manual micro

INSTITUTO TECNOLOGICO DE SONORADIRECCION ACADEMICA DE LA DIVISIONDE INGENIERIA Y CIENCIAS BIOLOGICAS

MANUAL DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA I

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Ing. Anacleto Félix Fuentes

Depto. de Química e Ing. Química

CD. OBREGON, SONORA JUNIO DE 1996

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INSTITUTO TECNOLOGICO DE SONORA

RectorDr. Oscar Russo Vogel

Vicerrector AcadémicoLic. Javier J. Vales García

Director Académico de la División de Ingeniería y Ciencias BiológicasIng. Mario A. Pablos Tavares

Jefe del Depto. de Química e Ing. QuímicaQ. Rosa Amelia Beltrán Esparza

Este manual fue editado para uso exclusivo de maestros y alumnos del ITSON que cursan la materia.

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PRESENTACION

El presente curso tiene como finalidad dar al estudiante una serie de herramientas de gran utilidad para el manejo y aprovechamiento de microorganismos. Ya que la prosperidad del hombre y su bienestar depende en gran parte del dominio que se tenga sobre las poblaciones microbianas, sea en el aspecto biotecnológico, médico, agrícola e industrial, para lo cual necesita del conocimiento de las condiciones físicas, fisiológicas, bioquímicas y su comportamiento tanto en el ámbito parasitario, como en la reproducción de los mismos, ya sea para el aprovechamiento industrial de subproductos metabólicos o bien como fuente de proteína unicelular, para lo cual debemos de conocer las características de su crecimiento, sus condiciones físicas favorables como son los siguientes parámetros: temperatura, pH y los medios apropiados en el cual se desarrollan tanto "in vivo" como "in Vitro".

También es importante conocer las formas de inhibición y destrucción, así como la extirpación de muchos de ellos, como es el caso de microorganismos que actúan como contaminantes, por ejemplo: En la depuración del agua, pasteurización de la leche, refrigeración de alimentos, etc., que con dichas tecnologías se tiende al control de las poblaciones microbianas.

Como una recomendación de suma importancia es que el alumno antes de la realización de la práctica, comprenda en su totalidad lo que hará como se efectuará y por qué. Para así poder lograr los objetivos planteados en las prácticas que contempla este manual.

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REGLAMENTO

AL CUAL SE SUJETARAN LOS ALUMNOS DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

Las siguientes sugerencias son con el fin de proporcionar algunas ideas que deben considerarse en todo trabajo que desarrolles en el laboratorio de Microbiología, además se pretende evitar al máximo las posibles contaminaciones por microorganismos patógenos que en algunas prácticas se manejan.

1. Guarde sus enseres en el cajón de las gavetas, nunca los ponga sobre la mesa de trabajo.

2. Los estudiantes deberán entrar siempre al laboratorio con bata blanca limpia.

3. No deberá comer ningún alimento, masticar chicle, ni fumar dentro del laboratorio.

4. Acostumbrarse a no llevarse nunca a la boca lápices u otros objetos, ya que se trabaja con microorganismos viables.

5. Manténgase constantemente limpia la mesa así como los aparatos que use.

6. En caso de que un cultivo con gérmenes vivos se derrame avise inmediatamente al instructor.

7. Todos los objetos sólidos no contaminados tales como algodón, papeles, cerillos, deberán tirarse en los recipientes que con ese objeto existen en el laboratorio.

8. En caso de accidente personal tales como cortadas o piquetes en los dedos o caída de cultivo en los ojos, piel, avise al instructor.

9. Al final de la práctica limpie y ponga el material y equipo en su sitio perfectamente limpio y desinfecte cuidadosamente la mesa en su área de trabajo.

10. Antes de salir del laboratorio verifique que las llaves de gas y agua estén bien cerradas y desconectados los aparatos eléctricos (excepto incubadoras y

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refrigerador).

11. Lave perfectamente sus manos con agua y jabón antes de salir del laboratorio.

12. Conserve usted notas completas de los experimentos realizados en cada práctica en un cuaderno exclusivamente para este laboratorio, así como su hoja de reportes de prácticas; el instructor del laboratorio indicará la fecha máxima de entrega de reportes.

