manual de tec. inmunohematologicas 2013

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MANUAL DE PRACTICAS DE INMUNOHEMATOLOGIA

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INDICE

INTRODUCCION……………………………………. 2

OBJETIVO GENERAL………………………………. 4

INDICE DE PRACTICAS……………………………. 5

CREDITOS DE ELABORACION……………………42

VALIDACION………………………………………….43

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1.INTRODUCCIÓN

Los conocimientos teóricos de la respuesta inmunológica

se han empleado desde su función protectora contra la

infección hasta su papel como causa de varias

enfermedades inmunológicas importantes.

Estas enfermedades pueden deberse a interacciones con

antígenos extrínsecos (enfermedades alérgicas y por

inmunocomplejos) ó intrínsecos( enfermedades

autoinmunes).

La falla de la respuesta inmunológica o un cambio maligno

puede producir enfermedades. La inmunidad protectora y

la producción de la enfermedad en cierto modo son

productos coincidentes de una función biológica aun mas

fundamental de la inmunidad como el proceso fisiológico

básico que permite distinguir las moléculas extrañas de los

constituyentes del propio ser.

Todas las células tienen cierta capacidad de

reconocimiento, y en los vertebrados ésta función reside en

un órgano especial, “el aparato inmunológico”. Este se ha

especializado para desempeñar su función con gran

eficacia interactuando diferentes tipos de células.

Esta gran aceptación de la Inmunología se debe al lugar

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creciente que ocupan los conceptos y técnicas de

la Inmunología en las ciencias biológicas y en

todos los sectores de la medicina.

Este manual de prácticas para alumnos de cuarto semestre

de la especialidad de Laboratorio Clínico, tiene la finalidad

de que cuenten con las técnicas inmunológicas que les

ayuden a encontrar las causas probables de enfermedades

infecciosas, dotándolos de datos valiosos para dar un

diagnóstico del estado actual del paciente, apoyándose en

parámetros ya establecidos de valores normales ó de

referencia.

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I. OBJETIVO GENERAL

Aplicar las técnicas Inmunohematológicas accesibles de laboratorio

Que ayude al alumno a tener un conocimiento mas completo de

las reacciones inmunológicas.

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II. INDICE DE PRACTICAS

Práctica No. Titulo de la Práctica Página

1 Determinación de Grupo Sanguíneo6

2 Reacciones Febriles 113 Factor Reumatoide 164 HGC 215 Determinación de VDRL 256 Determinación de PCR 307 Determinación de Antiestreptolisinas 36

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Práctica No.

1

Titulo de la Práctica:

Determinación de Grupo Sanguíneo

Fecha de realización:Marzo 2013

Ubicación:Técnicas Inmunohematológicas

Unidad: II Temas:

Métodos de Aglutinación activa directa.

1.- OBJETIVO DE LA PRÁCTICA:

Aplicar la metodología de los grupos sanguíneos para conocer los diferentes aglutinógenos encontrados en los glóbulos rojos del individuo.

2.- INTRODUCCIÓN:

Los antígenos de grupos sanguíneos son de naturaleza proteica, casi siempre forman parte integral de la membrana del glóbulo rojo. Se les llaman también aglutinógenos y representan una característica hereditaria, y no cambian durante la vida. Se han descubierto muchísimos aglutinógenos diferentes.

3.- FUNDAMENTO DEL MÉTODO

La prueba se basa en la unión de un aglutinógeno presente en la superficie de los eritrocitos con un anticuerpo específico que da como resultado la aglutinación de los eritrocitos.

4.- MATERIALES A UTILIZAR:

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CANTIDAD DESCRIPCIÒN1 Placa de vidrio para grupo sanguíneo1 Torunda con alcohol1 Torniquete1 Jeringa de 3 ml1 Tubo vacutainer de BH 1 Pipeta pasteur1 bulbo2 Aplicadores5 Tubos de ensaye

5.- EQUIPO A UTILIZAR:

CANTIDAD DESCRIPCIÒN1 Centrífuga

6.- MATERIAL BIOLÓGICO

CANTIDAD DESCRIPCIÒN3 ml. Sangre con anticoagulante

7.- REACTIVOS:

CANTIDAD DESCRIPCIÒN1 Suero hemotipificador anti A1 Suero hemotipificador anti B1 Suero hemotipificador anti AB1 Suero hemotipificador anti D1 Solución salina fisiológica al 0-85%

8.- RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA (MATERIAL BIOLÓGICO):

Sangre Venosa

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Se extrae sangre venosa por las técnicas conocidas y se deposita en un tubo de ensaye con anticoagulante y se mezcla

9.- DESCRIPCIÓN DE LA PRÀCTICA 1.- Obtener 3 ml de sangre venosa..2-- Se puede usar sangre total o bien una suspensión de glóbulos rojos al 2-5% en solución salina fisiológica o en su propio suero ó plasma.3- Colocar una gota de sangre total a cada uno de los 4 círculos marcados en la placa de vidrio.4.- Adicionar a cada gota de sangre una de cada uno de los antisueros en el siguiente orden: anti A, anti B, anti AB, anti D.5.- Usando un aplicador de madera distinto para cada suero mezcle bien e incline suavemente la placa a uno y a otro lado.6.- Observe si hay aglutinación. No lea por mas de dos minutos.

