ltm 3 modul biologi molekuler rt-pcr, reverse transcriptase dan dna sequencing
TRANSCRIPT
Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR),
sequencing DNA, dan Reverse Transcriptase
Melissa Lenardi, 0906508296
I. Pendahuluan
Seiring dengan berkembangnya teknologi diagnosis molekuler, kini manusia telah dapat
melakukan pemeriksaan yang jauh lebih akurat dan efektif dengan menggunakan diagnosis
DNA, baik untuk mendiagnosis penyakit genetis, untuk keperluan pribadi, misalnya
penentuan perwalian anak, bahkan untuk keperluan identifikasi resistensi pada virus misalnya
pada kasus balita yang meninggal dunia akibat HIV/AIDS yang tidak terobati akibat resistensi
virus tersebut terhadap obat. Seperti yang telah diketahui bahwa setiap mahkluk hidup
memiliki materi genetik yang terkandung dalam DNA maupun RNA, begitu pula pada virus.
Hal inilah yang menjadi salah satu dasar dari pemeriksaan materi genetik pada kasus-kasus
resistensi. Penelitian ini membutuhkan penggandaan dari kopi RNA virus yang membutuhkan
teknologi Reverse Transcriptase-Polimerase Chain Reaction (RT-PCR) yang akan
dilanjutkan dengan sequencing DNA.1
II. Isi
Setelah dilakukan berbagai macam teknik pengambilan sampel darah pasien akan
dilakukan ekstraksi untuk dapat memperoleh materi genetik secara murni. Jika telah diperoleh
materi genetik murni, akan dilakukan amplifikasi (perbanyakan) untuk dapat memperoleh
jumlah sampel yang cukup dari keterbatasan sampel yang ada sebelumnya. Salah satu teknik
yang paling banyak digunakan saat ini dalam melakukan amplifikasi adalah Polymerase
Chain Reactions (PCR). Namun pada kasus amplifikasi RNA, maka dibutuhkan enzim
1
Reverse Transcriptase sehingga disebut Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
(RT-PCR).
II.I. PCR
Teknik PCR merupakan suatu metode in vitro yang dapat diterapkan untuk pembuatan
cepat DNA dalam jumlah yang sangat besar. Metode ini sangat cocok untuk keperluan teknik
klinis karena memerlukan jumlah sampel yang sangat sedikit. DNA yang diperoleh dapat
berasal dari sampel darah tepi dengan menggunakan bantuan rekasi berantai enzimatik,
sekuens DNA target-yang diinginkan-dapat diperbanyak2. Teknik ini secara sederhana dapat
dijabarkan sebagai berikut:
1. Persiapan Sediaan Bahan Reaksi
Untuk menyiapkan sediaan reaksi berantai, maka diperlukan kurang lebih bahan-bahan
utama antara lain DNA sampel yang telah diisolasi dari ekstraksi sebelumnya, Primer,
keempat macam deoksiribonukleosida trifosfat, dan DNA polimerase yang tahan panas
dalam jumlah besar ke dalam larutan di mana reaksi akan dimulai dengan pemanasan
terlebih dahulu. Primer adalah oligonukleotida atau sekuen DNA pendek sintetis yang
dibuat secara sengaja bersifat komplementer dengan sekuen DNA target. Namun, primer
ini tidak mencakup keseluruhan sekuen DNA target, tetapi hanya sebagian dari
permulaan DNA target yang akan direplikasi kemudian oleh DNA polimerase. Primer
yang diperlukan ada 2 macam (up-stream dan down-stream) dan keduanya saling
melengkapi untuk dapat membentuk batas yang jelas “dari mana dan sampai di mana”
sekuens DNA target yang dimaksud. Keempat jenis zat ini dicampurkan menjadi satu
dalam sebuah tabung reaksi. Untuk memperbanyak sampel, maka DNA sampel
sebelumnya dapat dibagi ke beberapa tabung reaksi dalam jumlah yang dinilai perlu,
2
kemudian ditambahkan ketiga zat lain tersebut.2 Perhatikan gambar 1 untuk memperoleh
gambaran lebih jelas.3
Gambar 1. Pembagian larutan sediaan PCR ke dalam beberapa
tabung reaksi (kiri) dan mesin PCR (kanan)
2. Reaksi Polimerase Berantai (PCR)
Setelah tabung-tabung yang berisi larutan dimasukkan ke dalam mesin, maka reaksi
amplifikasi berdasarkan PCR ini dapat dilangsungkan dalam 3 tahap utama, antara lain:
2.1. Denaturasi
Denaturasi diawali dengan pemanasan larutan sediaan sampai temperatur ±95ºC
selama 1 menit untuk meluruskan untaian double-helix dari DNA sampel yang ada di
dalam larutan. Denaturasi ini terjadi dalam bentuk lepasnya ikatan hidrogen yang
menjadi sturktur tersier dari DNA, sehingga dihasilkan rantai tunggal lurus dari DNA
dengan basa-basa nitrogen tak berpasangan. DNA yang telah terdenaturasi ini akan
menjadi aksesibel terhadap berbagai sekuens primer yang sudah disediakan di dalam
3
larutan. Namun, karena tingginnya temperatur yang ada, ikatan hidrogen antara
sekuens primer dan sekuens target tidak dapat terbentuk.