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RECOMENDACIONES PARA EVALUACION

- El alumno deberá presentarse al laboratorio con su diagrama de flujo.

- El alumno presentará y discutirá el cuestionario de la práctica, previo a la realización de ésta.

- El reporte de la práctica se hará en las hojas correspondientes (incluidas en el manual). La fecha de entrega lo indicará el instructor.

- Para la elaboración del reporte de la práctica se sugiere que el alumno se apoye con material bibliográfico referente a la misma.

- El alumno deberá presentarse al 100% en las sesiones de prácticas.

- Cuando menos se realizaran 2 exámenes parciales.

- La nota final del laboratorio será "A" (acreditado) o "NA" (no acreditado).

- Nota final de laboratorio "NA" equivale a 4 en el curso teórico.

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I N D I C E PAGINA

PRESENTACIONREGLAMENTORECOMENDACIONES PARA EVALUACIONPRACTICA Nº 1Equipo y material empleado en el laboratorio de MicrobiologíaPreparación de colorantes y reactivos 08

PRACTICA Nº 2Instrucciones generales para el uso del microscopio yobservación de microorganismos 14

PRACTICA Nº 3Técnicas de preparación y esterilización del materialque se usa en el laboratorio de Microbiología 23

PRACTICA Nº 4Preparación y esterilización de medios de cultivo 28

PRACTICA Nº 5Técnicas de siembra en medios de cultivo y observaciónde características de crecimiento 34

PRACTICA Nº 6Técnicas de aislamiento de cultivos puros de una mezclade microorganismos 39

PRACTICA Nº 7 y 8Pruebas relacionadas con el metabolismo bacteriano 44

PRACTICA Nº 9Efecto del medio sobre las bacterias 50

PRACTICA Nº 10Técnicas de observación de hongos y levaduras 56

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PRACTICA Nº 11 Análisis bacteriológico del agua 61 PRACTICA No. 1

EQUIPO Y MATERIAL MAS EMPLEADO EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA Y PREPARACION DE COLORANTES Y REACTIVOS

OBJETIVO

El objetivo de esta práctica es conocer, cuidar y saber aplicar el material y equipo para su uso en Microbiología. Así como la preparación de colorantes y reactivos.

INFORMACION GENERAL

La gran mayoría del equipo y materiales empleados en microbiología han sido tomados de los que se utilizan en Química, en Física y de otras ciencias Biológicas, sin embargo algunos instrumentos y métodos han sido creados por microbiólogos exclusivamente para su especialidad. En la investigación se necesita ingenio notable y podríamos decir que un investigador cabal de laboratorio deberá ser diestro en lo que respecta al funcionamiento y conocimiento de artefactos mecánicos.

PROCEDIMIENTO

Los trabajos en laboratorio de Microbiología exigen para su realización determinado material y equipo cuyo conocimiento es imprescindible.

El instructor dará a conocer el uso y manejo del equipo más empleado en Microbiología y además indicará la forma de preparación de algunos colorantes y reactivos.

MATERIAL

Cajas de Petri, tubos de ensayo con tapón de rosca, probetas, matraces, morteros, pipetas, matraces volumétricos, matraces erlenmeyer, embudos, frascos de dilución, cajeros, pipeteros, frascos, goteros, etc.

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EQUIPO

Incubadoras, hornos de calor seco, autoclave, microscopio compuesto, esteroscopio, potenciómetro, refrigerador, balanza analítica, homogenizador para medios de cultivo, parrilla eléctrica, etc.

EQUIPO PERSONAL

Bata, franela, cerillos, jabón.

PREPARAR LOS SIGUIENTES REACTIVOS

1. AZUL DE METILENOAzul de metileno = 0.3 gAlcohol etílico al 95% = 10 mlAgua destilada = 90 ml

Disolver el colorante en el alcohol, agregar agua destilada poco a poco y dejar reposar 18 horas y filtrar por papel filtro.

2. CRISTAL VIOLETACristal violeta = 0.25 gAlcohol etílico al 95% = 10 mlAgua destilada = 90 ml

Disolver el colorante en el alcohol, agregar agua destilada poco a poco reposar 18 horas y filtrar por papel filtro.

