TUGAS MATAKULIAH BIOANALISISJudul:Optimization of a gas chromatography-mass spectrometry method using chemometric techniques for the determination of ezetimibe in human plasma(Optimisasi metode gas kromatografi-spektrometri massa menggunakanteknik kemometri untuk penentuan ezetimibe dalam plasma manusia)

Kelompok : 6Anggota : MAHMUDATUS SHOLIHAH 122210101019NANDA SURYANING ROHMA122210101032MIA RISWANI122210101042GALUH SINOARSIH122210101050NIDIA RIZQI I.122210101073PUTRI KARTIKA NINGSIH 122210101105LERIANA ALYYU122210101080AMALIA SUSILOWATI122210101027

Dosen : Lestyo Wulandari, S.Si., M.Farm., Apt.

FAKULTAS FARMASIUNIVERSITAS JEMBER2014Abstrak: Sebuah kromatografi gas dan spektrometri massa (GC-MS) yang baru, cepat dan sensitif dikembangkan untuk menentukan ezetimibe (EZE) dalam plasma manusia. EZE diturunkan sebelum analisis GC-MS. Berbagai teknik derivatisasi seperti asetilasi, metilasi dan sililasi telah dicoba. EZE diekstraksi dari plasma dengan persen recovery yang tinggi (94.39% 97.57%) menggunakan metil eter terbutil dan penyangga karbonat (pH 9). Kondisi kromatografi yang dioptimalkan menggunakan metode kemometrik. Pada tahap pertama, optimasi dengan rancangan faktorial, variabel kromatografi (awal dan suhu kolom akhir, laju pemanasan, dan laju aliran gas) diskrining untuk memilih variabel penting untuk penyimpanan EZE. Pada langkah kedua, rancangan gabungan pusat diterapkan untuk menentukan waktu simpan EZE. Analisis ini dapat dicapai dalam waktu singkat (< 4 menit). Metode yang dikembangkan divalidasi untuk parameter termasuk spesifikasi, batas kuantisasi, linearitas, akurasi, presisi, persen recovery, stabilitas, ketahanan, dan kekasaran. Batas kuantitasnya ditemukan 10 ng mL 1. Metode ini berhasil diterapkan untuk menentukan total EZE dalam plasma pasien hiperkolesterolemia.

1. PendahuluanEzetimibe (EZE) adalah inhibitor penyerapan kolesterol yang bersifat sintetik dan spesifik. EZE ini bekerja menghambat penyerapan sterol dalam usus oleh pengikat yang selektif menuju transporter usus kolesterol. Setelah pemberian dengan rute oral, EZE yang diserap dan secara luas diubah ke EZE keton, dan EZE benzilik glukuronida, metabolisme yang kecil, dan juga aktif secara farmakologi dalam metabolisme EZE glukuronida oleh glukuronidasi 4-hidroksifenil. EZE dan glukuronida merupakan fragmen utama dalam plasma.Ezetimibe telah disetujui pada tahun 2002 oleh Food and Drug Administration (FDA). Pada tahun 2008, FDA melaporkan komunikasi awal tentang masalah keamanan terkait EZE, EZE/simvastatin, dan simvastatin serta mendorong baik seorang profesional dalam layanan kesehatan dan pasien untuk melaporkan efek samping EZE. Studi tentang isu-isu keamanan ini masih dalam tahap evaluasi.Metode analisis digunakan untuk menganalisis EZE dalam sampel biologis yang diperlukan untuk mengevaluasi keamanan dan efisiensi, untuk memahami profil farmakokinetik diantara berbagai pasien, dan untuk menentukan konsentrasi terapeutik pada pasien.Dalam literatur, beberapa metode analisis seperti kromatografi cair dua spektrometri massa (LC/MS/MS), deteksi kromatografi cair kinerja tinggi dengan ultraviolet (HPLC/UV), dan GC-MS dilaporkan untuk analisis EZE bebas dan total dan EZE glukoronida dalam sampel biologis. Dalam pelaporan metode GC-MS memakan waktu yang lama karena waktu analisis yang lama (sekitar 15 menit) dan juga pada saat pemulihan EZE dari plasma rendah. Dalam studi yang diusulkan, teknik derivatisasi yang berbeda dicoba dengan pereaksi turunan. Fase padat dan ekstraksi cair-cair digunakan untuk ekstraksi EZE dari plasma. Metode kemometrik seperti perancangan faktorial lengkap dan rancangan campuran pusat (CCD) yang digunakan untuk mengoptimalkan variabel kromatografi. Setelah metode yang divalidasi dkembangkan sepenuhnya, hal ini dapat diterapkan untuk menentukan jumlah EZE dalam plasma pasien hiperkolesterolemia.

