INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA “DR. MAURICIO RUSSEK BERMAN”

MANUAL DE LABORATORIO DE FISIOLOGÍA GENERAL (QFI)

8ª EDICIÓN

AGOSTO DE 2013

2   

AUTORES

Dra. Alva Sánchez Claudia

Biól. Avila Velarde Gerardo

Dra. Barrera Segovia Julia

Dr. Chuc Meza Eliézer

Dr. De la Cruz López Fidel

M. en C. Escalona Cardoso Gerardo Norberto

Dra. Franco Colín Margarita

Dra. Garcés Ramírez Linda

Dra. García Ramírez Martha

Biól. Guarneros Bañuelos Elizabeth

M. en C. Gutiérrez Lozano Ana Lilia

Dra. Ortiz Butrón María del Rocío Elizabeth

Dr. Pacheco Rosado Jorge

Dra. Paniagua Castro Norma

Dr. Ramírez San Juan Eduardo

Dr. Villanueva Becerril Iván

Dr. Zamudio Hernández Sergio Roberto

3   

ÍNDICE

Página ÍNDICE …………………………………………………………………………..……………… 3

PROGRAMA DE FISIOLOGÍA GENERAL, QFI ……………………………..…………….. 4

NORMAS DE LABORATORIO …………………………………………………………..…... 9

Práctica 1. Aspectos generales del manejo de animales de laboratorio y vías

de administración …………………………………………………………………………….. 10

Práctica 2. Conceptos básicos en homeostasis ………………………………………… 14

Práctica 3. Estudio de la penetración de sustancias a las células normales ………… 19

Práctica 4. Potencial de difusión y potencial de lesión ………………………..………… 23

Práctica 5. Potencial de acción, simulación por computadora ………….……………… 31

Práctica 6. Potencial de acción compuesto ……………………………………………… 37

Prácticas 7. Transmisión sináptica y 9. Músculo esquelético ………………..………… 45

Práctica 8. Modulación de una función celular por funciones químicas ……………… 52

Práctica 10. Propiedades del músculo cardiaco ………………………………………… 58

Práctica 11. Propiedades del músculo liso …………………………………….………… 64

APÉNDICE …………………………………………………………………..……………… 70

a) Manejo de animales de laboratorio ……………………………………………………… 70

b) Distribución de animales de laboratorio …………………………….………………… 72

c) Marcaje de animales de laboratorio ……………………………………………..……… 73

d) Vías de administración usadas en el curso ………………………………………..…… 74

e) Soluciones fisiológicas …………………………………………………….……………… 75

f) Soluciones empleadas en las prácticas …………………..…………………………… 76

g) Calibración del BIOPAC …………………………………………….…………………… 79

4   

PROGRAMA DE FISIOLOGÍA GENERAL, QFI

I. REGULACIÓN Y CONTROL (9 horas) 1. Sistemas, equilibrio y estado estable 1.1 Concepto de sistemas

1.2 Sistemas en equilibrio

1.3 Sistemas en estado estable o estacionario

2. Variables biológicas 2.1 Variables en estado estable

2.2 Variables reguladas

3. Sistemas con asas de información 3.1 Elementos constitutivos del asa de información

3.2 Retroalimentación y anteroalimentación

4. Variables reguladas y controladas 4.1 Diferencia entre regulación y control

4.2 Relación entre homeostasis y regulación

4.3 Homeorresis

II. LA CÉLULA COMO UN SISTEMA ABIERTO (7 horas) 1. Estructura de la membrana plasmática 1.1 Componentes químicos de la membrana

1.1.1 Funciones de las proteínas

1.1.2 Lípidos de membrana y fluidez de la membrana

1.1.3 Naturaleza dinámica de la membrana plasmática

2. Movimiento de sustancias a través de la membrana 2.1 Difusión simple

2.1.1 Difusión de agua

2.1.2 Difusión de iones

2.2 Difusión facilitada

3. Transporte activo

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3.1 Primario

3.2 Secundario

III. EXCITABILIDAD (10 horas) 1. Potencial de reposo de la membrana 1.1 Potencial de equilibrio electroquímico (ecuación de Nernst)

1.2 Equilibrio de Donnan

1.3 Bombas electrogénicas

1.4 Permeabilidad diferencial de las membranas

1.5 Ecuación de Goldman

2. Potencial de acción 2.1 Concepto de electrotono

2.2 Fases del potencial de acción y movimientos iónicos

2.2.1 Estructura y estados del canal dependientes de voltaje para sodio y

potasio

2.3 Periodos refractarios absoluto y relativo

2.4 Propagación del potencial de acción

2.4.1 Conducción en fibras amielínicas

2.4.2 Conducción en fibras mielínicas

IV. TRANSMISIÓN SINÁPTICA (8 horas) 1. Tipos de sinapsis 1.1 Sinapsis eléctrica

1.2 Sinapsis química

1.3 Mediadores ionotrópicos y metabotrópicos

2. Sinapsis excitadora (PPSE) 3. Sinapsis inhibidora (PPSI) 4. Modulación presináptica 5. Suma espacial, temporal e integración 6. La unión neuromuscular

6   

V. SEÑALIZACIÓN CELULAR Y TRANSDUCCIÓN DE SEÑALES (10

horas) 1. Naturaleza química de las señales 1.1 Señales hidrofílicas

1.2 Señales hidrofóbicas

2. Receptores acoplados a proteínas G y sus segundos mensajeros 2.1 Proteínas G heterotriméricas, inicio y terminación de la respuesta

2.2 Segundos mensajeros

2.2.1 AMPc

2.2.2 IP3 y DAG

2.2.3 GMPc

3. Calcio como mensajero intracelular 4. Óxido nítrico como mensajero intracelular 5. Receptores asociados a proteínas-tirosincinasa 5.1 Dimerización

5.2 Activación de la cinasa

5.3 Interacción de proteína-proteína dependiente de la fosfotirosina

5.4 La vía Ras-MAPK

6. Receptores intracelulares (respuesta a señales lipofílicas) 7. Regulación de la respuesta a las señales 7.1 Regulación ascendente

7.2 Regulación descendente

8. Convergencia, divergencia y comunicación cruzada entre diferentes vías de señalización

VI. CONTRACTILIDAD (12 horas) 1. Músculo esquelético 1.1 Unidad motora

1.2 Características morfológicas

1.2.1 Estructura del sarcómero

1.2.2 Características de las proteínas del músculo

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1.3 Actividad mecánica

1.3.1 Disposición de las proteínas contráctiles

1.3.2 Mecanismo de deslizamiento de los filamentos

1.3.3 Acople excitación contracción

1.3.4 La sacudida muscular

1.3.5 Suma de contracciones

1.4 Energética muscular

1.4.1 Tipos de fibras

1.4.2 Fatiga

1.5 Tipos de contracción

1.5.1 Isométrica

1.5.2 Isotónica

2. Músculo cardiaco 2.1 Características morfológicas

2.2 Propiedades eléctricas de las células musculares

2.2.1 Células marcapaso

2.2.2 Células del sistema conductor del corazón

2.2.3 Células contráctiles

2.3 Efectos de la inervación autonómica

3. Músculo liso 3.1 Características morfológicas

3.2 Propiedades eléctricas de las células musculares

3.2.1 Células contráctiles

3.2.2 Células marcapaso

3.3 Propiedades mecánicas

3.4 Efectos de la inervación autonómica

BIBLIOGRAFÍA • Alberts, B.; Johnson, A.; Lewis, J.; Raff, M.; Roberts, K. y P. Walter. (2010).

Biología molecular de la célula. 5ª edición. Editorial Omega. España.

8   

• Cereijido, Marcelino. (2009). Elogio del desequilibrio. En busca del orden y el

desorden en la vida. Colección Ciencia que ladra… Siglo XXI editores. Argentina.

• Eckert, R. y D. Randall (1994). Fisiología Animal. Mecanismos y Adaptaciones. 3ª

edición. McGraw Hill- Interamericana. España.

• Giese, A. (1983). Fisiología Celular y General. 5ª edición. Nueva Editorial

Interamericana. México.

• Hernández, O. (2011). Elementos básicos de neurofisiología. Trillas. México.

• Karp, G. (2011). Biología celular y molecular. Conceptos y experimentos. 6ª

edición. McGraw Hill. México.

• Levy, M.; Koeppen, B. y B. Stanton (2006). Fisiología. 4ª edición. Elsevier-Mosby.

España.

• Lodish, H.; Berk, A.; Matsudaira, P.; Kaiser, C.; Krieger, M.; Scott, M.; Zipursky,

S. y J. Darnell. (2005). Biología celular y molecular. 5a edición. Editorial Médica

Panamericana. Argentina.

• Russek, M. y M. Cabanac. (1990). Regulación y Control en Biología. 1ª reedición.

IPN. México.

• Sperelakis, N. (Ed.). (2012). Cell Physiology. Source Book. Essentials of

Membrane Biophysics. Fourth edition. Academic Press. U.S.A.

9   

NORMAS DE LABORATORIO 1. En la medida de lo posible, los equipos NO deberán exceder un máximo de 6

personas.

2. Cada equipo ocupará una mesa que será la misma durante todo el curso.

3. Los alumnos deberán usar bata, de preferencia blanca, en las sesiones prácticas.

4. Cada equipo deberá tener: a) dos franelas de 50 x 50 centímetros, b) equipo de

disección: pinzas de disección y presión, bisturí con hoja, tijeras de punta fina, aguja de

disección e hilo de algodón, c) marcador indeleble, d) cinta adhesiva (masking tape).

5. Cuando se utilice el equipo BIOPAC, los alumnos deberán guardar los archivos de

sus prácticas en un CD, no se permite el uso de memorias USB.

6. No se permite la ingesta de alimentos durante la estancia en el laboratorio.

7. El laboratorio deberá quedar limpio al terminar la sesión práctica: mesa limpia,

bancos sobre las mesas, cadáveres de animales en una bolsa de plástico y sin papeles

sucios en el piso.

8. El material roto, extraviado o descompuesto deberá reponerse a la mayor brevedad,

de lo contrario no tendrá derecho a presentar exámenes y prácticas.

9. Los resultados de las prácticas serán reportados por escrito. El reporte deberá

contener: a) Portada, b) Introducción (no más de 2 cuartillas), c) Objetivos, d)

Metodología (diagrama de flujo), e) Resultados (cuadros, gráficas y su descripción

correspondiente), f) Análisis de resultados (o discusión), g) Conclusiones, h)

Bibliografía. Los reportes deberán estar preparados, por lo menos en calidad de

borrador, para el día de la presentación del seminario.

10. Los alumnos que no cumplan con un mínimo de 80% de asistencias al curso, no

podrán acreditar la materia. Se tomará como retardo, la llegada dentro de los 15

minutos después de la hora de entrada establecida. Tres retardos constituyen una falta.

10   

PRÁCTICA 1

ASPECTOS GENERALES DEL MANEJO DE ANIMALES DE LABORATORIO Y VÍAS DE ADMINISTRACIÓN

INTRODUCCIÓN Actualmente, muchos de los experimentos de las ciencias biomédicas se realizan

en animales de fácil manejo, los cuales se han denominado animales de laboratorio y la

rata es uno de los más usados.

La legislación en México y en muchos países exige tratos bioéticos a los animales

destinados a la experimentación, de tal forma que se reduzca su utilización a lo

absolutamente necesario y se minimice su sufrimiento.

Cuando la experimentación se realiza con los métodos apropiados, el investigador

obtiene buenos resultados con el uso de animales y mejoran la calidad y

reproducibilidad de los datos.

Las vías de administración de sustancias deben seleccionarse con base en la

naturaleza fisicoquímica de la sustancia a aplicar y el animal de laboratorio que se

empleará.

En esta práctica se practicarán los principales métodos para el manejo, marcado y

distribución aleatoria de animales de laboratorio, así como las vías más usuales para la

administración de sustancias o fármacos.

OBJETIVOS - Manipular correctamente ratas de laboratorio.

- Distribuir aleatoriamente a las ratas utilizando un método adecuado.

- Determinar la importancia de la distribución aleatoria de los animales.

- Aprender el marcado adecuado de animales para la realización de cualquier tipo de

experimento.

- Aprender a administrar, a los animales más usados en el laboratorio, sustancias o

fármacos por distintas vías.

- Calcular las dosis de las sustancias que se van a administrar.

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- Organizar los datos obtenidos para su reporte y análisis.

MATERIAL - 3 ratas macho de 250 a 300 gramos.

- 1 caja de plástico para rata con tapa.

- 1 balanza granataria y canasta con tapa.

- 3 termómetros digitales o industriales.

- 3 jeringas de 1 ml con aguja.

- 1 cánula para administración intragástrica en rata.

- 1 vaso de precipitados de 50 ml.

- 1 cronómetro.

- vaselina.

- cinta adhesiva (masking tape).

- pentobarbital sódico (nembutal).

- ácido pícrico (o marcador indeleble).

DESARROLLO 1. Practicar, durante toda la sesión, las técnicas básicas para el manejo de la rata (ver

apéndice).

2. Distribuir aleatoriamente las 18 ratas en los 6 equipos (ver apéndice)

3. Marcar y pesar a las ratas (ver apéndice).

4. Calcular, para cada rata, el volumen de anestésico (pentobarbital sódico) que se

requiere administrar, si la concentración de la solución de pentobarbital es 63 mg/ml y la

dosis para estos animales es de 35 mg/Kg.

5. Medir la temperatura colonal y determinar la presencia o ausencia de los reflejos

flexor y de enderezamiento en las ratas. Estos se considerarán los valores basales.

a) Para medir la temperatura colonal de las ratas: introducir por el recto el bulbo del

termómetro untado con vaselina (si el termómetro es industrial, debe introducirse

aproximadamente 5 centímetros y mantenerse así durante 1 minuto y medio para

realizar la lectura).

b) Observar y registrar la presencia o ausencia de los reflejos flexor y de

enderezamiento. Para el reflejo flexor, aplicar un estímulo doloroso en alguna de las

patas de la rata, se registra como presente si la rata retira la pata. Para el reflejo de

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enderezamiento, colocar la rata “boca arriba” (posición supina dorsal) sobre la mesa de

trabajo, si la rata se endereza y se posa sobre sus 4 pata, se considera que el reflejo

está presente.