3. SAFRANINASafranina = 0.25 gAlcohol etílico al 95% = 10 mlAgua destilada = 90 ml

Disolver la safranina en el alcohol, agregar agua destilada poco a poco, dejar reposar 18 horas y filtrar por papel filtro.

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4. CARBOL-FUCSINAFucsina básica = 1 gAlcohol etílico al 95% = 10 mlFenol al 5% = 90 ml

Disolver la Fucsina en el alcohol, agregar la solución de fenol y dejar reposar por 18 horas y filtrar.

5. FENOL AL 5%Fenol = 25 gAgua destilada = aforar a 500 ml

6. ALCOHOL-ACETONAAlcohol al 95% = 75 mlAcetona = 25 ml

7. ALCOHOL-ACIDOAcido nítrico = 2.5 mlAlcohol etílico al 95% = 97.5 ml

8. LUGOL (I-KI)Yodo = 1 gYoduro de potasio = 2 gAgua destilada = 300 ml

Triturar el yodo y el yoduro de potasio en un mortero hasta obtener una mezcla más o menos homogénea y agregar poco a poco el agua.

NOTA: TODOS LOS COLORANTES Y REACTIVOS CONSERVARSE EN FRASCOS GOTEROS COLOR AMBAR.

CUESTIONARIO

1. Definir que es un colorante2. Definir la función del grupo cromóforo y auxocromo de un colorante3. Explique las propiedades de los colorantes básicos4. Explique las propiedades de los colorantes ácidos

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5. Investigue las fórmulas químicas y propiedades del azul de metileno, safranina y cristal violeta6. ¿Qué es un desinfectante?, de 5 ejemplos7. ¿Qué es un mordiente?, de 3 ejemplos8. Mencione y dé los usos de 5 equipos más utilizados en un laboratorio de Microbiología.

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REPORTE

PRACTICA Nº 1

EQUIPO Y MATERIAL MAS EMPLEADO EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA Y PREPARACION DE COLORANTES Y REACTIVOS

FECHA EN QUE SE REALIZO LA PRACTICA

MODIFICACIONES A LA PRACTICA

RESULTADOS OBTENIDOS

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DISCUSION DE RESULTADOS

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

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PRACTICA Nº 2

INSTRUCCIONES GENERALES PARA EL USO DEL MICROSCOPIO Y OBSERVACIONES DE MICROORGANISMOS

OBJETIVO

El objetivo de esta práctica es conocer y aplicar los conocimientos de la parte mecánica y óptica del microscopio en la observación correcta de las características morfológicas de bacterias, hongos, levaduras y algas.

INFORMACION GENERAL

El microscopio es una de las herramientas más utilizadas en el estudio de los microorganismos, ya que nos proporciona la amplificación necesaria para poder observar a los organismos que no son posibles de ser observados a simple vista. El conocer y entender como funciona este instrumento es de vital importancia para todo trabajo en el laboratorio de Microbiología.

Los microscopios son de dos tipos diferentes: el óptico y el electrónico, según sea el principio en el cual se basa la amplificación.En el microscopio óptico se obtiene la amplificación por medio de un sistema de lentes mientras que en el microscopio electrónico se usa un haz de electrones en lugar de ondas luminosas para obtener la imagen amplificada.

Del microscopio óptico, el más sencillo es conocido como microscopio simple y consta de una sola lente convergente, también conocida como lupa, de capacidad amplificadora muy reducida.

El aparato más utilizado es el microscopio compuesto o microscopio óptico de campo claro que supera extraordinariamente al anterior, ya que básicamente consta de dos sistemas de lentes, uno de ellos amplia la imagen del objeto observado, que es captada y nuevamente amplificada por el segundo sistema, consiguiéndose con esto un mayor poder de resolución.

El poder de resolución puede describirse como la capacidad para distinguir dos puntos muy próximos, de modo que pueden verse separados.

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Además del microscopio de campo claro, existen los siguientes tipos; de campo oscuro, luz ultravioleta, fluorescencia y contraste de fase, etc.