2.2. Penggabungan (Annealing)
Penggabungan yang dimaksud adalah pelekatan dari kedua jenis sekuens primer ke
sekuens target yang telah terpisah. Proses ini memerlukan penurunan suhu menjadi
±60ºC selama 1 menit, sehingga hanya sekuens primer yang dapat melekat,
sedangkan ikatan hidrogen antartemplate tidak dapat terjadi. Akibatnya, terbentuklah
pisahan template dengan masing-masing sekuens primernya.
2.3. Pemanjangan (Extension)
Tahap pemanjangan ini memerlukan bantuan DNA polimerase jenis Taq (enzim
yang diisolasi secara khusus dari bakteri Thermus aquaticus) yang tahan terhadap
perubahan suhu ekstem, yaitu pada temperatur ±72ºC selama 1 menit. Pemanjangan
ini pula melibatkan keempat macam deoksiribonukleosida yang telah tersedia dalam
larutan. Proses pemanjangan terjadi pada arah yang berlawanan dari kedua template
dan dimulai dari ujung start pada masing-masing primer yang ada.3
Tahap-tahapan di atas akan terjadi berulang kali dan tiap 3 tahap penuh yang
terselesaikan disebut sebagai 1 siklus. Pada 3 siklus pertama, mulai terbentuk rantai murni
dari sekuens DNA target yang diperlukan/DNA target. Namun, pada tahap-tahap selanjutnya
terbentuk terus kopi dari sekuens DNA target dan kopi dari rantai DNA panjang secara
eksponensial. Sampai kepada siklus 30 kemudian, jumlah DNA rantai panjang hanyalah
sekita 60 kopi, sedangkan jumlah sekuens target yang terkopi dapat mencapai milyaran.4
4
II.II. Reverse Transcriptase
Reverse transcriptase (nama lain: RNA-Dependent DNA
Polimerase ) adalah suatu enzim yang menggunakan cetakan
RNA untuk membuat salinan DNA. Terlihat pada gambar 25.
Cetakan RNA yang ditranskripsi dari DNA oleh RNA
polimerase atau diperoleh dari sumber lain, misalnya virus
RNA. Salinan DNA dari RNA yang dihasilkan oleh reverse
transcriptase dikenal sebagai cDNA. Retrovirus juga
menggunakan reverse transcriptase untuk menghasilkan DNA
untai ganda agar dapat terintegrasi dengan genom manusia.2
II.III.I.Fungsi dan proses reverse transcriptase pada virus
Reverse transcriptase digunakan oleh virus RNA untuk mengubah materi genetiknya
menjadi DNA dalam proses replikasi. Virus RNA seperti retrovirus menggunakan enzim ini
untuk dapat berintegrasi pada genom sel host. Tanpa reverse transcriptase, genom virus tidak
akan dapat berintegrasi dan tidak dapat bereplikasi.
Pada retrovirus, genom terdiri atas dua molekul sense RNA rantai tunggal dengan ujung
5’ dan ekor 3’. Terdapat beberapa langkah pembentukan DNA, yaitu:
1. Sebuah tRNA bertindak sebagai primer dan membentuk rantai komplemen dari enom
virus yang disebut primer binding site (PBS).
2. DNA komplemen kemudian berikatan dengan U5 (daerah non-koding) dan daerah R
(daerah berulang pada ujung-ujung RNA) dari virus RNA.
3. Bagian domain reverse transcriptase yang disebut RNAse H mendegradasi ujung 5’ dan
akan membuang baguan U5 dan R.
4. Primer akan pergi ke ujung 3’ RNA dan akan mensintesis DNA.
5
Gambar 2. Reverse Transriptase
5. Untai komplemen DNA pertama disebut cDNA akan
diperpanjang.
6. Pembentukan komplemen DNA lain pada RNA virus,
dan proses berulang.6
RNA retrovirus dibuat dari ujung 5’ ke ujung 3’. Lokasi
primer berlekatan ke RNA visrus disebut PBS. Ujung 5’
disebut U5 dan ujung 3’ disebut leader. tRNA primer terdiri
atas 14-22 nukleotida yang akan melekat pada PBS.6
II.III.II. Fungsi Reverse Transcriptase bagi manusia
Reverse transcriptase secara umum digunakan dalam penelitian lanjutan proses PCR
(Polimerase Chain Reaction) untuk RNA yang disebut RT-PCR. Jalur PCR konvensional
hanya dapat digunakan untuk untai DNA, namun dengan bantuan reverse transcriptase. RNA
dapat diubah menjadi DNA, dan memungkinkan analisis RNA.