6. Determinar qué vía de administración se utilizará con cada una de las 3 ratas

(intragástrica, intraperitoneal o subcutánea) y administrarles adecuadamente el volumen

de pentobarbital calculado (ver apéndice).

7. Medir la temperatura colonal y determinar la presencia o ausencia de los reflejos

flexor y de enderezamiento en las ratas después de haber realizado la administración

de pentobarbital por las diferentes vías, esto se hará cada 5 minutos durante 25

minutos.

DATOS a) Temperatura colonal (°C)

TIEMPO (minutos)

VÍA INTRAGÁSTRICA

VÍA INTRAPERITONEAL

VÍA SUBCUTÁNEA

0 (basal)

5

10

15

20

25

b) Reflejos flexor (F) y de enderezamiento (E). Marcar presencia (+) o ausencia (-).

TIEMPO (minutos)

VÍA INTRAGÁSTRICA

F E

VÍA INTRAPERITONEAL F E

VÍA SUBCUTÁNEA

F E 0 (basal)

5

10

15

20

25

13   

PRESENTACIÓN DE RESULTADOS Agrupar los resultados de todos los equipos y utilizar los programas SigmaStat 3.5 y

GraphPad Prism 5 (o cualquier otro programa graficador), para:

* Obtener la media y el error estándar de los datos de temperatura colonal de las ratas

administradas con cada vía en cada uno de los tiempos considerados.

* Realizar el análisis estadístico (ANOVA bifactorial de medidas repetidas), y

* Elaborar la gráfica de temperatura colonal contra tiempo.

* Elaborar las gráficas de porcentaje de ausencia de los reflejos, tanto flexor como de

enderezamiento, contra tiempo.

BIBLIOGRAFÍA Aréchiga, H. (1999). El uso de animales en el laboratorio de experimentación.

Elementos, BUAP. (36):13-17.

Baker, J. H.; Lindsey, J. R. and S. H. Weisbroth, Eds. (1980). The laboratory rat. Vol II.

Academic Press. London and N.Y. Pp: 3.28.

Barastegui, A. C. (1976). Esquemas de prácticas de farmacología. Espaxs. Pp. 26-27.

Daniel, W. W. (2010). Bioestadística. Base para el análisis de las ciencias de la salud.

4ª edición. Limusa-Wiley. México.

Fox, G. J.; Anderson; C. L.; Loew, M. F. and F. W. Quimby, Eds. (2002). Laboratory

animal medicine. 2nd edition. American College of Laboratory Animal Medicine Series.

Academic Press. U.S.A.

Norma Oficial Mexicana sobre especificaciones técnicas para la producción, cuidado y

uso de los animales de laboratorio (NOM-062-ZOO-1999). Diario Oficial de la

Federación, 22 de agosto de 2001.

Academia Nacional de Medicina, Academia Mexicana de Ciencias y Universidad

Nacional Autónoma de México. (1999). Guía para el cuidado y uso de los animales de

laboratorio. México.

14   

PRÁCTICA 2

CONCEPTOS BÁSICOS EN HOMEOSTASIS

INTRODUCCIÓN Todos los organismos vivos están continuamente sujetos a cambios ambientales,

afectándolos a todos sus niveles: órganos, tejidos, células y vías metabólicas

(sistemas). Los organismos responden a los cambios energéticos del medio (estímulos),

manteniendo constante su medio interno (variables reguladas) mediante el control de su

entrada y salida de energía. Es esta, la cibernética aplicada a la fisiología, la base

esencial para una mejor comprensión del funcionamiento de los seres vivos.

OBJETIVOS - Identificar y analizar los distintos estados de un sistema.

- Manejar e integrar los conceptos de regulación y control.

- Demostrar algunos aspectos de la homeostasis.

MATERIAL - 1 balanza para pesar ratas y canasta con tapa.

- 2 cajas de plástico para rata con tapa

- 2 termómetros con escala de 0-50°C.

- 2 termómetros clínicos digitales.

- 2 termómetros clínicos para humano.

- 3 cronómetros

- vaselina, cubos de hielo.

- 1 baño María.

- 1 resistencia con termostato.

- 1 termómetro de carátula.

- 1 vaso de precipitado de 50 ml

- 4 jeringas de 1 ml.

- 5 ratas adultas.

- pentobarbital sódico (nembutal)

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DESARROLLO A. Coloque en un baño María 2 litros de agua a temperatura ambiente. Por medio del

botón del termostato, caliente el agua 10°C arriba de la temperatura ambiente. Mida la

temperatura cada 5 minutos hasta que ésta se mantenga constante durante 15 minutos.

Adicione 6 cubos de hielo (o el suficiente para bajar la temperatura) y registre la

temperatura en este momento y cada 10 segundos durante 3 minutos, después, cada

minuto, hasta que la temperatura vuelva a tener el valor basal.

1.- ¿Qué función tienen los cubos de hielo?

2.- ¿Cómo clasificaría al sistema?

3.- ¿Cómo responde el sistema a cada una de las perturbaciones?

Identifique cada uno de los componentes del sistema.

B. Tome la temperatura colonal basal a 4 ratas adultas (introducir el termómetro 5

centímetros). Posteriormente administre intraperitonealmente a dos de ellas con

pentobarbital sódico (35 mg/Kg de peso) y a las otras dos con solución salina (el

volumen correspondiente). Éstas últimas servirán como control. La anestesia y el

manejo se realizarán como lo marca el apéndice C de la NOM-062-ZOO-1999.

- Una rata control y una rata bajo anestesia se colocarán en un cuarto caliente (40°C).

- Las dos ratas restantes (anestesiada y control) se mantendrán en un cuarto frío (8°C).

- Tome la temperatura colonal cada 10 minutos durante el tiempo en el que

permanecen sometidas a los cambios de temperatura (media hora).

- Después de salir de los cuartos (frío y caliente), continúe tomando la temperatura

colonal de las ratas en las condiciones basales (temperatura ambiente) hasta que la

temperatura corporal sea similar al valor antes de la perturbación.

- Anote todas las respuestas conductuales que presentan las ratas para compensar la

perturbación por cambios en la temperatura ambiental.

1.- ¿Cómo responde el sistema a cada una de las perturbaciones? Identifique cada uno

de los componentes del sistema.

C. Con la finalidad de comparar los mecanismos termorreguladores en sistemas con

diferente masa corporal (rata y humano), por equipo, someter a un alumno a

perturbaciones de temperatura: cuarto caliente y otro al cuarto frío. Medir la temperatura

16   

oral a temperatura ambiente (basal). Durante el tiempo que permanecen sometidos a la

perturbación, medir cada 10 minutos (media hora).

- Después de salir de los cuartos (frío y caliente), continúe tomando la temperatura oral

en las condiciones basales (temperatura ambiente) hasta que la temperatura corporal

sea similar al valor antes de la perturbación.

- Anote todas las respuestas que presentan los sujetos de experimentación para

compensar la perturbación.

1.- ¿Cómo responde el sistema a cada una de las perturbaciones? Identifique cada uno

de los componentes del sistema.

Para realizar el experimento C, y con base en el Código de Nüremberg y en la

Declaración de Helsinki de la Asociación Médica Mundial, los alumnos sometidos a los

cuartos caliente y frío deberán firmar la autorización correspondiente.

DATOS * Experimento A

Tiempo (minutos)

Temperatura del agua

(°C)

* Experimentos B y C

* Cuarto a 40°C

Tiempo (minutos)

Basal (0)

(10)

(20)

(30)

Fuera del cuarto (40)

Temperatura colonal, rata control (°C)

Temperatura colonal, rata anestesiada

(°C)

Temperatura oral, humano

(°C)

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* Cuarto a 8°C

Tiempo (minutos)

Basal (0)

(10)

(20)

(30)

Fuera del cuarto (40)

Temperatura colonal, rata control (°C)

Temperatura colonal, rata anestesiada

(°C)

Temperatura oral, humano

(°C)

PRESENTACIÓN DE RESULTADOS Agrupar los resultados (de todos los equipos) obtenidos en cada una de las condiciones

experimentales para realizar el análisis estadístico y las gráficas correspondientes,

señalando en las mismas el error estándar de cada media.

Con los datos del experimento B, determinar si existe diferencia estadística en los

registros de temperatura de las ratas control y de las anestesiadas para cada una de las

temperaturas ambientales (frío y calor). Explique.

¿Qué tipo de sistema se considera a las ratas control y que tipo de sistema a las ratas

anestesiadas? En este sistema (rata) indique:

- La variable regulada.

- El estímulo y el receptor.

- Las vías aferentes y las eferentes.

- El centro integrador.

- Los efectores.

Con los datos de los experimentos B y C, determinar si existe diferencia estadística en

los registros de temperatura de las ratas control y de los humanos para cada una de las

temperaturas ambientales (frío y calor). Explique.

18   

BIBLIOGRAFÍA Russek M. y M. Cabanac, 1983. Regulación y Control en Biología Instituto Politécnico

Nacional. México, D.F.

Daniel, W.W. Bioestadística. Base para el análisis de las ciencias de la salud. 1995.

Noriega Eds. 5a Edición.

Steel, R.G.D. y Torrie, J.H. Bioestadística. Principios y Procedimientos. 1988. McGraw-

Hill.

Mainetti, J. A., Código de Nüremberg, Tribunal Internacional de Nüremberg, 1947.

Traducción adaptada de Mainetti J. A. (1989), Ética Médica, Quirón, La Plata,

Argentina.

Declaración de Helsinki de la Asociación Médica Mundial. Pautas Éticas Internacionales

para la Investigación y Experimentación Biomédica en Seres Humanos. ISBN 92 9036

0569. Consejo de Organizaciones Internacionales de las Ciencias Médicas (CIOMS),

1993, Ginebra, pp. 53-56.

NORMA Oficial Mexicana NOM-062-ZOO-1999, Especificaciones Técnicas para la

producción, cuidado y uso de los animales de laboratorio.

19   

PRÁCTICA 3

ESTUDIO DE LA PENETRACIÓN DE SUSTANCIAS A CÉLULAS NORMALES

INTRODUCCIÓN Continuamente se realiza entre los seres vivos y su medio un intercambio de

iones y sustancias. A nivel celular, éste depende de varias propiedades fisiológicas

conocidas colectivamente como permeabilidad celular. En este fenómeno participan dos

grupos de factores: a) las propiedades de las membranas celulares y b) las fuerzas

impulsoras. Las membranas celulares no sólo son diferencialmente permeables a varias

sustancias, sino que también, presentan alteraciones en su permeabilidad bajo

diferentes situaciones fisiológicas y ambientales. Las fuerzas impulsoras son de dos

tipos: a) fuerzas físicas, que dependen de gradientes de concentración o difusión en

soluciones acuosas y b) propiedades celulares especiales de difusión, facilitada

(transportadora) y de transporte activo.

OBJETIVO - Determinar los distintos factores que intervienen en la penetración de algunas

sustancias a través de la membrana celular por difusión simple.

MATERIAL Y SOLUCIONES Por equipo:

• Lanceta

• 5 pipetas Pasteur con bulbo

• 4 pipetas graduadas de 1 ml

• 4 pipetas graduadas de 5 ml

• Gradilla

• 20 tubos grandes

• 4 vasos de precipitados de 50 ml

• Algodón

20   

Soluciones:

• NaCl 0.9% (0.2M)

• Alcohol etílico 96%

• Alcohol etílico 0.3 M

• Alcohol metílico 0.3 M

• Alcohol propílico 0.3 M

• Alcohol butílico 0.3 M

• Sacarosa 1 M

• KCl 1 M

• BaCl2 1 M

Para realizar el siguiente experimento y con base en el Código de Nüremberg y a la

Declaración de Helsinki de la Asociación Médica Mundial, los alumnos a los que se les

extraerá sangre deberán firmar la autorización correspondiente.

DESARROLLO I.- Preparación de la suspensión de glóbulos rojos.

a) Obténgase sangre de la yema de un dedo con una lanceta estéril (previamente limpie

con alcohol etílico 96%).

b) En un tubo de ensayo que contenga 5 ml de solución salina isotónica (NaCl 0.2 M),

agregue 5 gotas de sangre.

NOTA: Si la muestra de sangre, se toma por punción venosa:

a) Colocar la sangre obtenida por punción venosa, en un tubo de ensayo

heparinizado, homogeneizar la sangre con la heparina.

b) En un tubo de ensayo que contenga 5 ml de solución salina isotónica (NaCl 0.2

M), agregue 5 gotas de sangre obtenida por punción venosa.

1.- Preparación de los patrones de comparación.

• Añada 5 gotas de la suspensión anterior de glóbulos rojos a 2 tubos de ensayo

que contengan: el primero 5 ml de agua destilada y el segundo 5 ml de NaCl 0.2 M.

• Observe a través del líquido y determine si ocurre hemólisis, colocando detrás

del tubo una hoja blanca con letras. SI HAY hemólisis, las letras se podrán leer

claramente, si NO HAY hemólisis, el tubo estará turbio y las letras no se leerán con

facilidad.

21   

2.- Determinación de la concentración hemolizante para diferentes soluciones de NaCl

(en cada caso use 5 gotas de la suspensión de eritrocitos y 5 ml de la solución).

• Determine si una solución de NaCl 0.1 M es hemolizante.

• Diluya a la mitad y observe.

• Realice el número de diluciones necesarias hasta encontrar la solución

hemolizante.

• Realice lecturas cada 30 segundos.

3.-Determinación de la concentración hemolizante para diferentes sustancias

(electrolitos y no electrolitos).

• Determine la concentración a la que son capaces de producir hemólisis las

siguientes sustancias: sacarosa, KCl y BaCl2.

• En cada caso proceda como lo realizó en el inciso 2.