Método en tubo:1.- Prepare una suspensión de glóbulos rojos al 2-5% usando solución salina fisiológica al 0.85% o bien el propio suero o plasma de la muestra desangre-2.- Marcar cada uno de los tubos como anti A, anti B, antiAB Y anti D respectivamente-3.- Colocar una gota de la suspensión de eritrocitos a cada uno de los cuatro tubos.4.- Adicionar una gota de cada uno de los antisueros en el orden antes mencionados.5- Mezcle y centrifugue a 1500 rpm durantes un minuto o bien a 3400 rpm por 20 segundos.6.- Resuspender suavemente cada uno de los cuatro tubos.7.- Observar si hay aglutinación.

10.- INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS Las reacciones posibles son las siguientes:

Suero hemoclasificador Anti A Anti B Anti AB Grupo

- - - O+ - + A- + + B+ + + AB

11.- OBSERVACIONES

Existen causas de reacciones falsas + en la determinación del grupo ABO:. Cuando la placa de vidrio está sucia , con grasa..Es indispensable prevenir el crecimiento bacteriano en el suero, ya que esto ocasiona aglutinación bacteriogénica inespecífica.

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12.- NOTAS IMPORTANTES

Recordar que existen dentro de los mismos grupo sanguíneos, subtipos de los mismos.

13.- ACTIVIDADES

Anota tus resultados. Informa tus resultados Comenta conclusiones con tus compañeros. Contesta el siguiente cuestionario. Completa el glosario de términos.

CUESTIONARIO

1.- Que tratas de identificar en un grupo sanguíneo?2.- Cuantos sistemas tiene el sistema ABO?¿Cuales son?3.- Cuantos sistemas de grupo sanguíneo existen?Menciona al menos 5 de éstos.4.- Cual es la importancia de realizar el grupo sanguíneo en un paciente?5.- Una persona que es del grupo O que tipo de aglutinógenos y de aglutininas tiene en su sangre?

14- GLOSARIO DE TERMINOSAglutinogeno.- Aglutininas.-Reacción Ag-Ac.-

15.- BIBLIOGRAFÍA ESPECÌFICA

AUTOR TÌTULO EDITORIAL

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1.- INMUNOLOGIA. Biología y Patología del sistema inmune.

1.- J.R. Regueiro González. C. López Larrea S. González Rodriguez.

1.- .- 3ª. Edición Editorial Panamericana.

2.- INMUNOLOGIA 2.- Oscar Rojas Espinoza 2.- 2ª Edición 2001. Editorial Panamericana.

3.- FUNDAMENTOS DE INMUNOLOGIA 3.- Nemirovsky Mario S. 3.- Trillas México 2003

4.- INMUNOLOGIA CELULAR y molecular

4.- Abbas Abul K. 4.- Mc Graw Hill España 2002.

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Práctica No.

2

Titulo de la Práctica:Reacciones Febriles


Ubicación:

Unidad: 2 Temas: 2.1- 2.4

2.1 Aplicar técnicas de laboratorio


Conocer la metodología de las reacciones febriles.

2.- INTRODUCCIÓN:

Las reacciones febriles son útiles para el diagnóstico de muchas enfermedades tales como: fiebre tifoidea, paratifoidea, tifo y enfermedades producidas por otras rickettsias.Los procesos febriles provocados por distintos microorganismos pueden diagnosticarse por el laboratorio sea por el descubrimiento del agente causal o por el hallazgo de los anticuerpos generados durante el transcurso de la infección.Las reacciones de aglutinación se emplean con frecuencia en el estudio de infecciones provocadas por distintos gérmenes: Salmonellas, Brucellas, etc.La temperatura aumenta considerablemente y aparecen otros síntomas igualmente inespecíficos, dificultando enormemente el diagnóstico de la enfermedad. Tal es el caso de la fiebre tifoidea causada por Salmonella typhi; las paratifoideas causadas po S. paratyphi A y S. paratyphi B; la fiebre de malta causada por Brucella melitensis y tifo causado por rickettsia prowasekii.Cada uno de éstos microorganismos inducen una respuesta humoral produciendo anticuerpos que se identifican fácilmente con antígenos específicos. En el caso de Rikettsia prowasekii es muy difícil contar con antígenos provenientes de ella, pero se utiliza Proteus OX 19 el cual posee determinantes antigénicos comunes con la rikettsia.Para la determinación de los anticuerpos se utiliza el suero del enfermo y antígenos purificados. El título de anticuerpos depende del tipo y curso de la enfermedad.

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Estas reacciones se basan en el hecho de que cuando el organismo humano es invadido por agentes infecciosos, responde produciendo anticuerpos aglutinantes contra ellos, los cuales se ponen de manifiesto al entrar en contacto el anticuerpo con el antígeno específico.


CANTIDAD DESCRIPCIÒN1 Lámpara1 Agitador mecánico1 Placa de vidrio4 Aplicadores2 Torundas1 Torniquete1 Jeringa de 5 ml1 Tubo vacutainer de tapón rojo


CANTIDAD DESCRIPCIÒN4 Cronómetros


CANTIDAD DESCRIPCIÒNSuero humano

7.- REACTIVOS:

CANTIDAD DESCRIPCIÒN1 Antígeno “O” ( somático)1 Antígeno “H” ( flagelar)1 Antígeno paratyphi A1 Antígeno paratyphi B1 Antígeno Brucella1 Antígeno Proteus OX 19

8.- RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA (MATERIAL BIOLÓGICO): Sangre por punción venosa.