En cuanto a los microorganismos, tres características básicas hacen necesario el empleo de técnicas especializadas en la investigación microbiológica como son: su tamaño diminuto, la aparente ausencia de diferencias individuales y su amplia distribución en la naturaleza. Es por esto necesario emplear estudios microscópicos de alto poder de amplificación, por consiguiente el procedimiento más correcto para estudiar la morfología de los microorganismos principalmente bacterias, consiste en el examen de un frotis, que previa fijación a un portaobjetos se tiñe con algún colorante y se examina después microscópicamente con el objetivo de inmersión, que es el de mayor poder de resolución.

Para obtener un buen frotis, debe "extenderse" el material, con objeto de formar una película delgada, y obtener así una sola capa de bacterias, perfectamente separadas sobre el portaobjetos. Con esta preparación previa pueden observarse perfectamente células aisladas, ya que de otra forma, los microorganismos se aglomeran en masas sólidas impenetrables a la luz.

Es necesario la tinción, ya que la diminuta célula bacteriana en su estado natural permitirá el paso de cantidad excesiva de luz y no se puede tener una buena observación.

Las células toman la tinción total o parcialmente de acuerdo con una relación química entre alguna sustancia celular y el colorante o bien, su superficie queda teñida por un mecanismo de atracción. En otras palabras las propiedades tintoriales de una célula dependen de su composición química y las diferencias en sus reacciones de coloración, constituyen índices importantes para distinguir unas bacterias de otras.

Existen dos grandes métodos de tinción para diferenciar a las bacterias: la tinción al GRAM que separa a las bacterias en GRAM positivas y GRAM negativas, dependiendo esto de la coloración que tome la célula. La otra tinción es la de ZIEHL-NEELSEN o de ácido-resistencia que se emplea para identificar algunos grupos de bacterias con alto contenido de lípidos.

PROCEDIMIENTO

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El microscopio consta de dos partes fundamentales (el instructor mostrará cada parte del microscopio e indicará su funcionamiento)

a) Parte mecánica consta de:Pie o base del microscopiobrazoplatinatornillo macrométricotornillo micrométricorevólver de objetivosobjetivos

b) Parte óptica que consta de:Espejodiafragmacondensadorlente de luz de los objetivoslentes y espejos del tubo del microscopiolentes de los oculares

GENERALIDADES

Cuando se va a observar algún objeto al microscopio siempre debe estar en posición vertical. Aprenda a observar a través del microscopio teniendo los dos ojos abiertos cuando el microscopio sea monocular, esto reduce el esfuerzo de los ojos usados en la observación.

FUENTE DE LUZ

La mejor fuente de luz se obtiene de la luz indirecta del sol, pero debido a la variabilidad de estas condiciones se emplea luz artificial.

La luz del espejo es enfocada por el condensador que se encuentra bajo la platina, el objeto de estudio es colocado en el portaobjeto que se pone en la platina, la imagen producida por el objeto es amplificada por el ocular.

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ENFOQUE

El microscopio tiene tres objetivos: el de 16 mm o seco débil, el de 4 mm o seco fuerte y el de 1.8 mm u objetivo de inmersión. Estos nombres se refieren a la "distancia de trabajo", se puede notar que las dos últimas distancias de trabajo son cortas por lo que siempre se ajustan con el tornillo de ajuste fino o micrométrico.OBJETIVO DE INMERSION

Evite el uso de una cantidad excesiva de aceite de cedro; después de usar el microscopio siempre se limpia el objetivo. Esta limpieza es muy importante puesto que el residuo gomoso reduce la eficacia de los lentes.

LOCALIZACION Y ENFOQUE DEL OBJETO

Ajustar la fuente de luz usando el objetivo seco débil, mirando a través del tubo de ajuste del espejo hasta que la fuente de luz esté en el centro del tambo; el tambo debe quedar iluminado uniformemente. El diafragma debe estar completamente abierto, el condensador totalmente arriba. Para enfocar el objeto que se va a observar, sin mirar por el ocular (viendo el portaobjeto) mueva el tubo hacia abajo con el tornillo de ajuste macrométrico hasta que el lente esté a cierta distancia de la preparación. Ahora mire el ocular, con el tornillo de ajuste macrométrico haga que el objeto sea visible, si es necesario use el tornillo de ajuste micrométrico para enfocar mejor. Estos movimientos se hacen lentamente.

