Il LIEVITOSaccharomyces cerevisiae

Organismo modello

Caratteristiche:

ä Il lievito di birra, Saccharomyces cerevisiae, appartenente al regno dei Funghi e al Phylum degli Ascomiceti, è un organismo unicellulare, eucariota molto interessante per effettuare una molteplicità di esperimenti e osservazioni

ä Modello in Citologia e in Genetica.ä Nel 1996 il suo genoma è stato interamente sequenziato.ä Il metabolismo del lievito: i saccaromiceti ricavano energia dalla

fermentazione degli zuccheri che vengono convertiti in alcol conproduzione di CO2.C6H12O6 (glucosio) 2 C2H5OH ( alcol etilico) + 2 CO2

Organismo MODELLO …

q MANEGGEVOLEq di FACILE REPERIBILITA’q Non pericolosoq Disponibile in ogni periodo dell’anno

ä Osservazione di MICRORGANISMIä Osservazione di microrganismi UNICELLULARIä Confronto di DIMENSIONI cellulari (3-10 µm)ä Microrganismi AEROBI/ANAEROBIä METABOLISMO: fermentazione alcolicaä Presenza di ENZIMI (EN-ZYMA = “dentro il lievito”): catalasiä RIPRODUZIONE (asessuata – gemmazione)ä Concetto di POPOLAZIONEä CONTEGGIO di una popolazione microbicaä COLTIVAZIONE di microrganismi (terreni di coltura)ä CRESCITA di una popolazione microbica (curva di crescita esponenziale)ä FATTORI fisico-chimici che influenzano la crescita di una popolazione microbicaä BIOTECNOLOGIE: tradizionali (fermentazione) e avanzate (ingegneria genetica)

FERMENTAZIONE : la produzione di gas

ä provetta n. 1: acqua + lievito di birra (palloncino verde)

ä - provetta n. 2: acqua + zucchero (palloncino giallo)

ä - provetta n. 3: acqua + lievito di birra + zucchero (palloncino rosso)

su ognuna si inserisce un palloncino.

Lo sviluppo di anidride carbonica come prodotto della fermentaziLo sviluppo di anidride carbonica come prodotto della fermentazione del saccarosio one del saccarosio si osserva solamente nella provetta n. 3 perchsi osserva solamente nella provetta n. 3 perchéé in essa in essa èè presente sia il lievito, che trae presente sia il lievito, che trae energia da un metabolismo di tipo fermentativo, sia il substratoenergia da un metabolismo di tipo fermentativo, sia il substrato necessario per la necessario per la fermentazione ciofermentazione cioèè lo zucchero.lo zucchero.

il gas prodotto dalla fermentazione è CO2

ä Sciogliere il lievito in acqua a temperatura di 30°C nella bottiglietta con valvola

ä Collegare il tubicino alla valvola e immergere nell’acqua di calce posta nel bicchiere.

ä Dopo circa 30m si noteràintorbidamento dell’acqua di calce a causa della seguente reazione.

ä CO2 + Ca(OH)2 CaCO3 + H2O

Metabolismo: produzione di calore

ä 1) in un becher da 200 ml sciogliere 10 g di lievito in 100 ml di acqua a temperatura ambiente + 50 g di zucchero

ä 2) versare la miscela nel calorimetro (o termos), tapparlo e controllare la temperatura ogni 10 minuti con un termometro inserito

ä l’aumento della temperatura è la prova della produzione di energia per mezzo della fermentazione alcolica

Riproduzione del lievito

RIPRODUZIONE ASESSUATA: GEMMAZIONE

ä In condizioni ambientali normali, il lievito si moltiplica per gemmazione, adotta cioèun sistema di riproduzione asessuata che ha come risultato la nascita di una cellula gemella diploide, corredata di un patrimonio genetico identico a quello posseduto dalla cellula madre.

RIPRODUZIONE SESSUATA: ASCOSPORE

ä In condizioni ambientali avverse invece la cellula si trasforma in “asco”, un sacco contenente 4 cellule aploidi (aventi una sola serie di cromosomi) dette spore.