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9.- DESCRIPCIÓN DE LA PRÀCTICA: 1.- Realizar la toma de muestra y obtener 5 ml de sangre total.2. Dejar coagular y centrifugar el tubo a 3400 rpm durante 3 minutos. Separa el suero en otro tubo de ensaye limpio.3.- En la placa de vidrio colocar 0.02 ml ( 20 microlitros) de suero problema en cada una de las 6 divisiones ó circulos de la placa.4.- Adicionar a cada división o circulo una gota de cada uno de los 6 antígenos en el orden siguiente: Antígeno “O” , Antígeno “H” , Antígeno paratyphi A, Antígeno paratyphi B, Antígeno Brucella , Antígeno Proteus OX 19.5.- Mezclar bien todas las divisiones o círculos con aplicadores diferentes.6.- La placa se oscila en un agitador mecánico durante 4 minutos.7.- Observar si hubo aglutinación en cada uno de los círculos ayudándose con la luz de una lámpara.8.- En caso de que aparezca aglutinación de alguno de los antígenos con alguno de los sueros, se toma otra placa y en ella se depositan los siguientes volúmenes de dicho suero y antígeno:

_______________________________________________________________

No Div. Ml de suero Volúmen de antígeno Titulo1 0.02 1 gota 1:802 0.01 1 gota 1:1603 0.005 1 gota 1: 3204 0.0025 1 gota 1:640

9.- Se agrega una gota del antígeno positivo a cada dilución, mezclar bien con aplicadores diferentes y agitar 4 minutos.10.- Observar la aglutinación . La lectura de la misma no debe de exceder de 2 minutos.

10.- INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS El título del suero se informa como la recíproca de la dilución mas alta en la que todavía se observa aglutinación.Las lecturas se harán con una fuente de luz indirecta observando la aglutinación macroscópica.

El criterio de positividad se determina por la menor cantidad de suero capaz de producir 50% de aglutinación.Cualquier título mayor de 1: 160 debe ser considerado como positivo.

11.- OBSERVACIONES

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La mayoría de los sueros considerados como normales pueden mostrar títulos de 1:20, 1:40 y casualmente 1:80. 12.- NOTAS IMPORTANTES

La presencia de títulos bajos pueden deberse a vacunaciones ó infecciones pasadas o subclínicas del paciente.La mejor indicación de un proceso activo lo marca dos titulaciones sucesivas con una diferencia importante entre el primer y segundo título aunque también se observe esto en personas convalescientes.

13.- ACTIVIDADES


CUESTIONARIO1.- Dé un concepto de las reacciones febriles.2.- Explique el fundamento de la práctica de las reacciones febriles.3.- Qué tipo de enfermedades identificamos al realizar ésta prueba de laboratorio.4.- Como se llama la enfermedad que resulta de dar positivo en proteus OX19.5.- Interprete el siguiente resultado: Tifico O 1:160, Tífico H 1: 320

14- GLOSARIO DE TERMINOS

.15.- BIBLIOGRAFÍA ESPECÌFICA

AUTOR TÌTULO EDITORIAL1.- INMUNOLOGIA. Biología y Patología del sistema inmune.

1.- J.R. Regueiro González. C. López Larrea

1.- .- 3ª. Edición Editorial

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S. González Rodriguez.

Panamericana.





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Práctica No.

3

Titulo de la PrácticaFactor Reumatoide Fecha de

realización:Mar2013

Ubicación:

Unidad: 2 Temas: 2.1- 2.2

Manejar técnicas de laboratorio de aglutinación pasiva indirecta.


Aplicar la metodología de la técnica adecuada para realizar técnicas de laboratorio para detectar la presencia de anticuerpos en pacientes con Artritis Reumatoide.

2.- INTRODUCCIÓN:

Es el anticuerpo mas importante detectado en la artritis reumatoide . Puede ser de tipo IGM, IgG e IgA, principalmente. El FR no es específico de la Artritis reumatoide y se encuentra con distinta incidencia y con títulos no muy elevados en pacientes con Lupus eritemataoso sistémico, tuberculosis, lepra, sífilis, leishmaniasis y aún en individuos normales.Para estudiar la presencia del FR se emplea una metodología variada, del cual el mas simple es el que utiliza la aglutinación de partículas de látex, bentonita o glóbulos rojos cubiertos con globulina humana.


En la artritis reumatoide, otras enfermedades vasculares de la colágena, endocarditis infecciosa activa y algunos padecimientos distintos, el “factor reumatoide” está presente en el suero. Es una IgM o IgG con reactividad de anticuerpo para la IgG humana.El factor reumatoide se detecta en los pacientes por medio de partículas de látex que están cubiertas con la fracción gammaglobulina humana, que precipitan en contacto con el suero del pacientes con artritis reumatoide que contiene una sustancia parecida a un anticuerpo de alto peso molecular, llamado Factor reumatoide.