LIMPIEZA DEL MICROSCOPIO

Una vez utilizado el microscopio se deberá apagar la fuente de la luz artificial, acto seguido, hacer la limpieza con papel de seda, de los objetivos (en especial el de inmersión), de los oculares y de la platina.

Cubrir el microscopio con su camisa o colocar en su caja. Limpie perfectamente su área de trabajo. Al transportar el microscopio, se colocará la base del microscopio sobre la palma de la mano izquierda y con la mano derecha se tomará firmemente del brazo del microscopio.

MORFOLOGIA Y ESTRUCTURA DE LA BACTERIA

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MATERIAL

Portaobjetos, asas, mecheros, cultivos de microorganismos

COLORANTES Y REACTIVOS

Azul de metileno, safranina, cristal violeta, carbol fucsina, Lugol, alcohol ácido, alcohol acetona.OBSERVACION DE PREPARACIONES EN FRESCO

PROCEDIMIENTOa) Flamear hasta el rojo el asa de inocularb) Quitar el tapón de uno de los cultivos de microorganismo proporcionado y

flamear el borde del tubo.c) Recoger una asada del cultivo y colocarla en el centro del portaobjeto

limpio (en caso de que el cultivo sea sólido suspenderlo en una gota de agua estéril)

d) Flamear de nuevo el borde del tubo y volver a taparloe) Esterilizar el asa de inocularf) Colocar un cubreobjeto sobre la suspensión del cultivo y presionar

suavementeg) Observar la preparación con el objetivo seco débil y después con el seco

fuerte

TECNICA PARA HACER UN FROTIS

a) Anotar el número correspondiente con lápiz graso sobre el portaobjetos, de la muestra por observar, indicando con más detalle la descripción en un cuaderno de anotación

b) Tomar y extender en un portaobjetos con el asa una gota del producto que se va a examinar si éste es fluido. Si es de consistencia más sólida, se diluye una pequeña porción del mismo en una gota de agua estéril colocada previamente sobre el portaobjetos con el asa

c) Las extensiones deben ser suficientemente finas para que los microorganismos aparezcan bien aislados al examen microscópico y lo suficientemente gruesa para ser localizado y hacer el enfoque con facilidad

d) Secar la preparación al aire, calentar muy suavemente en la corriente del

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aire caliente del mechero para acelerar la desecacióne) Fijar por medio del calor. Pasar el portaobjetos dos o tres veces con cierta

lentitud sobre la llama del mechero hasta una temperatura soportable al aplicarlo sobre el dorso de la mano. Se puede provocar alteraciones en la morfología de las bacterias si el calentamiento es excesivo

f) Dejar enfriar y hacer las siguientes tinciones

TINCION SIMPLE

a) La preparación seca y fijada se tiñe cubriéndola durante unos minutos (1 a 3) con una solución colorante

b) Lavar con agua de la llavec) Secar al aired) Observar con el objetivo de inmersión

COLORACION DE GRAM

a) Preparar un frotis, dejar secar al aire y fijar a la flamab) Cubra la preparación con la solución de cristal violeta dejar actuar el

colorante durante un minutoc) Escurra el colorante, lave con agua de la llave, cubra la preparación con

Lugol, dejar actuar este agente durante 15 segundosd) Escurra el Lugol, lave con agua corriente, cubra la preparación con

alcohol-acetona de 30 a 60 segundos, lave abundantemente con agua de la llavee) Cubra la preparación con safranina por un minuto y lave con agua de la

llave, secar la preparación al aire, se observa con el objetivo de inmersión

COLORACION DE ZIEHL-NEELSEN

Es la coloración de gérmenes ácido-alcohol resistentesa) Prepare un frotis, seque al aire y fije al calorb) Cubra la preparación con carbol-fucsina y caliente por el reverso hasta

emisión de vapores durante 5 a 10 minutos, cuidando de que no hierva el colorante, añadir colorante de vez en cuando para evitar que este se seque

c) Lave con agua y decolore con alcohol-ácido, limpiar el reverso del portaobjetos, lado contrario al frotis

d) Lave con agua y cubra la preparación con azul de metileno durante 60

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segundose) Lave con agua, dejar reposar y observe con el objetivo de inmersión

CUESTIONARIO

1. Haga un esquema de un microscopio compuesto, dibujando cada una de sus partes e indicando su función

2. Explique el sistema óptico de un microscopio compuesto

3. ¿Qué amplificaciones se obtienen con un microscopio compuesto?