2. Experimen2.1 Bahan dan reagenEZEdanoxymetholone(internalstandar(IS))DiperolehdariInstitutPusatKesehatanTurkidan Permandian TurkiDopingControlCenter(Ankara,Turki),masing-masing.N-metil-N (trimethylsilyl) triuoroacetamida(MSTFA),bis (trimethylsilyl) acetamide(BSA), trimethyl chlorosilane (TMCS),N-metil-N-trimethylsilyl-hepta uorobutyramide(MSHFBA),N-(tert-butyldimethylsilyl)-N-methyltri uoroacetamide(MTBSTFA),N-metil-bis (triuoroacetamide) (MBTFA),imidazoldan glucuronidasedariHelixpomatia(tipeHP-2,= 100.000unit/mL kegiatanglucuronidase) Diperoleh dari Sigma. Mercaptoethanol, ammonium Iodida (NH4I), kalium karbonat,kaliumbikarbonatdanmetiletertertbutyldibelidari Merck.

2.2 Instrumentasi dan Kondisi analisis GC/MSGC-MS analisis dilakukan pada 6890N Agilent GC dilengkapi dengan detector massa selektif 5973N. A 5% fenil methylpolysiloxane kapiler kolom (id 10 m 0.25 mm dengan ketebalan 0,25 mlm Agilent Teknologi, USA) digunakan untuk pemisahan kromatografi. Awal suhu oven didirikan di 206 C; kemudian suhu meningkat 305 c pada tingkat 33.11 C/min. Menjalankan waktu untuktotal Injeksi pada 4menit. Detektor massa selektif beroperasi di electron dampak ionisasi mode.Dipilih ion pemantauan (SIM) mode ini digunakan untuk menentukan EZE dan IS. Ion-ioniturasiomassa terhadap muatan(m = z)326untuk EZE danm = z548 untuk IS yang dipilih untukkuantisasi.MultiplierelektrondetektorMSditetapkanuntuk 306eV. Suhu depan inlet, ion sumber dan antarmuka yang 280, 230 dan 280 C, masing-masing.GC-MS analisis dilakukan pada 6890N Agilent GC dilengkapi dengan detector massa selektif 5973.A 5% fenil methylpolysiloxane kapiler kolom (id 10 m 0.25 mm dengan ketebalan 0,25 m lm Agilent Teknologi, USA) digunakan untuk pemisahan kromatografi. Awal suhu oven didirikan di 206 C; kemudian suhu meningkat 305 c pada tingkat 33.11 C/min. Menjalankan waktu untuk total injeksi pada 4menit. Detektor massa selektif beroperasi di electron dampak ionisasi mode. Dipilih Ion pemantauan (SIM) mode ini digunakan untuk menentukan EZE dan IS. Ion-ion itu rasio massa terhadap muatan(m = z)326untuk EZEdanm = z548 untuk IS yang dipilih untuk kuantisasi. MultiplierelektrondetektorMSditetapkanuntuk 306eV.Suhu depan inlet, ion sumber dan antarmuka yang masing-masing 280, 230 dan 280 C

2.3 Preparasi standart dan validasi sampelSaham larutan EZE (1000 g/mL) disiapkan dengan melarutkan 10 mg EZE dalam 10 mL metanol. Kerja solusi dari EZE pada konsentrasi 10, 1, dan 0,5 g/mL digunakan untuk mempersiapkan berduri plasma sampel. Solusi kerja telah dipersiapkan oleh serial pengenceran saham larutan EZE dengan metanol.Saham solusi ini disimpan di -20 C sampai penggunaan, sementara solusi bekerja dipelihara di 4 C. Untuk mempersiapkan berduri plasma sampel studi validasi, jumlahkerjayangtepat standar solusi EZE dan sejumlah konstan IS ditambahkan ke 1.5 mLplasma.Sampel plasma dijadikan dasar dengan 500 L karbonat bu er (pH 9) dan kemudian EZE diambil dengan 4 mL eter. Lapisanorganikmenguapkekeringandi bawah nitrogen. Residu adalah derivatizated dengan 40 L MSTFA /- mercaptoethanol NH4I: 735.

2.4. Persiapan reagen derivatisasiMSTFA/-mercaptoethanol/larutan NH4I: Untuk larutan stok, 100mg NH4I ditambahkan ke 5mL MSTFA. Campuran divortex dan disimpan pada 800C sampai amonium iodida terlarut; kemudian 300L -mercaptoethanol ditambahkan ke dalamnya. Larutan kerja dibuat dengan pengenceran dari 556L larutan stok dengan 5mL MSTFA. Larutan MSTFA/imidazol: 0,2mg imidazol ditambahkan ke 5mL MSTFA dan campuran divortex untuk melarutkan imidazol. BSA/TMCS, MSHFBA/TMCS, larutan MTBSTFA/TMCS: 0.1mL TMCS ditambahkan ke 5mL reagen derivatisasi. Semua larutan derivatisasi disimpan di +40C dalam ruang gelap.