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CANTIDAD DESCRIPCIÒN1 Cronómetro1 Lámpara de luz intensa


CANTIDAD DESCRIPCIÒN


CANTIDAD DESCRIPCIÒN3 ml. Sangre con anticoagulante

7.- REACTIVOS:

CANTIDAD DESCRIPCIÒN1 Antígeno adsorbido a partículas de látex1 Suero control positivo1 Suero control negativo1 Diluyente Concentrado(regulador glicina-salina pH 8.2

concentrado1 Placa de reacción


Sangre Venosa

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Se extrae sangre venosa por las técnicas conocidas y se deposita en un tubo de ensaye con anticoagulante y se mezcla

9.- DESCRIPCIÓN DE LA PRÀCTICA METODO CUALITATIVO:El látex debe de estar a temperatura ambiente antes de ser utilizado1.- Colocar en una gradilla 1 tubo de13x1002.- Depositar 1 ml del frasco No 4( diluyente concentrado) diluido.3.- Añadir 0.05 ml de suero problema.4.- Después de haber agregado el suero problema, la dilución obtenida es 1:20 y está lista para su uso.5.- En un anillo de la placa depositar 0.05 ml del suero diluido.6.- En otro anillo depositar una gota del frascoNo 2 ( suero control positivo)7.- En un tercer anillo depositar una gota del frasco No 3 ( suero control negativo)8.- Añadir a cada uno de los 3 anillos una gota del frasco No 1( látex) previamente resuspendido.9.- Mezclar manualmente la placa de reacción durante 2 minutos.10.- Realizar la lectura del resultado en este momento bajo una fuente de luz directa.

VALORES DE REFERENCIA: Negativo.

10.- INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS RESULTADO POSITIVO: Presencia de agregados macroscópicos ( aglutinación comparable al control positivo)RESULTADO NEGATIVO: Ausencia de agregados macroscópicos ( sin aglutinación comparable al control negativo)

11.- OBSERVACIONES

Deben tomarse en cuenta las posibles causas de aglutinación inespecíficcas tales como:.Lecturas posteriores a los 3 minutos de efectuada la mezcla de suero y el látex.Suero con fibrina..Suero alto en contenido de lípidos.


Sueros provenientes de personas sanas pueden presentar reacciones falsas positivas.

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13.- ACTIVIDADES


CUESTIONARIO1. Qué es el factor reumatoide?

2.- Que tipo de enfermedades también nos dan un título de anticuerpos elevado al realizar ésta técnica?

3. Qué tipo de inmunoglobulina representa el anticuerpo del Factor reumatoide?

4. Menciona algunas caracteristicas de la artritis reumatoide como enfermedad.


Factor Reumatoide.-



1.- J.R. Regueiro González. C. López Larrea


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S. González Rodriguez.

2.- INMUNOLOGIA 2.- Oscar Rojas Espinoza2.- 2ª Edición 2001. Editorial Panamericana.




Práctica No.

4

Titulo de la Práctica:Determinación de Pregnosticón

( Prueba de Embarazo)

Fecha de realización:Marzo2013

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Ubicación:

Unidad: 2 Temas: 2.1-2.4



Conocer la técnica para determinar la glucoproteína gonadotropina coriónica humana.

2.- INTRODUCCIÓN:

La HGC es una glucoproteína producida por las células trofoblásticas después de aproximadamente 10 días de la concepción.Después de la concepción se produce un rápido aumento en la cantidad de HGC en la orina aproximadamente a las cinco semanas de gestación ( 5 semanas después del último periodo menstrual), que alcanza los niveles máximos en un tiempo aproximadamente de 10 semanas de gestación. Las semanas de gestación se refieren a las semanas después de la concepción, ya que ésta fecha es mas difícil de determinar con certeza.A medida que la producción de estrógenos y progesterona aumenta por la placenta durante el segundo trimestre, los niveles de HGC descienden. Este nivel constituye constituye la medida mas lógica para la pronta confirmación de un embarazo.3.- FUNDAMENTO DEL MÉTODO

Los eritrocitos, previamente son sometidos a un tratamiento especial con gonadotrofina coriónica humana( antígeno), actúan com portadores de éste antígeno. Al adicionar el antisuero correspondiente se produce una reacción inmunoquímica dando lugar a un patrón de sedimentación homogénea de los eritrocitos. La adición simultánea del antígeno libre en forma de HGC, tal como se presenta en la orina de mujeres embarazadas, bloquea los anticuerpos e impide la reacción con los eritrocitos.


CANTIDAD DESCRIPCIÒNTubo de ensaye de 13x 100Pipetas de 1 ml

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GradillaPapel filtroPapel filtro suave Whatman




CANTIDAD DESCRIPCIÒNOrina

7.- REACTIVOS:

CANTIDAD DESCRIPCIÒNSuero anti HGCEritrocitos contenidos en el tubo para la prueba


Sangre Venosa

Recolectar orina , de preferencia la primera de la mañana por ser la mas concentrada, en un frasco perfectamente limpio.

9.- DESCRIPCIÓN DE LA PRÀCTICA 1.- Filtre una pequeña cantidad de orina (5-8 ml). Se aconseja emplear papel filtro suave, de preferencia Whatman.Como otra alternativa, la orina puede centrifugarse durante 5-10 minutos a 3000ó 4000 rpm.

2.- Con una pipeta introdúzcase 0.1 ml de ésta orina en un tubo abierto,( una vez abierto un tubo, debe utilizarse de inmediato para garantizar la estabilidad de los reactivos)3.- Añádase a continuación con una pipeta de 0.4 ml de solución amortiguadora.

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4.- Agítese el tubo durante 1 minuto y colóquese en la gradilla con espejo inferior5.- Deje reposar la gradilla con el tubo( o tubos) durante dos horas, sin cambiarla de lugar, ni moverla.6.- A continuación puede leerse el resultado de la prueba en el espejo de la parte inferior de la gradilla.