Reverse transcriptase juga digunakan untuk membentuk perpustakaan cDNA yang
dibentuk dari mRNA. Reverse transcriptase pun dapat dimanfaatkan untuk keperluan
komersial, selain digunakan dalam pendidikan kaarena dapat digunakan untuk meng klonik,
membentuk sekuens dan menguji karakteristik DNA.6
II.III. RT-PCR
RT-PCR menggunakan sepasang primer yang berkomplemen sebagai permulaan jalur
transkripsi pada ujung-ujung untai cDNA. Primer ini akan dielongasi oleh DNA polimerase
dan akan menghasilkan untaian DNA pada tiap siklusnya, dan akan membentuk amplifikasi
alogaritmik.1
6
Gambar 3. Proses Reverse Transcriptase
RT-PCR terdiri dari beberapa langkah, meliputi :
a. RT (reverse transcriptase), pembentukan cDNA dari untai RNA dengan
menggunakan reverse transcriptase dan primer. Tahap ini merupakan tahapan yang
paling penting agar proses PCR dapat berlangsung mengingat DNA polimerase hanya
dapat bekerja pada template DNA. Tahap RT dapat dilakukan dalam tabung yang
PCR, maupun terpisah. RT dilakukan pada suhu 40C sampau 50C
b. Denaturasi, dsDNA didenaturasi pada suhu 95C, agar kedua untai terpisah dan
dimulai siklus PCR. Kemudian suhu diturunkan hingga mencapai suhu annealing
(suhu bergantung pada jenis primer yang digunakan, konsentrasi primer, jenis dan
konsentrasi probe, serta konsentrasi kation).
c. Elongasi DNA, pemanjangan sekuense DNA yang dilakukan ooleh termostabil Taq
DNA Polimerase, yang umumnya dilakukan pada suhu 72C, suhu optimal enzim.
Gambar 4. Mekanisme pengaturan temperatur pada PCR terhadap lama waktu dalam
tiap siklus
7
Tidak hanya pada proses amplifikasi, untuk pemeriksaan DNA pun seringkali diperlukan
teknik tertentu yang cukup rumit agar sekuens yang awalnya tidak diketahui dapat terbaca,
dan darisini pulalah seorang pemeriksa dapat mengetahui terdapat atau tidaknya kelainan atau
mutasi pada materi genetik yang diberikan.
II.III.I.Kegunaan RT-PCR
Amplifikasi exponensial dengan bantuan RT-PCR memberikan hasil yang sangat sensitif
dan hanya membutuhkan sejumlah kecil RNA. RT-PCR digunakan secara luas untuk
mendiagnosis penyakit-penyakit genetik secara semikuantitatif, dalam menentukan RNA
molekul spesifik dalam sel atau jaringan. Alanisis Nothern Blot digunakan untuk mempelajari
ekspresi gen RNA.
RT-PCR juga dapat digunakan dalam insersi gen eukariot kepada prokariot. Mengingat
hampir semua gen eukariot mengandung intron yang tidak mengekspresikan gen, dan tidak
terdapat pada mRNA, dengan melakukan RT-PCR pada mRNA kita akan mendapatkan hasil
gen spesifik tanpa intron.
RT-PCR biasanya juga dilakukan dalam berbagai penelitian genom virus RNA, seperti
Influensa, maupun retrovirus seperti HIV.
8
9
II.IV. Sequencing DNA
Awalnya, teknik DNA sequencing dikembangkan oleh Alan Maxam dan Walter
Gilbert. Teknik awal ini cukup rumit karena masih terlalu sederhana dan memiliki banyak
kelemahan, misalnya memerlukan terlalu banyak DNA yang telah dipurifikasi, pembacaan
yang dapat dilakukan relatif pendek, dan tidak adanya automatisasi kimiawi. Tahap-tahapan
dari pembacaan sekuens DNA dengan teknik Maxam-Gilbert dapat dilihat pada tabel dan
bagan di bawah ini.7,8,9
Prinsip umum dari teknik Maxam-Gilbert ini adalah memanfaatkan degradasi kimiawi
dari basa-basa purin, di mana:
1. Purin (basa A dan G) akan dirusak oleh dimetilsulfat
2. Metilasi dari basa-basa nitrogen
3. Pemanasan yang akan melepaskan basa-basa tersebut
4. Pemotongan basa G oleh alkali
5. Asam encer akan memotong basa A lebih banyak dari basa G.
10
Tabel 1. Modifikasi kimia yang digunakan pada
Gambar 5. Penjelasan Skematis Metode Maxam-Gilbert
Namun, disebabkan oleh banyaknya kekurangan dari metode ini, maka pada tahun 1958,
Freedrick Sanger kemudian mengembangkan metode yang lebih efesien dalam DNA
Sequencing, yang disebut sebagai metode Sanger, sampai saat ini masih sering digunakan.