2.5. Preparasi sampel untuk analisis plasma manusiaSampel darah manusia dikumpulkan dari pasien kira-kira 1jam (tmax) setelah pemberian obat. Sampel darah ditempatkan dalam tabung gelas yang mengandung asam ethylenediaminetetraacetic sebagai antikoagulan dan kemudian disentrifugasi pada 4000 rpm selama 10 menit. Supernatan (plasma) dipindahkan ke dalam tabung reaksi. Untuk mempersiapkan sampel plasma untuk di analisis, pertama hidrolisis asam dilakukan untuk mengkonversi EZE-glukuronida ke EZE. 10L IS, 500L buffer natrium asetat(0,5 M, pH5) dan 50L -glucuronidase ditambahkan ke dalam 1,5mL sampel plasma manusia. Selanjutny diinkubasi pada 500C selama 60 menit. Sampel diekstraksi dan kemudian diderivatisasi dengan 40L MSTFA pada 800C selama 60 menit. Larutan disuntikkan ke dalam sistem GC-MS.

2.6. Metode Validasi Metode validasi yang diusulkan menurut FDA pedoman validasi metode bioanalisis. Parameter validasi berikut yang dievaluasi: spesifisitas, linearitas, batas kuantisasi, akurasi, presisi, stabilitas, recovery, ketahanan, dan kekasaran.2.6.1. SpesifisitasSpesifisitas dievaluasi dengan menganalisis 6 sampel blanko plasma yang diperoleh dari sumber yang berbeda. Kromatogram diamati untuk setiap gangguan endogen pada waktu retensi EZE dan IS dengan memonitor ion pada m/z 326, 416, dan 463 untuk EZE dan 548 untuk IS.2.6.2. Linearitas dan batas kuantisasi(LOQ)Untuk menentukan LOQ, spike sampel plasma memiliki penurunan konsentrasi EZE dianalisis dengan GC-MS dan sinyal untuk rasio kebisingan dihitung untuk setiap konsentrasi. Selain itu, presisi dan akurasi dihitung di tingkat LOQ.Linearitas dilakukan dengan menganalisis sampel plasma spike disiapkan di 8 konsentrasi yang berbeda dari EZE di kisaran 10-250 ngmL-1. Kurva kalibrasi dibangun dengan memplot rasio luas puncak (area puncak EZE ke puncak daerah IS) versus konsentrasi EZE. Standar deviasi pada setiap titik kalibrasi dievaluasi.2.6.3 Akurasi dan PresisiAkurasi dan presisi dievaluasi secara intraday dan interday. Untuk menentukan presisi dan akurasi pada metode GC-MS, spike sampel plasma disiapkan sebanyak 6 seri sampel plasma pada 4 tingkat konsentrasi (10, 20, 150, dan 200 ng /mL) dalam jangkauan linear. Sampel dianalisis pada hari yang sama (intraday) dan 6 hari berturut-turut (interday). Akurasi dan presisi dinyatakan sebagai bias dan relatif standar deviasi (RSD). Nilai-nilai yang dapat diterima presisi dan akurasi adalah 20% untuk LOQ dan 15% untuk tingkat lainnya.2.6.4 StabilitasStabilitas EZE dalam plasma diamati dalam jangka waktu pendek (untuk 24 jam dalam suhu kamar), jangka waktu panjang (selama 3 bulan pada suhu 80oC), freeze-thaw (3 siklus freeze-thaw, selama 24 jam pada suhu 80oC), dan postpreparative (selama 24 jam dalam stabilitas autosampler).Untuk jangka pendek dan stabilitas jangka panjang,spike sampel plasma disiapkan pada tiga konsentrasi yang berbeda lalu dianalisis setelah penyimpanan. Hasil yang diperoleh dibandingkan dengan spike sampel plasma yang telah disiapkan.Stabilitas Post-preparative dievaluasi dengan menganalisis spike sampel plasma sebelum dan sesudah penyimpanan dalam autosampler selama 24 jam, dan kemudian dibandingkan dengan hasil.Untuk stabilitas freeze-thaw, spike sampel plasma disimpan pada suhu 80o C selama 24 jam kemudian dicairkan pada suhu kamar. Prosedur ini diulang dua kali. Setelah 3 siklus, sampel dianalisis dan hasilnya dibandingkan dengan spike sampel plasma yang telah disiapkan.2.6.5 RecoveryRecovery ditentukan pada 4 konsentrasi yang berbeda (10, 40, 100, dan 250 ng/mL) dalam hal recovery absolut dan recovery relatif. Recovery absolut dihitung sebagai daerah puncak EZE dalam plasma sebelum ekstraksi, dimana daerah puncak terbagi atas luas puncak larutan standar EZE pada konsentrasi yang sama. Recovery relatif dihitung sebagai daerah puncak EZE dalam plasma sebelum ekstraksi yang terbagi atas luas puncak EZE plasma setelah ekstraksi.2.6.6 Ketahanan dan KekasaranKetahanan dan kekasaran yang bersamaan dievaluasi untuk metode yang dikembangkan dengan menggunakan desain rancangan Plackett Burman. Efek dari 8 variabel (suhu oven awal dan akhir, laju oven, flow rate, tegangan elektron multiplier, perbedaan analis, perbedaan merk , dan MSTFA) diperiksa. Perbandingan luas puncak dari EZE ke IS terpilih sebagai respon.2.6.7 analisis statistikAnalisis statistik hasil dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak statistik Minitab. Perbedaan-perbedaan antara kelompok-kelompok diuji oleh one-way ANOVA (F-test) pada P = 0,05.