ä Le spore prodotte dai lieviti del genere Saccharomyces sono di due sessi: a ed a’

ä Spore di sesso diverso possono unirsi a formare un nuovo individuo diploide che avrà caratteristiche intermedie rispetto a quelle possedute dai due genitori. Quando si uniscono spore di specie diverse si originano i cosiddetti “ibridi”.

I lieviti del genere I lieviti del genere SaccharomycesSaccharomyces sono generalmente diploidi, ovvero nel loro nucleo sono generalmente diploidi, ovvero nel loro nucleo contengono 2 serie omologhe di 16 cromosomi: una serie proveniencontengono 2 serie omologhe di 16 cromosomi: una serie proveniente da ciascun genitore.te da ciascun genitore.

Gemmazione

ä La gemmazione si differenzia dalla scissione in quanto il citoplasma si ripartisce in maniera diversa tra le due cellule.

ä Sulla cellula che inizia la divisione si forma una piccola protuberanza in cui migra uno dei nuclei. La gemma cresce e si stacca formando un individuo autonomo.

ä Con l’osservazione al microscopio si possono notare numerose cellule con gemme appena accennate e altre con gemme che hanno raggiunto dimensioni massime che sono prossime a staccarsi dalla cellula madre.

Presenza di ENZIMI

ä L’enzima catalasi agisce da catalizzatore ed velocizzando la reazione di decomposizione dell’acqua ossigenata:2 H2O2 O2 + 2H2Oche produce ossigeno e acqua

ä La catalasi, si trova in genere nelle cellule di organismi animali, vegetali e microrganismi.

Questa attività enzimatica dipende dallaTemperatura e dal pH.

Una molecola di catalasi può agire, prima di inattivarsi su 5 milioni di molecole di acqua

Crescita microbica

ä Crescita esponenziale di una popolazione

MISURAZIONE DELLA CRESCITA MICROBICALa crescita di una popolazione microbica è funzione del numero delle cellule a tempi diversi.

Conta cellulareLe cellule possono essere contate (a)direttamente al microscopio,(b) facendole sviluppare in colonie visibili ad occhio nudo

Conta al microscopio

Conta al microscopioä La conta al microscopio può essere fatta

usando un vetrino su cui è marcata una grigliatura a passo noto (Camera di BURKER). Si individuano cosìpiccolissimi volumi noti ed uguali che entrano in un unico campo microscopico. Il numero medio di cellule trovato all'interno di tali microvolumi permette di risalire al numero di cellule mediamente presente in 1 ml del campione in esame.

Conta delle colonie su piastra

ä Conta delle colonie su piastra

E' il metodo più usato per determinare il numero di cellule vive. Si semina un campione di diluizioni nota sulla superficie di un terreno di coltura agarizzato contenuto in piastre Petri per distribuire separatamente le cellule. Dopo incubazione si contano le colonie sviluppate. I dati ottenuti si riferiscono come CFU (colony forming units = unità formanti colonie). Dati attendibili si hanno quando il numero delle colonie , sviluppate dopo incubazione sulla piastra , ècompreso tra 30 e 300.

LA CURVA DI CRESCITA

Fattori influenzanti la crescita:

TEMPERATURApHConcentrazione salina del mezzoUmiditàLuceSostanze nutritive

velocità di crescita(n di generazioni /h)

tempo di generazione (h)

Batteri 0,7 - 3 1 - 0,25

Lieviti 0,35 - 0,6 2 - 1,10

Biotecnologie tradizionali: fermentazione in pane, vino, birra,

Il lievito metabolizza Il lievito metabolizza diversi carboidrati diversi carboidrati dando luogo a dando luogo a fermentazione alcolicafermentazione alcolica

Biotecnologie avanzate:

Ingegneria geneticaProduzione di proteine,

farmaci, vaccini…

ä I lieviti, da un punto di vista applicativo, spesso associano i vantaggi tipici dei procarioti (rapida crescita, genoma relativamente piccolo) con alcuni tipici degli eucarioti (espressione dei geni, modificazioni di proteine e loro secrezione).