Pada dasarnya, terdapat metode-metode lain misalnya cycle sequencing, RFLP, DNA arrays,
dan sebagainya. Metode Sanger dapat diringkas menjadi skema di bawah ini.11
no hydroxyl group at 3’
endprevents strand
extension
CH2OOPPP5’
3’
BASE
Gambar 6. Penjelasan Skematis Metode Sanger
Secara prinsipial, metode Sanger (1) mengandalkan pembuatan kopi parsial dari fragmen-
fragmen DNA melalui DNA polimerase, (2) Pengumpulan dari fragmen-fragmen DNA yang
dihentikan dengan basa dideoksiribonucleotidatriphospate (ddNTP berupa A,C,G, atau T),
setelah itu (3) Fragmen tersebut kemudian dipisahkan dengan elektroforesis, dan (4)
dilakukan pembacaan sekuens dengan secara manual ataupun terkomputerisasi. Metode ini
pun digunakan oleh Sir Alec Jeffries pada tahun 1985 untuk kegiatan
forensik melalui penemuannya akan perulangan pada basa-basa STR (panjang sekitar 9-80
pasang basa) yang sangat spesifik untuk tiap individu (DNA Fingerprinting).
Pembacaan sekuens dari fragmen DNA dibantu oleh basa-basa ddNTP yang telah
diberikan zat fluoresens sehingga dapat berpendar jika disinari dengan panjang gelombang
12
Gambar 7. Struktur umum ddNTP
tertentu, misal sinar UV. Pembacaan dilakukan pada gel agarosa yang berada dalam medan
listrik, sehingga DNA dengan panjang molekul yang lebih pendek akan bergerak lebih jauh
(lebih ke bawah) dibandingkan DNA dengan panjang molekul yang lebih panjang.8,9
III. Kesimpulan
Dengan menggunakan teknih RT-PCR yang dilanjutkan dengan sequencing DNA, kita
daqpat mengetahui ada tidaknya sifat resistensi obat pada HIV dengan melihat dan
membandingkan HIV non-resisten sehingga dokter dapat memberikan treatment alternatif
yang dapat meningkatkan angjka harapan hidup penderita.
IV. Daftar Pustaka1. Hunt M. Real Time PCR. Diunduh dari http://pathmicro.med.sc.edu/pcr/realtime-
home.htm. Diakses 06 April 2010, pkl. 00.07 WIB.2. Marks DB, Marks AD, Smith CM. Biokimia Kedokteran Dasar: Sebuah Pendekatan
Klinis: Penggunaan Teknik DNA Rekombinan dalam Dunia Kedokteran. 1st ed. Jakarta: Penerbit EGC; 2000.p.235-255, 172.
3. Anonymous. Microtubes in PCR. Diunduh dari http://schools-wikipedia.org/images/798/79806.png. Diakses 06 April 2010, pkl. 00.12 WIB.
4. DIPGRI and Cornell University. The Polymerase Chain Reaction. Diunduh dari http://irc.igd.cornell.edu/MolecularMarkers/PCR%20basics.pdf. Diakses 06 April 2010, pkl. 00.15 WIB.
5. Yepyhardi. Important Terms Related to Microarrays. Diunduh dari http://8e.devbio.com/images/ch04/0405fig2.jpg. Diakses pada 06 April 2010, pkl. 00.44 WIB.
6. Bernstein A, Weiss R, Tooze J. Molecular Biology of Tumor Viruses : RNA tumor viruses.2nd ed, New York: Cold Spring Harbor Laboratory. 1985.
7. Biology and Science. An Overview of Forensic Typic Systems & Procedures for Forensic DNA Analysis. Diunduh dari http://science.kennesaw.edu/~rrascati/forensicpolymorphs.html. Diakses 23 Maret 2010, pkl. 18.24 WIB.
8. Auckland Biomedic Techniques. DNA Profilling. Diunduh dari http://www.sbs.auckland.ac.nz/uoa/fms/default/science/about/departments/sbs/student_information/schools/biotechnology/docs/dnaprofiling.pdf. Diakses 23 Maret 2010, pkl. 21.23 WIB.
9. Universitas Gadjah Mada. DNA Sequencing Presentation. http://faperta.ugm.ac.id /newbie/download/ pak_tar/genetika-molekuler/Instrument20072.ppt. Diakses 23 Maret 2010, pkl.19.33 WIB.
13