VALORES DE REFERENCIA:El resultado es un patrón de sedimentación específico en forma de un anillo claramente definido( resultado positivo).Si en la orina no hay gonadotrofina coriónica humana o si la hay en cantidad insuficiente, aparece un patrón de sedimentación difuso, de color amarillo pardo ( la prueba es negativa).

10.- INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS Si la mujer está embarazada aparece un anillo claramente definido. Si el diámetro del anillo es mayor y éste anillo es mas vago y de contornos menos definidos, se considera el resultado como dudoso y debe repetirse la prueba aproximadamente al cabo de una semana.

POSITIVO NEGATIVO11.- OBSERVACIONES

Se debe hacer la lectura después de 2 horas de realizada la prueba. Sin embargo puede ocurrir que algunas horas después de la lectura de un resultado negativo, aun se forme un anillo mas o menos vago. Este fenómeno puede indicar que la cantidad de HGC presente en la muestra de orina se encuentra en el límite de las cantidades demostrables; sin embargo en tal caso no puede sacarse ninguna conclusión.


El tubo o los tubos ( según sea el número de pruebas) deben colocarse en un lugar completamente libre de vibraciones, y hacer la lectura sin mover la gradilla.

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13.- ACTIVIDADES


CUESTIONARIO

1.- Hacer un breve resúmen de la HGC.2.- 14- GLOSARIO DE TERMINOS

Traumatismo. Lesión que sufre la vena durante la extracción dela sangre. 15.- BIBLIOGRAFÍA ESPECÌFICA








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Práctica No.

5

Titulo de la Práctica:Determinación de VDRL

Fecha de realización:Marzo2013

Ubicación:

Unidad: 2 Temas: 2.1-2.4



Determinar la presencia de reaginas en el organismo de personas que padecen sífilis y otras enfermedades.

2.- INTRODUCCIÓN:

La sífilis es una enfermedad generalizada, producida por Treponema pallidum, transmitida habitualmente por contacto sexual. El diagnóstico descansa en la serología; los métodos determinan dos clases de anticuerpos: 1) tipo cardiolipina, no treponema é inespecíficos y 2) Los antitreponemas específicos. La facilidad para su determinación ha hecho que los del tipo cardiolipina se utilicen universalmente en las exploraciones iniciales ya sean exámenes individuales o encuestas de población; la variante técnica mas comúnmente empleada es la llamada VDRL( Venereal Disease Reseach Laboratory) que determina la floculación en placa( cualitativa) del antígeno con cardiolipina y lecitina. La cardiolipina y la lecitina son dos sustancias reactivas que se aíslan a partir del músculo del corazón del buey, conduciendo al antígeno mas específico utilizado en la actualidad en la prueba de VDRL.La reagina es una sustancia que aparece en la sangre y LCR de personas que padecen sífilis y otras enfermedades como el mal de pinto, lepra y paludismo.Cuando se mezcla un suero que contiene reaginas con el antígeno no treponémico, las partículas de emulsión floculan formando agregados fácilmente que podemos observar a través del microscopio.



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CANTIDAD DESCRIPCIÒNPlaca cóncava ( indispensable)Agitador mecánicoCronómetroPipetas automáticas de 50 microlitrosPipeta volumétrica de 1ml


CANTIDAD DESCRIPCIÒN1 Microscopio


CANTIDAD DESCRIPCIÒN3 ml. Sangre por punción venosa. Centrifugar y separa el suero.

7.- REACTIVOS:

CANTIDAD DESCRIPCIÒNAntígeno en suspensión estabilizadoControl positivoControl negativoAguja No 21 sin bisel


Sangre Venosa

Se extrae sangre venosa por las técnicas conocidas.

9.- DESCRIPCIÓN DE LA PRÀCTICA Método cualitativo:1.- En un anillo de una placa cóncava deposite o.05 ml de un suero problema ( 50 microlitros).2.- En anillos diferentes colocar una gota de suero control positivo y en otra por separado una gota de suero control negativo.

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3.- Añadir una gota del antígeno en suspensión estabilizado previamente resuspendido, en cada una de las 3 muestras, utilizando la aguja No 21 sin bisel.4.- Colocar la placa sobre un agitador mecánico a 180 rpm DURANTE 4 MINUTOS. Las pruebas realizadas en un clima extremadamente seco puede provocar la evaporación de las muestras, por lo tanto la placa en rotación puede ser cubierta con una tapa de caja petri humedecida previamente con una gasa.5.- Leer inmediatamente al microscopio con objetivo y ocular 10X.

Valores de Referencia:

NEGATIVO

10.- INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS No se observan grumos………………………….NegativoPequeños agregados……………………………..Positivo débilAgregados medianos o grandes…………………Positivo

Método cuantitativo:1.- Seleccionar los sueros positivos obtenidos en la prueba cualitativa.2.- Colocar en una gradilla 6 tubos de 12x75mm y numerarlos.3.- Agregar a cada uno 0.5 ml de solución salina isotónica al 0.9%4.- Depositar 0.5 ml de suero al tubo No 1 y mezclar.5.- Pasar 0.5 ml del tubo No1 al Tubo No2 y mezclar.6.- Pasar 0.5 ml del tubo No2 al al tubo No 3, mezclar7.- Continuar ésta operación hasta el tubo No 6.Eliminar 0.5 ml del último tubo para que todos tengan el mismo volumen.8.- Depositar 0.5 ml de cada una de las diluciones sobre los diferentes anillos del la placa cóncava.9.- Añadir una gota del antígeno en suspensión estabilizado(VDRL) utilizando la aguja No 21 sin bisel a cada una de las diluciones.10.- Colocar la placa sobre un agitador mecánico a 180 rpm durante 4 minutos.11.- Leer al microscopio con objetivo ocular 10X.