4.- Determinación de los tiempos de hemólisis para diferentes sustancias lipofílicas:

• Establezca el tiempo de hemólisis para los siguientes alcoholes: metílico

(coeficiente de partición=0.0097); etílico (coeficiente de partición=0.0357); propílico

(coeficiente de partición=0.156); butílico (coeficiente de partición=0.588).

DATOS SOLUCIÓN DILUCIÓN

HEMOLIZANTE NaCl

Sacarosa

KCl

BaCl2

SOLUCIÓN TIEMPO DE HEMÓLISIS

Alcohol metílico

Alcohol etílico

Alcohol propílico

Alcohol butílico

22   

PRESENTACIÓN DE RESULTADOS Realice para las experiencias 2 y 3, una gráfica que relacione la concentración

hemolizante con el factor estudiado.

Para la experiencia 4 realice la gráfica correspondiente que relacione el tiempo de

hemólisis con el factor estudiado.

BIBLIOGRAFÍA 1. Eckert R., D. Randall y G. Augustine. Fisiología Animal. Mecanismos y Adaptaciones.

4a edición.1998. Editorial Interamericana-McGraw-Hill. España. p: 101 -135.

2. Ganong F.W. Fisiología Médica. 17ª Edición. 2000. Editorial Manual Moderno.

México, D.F. p. 6 - 9; 32 - 40.

3. Berne R. y M. Levy. Fisiología. 3ª. Edición. 2002. Editorial. Harcourt. Mosby. España.

p: 4 -17.

23   

PRÁCTICA 4

POTENCIAL DE DIFUSIÓN Y POTENCIAL DE LESIÓN

INTRODUCCIÓN La diferencia en la concentración de iones a ambos lados de una membrana con

permeabilidad selectiva, a través de la cual sólo puede moverse una especie iónica (el

catión o el anión), genera un flujo de iones desde el lado en que la concentración es

mayor hacia el lado en que la concentración es menor. Este movimiento de partículas

con carga eléctrica, al no acompañarse de partículas con carga de signo opuesto,

genera una diferencia de potencial eléctrico a través de la membrana (potencial de

difusión), el cual se opone al paso de nuevos iones hacia el lado de menor

concentración.

Al cabo de cierto tiempo, el flujo dado por la diferencia de concentraciones (gradiente

químico) llega a ser compensado por el flujo de repulsión, dado por la diferencia de

potencial eléctrico (gradiente eléctrico).

En estas condiciones, se dice que el ion está en equilibrio electroquímico a través de la

membrana. La diferencia de potencial de la membrana tiene un valor que se denomina

potencial de equilibrio (Eion). Este potencial está definido por la ecuación de Nernst:

Eion= Potencial de equilibrio (Voltios)

R= Constante de los gases

T= Temperatura absoluta

F= Constante de Faraday

z= Valencia del ion

C= Concentración del ion difusible

Julius Berstein fue el primero en proponer, en 1902, una hipótesis satisfactoria para

explicar el origen del potencial de reposo en el nervio y en las fibras musculares. Por

medio de métodos químicos averiguó que el interior de ambas células era rico en

potasio, con poca cantidad de sodio y cloro. Además, averiguó que en el interior de la

24   

célula había aniones a los cuales la célula no era permeable, por lo que postuló que el

potencial de reposo era consecuencia de una distribución desigual de iones de potasio,

como predecía la ecuación de Nernst. Como en aquella época no podía medirse con

precisión el potencial de reposo de una célula, Berstein cortó varias fibras musculares e

insertó un electrodo en el área cortada, haciendo contacto eficaz con el líquido interno

de las fibras musculares, a este registro se le llamó potencial de lesión. Los datos que

encontró mostraron que el potencial de membrana seguía de manera muy cercana el

potencial de equilibrio predicho por la ecuación de Nernst para el ion potasio.

La diferencia de potencial que existe a través de las membranas biológicas depende de

los gradientes de concentración y de la permeabilidad relativa para cada especie iónica.

La ecuación de Goldman, Hodgkin y Katz define el potencial de membrana en función

de estos dos importantes factores:

Em= Potencial de membrana

P= Permeabilidad relativa de cada ion

i= Compartimiento intracelular

e = Compartimiento extracelular

Otro factor importante para el mantenimiento del potencial de membrana es el

transporte activo, ya que la membrana celular es permeable a diversos iones y éstos no

están en un equilibrio electroquímico, es decir, el potencial de membrana no es igual a

su potencial de equilibrio, por lo que los iones difunden a favor del gradiente

predominante (electroquímico) y las células deben compensar estos flujos de difusión

para que no se alteren las concentraciones iónicas. Esto se hace mediante el transporte

activo de los iones, con un gasto continuo de energía metabólica por parte de la célula.

El resultado de la interacción de los factores mencionados es un estado estable, en el

cual se mantienen constantes las concentraciones intracelulares y extracelulares de

iones, así como el potencial de membrana.

25   

OBJETIVOS - Demostrar que la difusión de un electrolito a través de una membrana artificial con

permeabilidad selectiva genera una diferencia de potencial (potencial de difusión).

- Determinar el potencial de lesión de un músculo esquelético de rana y establecer si

existe una relación entre la diferencia de potencial obtenida con diferentes

concentraciones de potasio y el predicho por la ecuación de Nernst.

MATERIAL Por equipo:

1 multímetro digital.

1 par de electrodos de plata clorurados

2 celdas de calomel con puente salino.

2 alambres de plata.

2 soportes de media luna. Si no hay electrodo de plata

3 pinzas de tres dedos

3 pinzas dobles.

6 vasos de precipitados de 50 ml.

6 jeringas de 10 ml con aguja.

1 Rana.

3 vasos de precipitados de 500 ml.

1 caja de Petri. 1 membrana para diálisis.

2 tubos de vidrio. 1 cámara de Ussing.

1 huevo de gallina

Soluciones:

Solución de Ringer. Vaselina sólida.

Solución de LIC.

Soluciones de K2SO4: 0.005, 0.01, 0.025, 0.05 y 0.1 M (para el potencial de lesión)

Soluciones de Na2HPO4: 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0 y 2.0 M (Cámara de Ussing)

Solución de KCl: 400, 100, 50, 20 10, 5, 2.5, 1 mM (para el potencial de difusión en el

huevo)

26   

DESARROLLO Potencial de difusión con la cámara de Ussing y membrana artificial 1.- Recortar la membrana de diálisis al diámetro de la cámara de Ussing.

2.- Aplicar vaselina a los bordes de cada compartimiento de la cámara de Ussing,

colocar sobre uno de ellos la membrana exactamente centrada y unir ambos

compartimientos.

3.- Sujetar la cámara a su soporte.

4.- Llenar los dos compartimientos de la cámara con la solución de Na2HPO4 0.05 M y

medir la diferencia de potencial, introduciendo un puente salino del electrodo de calomel

en cada compartimiento y conectando los dos electrodos al multímetro (figura 1). En

caso de contar con electrodos de plata, introducir éstos en cada compartimento.

5.- Vaciar uno de los compartimientos, enjuagarlo con la solución de Na2HPO4 0.1 M y

llenarlo con esta solución. El otro compartimiento servirá como referencia fija.

6.- Medir los cambios en la diferencia de potencial

7.- Repetir los puntos 5 y 6 usando soluciones sucesivamente más concentradas. A

partir de esta experiencia también se debe enjuagar y reponer la solución 0.05 M del

compartimiento de referencia, ya que la difusión de los iones modifica su concentración.

Figura 1. Diagrama para determinar potencial de difusión usando cámaras de Ussing y electrodos de calomel.

27   

Potencial de difusión usando el cascarón de huevo. 1.- Localice la cámara de aire del huevo y en ese sitio rompa el cascarón para obtener

una abertura de 3 cm de diámetro, deseche el contenido del huevo y enjuague con

agua destilada el cascarón.

2.- Con las pinzas de disección golpeé levemente el cascarón de huevo en el extremo

opuesto a la cámara de aire y desprenda cuidadosamente el cascarón fracturado

evitando romper la membrana que está adherida al cascarón para formar una ventana

de aproximadamente 0.5 cm de diámetro. Es muy importante que no rompa esta

membrana pues a través de ella se establecerá la difusión del ion potasio, si existe

fuga no se podrá establecer éste.

3. Coloque en el interior del huevo una solución 400 mM de KCl y uno de los electrodos

de medición.

4. En un vaso de precipitados de 50 ml coloque solución de KCl 1 mM hasta que quede

al borde del vaso. Coloque el cascarón de huevo en la boca del vaso de tal forma que la

ventana de 0.5 cm quede en contacto con el líquido del vaso e introduzca por un

extremo del vaso el otro electro y mida en el multímetro el potencial desarrollado (figura

2).

Figura 2. Potencial de difusión medido en el cascarón de huevo.

28   

5. Sin vaciar el contenido del huevo cámbielo ahora a un vaso que contenga una

solución 2.5 mM de KCl y mida el potencial desarrollado.

6. Continué como en el inciso 5 pero probando las siguientes concentraciones: 5, 10,

20, 50 y 100 mM (observe que irá midiendo de una menor a una mayor concentración

de KCl).

7. Al terminar de probar todas concentraciones y sin mover los electrodos de su sitio

pruebe que pasa con la lectura del multímetro si levanta el cascarón de huevo a fin de

que no tenga contacto con la solución de KCl.

Potencial de lesión 1.- Descerebrar y desmedular una rana; cortar la piel de una pata, exponer el músculo

gastrocnemio y separarlo cortando los tendones que lo unen al hueso

2.- Pasar el músculo por el anillo de goma hasta la mitad, cortar la mitad restante y

jalarlo un poco para que la parte seccionada quede dentro del anillo de goma.

3.- Introducir el tubo de vidrio en el anillo de goma, llenarlo con solución LIC y sujetarlo

a un soporte con la pinza de tres dedos. Introducir el músculo en un vaso de

precipitados conteniendo solución de Ringer. Así, la solución LIC está en continuidad

con la parte lesionada, y la solución de Ringer está en continuidad con la parte sana del

músculo (figura 3).

Figura 3.

29   

4.- Medir el potencial de lesión del músculo tratado, colocando un puente salino del

electrodo de calomel (rojo) en la solución LIC y el otro electrodo (negro) en la solución

de Ringer; o bien, los electrodos de plata en vez de los puentes salinos. Conectar los

dos electrodos al multímetro y anotar la lectura.

5.- Sustituir la solución de Ringer por solución de K2SO4 0.025 M y leer la diferencia de

potencial en el multímetro.

7.- Repetir el punto anterior con cada una de las soluciones de K2SO4, en orden

creciente de concentración.

PRESENTACION DE RESULTADOS Potencial de difusión usando cámara de Ussing. Elabore un cuadro con los siguientes datos:

a) Concentración de Na+ del compartimiento 1 (de referencia).

b) Concentración de Na+ del compartimiento 2.

c) La relación de ambas concentraciones (C2/C1).

d) La diferencia de potencial según la ecuación de Nernst (mV).

e) La diferencia de potencial medida experimentalmente (mV).

f) Construya una gráfica con la diferencia de potencial (mV) en las ordenadas y el

logaritmo decimal (log) de la relación de concentraciones en las abscisas.

Potencial de difusión con el cascarón de huevo a) Elabore una tabla con los valores de potencial obtenido con cada concentración de

KCl probada, y con los valores teóricos obtenidos calculando con la ecuación de Nernst

la diferencia de potencial.

b) Elabore una gráfica (diferencia de potencial (mV) en las ordenadas y el log de la

relación de las concentraciones (log Cext/Cint) en las abscisas) de los valores obtenidos

con el cascarón y de los valores obtenidos con la ecuación de Nernst. Discuta si las

curvas son semejantes entre sí y a que se debe.

Potencial de lesión Elabore un cuadro con los siguientes datos:

a) Concentración de K+ de la solución LIC.

b) Concentración de K+ de la solución del recipiente.

30   

c) La relación de ambas concentraciones (C2/C1).

d) El logaritmo natural de esta relación (log C2/C1).

d) La diferencia de potencial según la ecuación de Nernst (mV).

e) La medida obtenida en el experimento.

Este experimento es semejante al realizado por Berstein en 1902 para demostrar que el

potencial de membrana muscular en reposo está dado por una diferencia de

concentraciones del ion potasio entre el interior y el exterior de la membrana muscular.

Con los datos obtenidos en este experimento ¿cómo demostraría lo propuesto por

Berstein?

BIBLIOGRAFÍA Aidley D. J., 1989. The Physiology of Excitable Cells. Ed. Cambridge University Press,

Cambridge, Inglaterra.

Eckert R., Randall D. y Augustine G., 1990. Fisiología Animal. Mecanismos y

Adaptaciones. 3a ed. Ed. Interamericana-McGraw-Hill, Madrid, España.

Kuffler S. y Nicholls J., 1982. De la Neurona al cerebro. 1° Edición, Ed. Reverté,

Barcelona, España, pp. 89-131.

31   

PRÁCTICA 5 POTENCIAL DE ACCIÓN, SIMULACIÓN POR COMPUTADORA

INTRODUCCIÓN Una de las vías de la transmisión de la información en los organismos, utiliza señales

eléctricas generadas en el sistema nervioso. Estos impulsos nerviosos en general,

están asociados con respuestas rápidas de las células excitables a los estímulos del

medio. Al aplicarles el estímulo adecuado muestran un cambio de potencial: el potencial

de acción (llamado también espiga o impulso nervioso), el cual es conducido a lo largo

de la región axónica de una neurona o a lo largo de la membrana plasmática de una

célula muscular. De manera inicial el estímulo produce una despolarización de la

membrana del axón, la cual a su vez hace que aumente la conductancia de Na+ al

interior. A cierto nivel de despolarización de la membrana (cerca del 15% del potencial

de reposo), la membrana se vuelve muy permeable al Na+ (por la apertura de canales

de Na+ dependientes de voltaje). El influjo de Na+ hace que el potencial transmembrana

caiga rápidamente hacia cero y el potencial de membrana tiende a llegar al potencial de

equilibrio de este ion. En el pico de la espiga se inicia otro cambio en la permeabilidad,

lo que da como resultado una mayor conductancia del K+. El eflujo de este ion en

sentido de su gradiente de electroquímico, tiende a llevar al potencial transmembrana

de vuelta al valor del potencial de equilibrio del K+. A medida que aumenta la

conductancia del K+, se inactiva la conductancia del Na+.