4. ¿Cuál es la función del aceite de inmersión en la observación microscópica?

5. Mencione las principales características de un microscopio electrónico, de fluorescencia y de campo obscuro

6. ¿Por qué es importante realizar un buen frotis bacteriano en la observación microscópica?

7. Explique las diferencias entre una tinción simple y una diferencial

8. Explique el fundamento de la tinción al Gram

9. Mencione las características morfológicas de bacterias, levaduras, hongos y algas

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REPORTE

PRACTICA Nº 2

INSTRUCCIONES GENERALES PARA EL USO DEL MICROSCOPIO Y OBSERVACIONES DE MICROORGANISMOS




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PRACTICA Nº 3

TECNICAS DE PREPARACION Y ESTERILIZACION DEL MATERIAL QUE SE USA EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

OBJETIVO

Conocer el tipo de material requerido para llevar a cabo las prácticas del laboratorio de microbiología, así como las diversas técnicas y aparatos utilizados para la esterilización del mismo.

INFORMACION GENERAL

La esterilización es la eliminación completa de cualquier forma de vida y existen varios métodos para llevarla a cabo.La elección del método depende de la naturaleza física del material al que se va esterilizar y del uso que se le piensa dar. Entre los métodos utilizados tenemos:

CALOR AL ROJO

Se utiliza para las asas de platino empleadas en la siembra o inoculación, para las bocas de los tubos de cultivo y frascos, portaobjetos y cubreobjetos. Se esteriliza suspendiéndolos en la flama del mechero.

EBULLICION

El agua en ebullición mata a las formas vegetativas por coagulación de las proteínas, pero no mata a las esporas. Este método raramente se usa en el trabajo de laboratorio.

ESTERILIZACION POR VAPOR

El vapor esteriliza por coagulación de las proteínas. El vapor a presión es un agente esterilizante debido a que se alcanzan temperaturas superiores a las alcanzadas por ebullición.El aparato de laboratorio diseñado para esterilizar por éste método se llama autoclave.

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Consiste en una doble cámara que puede saturarse de vapor y mantenerse a una determinada presión y temperatura durante un tiempo largo. Es importante que el aire de la cámara sea reemplazado por completo por vapor saturado. Si hay aire presente se alcanzará una temperatura inferior.

Este método es empleado para esterilizar medios de cultivo, soluciones, cantidades medidas de agua en tubos o botellas ,etc.

Generalmente se opera a una presión de 15 lb/pul2 (121 C). El tiempo de operación depende de la naturaleza del material por esterilizar, del tipo de recipiente y del volumen.

ESTERILIZACION POR CALOR SECO

El calor seco, a diferencia del calor húmedo, deshidrata las células y oxida sus proteínas. Es recomendable exponer el material por lo menos una hora 30 minutos a una temperatura de 180 a 220C, que se controla por medio de un termostato.

Este método de esterilización se emplea para material de vidrio.

RADIACIONES

La luz solar tiene un poderoso efecto germicida. Esta propiedad se debe a los rayos muy cortos de alta frecuencia llamados ultravioleta, que matan a las bacterias cuando su intensidad es fuerte.

MATERIAL

Pipetas, cajas de petri, tubos de cultivo, tubos de ensayo, matraces erlenmeyer, mortero, embudos, portaobjetos, algodón, papel de envoltura (de aluminio), cajeros, pipeteros, canastas, pinzas para crisol.