Interpretación de resultados:

El título del suero problema será la última dilución que presente el resultado positivo, de acuerdo al cuadro siguiente:

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No TUBO DILUCION1 1/22 1/43 1/84 1/165 1/326 1/64

11.- OBSERVACIONES

El suero con exceso de reaginas pueden ocasionar reacción atípica ( grumos de tamaño irregular). Es recomendable diluir el suero en solución salina y probar nuevamente.


Sueros extremadamente turbios o hemolizados son insastifactorios para la prueba.2. Sueros débiles positivos y con fuertes evidencias clínicas de la enfermedad es conveniente efectuar la prueba cuantitativa, ya que ocasionalmente pueden presentar el fenómeno de prozona.3.- El antígeno en suspensión debe de estar a temperatura ambiente antes de ser utilizado.

13.- ACTIVIDADES


CUESTIONARIO1.- Qué significan las siglas VDRL?

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2.- Porqué decimos que la prueba de VDRL es una prueba inespecífica?3.- Qué otras técnicas podemos utilizar para determinar la presencia de reaginas y/o al agente causal de la enfermedad venérea?4.- Menciona el agente causal de la sífilis?5.- Describe brevemente lo que es la sífilis.


Prueba específica.-Prueba inespecífica.-









Práctica No.

6

Titulo de la Práctica:Determinación de Proteína C. Reactiva


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Ubicación:

Unidad: 2 Temas: Manejar técnicas de laboratorio de

aglutinación pasiva indirecta1.- Objetivo:

Aprender a manejar técnicas de laboratorio de aglutinación pasiva indirecta.

2.- INTRODUCCIÓN:

Tillet y Francis concluyeron en 1930 que la reacción que se origina en el suero de pacientes que sufren de enfermedadesinflamatorias precipita con un extracto de pneumococo noproteico llamado polisacárido C. La proteína que causa este tipo de reacción fue llamada Proteína “C” Reactiva.Como un fenómeno no específico, el incremento en lconcentración de Proteína C Reactiva se puede presentar en cualquier proceso inflamatorio agudo (ya sea infeccioso o no infeccioso). La concentración de Proteína C Reactiva generalmente se encuentra por debajo de 6 mg/L en el suero de adultos sanos y en enfermedades inflamatorias estos valores frecuentemente se incrementan en un lapso de 4 a 8 horas después de presentarse un evento agudo alcanzando niveles aproximadamente de 20 a 500 mg/L.Varios métodos de inmunoprecipitación se han desarrollado para la detección de Proteína C Reactiva. El principio del procedimiento presentado involucra una reacción inmunológica entre la Proteína C Reactiva (como antígeno) y el anticuerpo correspondiente adsorbido a las partículas de látex (látex sensibilizado con anti-Proteína “C” Reactiva).


La proteína C. Reactormal que aparece en la sangre de personas que han pasado por una fase aguda producida por distintas enfermedades inflamatorias. Se valora por reacciones de precipitación usando como reactivo suero anti proteína C reactiva.ó bien con partículas de látex revestidas de antisuero antiproteína C.

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CANTIDAD DESCRIPCIÒN- CronómetroLámpara de luz intensaPlaca de vidrioaplicadores


CANTIDAD DESCRIPCIÒNAgitador mecánico


CANTIDAD DESCRIPCIÒN5 ml. Obtener 3.0 mL de sangre por punción venosa.

Centrifugar y separar el suero.

7.- REACTIVOS:

CANTIDAD DESCRIPCIÒNAntisuero adsorbido a partículas de látex. (látex anti-PCR)Suero Control PositivoSuero Control NegativoDiluyente Glicina Salina, concentrado, pH 8.2Placa de reacción

8.- RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA (MATERIAL BIOLÓGICO): Sangre VenosaSe extrae sangre venosa por las técnicas conocidas.

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9.- DESCRIPCIÓN DE LA PRÀCTICA

Preparación del Diluyente Glicina Salina Concentrado:El frasco de Diluyente Glicina Salina Concentrado se afora con agua destilada al volumen suficiente según corresponda la presentación. Ejemplo:- 50 mL (para 50 pruebas)- 100 mL (para 100 pruebas)- 40 mL (para 40 pruebas), etcétera

MÉTODO CUALITATIVO:

NOTA: El látex Anti-PCR debe estar a temperatura ambiente antes de ser utilizado.

1. Colocar en una gradilla un tubo de 13 x 100 mm.2. Agregar 0.95 mL del frasco No. 4 (Diluyente glicina-salina concentrado pH 8.2) diluido.3. Añadir 0.05 mL del suero problema.4. Después de haber agregado el suero problema, la dilución obtenida será 1:20 y estará lista para su uso.5. En un anillo de la placa depositar 0.05 mL del suero diluido.6. En otro anillo depositar una gota del frasco No. 2 (suero control positivo).7. En un tercer anillo depositar una gota del frasco No. 3 (suero control negativo).8. Añadir a cada uno de los 3 anillos una gota del frasco No. 1 (Látex anti-Proteína «C» Reactiva) previamenteresuspendido.9. Mezclar manualmente la placa de reacción durante 2 minutos.10. Realizar la lectura del resultado en este momento bajo una fuente de luz directa.