OBJETIVO GENERAL Establecer el papel que tienen los canales iónicos de Na+ y K+ en la generación del

potencial de acción

OBJETIVOS PARTICULARES Determinar el efecto que tienen los estímulos eléctricos de diferentes intensidades y

duraciones sobre el potencial de acción y la excitabilidad de una neurona.

Determinar el efecto que tiene la aplicación de estímulos repetidos a diferentes

intervalos sobre el potencial de acción y la excitabilidad de una neurona.

32   

Observar el efecto que provocan el cambio de la concentración de los iones

involucrados en el potencial de acción sobre el potencial de membrana.

Observar el efecto que provocan algunas sustancias bloqueadoras de los canales

dependientes de voltaje sobre la naturaleza y características del potencial de acción.

MATERIAL Programa de simulación por computadora, basado en el modelo propuesto por Hodgkin

y Huxley, para la generación del potencial de acción creado por Dave Touretzky

“HHsim”, Computadora PC.

DESARROLLO El dispositivo empleado para desarrollar este simulador es similar al que muestra la

figura 4. Identificar sus partes.

Figura 4. Esquema de la disposición de los electrodos de estimulación y registro en un fragmento sellado de axón gigante de calamar.

Iniciar el programa HHsim y localizar en la pantalla principal los controles que se

muestran en la figura 5, a los que se hace referencia en las actividades posteriores.

Establecer los parámetros iniciales de la forma siguiente:

- Asegúrese que el control 1 marca “Voltage Recording”.

- En el control 2, seleccionar g Na (pS), g K (pS) y blank, respectivamente.

33   

- Activar “Membrane” en el control 3. Esto despliega una ventana donde debe

establecer la temperatura en 20°C. Ocultar la ventana con el botón “Hide” que aparece

en la misma.

Figura 5. Pantalla principal del programa HHsim. Los números 1 al 4 indican los controles que se emplean durante esta práctica.

Potencial umbral - Activar “Stimuli” en el control 3. Esto despliega una ventana donde se pueden cambiar

los parámetros de dos estimuladores capaces de aplicar dos estímulos cada uno. Para

este caso solo se usará el primer estímulo del estimulador 1.

- Cada estímulo tiene tres parámetros: (Ti) Tiempo de inicio (ms), (Int) Intensidad (nA) y

(Dur) Duración (ms). Establecer Ti= 0.0 ms, Int= 10 nA y Dur=0.1 ms. El segundo

estímulo debe marcar cero en todos los parámetros.

- Activar el estimulador usando el botón “Stim1” del control 4 y observar la respuesta en

el potencial de membrana.

34   

- Aplicar estímulos similares, incrementando gradualmente la duración hasta provocar

un potencial de acción.

- Encontrar la duración mínima para que estímulos con intensidades de 5, 10, 15, 20,

35, 40, y 66 nA que pueda provocar un potencial de acción.

Nota: Antes de aplicar cada estímulo debe borrar la respuesta anterior usando el botón

“Clear” del control 4.

Suma temporal de estímulos subumbrales - Establecer el primer estímulo con Int= 15 nA, Dur= 0.4 ms y Ti= 0 ms. El segundo

estímulo debe ser similar pero con Ti= 15 ms.

- Activar el estimulador y observar la respuesta.

- Repetir la experiencia disminuyendo gradualmente el tiempo de inicio del segundo

estímulo (Ti= 8, 4, 2, 1 ms).

Periodo refractario - Establecer el primer estímulo con Int= 50nA, Dur= 0.11ms y Ti= 0 ms. El segundo

estímulo con Int= 40nA, Dur= 0.11ms y Ti= 20 ms. Activar el estimulador y observar la

respuesta.

- Repetir la experiencia reduciendo el tiempo de inicio del segundo estímulo a 10ms.

Observar la respuesta.

- Repetir la experiencia con Ti= 5ms para el segundo estímulo. Observe la respuesta.

- Encontrar el tiempo de inicio para el segundo estímulo al cual desaparece el segundo

potencial de acción.

- Repita la experiencia con Ti= 2ms para el segundo estímulo. Observe la respuesta.

- Incremente la intensidad del segundo estímulo a Int= 60nA. Observe

- Incremente la intensidad del segundo estímulo a Int= 70nA. Observe

- Reduzca el tiempo de inicio del segundo estímulo hasta Ti= 1.8ms.

- Incremente la intensidad del segundo estímulo hasta Int= 80nA. Repita incrementando

a Int= 100nA.

Concentraciones iónicas - Establezca los parámetros del segundo estímulo en cero, para el primer estímulo Int=

20nA, Dur= 0.5ms y Ti= 0ms.

- Aplique el estímulo

35   

- Sin borrar la respuesta anterior active “Membrane” con el control 3. Cambie la

concentración extracelular de Na+ = 400mM. Aplique el estímulo.

- Sin borrar las respuestas anteriores, reduzca la concentración extracelular de Na+, de

50 en 50mM aplicando un estímulo cada vez. Observe la respuesta.

Nota: Puede utilizar el botón “Zoom out” del control 4 y la barra de desplazamiento de

tiempo para visualizar toda la serie y comparar las respuestas.

- Borre las respuestas anteriores.

- Restablezca la concentración original.

- Repita el experimento aumentando de 50 en 50mM la concentración extracelular de

Na+. Si es necesario detener el experimento use el botón “Stop” del control 4.

- Restablezca la concentración original, borre las respuestas anteriores y aplique un

estímulo.

- Reduzca ahora la concentración extracelular de K+ de 1 en 1nM aplicando estímulos

cada vez. Continúe reduciendo aún si no se provoca un potencial de acción.

- Restablezca la concentración, borre las respuestas anteriores y estimule.

- Incremente de 1 en 1mM la concentración extracelular de K+ estimulando cada vez. Si

es necesario detener la prueba use el botón “Stop”.

Canales dependientes de voltaje - Restablezca las concentraciones originales, borre las respuestas anteriores y aplique

un estímulo.

- Sin borrar la respuesta anterior active “Drugs” del control 3. Y cambie el porcentaje de

inhibición por Tetrodotoxina (TTX) incrementando de 5 en 5% estimulando cada vez sin

borrar.

- Restablezca, borre las respuestas anteriores y repita la experiencia ahora

incrementando la inhibición por tetraetilamonio.

- Restablezca, borre las respuestas anteriores, aplique pronasa. Aplique un estímulo.

BIBLIOGRAFÍA Aidley, D. J. The Physiology of Excitable Cells. 1989. Edit. Cambridge University Press,

Cambridge, Inglaterra.

36   

Berne R. y M. Levy, Fisiología. 2ª Ed. 1992. Edit. Mosby Year Book. España, Madrid. p.

34-39.

Carpenter S.H.R., Neurofisiología. 1986. Edit. Manuel Moderno, México, D.F.

Darnell J., H. Lodish y D. Baltimore, Biología Celular y Molecular. 2ª Ed. 1993. Edit.

Omega S.A. España, Barcelona p. 844-858.

Eckert, Randall D., Burgreen W., y K. French, Fisiología Animal, Mecanismos y

Adaptaciones. 4ª Ed. 1998. Edit. Interamericana-McGraw-Hill. Madrid, España.

Ganong F.W., Fisiología Médica. 17a Ed. 2000. Edit. Manual Moderno México.

Schmidt F.R. y G. Thews, Fisiología Humana. 1993. Edit. Mc Graw Hill-Interamericana.

España Madrid p. 23-34.

37   

PRÁCTICA 6

POTENCIAL DE ACCIÓN COMPUESTO

INTRODUCCIÓN La función primaria del sistema nervioso es la transmisión de información entre

los órganos sensoriales y los tejidos de respuesta (músculos y glándulas), pasando por

un centro de integración. Para ello, el tejido nervioso está dispuesto en forma de un

cableado que corre de los órganos sensoriales a alguna estructura del sistema nervioso

central y de ahí a las células musculares. Este cableado está formado esencialmente

por los axones de las neuronas periféricas, que pueden ser muy largos. Los axones que

se proyectan hacia regiones contiguas del cuerpo (por ejemplo, los que van a diferentes

células musculares en la pierna) viajan en forma de grupos compactos junto con los que

vienen en sentido aferente desde estructuras receptoras (por ejemplo, de la piel) de la

misma región. Este conjunto de axones forma un nervio periférico. Una fibra individual

(un axón) tiene un diámetro de alrededor de 20 µm (0.002 cm) y no se distingue a

simple vista; un nervio es mucho más grueso y se le observa con facilidad.

Medir la respuesta eléctrica de una fibra individual requiere de equipo muy sofisticado y

adiestramiento especial. En comparación, medir la respuesta eléctrica de un nervio

completo (potencial de acción compuesto) es sencillo, pero requiere hacer algunas

consideraciones: los cambios de voltaje que se registran son extracelulares (tanto el

electrodo de registro como el de referencia están fuera de la célula), por lo que el trazo

del potencial de acción tiene una forma diferente al del potencial clásico, y recibe el

nombre de potencial bifásico. En segundo lugar, puesto que las neuronas pueden tener

umbrales distintos, el potencial de acción compuesto no cumple estrictamente la ley de

todo o nada del potencial de acción. Por lo demás, la preparación de nervio completo

reproduce las principales características de la actividad eléctrica de las células

nerviosas.

38   

OBJETIVO Las actividades que se describen tienen como propósito medir la respuesta eléctrica de

un nervio completo, y determinar las propiedades de conducción de estas fibras.

MATERIAL - Estuche de disección

- Disectores de vidrio

- Cámara para nervio aislado

- Unidad de adquisición Biopac MP36.

- Electrodo SS2L

- Cable DB9H

- Gotero

- Hilo

- Rana grande

DESARROLLO I. Montaje de la preparación En esta preparación se utiliza el nervio ciático de rana, que por su grosor es el más fácil

de obtener y manejar. El nervio se coloca en una cámara provista de bandas metálicas

que funcionan como electrodos de estimulación o de registro. Al mismo tiempo, la

cámara aísla al nervio de los líquidos conductores.

1. Con ayuda de unas tijeras grandes y un estilete, descerebre y desmedule la rana

(figura 6).

2. Corte la piel de una de las patas posteriores y remuévala hasta descubrir

completamente la extremidad.

3. Separe cuidadosamente los músculos en la cara posterior del muslo y localice el

nervio ciático.

4. Sin tocar el nervio, descúbralo en ambos sentidos hasta la médula espinal por un

lado y hasta la rodilla por el otro. Corte los músculos que sea necesario (figura 6).

5. Amarre un trozo de hilo alrededor del nervio tan cerca de la médula espinal como sea

posible.

39   

6. Con unas tijeras finas separe el nervio de la médula, de manera que la fibra quede

sujeta con el hilo.

7. Con ayuda de los manipuladores de vidrio, separe cuidadosamente el nervio, hasta

liberar una porción de 8 a 10 cm.

8. Coloque el nervio extendido sobre los electrodos de la cámara para nervio aislado.

Figura 6. Obtención del nervio ciático de rana.

II. Montaje del equipo de estimulación y de registro Para medir la respuesta del nervio, se aplicarán estímulos eléctricos en un extremo del

nervio y se medirán en el extremo opuesto los cambios de voltaje generados en la

membrana. El estimulador se conecta a los electrodos en un extremo de la cámara. La

respuesta del nervio se registra en el CH2 de la pantalla de la computadora, que va

conectado a los electrodos en el otro extremo por medio del MP36 y el SS2L. Además,

el MP36 envía la señal del estimulador hacia la computadora por el CH1 sin necesidad

de conexiones externas.

40   

1. Guiándose con la figura 7, verifique que las conexiones del equipo estén en las

posiciones siguientes:

- ESTÍMULO: Conectar el cable DB9H a Analog out del MP36.

- REGISTRO DEL PAC: Conecte el electrodo de registro SS2L al CH2.

Nota el CH1 no debe estar conectado.

2. Conecte el cable rojo St(+) del DB9H en el pin del extremo de la cámara de nervio

aislado.

3. Una el cable negro St(-) del DB9H al cable negro (GND) del SS2L y conéctelo al pin

siguiente de la cámara del nervio.

4. El cable blanco Vin(-) y el cable rojo Vin(+) del SS2L se conectan a los pines del otro

extremo, estos cables pueden moverse de acuerdo con la longitud del nervio. Nota el

cable rojo Vin(+) siempre debe ser el más alejado del estímulo.

Figura 7. Montaje del equipo de estimulación y de registro para potencial de acción compuesto en nervio ciático de rana.

41   

III. Determinaciones prácticas Una vez que el equipo ha sido conectado, abra el archivo PAC-Ciatico-01, el cual ya

tiene los parámetros de calibración. Antes de realizar las determinaciones en el nervio

realice una prueba colocando en su lugar un hilo humedecido en solución Ringer. La

intensidad del estímulo debe ser de 0.050V. Si no observa la respuesta, incremente la

intensidad del estímulo en intervalos de 0.050.

Retire el hilo y coloque el nervio (no olvide guardar el archivo cambiando el nombre en

cada determinación).

a) Estímulos umbral y máximo El potencial de acción compuesto requiere una cierta cantidad mínima de carga para

ser generado pero, a diferencia del potencial de acción simple, su intensidad aumenta

al aumentar la intensidad de la estimulación. Esta tendencia tiene un límite, y se conoce

como estímulo máximo al valor de estimulación que induce la máxima intensidad de

respuesta de un nervio.

1. Usando un estímulo inicial con una intensidad de 0.050V, aumente lentamente la

intensidad del estímulo (intervalos de 0.050V) hasta que se aprecie la más leve

respuesta del nervio.