3. Hasil dan Diskusi3. 1 Optimasi Kondisi DerivatisasiEZE butuh diderivatisasi untuk menjadi stabil dan mudah menguap pada suhu tinggi sebelum analisis GC-MS. Untuk tujuan ini, dilakukan reaksi derivatisasi yang berbeda (sililasi, metilasi, dan asetilasi). Reaksi derivatisasi dilakukan pada suhu (60 dan 80 oC) dan waktu (30, 60, dan 120 menit) berbeda. Nilai peak area diperoleh untuk setiap kondisi reaksi yang direncanakan dan digunakan untuk memantau hasil turunan EZE yang baru.Dalam reaksi sililasi, MSTFA, MSTFA / imidazol, MSTFA / -mercaptoethanol / NH4 I, BSA / TMCS, MSHFBA / TMCS, dan MTBSTFA / TMCS digunakan sebagai reagen sililasi. Reagen-reagen tersebut membentuk turunan trimetilsilil eter yang baru (OTMS) dengan mengganti hidrogen aktif EZE dengan grup TMS, kecuali MTB-SFTA / TMCS. Untuk reaksi sililasi, nilai-nilai peak area pada waktu dan suhu yang berbeda diperlihatkan pada Gambar 1.Asetilasi juga telah dilakukan. Dengan teknik ini, hidrogen aktif EZE digantikan oleh gugus tri fluoroasetil (TFA) dan diperoleh turunan baru bis-OTFA dari EZE. Reaksi asetilasi telah dicoba pada suhu (60 dan 80 oC) dan waktu (30, 60, dan 120 menit) berbeda dan nilai peak area-nya dievaluasi (Gambar 1).Dalam reaksi metilasi, tidak didapatkan produk derivatisasi.Membandingkan hasil reaksi antara reaksi sililasi dan asetilasi, reaksi sililasi lebih efisien sesuai dengan hasil turunan EZE yang baru. Dibandingkan secara statistik, ketika direaksikan menggunakan MSTFA / imidazol dan MSTFA / -mercaptoethanol / NH4 I pada 80 oC selama 60 menit tidak ada perbedaan yang signifikan dari hasil reaksi (P> 0,05). Pengulangan derivatisasi (n=12) dievaluasi dengan RSD, peak area sebesar 1,10% dan 4,68% masing-masing untuk MSTFA / -mercaptoethanol / NH4 I dan imidazol / MSTFA. Oleh karena itu, diputuskan untuk derivatisasi EZE dengan menggunakan MSTFA / -mercaptoethanol / NH4 I pada 80 oC selama 60 menit.Fase padat dan ekstraksi cair-cair digunakan untuk mengekstraksi EZE dari plasma manusia. Telah diuji pada berbagai jenis sorben fase padat (Oasis HLB, Strata X, C18, dan C8) dan berbagai kondisi. Diketahui bahwa Oasis HLB dan Strata X memberikan recovery yang lebih tinggi (53% -65%) dibandingkan dengan C18 dan C8.Dalam ekstraksi cair-cair telah dicoba menggunakan 4 mL heksana, metil tertbutyl eter, etil asetat, dan diklorometana. Eter terpilih sebagai pelarut ekstraksi karena diperoleh recovery yang lebih tinggi. Kemudian ekstraksi diteliti pada pH berbeda (5, 8, dan 9) menggunakan eter. Gangguan senyawa endogen dari plasma dipantau pada pH 5. Nilai recovery dihitung pada pH 8 dan 9 dan tidak ada perbedaan yang signifikan (uji ANOVA, P> 0,05).Maka diputuskan bahwa buffer karbonat 500 L (pH 9) dan 4 ml metil tertbutyl eter adalah pilihan terbaik karena memiliki recovery (97,66%) dan presisi (RSD