Interpretación

Resultado PositivoPresencia de agregados macroscópicos (aglutinacióncomparable al control positivo).

Resultado NegativoAusencia de agregados macroscópicos (sin aglutinación,comparable al control negativo). La no aglutinación o una ligeraaparición de granulocidad que no exceda a la observada enel control negativo indican un resultado negativo.

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MÉTODO SEMICUANTITATIVO1. Seleccionar los sueros positivos obtenidos en la prueba cualitativa.2. Colocar en una gradilla 5 tubos de 12 x 75 mm y numerarlos.3. Depositar al tubo No. 1, 0.95 mL del frasco No. 4 (Diluyente glicina-salina concentrado, pH 8.2) diluido.4. Depositar del tubo No. 2 al 5, 0.5 mL del frasco No. 4 (Diluyente glicina-salina concentrado pH 8.2) diluido.5. Añadir al tubo No. 1, 0.05 mL del suero problema dilución 1:20. Mezcle.6. Pasar 0.5 mL del tubo No. 1 al tubo No. 2. Mezcle.7. Pasar 0.5 mL del tubo No. 2 al tubo No. 3. Mezcle.8. Continuar esta operación hasta el tubo No. 5.9. Depositar 0.05 mL de cada una de las diluciones en anillos diferentes de la placa.10. Añadir una gota del frasco No.1 (látex Anti-Proteína «C» Reactiva) a cada una de las diluciones.11. Mezclar manualmente la placa de reacción durante 2 minutos.12. Realizar la lectura del resultado en este momento.

Valores de Referencia: NEGATIVO

10.- INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS El título del suero problema será la última dilución que presente agregados macroscópicos (aglutinación). Ejemplo :

TUBO/Dil 1 2 3 4 Resultado1:20 1:40 1:80 1:160+ - - - positivo1:20+ + - - positivo1:40+ + + - positivo1:80

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11.- OBSERVACIONES

1. No deben utilizarse sueros turbios, hemolizados o contaminadospara realizar la prueba.2. Para evitar falsos resultados NO es recomendable realizarla lectura después de los 2 minutos.


El plasma no es recomendable para la determinación.

13.- ACTIVIDADES


CUESTIONARIO

1Qué significado clínico tiene la presencia de ésta proteína C en el organismo de un individuo?2.- Cual es el fundamento de la práctica?3.- La PCR es una prueba específica ó inespecífica? Porque?4.- La fiebre reumática se considera una enfermedad autoinmune?5.- Describe brevemente ésta enfermedad.


PCR.- .

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Práctica No.

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Titulo de la Práctica:Determinación de Antiestreptolisinas


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Ubicación:

Unidad: 2 Temas: Aplicar metodología de

Reacciones de Neutralización.


Aplicar la metodología de la técnica adecuada para realiza

2.- INTRODUCCIÓN:

Casi todas las cepas de estreptococos grupo serológico A producen dos factores hemolíticos, estreptolisina O y S. Ambas son capaces de dividir( hemolizar) glóbulos rojos. Cuando un individuo tiene una infección estreptocócica grupo A la estreptolisina O estimula el desarrollo de anticuerpos específicos. Los títulos séricos de antiestreptolisina O pueden tener valor diagnóstico en pacientes que tienen o han tenido recientemente una infección estreptocócica grupo A.La estreptolisina O es una hemolkisina de origen lábil, activa frente a los eritrocitos humanos y a los del conejo. Esta estreptolisina es producida en su mayoría por las cepas Lancefield de estreptococos del grupo A, así por algunas cepas de los grupos C y G.


En las infecciones causadas por estreptococo Betahemolítico, se libera estreptolisina-O de la bacteria estimulando la producción de anticuerpos antiestreptolisina- O (ASO). La presencia y el nivel de estos anticuerpos en una muestra de suero pueden reflejar la naturaleza y severidad de la infección. Esta prueba de estreptolisina utiliza una suspensión buffer estabilizada de partículas de látex de poliestireno recubiertas con estreptolisina-O. Cuando el reactivo de látex se mezcla con una muestra de suero que contenga anticuerpos hacia estreptolisina-O, ocurre la aglutinación. El reactivo de látex es producido de manera de que la aglutinación tome lugar únicamente cuando el nivel de anticuerpos hacia estreptolisina-O sea igual o mayor a 200 IU/mL, estees un nivel indicativo de enfermedad por estudios clínicos y epidemiológicos.


CANTIDAD DESCRIPCIÒN• Cronómetro

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• Fuente de luz

• Tubos de prueba y gradillas (para la pruebasemicuantitativa)

• Pipetas serológicas (para la prueba semicuantitativa)

Agitador mecánico (opcional)

• Placa - 6 anillos

• Pipetas/agitadores desechables




CANTIDAD DESCRIPCIÒN5 ml. Sangre sin anticoagulante.

7.- REACTIVOS:

CANTIDAD DESCRIPCIÒNASO Reactivo de Látex (Tapa Blanca)Suspensión de partículas de látex de poliestirenorecubiertas con estreptolisina-O en un buffer salino

ASO Control Positivo (Tapa Roja)Suero humano estabilizado, conteniendo más de 200IU/mL de antiestreptolisina-O

Control Negativo (Tapa Verde)Suero humano estabilizado, conteniendo menos de100 IU/mL de antiestreptolisina-O.