2. Determine la intensidad del estímulo. Éste es el estímulo umbral.

3. Siga aumentando lentamente la intensidad del estímulo, observando cómo crece la

respuesta del nervio.

4. Encuentre el punto en el que la respuesta deja de crecer al aumentar la intensidad

del estímulo. Anote la intensidad de este estímulo. Éste es el estímulo máximo

b) Velocidad de conducción Puesto que los electrodos de registro están situados a cierta distancia de los de

estimulación, la señal eléctrica tomará cierto tiempo en llegar desde su punto de origen

hasta donde es registrada, y la duración de este periodo (llamado periodo de latencia)

depende de la velocidad con la que el nervio conduce los impulsos. La pantalla de la

computadora registra los eventos de estimulación (canal B) y de respuesta (canal A), de

modo que la duración del periodo de latencia y la velocidad de conducción del nervio se

pueden determinar fácilmente.

42   

1. Aplicando un estímulo de intensidad intermedia entre el umbral y el máximo. Mida

sobre la pantalla el intervalo que separa el inicio del estímulo del inicio de la respuesta

(periodo de latencia).

2. Mida la separación entre el electrodo de estimulación y el electrodo de registro que

estén más próximos entre sí en la cámara para nervio. Con estos valores calcule la

velocidad de conducción del nervio (expresada en m/s)

3.- Repita la operación después de poner unas gotas de Ringer frio sobre el nervio.

c) Suma de estímulos subumbrales 1. Para esta experiencia se debe modificar las condiciones de adquisición del registro,

para eso, cierre el archivo actual y abra el archivo PAC-Ciatico-02. En este caso se

aplican dos estímulos. La intensidad de los estímulos debe ser ligeramente menor al

valor umbral. EL retraso entre los dos estímulos se debe reducir paulatinamente

comenzando con 25ms.

2. Aplique los estímulos y repita la experiencia reduciendo el tiempo de retraso entre los

estímulos hasta observar un PAC.

3. Mida el intervalo de tiempo que hay entre el inicio del primer estímulo y el inicio del

segundo. Este tiempo es el necesario para que se sumen los potenciales locales

producidos por los estímulos subumbrales.

d) Períodos refractarios 1. Cierre el archivo anterior y abra nuevamente PAC-Ciatico-02. Separe los dos

estímulos con un retraso de 30ms.

2. Aumente la intensidad de ambos estímulos hasta un valor ligeramente superior al

umbral ambas respuestas deben ser similares en amplitud y forma.

3. Reduzca lentamente el retardo del segundo estímulo, observando atentamente la

respuesta al segundo estímulo, hasta que se aprecie una leve reducción en esta

respuesta.

4. Mida el intervalo de tiempo que hay entre los 2 estímulos. Este valor corresponde a la

duración del periodo refractario relativo.

5. Siga aproximando lentamente el segundo estímulo, hasta que la respuesta al

segundo estímulo desaparezca por completo. El tiempo transcurrido entre los dos

estímulos es la duración del periodo refractario absoluto.

43   

e) Curva de intensidad-duración 1. Cierre el archivo anterior y abra PAC-Ciatico-03.

2. Ajuste la intensidad del estímulo ligeramente arriba del valor umbral, de modo que el

potencial de acción tenga una amplitud bien definida.

3. En estas condiciones, mida sobre la pantalla la duración de la respuesta.

4. Reduzca la intensidad del estímulo en una décima parte. Con el control de duración,

aumente su duración hasta que la respuesta del nervio regrese al tamaño exacto al que

se ajustó en el inciso 2.

5. Mida y registre nuevamente la duración y la intensidad del estímulo.

6. Reduzca nuevamente la intensidad del estímulo y ajuste la duración para tener

siempre el mismo tamaño de respuesta. Registre el nuevo par de valores.

7. Repita el proceso hasta que el estímulo se haya reducido a un punto en el que no

logre generar un PAC aun aumentando la duración (o hasta valor máximo permitido por

el equipo).

8.- Repita el proceso ahora aumentando la intensidad del estímulo y reduciendo la

duración.

PRESENTACIÓN DE RESULTADOS En su reporte incluya los valores calculados en cada experiencia: estímulos umbral y

máximo (V), velocidad de conducción del nervio (m/s), tiempo necesario para la

sumación de los estímulos subumbrales (ms) y duración de los periodos refractarios

absoluto y relativo (ms). Para la última experiencia trace una gráfica (abscisas:

duración; ordenadas: intensidad) con los pares de valores obtenidos.

Incluya para cada experiencia un diagrama del trazo observado en la pantalla del

BIOPAC. Recuerde incluir los pies de figura para cada una.

BIBLIOGRAFÍA Carpenter S.H. Neurofisiología. 1986. El Manual Moderno, México, D.F.

Eckert, R.D., Burgreen W., y French K. Fisiología Animal, Mecanismos y Adaptaciones.

4ª ed., 1998. Interamericana-McGraw-Hill, Madrid.

44   

Guyton C.A. Tratado de Fisiología Médica, 8a. ed., 1991. Interamericana-McGraw-Hill,

Madrid.

Kandel E.R., Schwartz J.H., Jessell T.M. Neurociencia y Conducta. 1997. Prentice Hall,

Madrid.

45   

PRÁCTICAS

7. TRASMISIÓN SINÁPTICA Y 9. MÚSCULO ESQUELÉTICO

INTRODUCCIÓN (Transmisión sináptica) La comunicación neuronal se realiza principalmente a través de sustancias

liberadas por una neurona, denominadas neurotransmisores, aunque existen otros

medios de comunicación, como es la eléctrica. La comunicación entre las células

nerviosas se lleva a cabo en regiones especializadas denominadas sinapsis. Las

sinapsis pueden clasificarse con base en sus diferencias funcionales o morfológicas.

Las sinapsis eléctricas prácticamente carecen de un espacio entre las regiones pre- y

postsinápticas y por lo tanto no existe un retardo sináptico en ellas. En cambio en las

sinapsis químicas la separación es de unos 20 a 50 nm (hendidura sináptica), por lo

que en éstas sí existe un retardo sináptico. En las sinapsis químicas, los mensajeros

que se liberan de las terminales presinápticas se unen a los receptores específicos

ubicados en las membranas de las neuronas que reciben el mensaje.

En los mamíferos, las fibras musculares son inervadas por el axón de una sola

motoneurona. El axón se une con la fibra muscular en la llamada placa neuromuscular,

una región especializada cuya función es similar a las sinapsis neuronales: cuando un

potencial de acción es generado en las neuronas motoras, provoca la liberación de

acetilcolina en las terminales presinápticas, que se une con receptores colinérgicos

localizados en la fibra muscular (membrana postsináptica). La interacción de la

acetilcolina (ACh) con su receptor provoca la despolarización de la fibra muscular en la

región de la placa motora. Esta despolarización es suficientemente grande para

provocar la activación de canales dependientes de voltaje y provocar un potencial de

acción que viaja a lo largo de la fibra muscular. El efecto de la ACh termina cuando ésta

es degradada por la enzima acetilcolinesterasa (AChE), presente en la hendidura

sináptica. Normalmente, la cantidad liberada de acetilcolina es suficiente para asegurar

que cada potencial de acción de la neurona motora provoque un potencial de acción en

la fibra muscular.

46   

INTRODUCCIÓN (Músculo esquelético) En los vertebrados y otros organismos, el movimiento de las extremidades y el

desplazamiento del cuerpo dependen de un tipo particular de tejido contráctil, el

músculo esquelético. Al igual que el tejido nervioso, el tejido muscular es excitable (es

decir, que su membrana es capaz de invertir momentáneamente su potencial para

luego recuperar su estado inicial), y este cambio de potencial de la membrana

(potencial de acción) es la señal que desencadena la contracción del músculo. Como es

lógico suponer, la actividad del músculo esquelético es voluntaria, es decir que se

origina en el sistema nervioso central y es transmitida al músculo a través de fibras

nerviosas. Es por esto que la actividad del músculo esquelético es considerada

neurogénica, en contraste con la actividad espontánea (miogénica) presente en otros

tipos de músculo.

Para realizar cualquier clase de trabajo mecánico los músculos del organismo tienen

que contraerse para generar fuerza. En la mayor parte de los casos, la longitud del

músculo se acorta considerablemente, cuando esta fuerza se aplica a través de las

articulaciones los miembros se mueven. Este tipo de trabajo muscular se denomina

contracción isotónica. En otros casos el acortamiento muscular no es visible,

contracción isométrica. En ambas situaciones las células musculares generan fuerza y

para este proceso se necesita de la energía obtenida del metabolismo. Los cambios

metabólicos provocados por una actividad muscular intensa, como un aumento en la

concentración de lactato en sangre y el descenso de pH, pueden contribuir al fenómeno

denominado fatiga muscular.

Los músculos esqueléticos deben generar fuerzas diferentes, a veces durante tiempos

prolongados. Dos mecanismos controlan la fuerza generada por un músculo. En primer

lugar debido a que el músculo contiene un gran número de unidades motoras (conjunto

de fibras musculares inervadas por la misma motoneurona), la fuerza puede variar a lo

largo de un amplio espectro mediante el reclutamiento de más y más unidades motoras.

La segunda forma de aumentar la fuerza y prolongar una contracción es elevar la

frecuencia de disparo de los nervios motores. La descarga de los nervios motores a

frecuencias altas desencadena corrientes adicionales momentáneas de calcio que

47   

logran sumar las respuestas mecánicas y producir una contracción sostenida. La

presencia de un gran número de unidades motoras en un músculo y la sumación de la

respuesta contráctil permiten una graduación continua de la generación de fuerza.

OBJETIVOS Transmisión sináptica: - Demostrar la función de la acetilcolina en la transmisión sináptica.

Músculo esquelético: - Describir la respuesta contráctil del músculo esquelético ante estímulos eléctricos de

diferentes características.

- Determinar la importancia del aporte sanguíneo en la contracción muscular.

MATERIAL 1 estuche de disección (personal) Soluciones: 4 jeringas de 1 ml con aguja Acetilcolina 1:10 000

1 vaso de precipitados de 50 ml d-tubocurarina (curare): 2, 10, 20 y 50 µg/ml

1 soporte con base de media luna Fisostigmina o neostigmina 1.5 mg/ml

2 pinzas dobles Solución fisiológica de Ringer

1 ligadura de hule (ver apéndice, soluciones fisiológicas).

1 perilla de hule

1 tabla para disección

1 polea

2 disectores de vidrio

1 cable DB9H para estimulador

1 Unidad de adquisición Biopac MP36

1 juego de electrodos con funda

1 cronómetro

1 Transductor de fuerza

Algodón

Hilo delgado

Material biológico:

1 Rana previamente descerebrada y desmedulada

48   

DESARROLLO Sujete la rana fuertemente en posición de decúbito dorsal a una tabla de disección y

proceda a realizar una preparación ciático-gastrocnemio (figura 8). Fije la pata de la

rana de modo que sólo se registre el movimiento del gastrocnemio.

Figura 8. Preparación ciático-gastrocnemio para su estimulación y registro.

Coloque los electrodos en el nervio (figura 9). Evite tocar el nervio con objetos metálicos

o las manos, utilice los disectores de vidrio.

Figura 9. Colocación de los electrodos de estimulación.

Conecte el transductor de fuerza al módulo MP36 y calibre. Posteriormente, con un hilo

delgado, una al músculo con el transductor y conecte los electrodos de estimulación

con el cable DB9H, finalmente conecte éste a la salida Analog out del módulo MP36,

cuidando que todos los parámetros estén al mínimo (ver apéndice).

Los puntos marcados a continuación con “a” corresponden a la práctica de Transmisión

Sináptica y los “b” a la de Músculo Esquelético:

1b.- Umbral. Busque el voltaje umbral con estímulos únicos de intensidad creciente y

con una duración de 0.2 ms, de tal forma que se logre una contracción mínima cuyo

registro sea observable.

49   

2b.- Relación intensidad del estímulo-fuerza de contracción. Aplique estímulos

supraumbrales cada vez más intensos, y observe el aumento gradual en la fuerza de

contracción. Encuentre y registre la intensidad del estímulo que produce la máxima

respuesta del músculo.

3b.- Suma de estímulos subumbrales. Aplique estímulos cuyo valor de intensidad se

encuentre por debajo del valor del estímulo umbral (estímulos subumbrales); aplique

estos estímulos a baja frecuencia. Con la misma intensidad de estimulación, incremente

gradualmente la frecuencia. Registre la respuesta contráctil bajo estas condiciones de

estimulación.

4b.- Suma de contracciones y tétanos. Seleccione una intensidad de estimulación

para producir una respuesta submáxima (por encima del umbral, pero sin llegar a la

máxima). Con esta intensidad, aplique estimulación continua con frecuencia baja (1 Hz)

y registre. Sin detener el registro, aumente gradualmente la frecuencia de estimulación

hasta llegar a 100 Hz y, observe la respuesta.

5a.- Registro basal. Busque nuevamente el voltaje umbral con estímulos únicos de

intensidad creciente y con una duración de 0.2 ms. Realice un registro de 30 s de las

contracciones obtenidas con estímulos umbrales con una frecuencia de 2 Hz.

6a.- Detenga la estimulación.

7a.- Efectos de la acetilcolina y fisostigmina. Inyecte en el gastrocnemio, lo más

cerca de la unión mioneural, 0.1 ml de fisostigmina (o neostigmina), de una solución de

1.5 mg/ml. Realice un registro de 30 s sin estimulación eléctrica.

8a.- Inyecte en el mismo sitio, 0.1 ml de acetilcolina y registre nuevamente sin

estimulación eléctrica durante 1 minuto.

9a.- Estimule eléctricamente con los valores del punto 5a y registra durante 30 s

(observe si la amplitud de la contracción es la misma que la contracción basal).

10b.- Fatiga muscular en la rana. Aplique estimulación supraumbral continua DE 1 Hz

y registre los cambios en amplitud de la contracción durante los siguientes 10 minutos o

50   

hasta que la respuesta disminuya de manera considerable. Dejar recuperar la

preparación por 10 min.

