linee guida legionellosiold.iss.it/binary/mipi/cont/4_m._scaturro.pdfpneumophila by concentration...

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Laboratorio Nazionale di Riferimento per le legionelle Istituto Superiore di Sanità

La Real-Time PCR per la ricerca di Legionella in campioni ambientali

Maria Scaturro Dipartimento di Malattie infettive parassitarie ed immunomediate [email protected]

Linee guida legionellosi Roma 10-11 Novembre 2016

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Svantaggi Sensibilità: 5-90%; Richiede terreni specifici; Adeguato trattamento del campione; 3-5 gg per rilevare la crescita delle colonie; Non è in grado di rilevare le legionelle intra-amoeba; Non è in grado di rilevare le forme VNCB; Esperienza.

Metodo colturale:

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Esame colturale Vs PCR

Coltura

•Batteri coltivabili

•Batteri che si duplicano

(Batteri in buono stato)

Unità formanti colonia/L

10-13 giorni per ottenere

risultati

PCR

• DNA genomico estratto dalle cellule.

• Indipendentemente dalle condizioni di

crescita.

• Independentemente dalla presenza

di altri batteri

• Indipendentemente dalla

condizione intracellulare.

Unità Genomiche/ L

1 giorno

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Certezza del risultato negativo

By Guillemet et al: Negative predictive value= 93% By Collins et al: Negative predictive value= 100%

By Guillemet et al

By Collins et al.

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Certezza del risultato negativo

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Linee guida 2015

“Poiché la q-PCR è effettivamente vantaggiosa per molteplici aspetti ma non

ancora validata a livello internazionale,

essa può, ad oggi, essere solo consigliata per una rapida analisi di numerosi

campioni prelevati da siti probabilmente associati ad un caso o ancor più a un

cluster di legionellosi,

potendo in tempi brevi escludere i siti negativi ed identificare quelli positivi.”

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Tale normativa specifica i requisiti metodologici generali, di valutazione della performance e di controllo di qualità. I metodi basati su qPCR non danno informazione riguardo la presenza di cellule vive e cellule morte.

Normativa

ISO/TS 12869:2012 Water quality -- Detection and quantification of Legionella spp. and/or Legionella pneumophila by concentration and genic amplification by quantitative polymerase chain reaction (qPCR) NF T90-471 Juin 2015 Qualité de l'eau - Détection et quantification des Legionella et/ou Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par réaction de polymérisation en chaîne en temps réel (qPCR).

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Linee Guida Italiane - Allegato 6: Ricerca di Legionella in campioni ambientali mediante Real-Time PCR

Aspetti generali

Personale qualificato, che conosco i fondamenti della biologia molecolare e

della PCR, nonché appropriate conoscenze di microbiologia.

Deve usare:

• Camice

• Guanti

• Materiale monouso

• Set di micropipette

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Condizioni generali per il test

• Aree di lavoro

• Campionamento

• Concentrazione

• Estrazione di DNA

• Amplificazione del DNA

• Controllo di inibizione

• Decontaminazione

Linee Guida Italiane - Allegato 6:Ricerca di Legionella in campioni ambientali mediante Real-Time PCR

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Aree di lavoro

• Il laboratorio dovrebbe contenere almeno tre aree fisicamente distinte:

1. Un’area per la concentrazione e l’estrazione del DNA

2. Un’area per la preparazione delle reazioni di PCR

3. Un’area per l’amplificazione


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Campionamento

I campioni devono essere raccolti in contenitori sterili, con tutte le precauzioni necessarie. Sul contenitore e/o su un registro devono essere indicati: luogo e data del prelievo, volume e temperatura e se è stato effettuato un trattamento con biocidi. Nel caso in cui si utilizzi la Real Time PCR per analisi di routine, se si prevede che il/i campioni siano negativi, è possibile campionare un solo litro. Nel caso in cui si debbano investigare cluster epidemici è sempre consigliato il prelievo di 2 litri d’acqua che saranno utilizzati possibilmente mescolati in sospensione omogenea. Qualora non fosse possibile fare un’unica sospensione, analizzare una prima metà di ciascun litro con la Real Time PCR ed eventualmente (se positivo in Real Time PCR) la seconda metà mediante coltura. Nel caso in cui un diverso volume d‘acqua è prelevato, bisogna indicarlo e tenerne conto nell’analisi quantitativa.

I campioni devono essere analizzati immediatamente o entro 24 h dal prelievo. In questo caso, i campioni devono essere conservati a 5 ± 3 °C.


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Concentrazione

Quando la concentrazione è ottenuta mediante filtrazione, i filtri devono essere in

policarbonato o altro componente con bassa capacità di adsorbimento di proteine

o DNA. Non si possono usare filtri in cellulosa. I filtri devono avere porosità

0.45μm.

E’ preferibile non conservare i filtri a 5 ± 3 °C, bensì procedere subito con

l’estrazione del DNA genomico.

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Estrazione del DNA

La scelta del metodo di estrazione va fatta sulla base della migliore soluzione per

la successiva fase di amplificazione del DNA. Il metodo andrebbe valutato

mediante prove preliminari o su campioni test.

Può essere eseguita direttamente sul filtro o dopo completa rimozione dei batteri

(es.: sonicazione).

Il DNA estratto può essere conservato a +4°C se analizzato in giornata, oppure a -

20°C per un alcuni mesi.


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Amplificazione del DNA

E’ possibile utilizzare kit commerciali purchè

validati secondo la normativa vigente.

E’ anche possibile usare sistemi “in house”

sempre purché conformi alle norme ISO e/o

AFNOR.

Un controllo negativo di estrazione deve

comunque essere inserito.

Mix di Amplificazione


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Controllo di inibizione

Il controllo interno positivo (IPC) da certezza del campione negativo.

Molti kit commerciali includono l’IPC nella miscela di amplificazione.


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Decontaminazione

Tutti i dispositivi riutilizzabili (rampa, funnels, pinzette etc) devono

essere decontaminate immergendole in una soluzione 1,7% ipoclorito o

1% acido cloridrico o un detergente non ionico per almeno 30 min. e

poi sciacquati con acqua distillata filtrata e sterilizzata a 121 ± 1 °C per

20 min.


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Linee guida italiane 2015

IMPORTANTE!!

Tutti i campioni che risultano positivi alla PCR devono essere analizzati

mediante coltura per poter determinare la concentrazione di Legionella nei

campioni.

• La valutazione del rischio è espressa come CFU/L.

• La PCR non è in grado di discriminare DNA da batteri vivi o morti.

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L’introduzione della PCR come primo “screening” di numerosi campioni al

fine di individuare rapidamente i campioni positivi è un passo molto

importante verso un miglioramento del nostro servizio verso i cittadini.

Non siamo ancora in grado di sostituire la PCR all’esame colturale, e questo

fondamentalmente perché i livelli di allerta e di azione sono espressi come

CFU/L di Legionella.

Conclusioni

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Conclusioni

Rimane dunque necessario effettuare l’esame colturale dei campioni

positivi alla PCR per definire la concentrazione di Legionella nel campione.

Ma l’esame colturale rimane importante anche perché l’isolamento dei

ceppi batterici ci consente ulteriori studi di tipizzazione dei ceppi, necessari

per la corretta identificazione della fonte di infezione.

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RI MENTO

Grazie per l’attenzione!

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