Buffer Glicina-Salina (20x) ConcentradoSolución de glicina y cloruro de sodio, pH 8.2 ± 0.1.


Sangre Venosa

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9.- DESCRIPCIÓN DE LA PRÀCTICA

A. Método Cualitativo1. Lleve los reactivos y las muestras a temperatura ambiente.2. Agite suavemente el frasco del reactivo de látex para dispersar y resuspender las partículas delátex. No agitar excesivamente.3. Añada una gota de la muestra del paciente no diluida utilizando una de las pipetas desechables, en un círculo de la placa. También coloque una gota de los controles positivo y negativo en otros círculos separados dentro de la misma la placa.4. Agite suavemente el frasco de látex. Coloqueuna gota del reactivo de látex junto a la gota de la muestra de suero en cada una de los círculosocupados.5. Mezcle ambas gotas con el agitador/mezclador desechable incluido, cubriendo por completotoda la superficie del círculo.6. Agite manualmente la placa por 2 minutos de manera que la mezcla rote suavemente y despacio dentro de los círculos ó coloque la placa en un rotor automático a 80-100 r.p.m.7. Después de 2 minutos, examine cada círculo para observar la ausencia ó presencia de aglutinación.

B. Método Semi-Cuantitativo1.- Esta reacción puede ser utilizada para estimar la concentración de ASO utilizando una serie de diluciones.La muestra del paciente se diluye con un Buffer de Glicina-Salina como se muestra a continuación:

Después, cada dilución se prueba con el látex como se describió en la sección “A. Método Cualitativo”.

10.- INTERPRETACIÓN DE RESULTADOSA. Método Cualitativo:

La presencia de aglutinación indica una concentración de ASO mayor a 200IU/mL ± 20% en la muestra.

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Aquellas muestras en las que no haya presencia de aglutinación contienen concentraciones de ASO menores a 200 IU/mL.

B. Método Semi-Cuantitativo:

Se reporta la dilución mayor hasta que se observe aglutinación. El contenido de ASO de la muestra del paciente se toma de la siguiente tabla:Dilución de la Concentración deAglutinación ASO IU/mL (± 20%)1 :2 > 4001 :4 > 8001 :8 > 16001 :16 > 3200

VALORES ESPERADOS

Un nivel detectable de 200IU/ml de anticuerpos de Antiestreptolisina-O usualmente es el límite normal superior, ya que menos del 15-20% de los individuos sanos presentan títulos mayores de 200IU/mL al probar sus sueros. Los títulos elevados de ASO pueden estar asociados con “espondilitis anquilosante”, glomerulonefritis, fiebre escarlatina y tonsilitis.

Generalmente no se encuentra incremento de losniveles de ASO en el suero de pacientes con Artritis Reumatoide excepto durante episodios agudos.

11.- OBSERVACIONES

Los tiempos de reacción mayores a 2 minutos pueden dar resultados falsos positivos (debido al efecto de secado). Los sueros muy lipémicos pueden también causar reacciones no-específicas.La fuerza de la aglutinación no es indicativa de la concentración de ASO en la muestra. En el procedimiento de prueba cualitativo, pueden presentarsereacciones débiles con concentraciones elevadas muy marcadas. En los casos de un título de ASO con gran incremento (más de 2000 IU/mL), la aglutinaciónpuede ser inhibida debido a un exceso de anticuerpo (efecto de prozona). Cuando se esperan estas altas concentraciones de ASO, la muestra se debe probar diluida. Los resultados de esta prueba siempre deberán de interpretarse en conjunto con el perfil clínico y con los otros resultados de las pruebas delaboratorio. Un resultado negativo no excluye por completo el diagnóstico de una fiebre reumática exactamente o de una glomerulonefritis postestreptococcica


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13.- ACTIVIDADES


CUESTIONARIO










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IV. CREDITOS DE ELABORACIÓN

ESTE CUADERNO DE TRABAJO FUE ELABORADO

ACADEMIA DE LABORATORIO CLINICO

Q.F.B. XOCHITL DEL CARMEN RIOS OCHOAQ.B.P. EDGARDO ACEVEDO CASARRUBIASQ.F.B. MARIA ESTHER SANCHEZ SERRAQ.F.B. MIGUEL ANGEL QUIJANO QOUOHQ.F.B. PEDRO PERALES SABIDOQ.F.B. ANDRES BARRIENTOS ACOSTAQ.F.B. ESLY HERNANDEZ TORRESDR. MARIO ALBERTO LOPEZQ.F.B. ALEJANDRA GARCIA PANTOJAMVZ RAMON PICHARDO HERNANDEZ

V. VALIDACIÓN DEL CUADERNO DE PRÁCTICAS

PLANTEL: C.B.T.i.s. No. 32 PERÍODO ESCOLAR: FEB-JULIO 2013

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MÓDULO III: SUBMÓDULO 3.- APLICAR TECNICAS INMUNOHEMATOLOGICAS

SEMESTRE: IV

ACADEMIA LOCAL DE: Laboratorista Clínico

Q.F.B. MIGUEL A. QUIJANO COUOHPRESIDENTE DE LA ACADEMIA

(nombre y firma)

ACADEMIA ESTATAL DE: Laboratorista Clínico

Q.F.B. MARIA ESTHER SÁNCHEZ SERRAPRESIDENTE DE LA ACADEMIA

(nombre y firma)

Villahermosa, Tabasco a 30 enero de 2013

manual de tec. inmunohematologicas 2013

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