11a.- Efecto de la d-tubocurarina. Registre nuevamente 30 s de respuesta basal

(punto 5a). Detenga la estimulación e inyecte en la misma región del músculo 0.1 ml de

la solución de d-tubocurarina de la más baja concentración, inmediatamente aplique

estímulos eléctricos en las mismas condiciones anteriores y registre durante 30 s.

12a.- Repita el punto 11a con las demás soluciones de d-tubocurarina, aplicadas en

orden de menor a mayor concentración.

13a.- Después de la última concentración empleada de curare, detenga la estimulación,

administre 0.1 ml de acetilcolina y estimule eléctricamente el nervio. Observe el efecto.

14b.- Fatiga muscular en el humano. Un miembro del equipo deberá presionar una

perilla de hule con una de las manos (ya sea derecha o izquierda) lo más rápido

posible. Registre el número de veces que la presiona en un minuto.

15b.- Deje descansar el brazo del sujeto durante 15 min.

16b.- Ligue el brazo utilizado con una ligadura de hule. Repita el punto 14b con la

misma presión y rapidez posible. Registre el número de veces que presiona la perilla en

un minuto.

17b. Otro miembro del equipo realizará también la experiencia de la fatiga muscular en

el humano, sólo que se invertirá el orden; es decir, primero realizará la experiencia con

el brazo ligado y después sin ligar.

PRESENTACIÓN DE RESULTADOS Todas las respuestas musculares obtenidas de la preparación ciático-gastrocnemio

deberán reportarse en valores de fuerza expresada en gramos.

Para la experiencia 2b, construya una gráfica de la relación entre intensidad del

estímulo y la respuesta contráctil. Así mismo, para las experiencias 10b y 11a haga

gráficas de la respuesta contráctil vs el tiempo o la concentración de la d-tubocurarina

respectivamente.

51   

Para la fatiga en humano, colecte los resultados del grupo y haga promedios de los

valores con los brazos ligados o sin ligar, separe tomando en cuenta también el orden

de la experiencia.

Orden inicial (presiones/minuto)

Orden inverso (presiones/minuto)

Equipo Brazo sin ligar Brazo ligado Brazo ligado Brazo sin ligar 1 2 3 4 5 6

Media EEM

Nota: En estricto apego a las Normas Oficiales Mexicanas vigentes y a las recomendaciones del Comité de Bioética de la ENCB, se ha decidido realizar en conjunto las prácticas “Transmisión sináptica” y “Músculo esquelético” con la finalidad de reducir en la medida de lo posible el uso de animales de experimentación. Así mismo, se substituye el uso de ratas por ranas, lo que permite un protocolo de experimentación en que se evita al máximo el sufrimiento innecesario de los animales. Los datos correspondientes a músculo esquelético, serán analizados una vez que se haya cubierto los aspectos teóricos correspondientes en el programa del curso.

BIBLIOGRAFIA Aidley, D.J. The Physiology of Excitable Cells. 4ª ed., 1998. Ed. Cambridge University

Press, Cambridge.

Brunton L.L., Lazo J.S. y Parker K.L. Goodman y Gilman: Las Bases Farmacológicas de

la Terapéutica. 11ª ed., 2006. Ed. Mc Graw Hill Interamericana Editores, México D.F.

Carpenter R.H.S. Neurofisiología. 2a ed., 1998. Ed. El Manual Moderno. México, D.F.

Kandel E.R., Schwartz J.H. y Jessell T.M. Principios de Neurociencia. 4ª ed., 2001. Ed.

Mc Graw Hill Interamericana Editores, México D.F.

Karp G. Biología Celular y Molecular. 6a ed., 2011. Ed. Mc Graw Hill Interamericana

Editores, México D.F.

Randall, D., Burgreen, W. y French, K. Eckert. Fisiología Animal: Mecanismos y

Adaptaciones. 4ª ed., 1998. Ed. Interamericana-McGraw-Hill, Madrid.

52   

PRÁCTICA 8 MODULACIÓN DE UNA FUNCIÓN CELULAR POR SEÑALES

QUÍMICAS

INTRODUCCIÓN Una de las características más importantes de los seres vivos es su capacidad

para reconocer variaciones en las condiciones del entorno que los induzcan a realizar

los cambios funcionales o estructurales necesarios para adaptarse a la nueva situación.

A nivel celular, se trate de organismos unicelulares o pluricelulares, es muy frecuente

que tal característica recaiga en la existencia de sistemas de reconocimiento de señales

químicas. Tales sistemas requieren de receptores, esto es, moléculas especializadas en

reconocer la señal química y que además sean capaces de inducir mediante un

proceso de complejidad variable, la respuesta específica a la señal. La cantidad de

complejos moleculares formados entre el receptor y la señal determinan la intensidad

de la respuesta producida. Un primer nivel de control de ésta puede establecerse a

través de variaciones en la concentración de la señal en el entorno celular.

Habitualmente este nivel de control es suficiente para cubrir las necesidades de las

células individuales. Sin embargo, se puede establecer un segundo nivel de control

modulando el número de receptores que las células están expresando para responder a

la señal. La existencia de estos dos niveles de control en las células que constituyen un

organismo pluricelular proporcionan un mayor grado de flexibilidad en la modulación de

la respuesta celular y una mayor capacidad de adaptación al organismo en su conjunto.

OBJETIVO Observar los niveles de control que pueden estar modulando una función celular, en

este caso la contractilidad uterina en la rata. De modo específico se evaluaran las

variaciones de contractilidad en función de cambios en la concentración de una señal

específica, oxitocina, y en la densidad de receptores a la misma.

53   

MATERIAL Por equipo. 1ª Parte: - Benzoato de estradiol 0.5 mg/ml (diluyente aceite vegetal).

- Aceite vegetal.

- 1 jeringa de 1 ml con aguja No 27

- Balanza para pesar animales

- 1 rata hembra adulta (aprox. 150 g de peso).

2ª Parte: - Sistema de adquisición MP36

- Transductor de fuerza.

- Gancho en S.

- 1 Soporte universal o de media luna

- 2 Pinzas dobles.

- 1 Baño con recirculador.

- 1 Termómetro.

- 1 Cámara para órgano aislado con tubo largo de desagüe y pinza Mohr.

- Tubería para el aireamiento de la preparación.

- 4 Jeringas de 1 ml con aguja.

- 1 Aguja con hilo.

- Estuche de disección (cada equipo deberá traer el suyo).

- 1 Caja de Petri.

- 1 Pizeta de 500 ml (aproximadamente).

Por grupo: 1ª Parte (Tratamiento).- 2 Cajas para 3 ratas c/u.

2ª Parte: (Obtención de datos). - Soluciones de oxitocina a 0.5, 1.5, 7.5 y 25 nM.

- 4 Litros de Solución fisiológica De Jalon.

54   

DESARROLLO 1ª Parte. 1.- Cada equipo recibirá una rata hembra. Esta se pesará y marcará de acuerdo al plan

siguiente; equipos nones, condición testigo, equipos pares, tratamiento con estrógenos.

Cada lote de ratas se coloca en una jaula debidamente rotulada con los siguientes

datos: Número de los equipos, grupo, tratamiento, fecha y profesor responsable.

2.- Durante cuatro días las ratas se inyectarán por vía subcutánea con el volumen

correspondiente a la milésima parte de su peso ya sea con la solución de estrógeno

(equipos pares) o con el aceite de maíz (equipos nones). Los equipos se

responsabilizarán del lote de ratas que le corresponda en cuanto a su tratamiento y

cuidado, manteniendo las condiciones adecuadas de alimento, agua y limpieza.

2ª Parte. Obtención de los Datos con el equipo del Biopac.

1.- Conectar el transductor de fuerza a la entrada del canal 1 del MP-36 y calibrar el

equipo.

2.- Calibrar el baño con recirculador a 31°C ± 1°C procurando mantener constante esta

temperatura durante todo el experimento. La cámara para órgano aislado se llena con

solución De Jalon y se coloca en el interior del baño. Esta solución debe mantenerse

con aireación continua (1 burbuja/segundo) y contar con un sifón para poder realizar los

lavados necesarios de la preparación.

3.- Los alumnos recibirán sus respectivas ratas, previamente sacrificadas por

dislocamiento cervical; le abrirán el abdomen, desplazando los intestinos a un lado para

localizar los cuernos uterinos (figura 10). Una vez localizados se disecan y se

transfieren a una caja de Petri con solución de Jalon aireada con una burbuja/segundo.

Los cuernos se limpian del tejido graso y se separan para utilizar uno de ellos en la

preparación.

55   

Figura 10. A la izquierda se muestra el sitio de la incisión y a la derecha la ubicación de los cuernos uterinos: 1) intestino, 2) vejiga urinaria, 3) cuernos uterinos. 4.- El cuerno aislado se ata en cada extremo con hilo evitando ocluir la luz,

trasladándolo posteriormente a la cámara para órgano aislado. Ahí se amarra uno de

los hilos en el ganchillo del fondo de la cámara y el otro al ganchillo en S, unido al

orificio del transductor para 50 gramos (figura 11).

Figura 11. Se muestra la disposición final de la cámara de órgano aislado (C), el recirculador (R) y la pizeta (P). El hilo del extremo libre del útero puede fijarse al transductor de fuerza (Tr*).

56   

5.- Se deja estabilizar la preparación durante 25 minutos, durante los cuales se podrían

observar contracciones espontáneas.

6.- Se inicia el registro siguiendo las instrucciones del profesor. Las concentraciones de

oxitocina se probaran en orden ascendente siguiendo la secuencia siguiente en la toma

de datos:

a) Registro de la actividad basal.

b) Sin parar el registro adicionar 0.2 ml de la concentración a probar y observar el efecto

durante 1 minuto.

c) Lavar la preparación para recuperar el registro basal. Repetir el ciclo.

6.- Para hacer los lavados de la preparación, se abre el desagüe de la cámara de

órgano aislado y simultáneamente se llena con solución De Jalon a 32 °C de la pizeta,

evitando así perder el sifón.

7.- En los registros obtenidos se medirá la amplitud en gramos de la contracción

inducida con cada concentración de oxitocina y con esta información se llenaran las

tablas siguientes.

DATOS * Grupo testigo (aceite vegetal)

[Oxitocina] nM Rata 0.5 1.5 7.5 25

1 3 5

Media EEM

* Grupo tratado con estrógenos

[Oxitocina] nM Rata 0.5 1.5 7.5 25

1 3 5

Media EEM

57   

PRESENTACIÓN DE RESULTADOS Con los datos de promedio y error estándar de las amplitudes de la contracción realizar

una curva del efecto en función de las dosis de oxitocina, tanto para el grupo testigo,

como para el grupo tratado con estrógenos. Para cada grupo de ratas discutir si la

modulación de la respuesta depende de la concentración de la señal. Además

comparar ambas curvas para determinar si la variación en la densidad de recetores a

oxitocina afecta la respuesta evaluada.

BIBLIOGRAFÍA Chambert, G., Lanzagorta, A., Ortiz, R., Paniagua, N., Quevedo, L. y Zamudio, S.,

Manual de fisiología humana (QFI), 2ª ed., 2003, Departamento de Fisiología de la

E.N.C.B-I.P.N., pp. 27-33.

Departamento de Farmacología de la Universidad de Edimburgo, Pharmacological

experiments on isolated preparations, 1ª Ed., 1968, E. & S. Livingstone LTD., Edinburgh

and London, pp.92-95.

Ganong, W., Fisiología médica, 17a Ed., 2000, Edit. Manual Moderno, México, pp 271-

272, 488 y 499.

Katzung, B., Farmacología básica y clínica, 7ª Ed., 1999, Edit. Manual Moderno,

México, pp 14-18.

Larcher, A., Neculcea, J., Breton, C., Aíslan, A., Rozen, F., Russo, C. y Zingg, H.,

Oxytocin receptor gene expression in the rat uterus during pregnacy and the estrous

cycle and in response to gonadal steroid treatment, 1998, Endocrinology, Vol. 136 (12),

pp 5350-5356.

58   

PRÁCTICA 10

PROPIEDADES DEL MÚSCULO CARDIACO

INTRODUCCIÓN El corazón continúa latiendo después de ser despojado de su inervación extrínseca,

esto se debe a la presencia de un tejido marcapaso especializado. Este tejido

especializado se caracteriza por poseer un potencial de membrana inestable

(prepotencial), el cual disminuye continuamente hasta alcanzar el valor de descarga

desencadenando el disparo de su potencial de acción.

Algunos agentes humorales que modifican la frecuencia de descarga del marcapaso, lo

hacen cambiando la pendiente del prepotencial (p.e. noradrenalina), aunque otras

actúan también alterando el potencial de membrana cambiando así el tiempo requerido

para alcanzar el nivel de descarga (p.e. acetilcolina).

Como en otros tejidos excitables, los cambios en la concentración externa de los iones

K+ afectan el potencial de membrana en reposo del músculo cardiaco, en tanto, que los

cambios en la concentración externa de Ca2+ afectan la magnitud de las contracciones

musculares.

La contractilidad del miocardio ejerce una importante influencia sobre el volumen

sistólico. Los impulsos de los nervios noradrenérgicos simpáticos en el corazón,

aumentan la frecuencia (efecto cronotrópico) y la fuerza de contracción (efecto

inotrópico). Las catecolaminas ejercen su efecto inotrópico por medio de una acción

sobre los receptores β1-adrenérgicos.

Los impulsos de las fibras cardiacas vagales colinérgicas disminuyen la frecuencia

cardiaca (efecto cronotrópico negativo).

OBJETIVOS - Determinar la influencia de los iones K+ y Ca2+ sobre la actividad del corazón.

- Determinar la influencia de la estimulación del nervio vago y de sustancias químicas

simpático y parasimpaticomiméticas sobre la actividad del corazón.

59   

- Obtener un registro del periodo refractario y la pausa compensadora en corazón de

rana.

