección hacia los analizadores que están a la espera. La identificación por radiofrecuencia (RFID) hace un rastreo de las muestras a través de la identificación inteligente de las muestras basándose en chips programados que contienen todos los datos relevantes de las muestras acoplados en la parte inferior del vial de las muestras. Hoy en día, la citometría de flujo la utilizan los laboratorios de análisis de leche cruda de todo el mundo para realizar miles de pruebas del recuento de bacterias al día en las muestras recogidas en las centrales lecheras. Pero si una sola prueba tarda nueve minutos, ¿cómo puede ser?

La clave está en gestionar el tedioso paso de la incubación de forma inteligente con múltiples instalaciones de incubación para manejar varias muestras a la vez. Pero las demandas no terminan ahí. La manipulación, el análisis y el rastreo de miles de muestras también se tienen que realizar de forma efectiva y, con frecuencia, el análisis del recuento bacteriano se tiene que combinar con otras pruebas, como un conjunto de pruebas de la calidad de la leche realizadas por otros instrumentos infrarrojos en el laboratorio.

Por lo tanto, los instrumentos modernos de citometría de flujo están cada vez más integrados en los sistemas automatizados de entrega de muestras, los sistemas de escaneado y los sistemas de software para realizar un rastreo de todos los datos generados. Hasta hace poco, la citometría de flujo para el recuento de bacterias estaba principalmente limitado a estos sofisticados entornos de laboratorio. Ahora, la aparición de nuevos instrumentos diseñados específicamente para la realización de un volumen de pruebas menor en la industria láctea ha cambiado ese paisaje.

Las muestras de pago tienen un chip individual acoplado en la parte inferior del vial de la muestra.

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Recuento de bacterias con pulsar un botón en la industria láctea El aumento del uso de la citometría de flujo en el laboratorio lácteo ha desembocado, naturalmente, en preguntas sobre cómo compartir el poder y la practicidad de las pruebas con los productores lácteos para seguir la senda marcada por otras tecnologías analíticas, como el infrarrojo cercano y medio. Estas han incorporado pruebas rápidas y sencillas sin productos químicos en la industria láctea para la mayoría de los ámbitos del control de calidad, excepto uno: la higiene.

En ese campo también se están obteniendo progresos que pueden abrir nuevos flancos en la lucha contra las bacterias en la leche cruda.

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BacsomaticTM vídeo para ver cómo funciona

Con unas medidas de tan solo 40 x 40 x 40 cm, un instrumento pequeño de citometría de flujo de FOSS ofrece una alternativa rápida a los métodos de ensayo manual o semiautomáticos que precisan la manipulación de reactivos. Ofrece resultados sobre el recuento de las bacterias y de las células somáticas en nueve minutos y medio. Además, el práctico formato hace que sea perfecto para su uso en la industria láctea, en granjas grandes o en laboratorios de análisis de leche más pequeños.

El método de la citometría de flujo es el mismo que se utiliza en los instrumentos grandes totalmente automatizados empleados por los laboratorios de análisis de la leche para procesar cientos de pruebas por hora, pero con un diseño pensado para las necesidades de resultados más pequeñas de las industrias lácteas que necesitan analizar las entregas de leche cruda que les llegan a diario en camiones cisternas.

La disponibilidad de una prueba rápida y fácil de realizar permite tomar decisiones de forma rápida sobre cómo gestionar las entregas y sobre la mejor forma de procesar la leche en función de la calidad higiénica.

Con su sistema de flujo inteligente, también se puede integrar el recuento de las bacterias y células somáticas en un instrumento práctico y pequeño, tal y como se explica en esta entrevista de vídeo con los científicos artífices de la nueva solución.

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Elementos de un buen instrumento de citometría de flujo

1. RepetibilidadEl recuento de las bacterias implica un montón de ceros, por ejemplo, unas 10 000 bacterias por ml es un recuento perfectamente normal en una muestra de leche de alta calidad y los números pueden subir hasta 1 000 000 por ml en una muestra de mala calidad. Una pequeña cantidad de contaminación de las muestras puede tener, por lo tanto, un impacto drástico en el resultado de la siguiente prueba y, para evitarlo, cualquier sistema de citometría de flujo debe incluir un enjuague de limpieza eficaz entre pruebas. Algunas bacterias también presentan una tendencia a acumularse en grupos, así que la preparación eficaz de la muestra, como parte del sistema de flujo del instrumento, es un factor importante a la hora de conseguir una buena repetibilidad.