LIMPIEZA DEL MATERIAL DE VIDRIO

1. Sumergir el material a limpiar en una mezcla sulfocrómica preparada de la siguiente manera:

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K2Cr2O7 50 gH2SO4 100 mlH20 1000 ml

Los objetos de vidrio, podrán permanecer en esta mezcla un tiempo largo proporcional a la cantidad de materia orgánica que contengan, luego se lavan con agua acidificada con HCl y a continuación con agua alcalina con KOH. Un lavado abundante con agua corriente y destilada al final de la operación.

2. Secar el material en el horno

3. Proceda a tapar con algodón las bocas de los tubos, matraces y pipetas teniendo especial cuidado de que los tapones de algodón no formen arrugas ni queden flojos.

Envuelva las cajas petri, pipetas, matraces y demás material que le proporcionen de acuerdo con la técnica indicada, cubrir con capuchones de papel los tapones de algodón de los tubos y matraces. Esterilizar el material de vidrio en el horno a una temperatura de 180 a 220 C durante 2 horas.

CUESTIONARIO

1. ¿Qué significa esterilización?2. ¿Mencione en qué casos se utiliza el calor seco y el calor húmedo para la esterilización?3. ¿Qué función tiene la mezcla sulfocrómica en la limpieza del material de vidrio?4. Definir ¿qué es el punto térmico mortal?5. ¿Qué es la esterilización por tindalización?6. ¿Por qué es importante un buen lavado del material de vidrio antes de esterilizarlo?7. ¿Por qué se recomienda que al final del lavado de material de vidrio se utilice agua destilada?8. Indique cuando menos 4 métodos de esterilización y en que casos los emplearía.9. ¿Cuándo se emplean soluciones ácidas o básicas para la limpieza de material de vidrio?10. ¿Por qué deben taparse con algodón los tubos, matraces y pipetas y por qué

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deben envolverse o cubrir con papel, cuándo este material va a ser esterilizado?

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REPORTE

PRACTICA Nº 3

TECNICAS DE PREPARACION Y ESTERILIZACION DEL MATERIAL QUE SE USA EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA




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PRACTICA Nº 4

PREPARACION Y ESTERILIZACION DE MEDIOS DE CULTIVO

OBJETIVO

Conocer los medios de cultivo que frecuentemente se utilizan para el crecimiento de microorganismos, así como su composición y forma de preparación.

INFORMACION GENERAL

El estudio de algunos procesos bioquímicos fundamentales de las células se han realizado en microorganismos debido a que son fáciles de cultivar en el laboratorio bajo condiciones controladas que permiten verificar sus características en generaciones sucesivas en tiempos relativamente cortos.

Para cultivar los microorganismos en el laboratorio es necesario conocer los requerimientos nutricionales de cada cepa en particular y controlar factores físicos como temperatura y pH (la mayoría de las bacterias pueden crecer a una temperatura de 30 C o más aunque algunas cepas se alejan mucho de este rango); el rango normal del pH tolerado es de 5 a 8. Para controlar el pH se usan generalmente medios de cultivo regulados.

Todas las células requieren para su crecimiento normal de: agua, una fuente de carbono, de nitrógeno, azufre, fósforo, energía y sales minerales en pequeñas cantidades como: sodio, potasio, calcio, magnesio.

Tanto los microorganismos como las plantas requieren que estos nutrientes estén en solución para poderlos asimilar. Por ello se debe seleccionar el medio de cultivo de tal manera que contenga los elementos necesarios para el adecuado crecimiento de la cepa que se desea.

Los medios de cultivo se han clasificado de acuerdo con su composición química y el uso a que se destinan en: enriquecidos, selectivos, diferenciales principalmente. O bien considerando su consistencia se clasifican en: sólidos, semisólidos y líquidos.

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En la preparación de medios de cultivo existen algunos materiales de uso muy común como son las peptonas, el extracto de carne, extracto de levadura y el Agar. Estos materiales, nutrientes para la célula, hacen posible el desarrollo de una gran cantidad de microorganismos.

El caldo nutritivo y el Agar nutritivo son ejemplos de medios de cultivo líquido y sólido que permiten el desarrollo de muchos tipos de microorganismos heterótrofos.

PROCEDIMIENTO

El instructor indicará los medios de cultivo que se preparan y esterilizan en esta sesión.