MATERIAL Material biológico

- Rana de 100 a 150 g de peso

Por equipo:

- Soporte de media luna

- Pinzas dobles

- Sistema de adquisición MP36

- Ajustador de tensión

- Transductor de tensión

- Cable DB9

- Electrodos de estimulación

- Estuche de disección

- Tabla de disección para rana

- Franela

- Hilo grueso y delgado

- Caja de Petri

- 3 vasos de p.p. de 50 ml.

- 6 jeringas de 1 ml

Soluciones: - Acetilcolina 1:10 000 - Ringer para corazón de rana

- Adrenalina 1:10 000 - Ringer con alto contenido de K+

- Atropina 1:10 000 - Ringer con alto contenido de Ca2+

DESARROLLO I. Desmedular, descerebrar y montaje de la rana. 1. El profesor se encargará de anestesiar a la rana (pentobarbital sódico 80 mg/kg, ip.)

descerebrarla y desmedularla (figura 12), [NOM-033-ZOO-1995 (sacrificio humanitario

de los animales domésticos y silvestres)]. Con ello se persigue eliminar los reflejos y

60   

tener solamente un animal vegetativo, el cual será entregado a los alumnos para la

realización de la práctica.

Figura 12. Desmedulación y descerebración de la rana

2. Se fija a la rana sobre la tabla de disección y se abre su cavidad torácica, tras

separar previamente la piel del abdomen. Se corta a nivel de la cintura escapular y se

descubre la región torácica. Con extremo cuidado se incide el pericardio y se libera así

el corazón (figura 13). Durante este procedimiento debe cuidarse de no lesionar ningún

vaso, principalmente los grandes troncos que ocupan la porción precordial.

Figura 13. Localización del corazón. 1) Aurícula, 2) ventrículo y 3) ápice.

3. Se fija el ápice del corazón (la punta) a un hilo conectado mediante un ganchito de

alambre a modo de anzuelo. Debe cuidarse de no perforar el miocardio (figura 14).

II. Efecto de sustancias simpático y parasimpaticomiméticas. 1. Realice un registro basal a una velocidad media.

Marcar el tiempo en el registro cada minuto durante 3 minutos una vez que observe

algún cambio; en todas las experiencias.

61   

2. Sin detener el registro agregue unas gotas de solución de adrenalina, continúe

registrando durante 3 minutos.

3. Lavar con Ringer.

4. Realice un registro basal y sin detener el registro agregue unas gotas de solución de

acetilcolina, continúe registrando durante 3 minutos.

5. Lavar con Ringer.

6. Realice un registro basal y sin detener éste agregue unas gotas de atropina, continúe

registrando durante 1 minuto y sin lavar adicione la misma cantidad de acetilcolina que

administró en el punto 4. Continúe registrando durante 3 minutos.

7. Realizar dos lavados con Ringer.

Figura 14. Dispositivo para registro de actividad cardiaca

62   

III. Periodo refractario y pausa compensadora. 1. Colocar los electrodos sobre el corazón. Ajustar el registro a una velocidad media.

2. Realice un registro basal. Aplique un estímulo umbral teniendo cuidado que el

estímulo caiga en el punto más elevado de la contracción. Siga estimulando a períodos

cada vez más alejados hasta lograr el registro de una contracción superpuesta a la

sístole normal (extrasístole). Observe.

IV. Efecto de los iones sobre la actividad del corazón. 1. Realizar un registro basal. Sin dejar de registrar agregar 0.5 ml de Ringer con alto

contenido de potasio. Una vez que se observe algún cambio marcar cada minuto

durante 3 minutos.

2. Realizar 2 lavados con Ringer.

3. Realizar un registro basal. Sin dejar de registrar agregar 0.5 ml de Ringer con alto

contenido de calcio. Una vez que se observe algún cambio marcar cada minuto durante

3 minutos.

4. Realizar 2 lavados con Ringer.

DATOS II. Sustancias simpático y parasimpaticomiméticas * Adrenalina Tiempo (minutos)

Basal 1 2 3

Frecuencia

Amplitud

* Acetilcolina Tiempo (minutos)

Basal 1 2 3

Frecuencia

Amplitud

63   

* Atropina + acetilcolina

Tiempo (minutos) Atropina + acetilcolina

Basal Atropina 1 2 3 Frecuencia

Amplitud

IV. Efecto de los iones sobre la actividad del corazón

* Ringer alto en potasio

Tiempo (minutos) Basal 1 2 3

Frecuencia

Amplitud

* Ringer alto en calcio

Tiempo (minutos) Basal 1 2 3

Frecuencia

Amplitud

PRESENTACIÓN DE RESULTADOS - Determine para cada experiencia la frecuencia (latidos/minuto) y amplitud (mm) de las

contracciones.

- Realice las gráficas correspondientes para cada experiencia.

- Adicione a su reporte los resultados obtenidos para cada experiencia.

BIBLIOGRAFÍA Aidley, D. J., 1998. The Physiology of Excitable Cells. 4ª- ed. Edit. Cambridge.

University Press. P. 381 – 393.

Conti, F. E., 2010. Fisiología Médica. McGraw-Hill-Interamericana, México.

Eckert, R., D. Randall y G. Augustine, 1998. Fisiología Animal. Mecanismos y

adaptaciones. 4ª. ed. Edit. McGraw Hill – Interamericana. Madrid, España. p 507 – 522.

Ganong, F. W. 2000. Fisiología Médica. 17ª. ed. Edit. El Manual Moderno, D. F.,

México. p. 84 – 89, 605 – 622.

64   

PRÁCTICA 11 PROPIEDADES DEL MÚSCULO LISO

INTRODUCCIÓN Aunque el músculo liso se ha estudiado menos que el esquelético, se sabe que

contiene los elementos que pueden hacer su proceso contráctil semejante. La

distribución de músculo liso en los organismos es abundante y básico para muchos de

los procesos vitales y de conservación del individuo y de la especie.

La excitación en el músculo liso, en general, obedece a factores humorales y nerviosos.

El intestino es el tipo de órgano en el que mejor se puede ilustrar el comportamiento del

músculo liso: el automatismo, la influencia de la inervación neurovegetativa, etc.

OBJETIVO - Estudiar las propiedades contráctiles del músculo liso.

- Observar el efecto de las sustancias simpático y parasimpaticomiméticas sobre la

actividad del músculo liso intestinal.

- Observar la influencia que ejercen algunos factores externos, como hipoxia,

temperatura y tensión sobre la actividad del músculo liso intestinal.

MATERIAL Por equipo: Soluciones: - Hilo - Acetilcolina 1:10 000

- aguja - Adrenalina 1:10 000

- matraz Erlenmeyer de 500 ml - Atropina 1: 1000

- termómetro industrial - Tyrode pH 7.2 – 7.4, 10 L.

- pinzas dobles Material biológico: - cámara de vidrio - 1 conejo con ayuno de 24 horas

- caja de Petri.

- vaso de p.p. de 50 ml.

- resistencia

65   

- pinza Mohr.

- 2 vasos de precipitados de 250 ml.

- soporte de media luna.

- 3 pipetas de 1 ml graduadas.

DESARROLLO Preparación del sistema de registro: Con ayuda de la resistencia se lleva el baño a 37 ± 1°C. Dentro del baño se coloca la

cámara para órgano aislado, la cual deberá contener solución de Tyrode con aireación

continua (dos a tres burbujas /segundo) y un eficiente sifón que debe manejarse con

cuidado en el tubo de desagűe para realizar los lavados. Se sacrifica al conejo con un

golpe en la nuca y se le abre el abdomen para localizar el estómago, y

aproximadamente 10 cm por debajo de éste se corta una porción de intestino de 20 cm,

el cual se transfiere a una caja de Petri que contiene Tyrode aireado a 37°C. Se

eliminan las membranas mesentéricas para que el músculo quede libre y se cortan

porciones (asas) de 1.5 a 2 cm (figura 15).

Figura 15.

66   

Con movimientos suaves se vaciará el contenido de las asas y cada equipo tomará una.

Las restantes se mantendrán en el seno de la solución aireada de Tyrode a 37 ± 1°C. A

una porción se le ata un hilo de unos 25 cm en cada uno de sus extremos teniendo

cuidado de que la luz intestinal no quede ocluido, como se observa en la figura 16.

Figura 16.

Esta preparación se traslada a la cámara de órgano aislado, amarrando una de los

extremos en el gancho del fondo de la cámara y el otro al transductor del BIOPAC

(figura 17). El equipo BIOPAC deberá estar calibrado (pedir ayuda al profesor) de tal

manera que se registren claramente los movimientos del duodeno.

Figura 17.

67   

IMPORTANTE: Cuidar que la temperatura del líquido de la cámara esté entre los 35 y

37°C, y pasen 2-3 burbujas de aire/segundo.

PRECAUCIONES ADICIONALES:

a) Mantener la aireación.

b) Mantener la temperatura a 37°C.

c) No sacar la resistencia mientras esté conectada.

EXPERIENCIAS: 1. – Realice un registro basal (1 min) de las contracciones del intestino en el que pueda

apreciar claramente la ritmicidad y el tono del mismo.

2.- Hipoxia. Sin dejar de registrar, suspenda el burbujeo de aire de la preparación; en

cuanto se noten los efectos volver a establecer la aireación. Dejar transcurrir un tiempo

adecuado para observar el restablecimiento de la actividad contráctil.

3. Temperatura. Sin detener el registro agregue a la cámara solución de Tyrode frío.

Anote la temperatura del interior de la cámara. Aumente la temperatura gradualmente

por calentamiento del recipiente exterior. Observe los cambios de la ritmicidad hasta

tener una temperatura de 38°C; y regresar la temperatura a 37°C.

4.- Tensión. Realizar un registro basal y sin dejar de registrar, aumente la carga del

músculo aumentando la altura del transductor. Observe la respuesta y determine si ésta

se mantiene durante 3 min.

5.- Adrenalina. Realice un registro basal y sin detener el registro agregue una gota de

adrenalina de una solución 1:10 000. Continúe registrando durante 3 min; o hasta

observar los efectos sobre la amplitud y la frecuencia de las contracciones.

6.- Realice los lavados con solución de Tyrode que sean necesarios hasta que la

preparación presente la frecuencia y amplitud que tenía en el registro basal anterior.

7. Acetilcolina. Realice un registro basal y sin detener registre los efectos que se

producen al regresar una gota de la solución de acetilcolina de una solución 1:10 000.

Continúe registrando durante 3 minutos o hasta observar los efectos sobre la amplitud y

la frecuencia de las contracciones.

8.- Realice los lavados con solución de Tyrode que sean necesarios hasta que la

preparación presente la frecuencia y amplitud que tenía en el registro basal anterior.

68   

9.- Atropina. Realice un registro basal y, sin detener el registro, agregue 0.2 ml de una

solución de atropina 1:1000. Registre durante 1 minuto y después agregue una gota de

acetilcolina. Continúe registrando durante 3 minutos o hasta observar los efectos sobre

la amplitud y la frecuencia de las contracciones.

DATOS * Adrenalina

Tiempo (s)

Basal 0 5 10 15 20 25 30 45 90

Frecuencia

Amplitud

* Acetilcolina

Tiempo (s)

Basal 0 5 10 15 20 25 30 45 90

Frecuencia

Amplitud

* Atropina + Acetilcolina

Tiempo (s)

Basal 0 5 10 15 20 25 30 45 90

Frecuencia

Amplitud

PRESENTACIÓN DE RESULTADOS - Determine para cada experiencia la frecuencia y amplitud de las contracciones.

- Realice las gráficas correspondientes para cada experiencia.

- Adicione a su reporte los resultados obtenidos de cada experiencia.

69   

BIBLIOGRAFÍA Berne, R. y Levy, M.; 1992. Fisiología. Ed. Mosby Year Book. Madrid, España, pp. 352 –

373.

Ganong, F.W.; 2000. Fisiología Médica.17a. ed. Ed. El Manual Moderno, México, pp.

89–92; 533–570.

Stuart, I.F.; 2003. Fisiología Humana. 7ª ed. Ed. McGraw-Hill—Interamericana. Madrid,

España, pp. 364–368.

Eckert, R., Randall, D. y Augustine, G.; 1998. Fisiología Animal. Mecanismos y

adaptaciones. 4a ed. Ed. McGraw-Hill–Interamericana. Madrid, España, pp. 435– 438.

70   

APÉNDICE

a) MANEJO DE ANIMALES DE LABORATORIO Las técnicas básicas para el manejo de animales incluyen:

i). Evitar sufrimiento innecesario al animal, que además de contravenir normas éticas,

puede condicionar respuestas anómalas.

ii). Evitar el manejo inadecuado y brusco del animal, para prevenir reacciones agresivas

hacia el experimentador.

a1) Ratas Evítese el manejar a la rata con violencia, pues rápidamente aprende a defenderse y se

torna difícil y peligrosa.

El manejo de la rata es similar al que se usa con el ratón, sin embargo, para levantarla y

manipularla es más conveniente tomarla suavemente y con seguridad por el dorso,

rodeando el tórax con la mano (figura 18), pero teniendo cuidado de no presionar con

demasiada fuerza porque se puede asfixiar.

Figura 18

a2) Ranas

La rana debe de tomarse con una franela húmeda para evitar pérdida de agua por la

piel (respiración cutánea) y facilitar su manipulación.

* Descerebración y desmedulación:

Remueva la porción anterior del cerebro haciendo un corte a nivel de las comisuras

bucales, que pase por el borde anterior de las membranas timpánicas (figura 19).

71   

Destruya el cordón espinal introduciendo un estilete y haciendo movimientos circulares

(figura 19).

Figura 19.

* Preparación ciático - gastrocnemio: Corte la piel alrededor de la parte superior de la

pierna, como se muestra en la figura 20. Para desprender la piel, jale hacia abajo de la

pierna hasta que quede expuesta toda la musculatura.

Figura 20.

Cuide de mantener húmedos con solución salina los tejidos expuestos.

Coloque una aguja de disección o una pinza entre el tendón de Aquiles y el hueso, pase

un hilo por debajo del tendón y amárrelo fuertemente. Finalmente corte el tendón de

Aquiles lo más lejos posible del músculo (figura 21).