2 RendimientoPara las aplicaciones de los laboratorios de análisis de la leche cruda, el rendimiento es el sustento de un servicio de atención al cliente eficaz y el beneficio para el laboratorio.

Alimentados por trenes de muestras automatizados, los instrumentos modernos de citometría de flujo pueden analizar hasta 600 muestras por hora para el recuento de células somáticas y hasta 200 por hora para el recuento de bacterias.

El recuento de bacterias es más lento debido al paso de incubación, tal y como se ha explicado en la descripción del método del recuento de bacterias anteriormente. Sin embargo, a pesar del hecho de que una incubación tarda ocho minutos, un uso inteligente de las cámaras de incubación permite la realización de una serie de pruebas en paralelo para obtener un alto rendimiento de las pruebas.

Se hace una compensación del diseño para los instrumentos prácticos más pequeños, en los que la colocación manual de las muestras reduce el rendimiento, en comparación con las soluciones de laboratorio grandes totalmente automatizadasutilizadas en los laboratorios de análisis de la leche. Así y todo, el tiempo hasta obtener el resultado de las pruebas individuales debería ser el

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mismo, permitiendo así tener aplicaciones útiles en la cadena de suministro, por ejemplo, con comprobaciones rápidas de la leche cruda que llega en cisternas a la industria láctea.

3. RobustezTal y como implican las demandas de alto rendimiento, una solución de citometría de flujo de gran volumen debe gestionar un flujo de muestras o líquidos de limpieza (enjuague) virtualmente constante. Los puntos críticos en el sistema de flujo, como las bombas y las válvulas, deben ser robustos y cualquier tarea de servicio debe ser lo más sencilla posible.

4. Tabla de conversión de IBC a UFCLos instrumentos BactoscanTM y BacSomaticTM ofrecen resultados en forma de recuento bacteriano individual (IBC). Sin embargo, muchos laboratorios están obligados a presentar sus resultados en Unidades Formadoras de Colonias (UFC), que obtienen mediante un método de recuento de la concentración de gérmenes tradicional. Por lo tanto, el software que sea compatible con el uso de una tabla de conversión para convertir IBC a UFC debería formar parte de la solución de citometría de flujo.

5. Manipulación de reactivosLos reactivos líquidos participan en el método, por ejemplo, para el tinte y la limpieza. Para que el entorno de trabajo de los operarios sea lo más sencillo y seguro posible, se pueden suministrar reactivos listos para usar en sistemas de bolsa cerrada, que evitan el contacto con la piel de forma eficaz. La dosificación también se puede controlar automáticamente para garantizar la misma mezcla de reactivos y dosificación cada vez, reduciendo así el riesgo de errores humanos y obteniendo unos resultados muy sistemáticos.

6. Auténtica capacidad de conexión en red para una gestión eficaz del instrumentoLa auténtica conexión en red es mucho más que una conexión a Internet. También debería permitirle echar un vistazo dentro del instrumento para comprobar el rendimiento y la estabilidad. Es algo indispensable para permitir la gestión y la vigilancia remotas de múltiples instrumentos desde una única ubicación, por ejemplo, para comprobar los resultados de las pruebas regulares de muestras de comprobación piloto.

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Productos de FOSS que emplean la citometría de flujo para el recuento de bacterias

El BactoScan™, que se basa en la tecnología probada de FOSS, mide la calidad higiénica de la leche mediante el análisis de las bacterias en la leche cruda. BactoScan, que proporciona resultados en cuestión de minutos, permite a los ganaderos o a los laboratorios analizadores de leche actuar de forma rápida para preservar y mejorar la calidad de la leche. Se pueden realizar hasta 200 pruebas por hora.

BacSomatic™ es el primer contador de bacterias y células somá-ticas integrado para el análisis de la calidad higiénica de la leche.El instrumento, pequeño y fácil de utilizar, ofrece una alternativa rápida a los métodos de ensayo manual o semiautomáticos que precisan la manipulación de reactivos. Proporciona unos resultados precisos del recuento bacteriano y las células somáticas en menos de nueve minutos y medio o en menos de un minuto y medio solo para el recuento de células somáticas. El práctico formato hace que sea perfecto para su uso en la industria láctea, en granjas de gran tamaño o en laboratorios de análisis de la leche más pequeños.

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