Con ayuda de sus pinzas y disectores de vidrio, separe cuidadosamente los músculos y

exponga el nervio ciático, el cual se identifica por su color amarillento, corriendo

cercano y paralelo a los vasos femorales (figura 21).

Figura 21.

72   

a3) Conejos

No se debe tomar por las orejas, sino por la piel del cuello con la mano izquierda; la

mano derecha servirá para sujetar las extremidades posteriores (restirando sin lastimar)

e inmovilizar al animal para poderlo trabajar (figura 22).

Cuando se tiene la caja adecuada para la manipulación del conejo, basta con acomodar

la cabeza del animal en el cepo de la misma. Esta caja permite el uso de las orejas para

realizar inyecciones por la vena vía Intravenosa (figura 22).

Figura 22.

b) DISTRIBUCIÓN DE ANIMALES DE LABORATORIO Es de gran importancia que se realice una distribución aleatoria de los animales para un

experimento de laboratorio, ya que esto contribuirá en gran parte a obtener resultados

verídicos. La distribución aleatoria permite tener grupos homogéneos y resultados

representativos de toda una población, además hay que mencionar que los caracteres

que guardan entre ellos se encuentran totalmente distribuidos al azar (p.ej. peso

corporal, agresividad, etc.), de tal manera que si no se consideran estos puntos tan

importantes, los grupos formados no serán equivalentes

Supóngase que hay 40 animales para colocarlos en 4 grupos iguales. Para integrar los

grupos se generan números aleatorios. Los números mayores de 4 se ignoran (por

ejemplo, los primeros números 9, 5, 5 se ignoran), el número que sigue (por ejemplo,

231) nos indica que el animal que vamos a retirar de la jaula va a formar parte del grupo

73   

número 2. El siguiente animal que se retira va al grupo 3, el siguiente al grupo 1 y así

sucesivamente hasta completar los 4 grupos de 10 animales cada uno.

c) MARCAJE DE ANIMALES DE LABORATORIO El marcar los animales facilita su identificación para los diferentes ensayos de

laboratorio:

- Experimentos AGUDOS que duran de tres a ocho horas.

- Experimentos CRONICOS que duran semanas y/o meses.

c1) Ratas y ratones

Para experimentos agudos se utiliza el método de manchado que consiste en aplicar un

colorante por medio de un hisopo, en diferentes regiones del cuerpo, lo que permite

hacer diferentes combinaciones: CA-cabeza; CO-cola; MI-pata delantera izquierda; MD-

pata delantera derecha; PI-pata trasera izquierda; PD-pata trasera derecha; LO-lomo;

CACO-cabeza y cola, etc.

Para experimentos crónicos se emplea el método de perforaciones en las orejas. Con

una pinza sacabocado se hacen perforaciones en las orejas izquierda y derecha del

animal (figura 23). El número total está dado por la suma de los valores de cada una de

las perforaciones. Con este procedimiento se eliminan los números 8, 9, 80, 90.

Figura 23

74   

c2) Ranas

Se les colocan cintillos de tela adhesiva en una de las extremidades, donde se anota el

peso corporal o un número que permita identificarlas.

c3) Conejos y cuyos

Cuando no se pueden identificar por alguna característica natural (color, tamaño, etc.)

se les colocan grapas en las orejas.

d) VÍAS DE ADMINISTRACIÓN Un fármaco puede introducirse en un organismo en forma de gas, de solución, de

suspensión, o en estado sólido. La forma es un factor importante en la velocidad de

absorción.

La vascularización del sitio de administración, y el área de la superficie absorbente

también influyen en la velocidad de absorción. Los fármacos son absorbidos con mayor

rapidez en áreas con riego abundante, por ejemplo los pulmones, que en sitios con

menor riego sanguíneo, como los subcutáneos.

Las vías de administración de fármacos utilizadas para lograr sus efectos sistémicos

pueden dividirse en dos grupos principales:

- ENTERICAS- Que usan el tubo gastrointestinal. Ejemplos: oral, rectal, intragástrica,

sublingual.

- PARENTERALES- Cuando NO se utiliza el tubo gastrointestinal. Ejemplos:

Intravenosa, subcutánea, intramuscular, tópica, intradérmica, respiratoria (inhalación),

etc.

d1) Vía Intraperitoneal Con toda la mano izquierda sujete la piel del cuello de la rata en una amplia zona

manteniéndola inmóvil, así con la mano derecha se puede estirar la cola o las patas

posteriores (sin lastimarla) y se presenta otra persona, la que hará la punción (figura

24).

Las punciones deben practicarse en la mitad inferior del abdomen, por fuera de la línea

media. Con una mano se levanta la piel de la región, para separar la pared del

contenido abdominal y evitar así su punción. Primero se introduce la aguja

subcutáneamente hasta la mitad de su longitud y luego se acaba de introducir

75   

verticalmente a través de la pared abdominal. Utilizar agujas de bisel corto y calibre

regular (figura 24).

Figura 24.

d2) Vía subcutánea

Es precisamente debajo de la piel del dorso del cuello. Se puede aprovechar el pliegue

que se toma entre el pulgar y el índice. Los dedos medio, anular y meñique sirven para

abrazar abdomen y tren posterior del animal. La mano derecha queda libre para hacer

la inyección clavando la aguja en la piel que queda sobre el pulgar e índice y en sentido

céfalo-caudal. Para asegurarse de que la inyección será subcutánea, una vez

atravesada la piel, se seguirá el trayecto de la aguja con los dedos.

e) SOLUCIONES FISIOLÓGICAS Las soluciones utilizadas en los experimentos de fisiología son llamadas SOLUCIONES

FISIOLÓGICAS (salina, Tyrode, Krebs, Ringer, etc.) y su composición depende del

tejido u órgano aislado (in vitro) que requiera mantenerse en un estado razonablemente

satisfactorio durante algún tiempo, en los 2 cuadros siguientes se muestran ejemplos.

Componentes g/L

Ringer Krebs Tyrode Hank

NaCl 6.5 6.9 8 8 KCl 0.14 0.35 0.2 0.4 CaCl2 0.12 0.28 0.2 0.14 MgCl2 6H2O 0.1 MgSO4 7H2O 0.29 0.2 NaH2PO4 H2O 0.01 0.16 0.05 Na2HPO4 2H2O 0.06 KH2PO4 0.06 NaHCO3 0.2 2.1 1 0.35 Glucosa 2 2 1 1

76   

Componentes g/L

LIC Ringer bajo K+

Ringer alto K+

Ringer bajo Ca2+

Ringer alto Ca2+

NaCl 6.5 6.5 6.5 6.5 KCl 0.11 0.28 0.14 0.14 CaCl2 0.12 0.12 0.24 NaH2PO4 H2 O 0.01 0.01 0.01 0.01 NaHCO3 0.2 0.2 0.2 0.2 K2HPO4 3H2O 10 KH2PO4 3 KHCO3 1.24 Glucosa 2 2 2 2 Citrato de sodio 1

f) SOLUCIONES EMPLEADAS EN LAS PRÁCTICAS PRÁCTICA 1. ASPECTOS GENERALES DEL MANEJO DE ANIMALES Y VÍAS DE

ADMINISTRACIÓN.

- Solución Salina 0.9%:

NaCl ...................... 9 g

Agua destilada ........1 L

PRÁCTICA 3. ESTUDIO DE LA PENETRACIÓN DE SUSTANCIAS A LAS CÉLULAS

NORMALES.

- Solución de NaCl 0.2 M:

Determine el peso molecular del NaCl y multiplique por 0.2, lleve a 1 litro con agua

destilada.

- Solución de sacarosa 1 M:

Pese una cantidad de sacarosa igual a su peso molecular (342.30) y lleve a 1 litro con

agua destilada.

- Proceda de la misma manera para las soluciones de KCl, LiCl, BaCl2 y CaCl2.

-Glucosa 0.2%:

Pesar 200 mg y llevarlos a 100 ml de H2O destilada:

- Solución de alcohol metílico 0.3 M:

77   

Si la cantidad necesaria es de 100 ml, divida el peso molecular de este alcohol (32.04)

entre 10 y después multiplique el valor obtenido por 0.3 (para obtener la molaridad de

0.3). Después divida este valor entre la densidad (0.79) para determinar el volumen

necesario.

- Proceda de la misma forma para preparar las soluciones de:

Alcohol Etílico (PM=46.07; densidad=0.79).

Alcohol Propílico (PM=60.097; densidad=0.80).

Alcohol Butílico (PM=74.124; densidad=0.81).

PRÁCTICA 4. POTENCIAL DE DIFUSIÓN Y POTENCIAL DE LESIÓN.

-Solución de Ringer.

-Solución de LIC (líquido intracelular).

-Soluciones de K2SO4: 0.005, 0.01, 0.025, 0.05 y 0.1M.

-Solución de KCl: 400, 100, 50, 20, 10, 5, 2.5, 1 mM.

-Soluciones de Na2HPO4: 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0 y 2.0 M.

PRÁCTICA 7. TRANSMISIÓN SINÁPTICA.

- Acetilcolina 1: 10 000:

Acetilcolina ........................ 1 mg

Solución salina 0.9 % ….. 10 ml

- Curare 50 g/ml:

Tubocurarina...................... 1 mg

Solución salina 0.9 % ….. 20 ml

- Fisostigmina 1.5 mg/ml:

Fisostigmina .................... 1.5 mg

Solución salina ................... 1 ml

PRÁCTICA 8. MODULACIÓN DE UN FUNCIÓN CELULAR POR SEÑALES

QUÍMICAS.

- Soluciones de oxitocina a 0.06, 0.2, 0.63 y 5 Ul/ml.

- 4 litros de solución fisiológica de Jalon

78   

PRÁCTICA 10. PROPIEDADES DEL MÚSCULO CARDIACO.

- Acetilcolina 1:10 000:

Acetilcolina.......................... 1 mg

Solución salina 0.9 % ….... 10 ml

- Adrenalina 1:10 000:

Adrenalina …………............ 1 mg

Solución salina 0.9 % ……. 10 ml

- Atropina 1:1000:

Sulfato de atropina ………... 1 mg

Solución salina 0.9 % ……... 1 ml

- Solución Ringer normal (ver soluciones fisiológicas).

- Solución Ringer con alto contenido de K+.

- Solución Ringer con alto contenido de Ca2+.

- Solución Ringer con bajo contenido de K+.

- Solución Ringer con bajo contenido de Ca2+.

PRÁCTICA 11. PROPIEDADES DEL MÚSCULO LISO.

- Acetilcolina 1:10 000: - Tyrode:

Acetilcolina ……................... 1 mg NaCl ........................... 8 g

Solución salina 0.9 % …….. 10 ml KCl .......................... 0.2 g

- Adrenalina 1:10 000: CaCl2 anhidro ......... 0.24 g

Adrenalina …………............. 1 mg MgCl2 ...................... 0.01-0.05 g

Solución salina 0.9 % …….. 10 ml NaH2PO4 ................ 0.05 g

- Atropina 1:1000: NaHCO3 ...................... 1 g

Sulfato de atropina ……….... 1 mg Glucosa ...................... 1 g

Solución salina 0.9 % ……… 1 ml Agua destilada ............ 1 L

* El CaCl2 debe disolverse por separado.

79   

g) CALIBRACIÓN DEL BIOPAC 1. Abrir el programa BSL PRO 3.7. 2. En el menú MP36, seleccionar: Ajuste adquisición.

3. En la ventana que se abre, debe decir adquirir y añadir usando memoria PC. 100 muestras/segundo en frecuencia de muestreo y 120 minutos en tiempo de adquisición. Seleccionar reajustar.

80   

4. En el menú MP36, seleccionar ajuste canales. Si el transductor de fuerza se conectó al canal 1 (CH1), éste aparecerá seleccionado.

5. Dar clic en el botón que tiene un triángulo negro invertido, seleccionar fuerza de 0 a 50 gramos o de 0 a 100 gramos (dependiendo de la práctica que se vaya a realizar).

81   

6. Dar clic en el botón de la llave de tuercas, aparecerá una ventana que tiene un botón “calibrar”, dar clic en él.

7. Se abre la ventana: “Cambiar parámetros”. Con el ganchillo con forma de “S” en el orificio de 50 o 100 g del transductor de fuerza (dependiendo de la práctica), se pone 0 en la casilla de valor de escala que está frente al botón Cal1. Se da clic en Cal 1.

82   

8. Si el paso anterior se realizó de forma adecuada, habrá un cambio en el valor de la casilla de valor de entrada que está frente al botón Cal 1:

9. Ahora se coloca la pesa de 10 gramos en el ganchillo en forma de “S” y se pone 10 en la casilla de valor de escala que está frente a Cal 2. Se da clic en Cal 2.

83   

10. De igual forma, si el paso anterior se realizó de forma adecuada, habrá un cambio en el valor de la casilla de valor de entrada que está frente al botón Cal 2:

11. Se da clic en OK de todas las ventanas que se han abierto. En el menú Ver, se selecciona Mostrar, y luego Cuadrícula. Se da clic en Inicio.

84   

12. Si la calibración se realizó de forma adecuada, aparecerá una línea roja (o de otro color) que se va “desplazando” sobre el valor de 10 gramos. Luego dar clic en stop.

13. Para comprobar que la calibración es adecuada, se retira la pesa de 10 gramos del gancho en “S” que está en el transductor de fuerza. Se da clic en Inicio, ahora la línea roja aparece en el valor de 0. La calibración es adecuada.

85   

14. Lo más recomendable ahora es guardar el archivo, si ocurre cualquier imprevisto no se tendrá que volver a calibrar. Para ello en el menú Archivo, seleccionar Guardar como:

15. Guardar el archivo de la siguiente forma: Grupo-equipo-número de práctica- mes y año (Ejemplo: 4FM1Eq2P6Ago2013). Dar clic en guardar. En la parte superior izquierda de la ventana aparecerá el nombre que se le ha dado al archivo con la extensión .acq.

16. El equipo está calibrado y listo para llevar a cabo sus registros.