*TECNICAS PARA PREPARAR MEDIOS DE CULTIVO

1. Según las instrucciones de cada uno de los medios de cultivo, tomar la parte proporcional de éste y disolverlos en agua destilada, mezclar hasta obtener una suspensión uniforme, calentar agitando frecuentemente, hervir durante un minuto.

Tapar el recipiente con algodón de tal manera que quede firme, cubrirlo con papel aluminio.

Esterilizar en autoclave a una temperatura de 121C, o sea 15 libras de presión por pulgada cuadrada por 15 minutos (o la temperatura indicada para el medio).

Sacar el medio del autoclave, enfriar a una temperatura aproximada de 45C (temperatura soportable al dorso de la mano).

Vaciar en placas hasta la altura indicada en las mismas (aproximadamente de 15 a 20 ml), tapar y dejar solidificar con la tapa hacia arriba.

2. Medio en tubo inclinado: Una parte del medio preparado en las instrucciones anteriores y después de que hierva, pasarlo a los tubos de cultivo y taparlos con algodón, o en su caso con tapón de rosca; colóquelos en posición vertical en un recipiente y esterilice en el autoclave. Después de la esterilización, colóquelos en

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la posición inclinada levantando la parte donde se encuentra el tapón. Dejando el "botón" lo suficientemente grande par que se conserve mayor tiempo el medio.

3. Medios de cultivo para picadura: Siga el mismo procedimiento anterior, sólo que en lugar de inclinar los tubos, déjelos en posición vertical.

4. Medios de cultivo líquidos: Siga las instrucciones del medio deshidratado y después de esterilizar, dejar los tubos en posición vertical.

*PROCEDIMIENTO SIMPLIFICADO PARA EL USO DEL AUTOCLAVE

1. Comprobar el nivel del agua

2. Colocar en su interior el material a esterilizar

3. Atornillar la tapa, apretar los tornillos por parejas diametralmente opuestas de forma que la tapa encaje perfectamente

4. Abrir la válvula de vapor y encender la fuente de calor

5. Una vez que salga el vapor por la válvula, se espera al menos 5 minutos para expulsar todo el aire y cerrar la válvula

6. Vigilar el manómetro y la válvula de seguridad. Cuando se alcanza la presión requerida, disminuir la intensidad de calor

7. Dejar que transcurra el tiempo necesario. Apagar la fuente de calor

8. Esperar que el manómetro descienda a cero, abrir la llave de vapor

9. Esperar 5 minutos y abrir la tapa

CUESTIONARIO

1. Explique concretamente a qué se llama medio de cultivo

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2. Diga a qué se llama medio sintético y a qué medio no sintético. Dar cinco ejemplos de cada uno

3. ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de emplear medios de cultivos sintéticos y no sintéticos?

4. Cite algunas propiedades de Agar-Agar y la gelatina

5. Indique un método para ajustar el pH de un medio de cultivo

6. Indique las propiedades químicas de las peptonas, extracto de carne, extracto de levadura.

7. ¿Cuáles son los ingredientes del Agar nutritivo y qué tipo de nutrientes proporcionan para el desarrollo de los microorganismos?

8. Indique las diferencias entre un medio de cultivo enriquecido, selectivo y para pruebas bioquímicas.

9. ¿Qué precauciones se deben considerar en la preparación y esterilización de los medios de cultivo?

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REPORTE

PRACTICA Nº 4

PREPARACION Y ESTERILIZACION DE MEDIOS DE CULTIVO




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PRACTICA Nº 5

TECNICAS DE SIEMBRA EN MEDIOS DE CULTIVO Y OBSERVACION DE CARACTERISTICAS DE CRECIMIENTO

OBJETIVO

Aprender los diferentes tipos de siembra de microorganismos, así como la observación de crecimiento en diferentes medios de cultivo.

INFORMACION GENERAL

La inoculación de medios para cultivo e identificación de microorganismos es un procedimiento a la vez fundamental e importante en toda investigación microbiológica, es por eso que se debe tener cuidado con esta técnica con el objeto de evitar la contaminación de los cultivos; las medidas de precaución que se aplican para prevenir la contaminación comprenden el procedimiento denominado técnica aséptica. Es de suma importancia tomar en cuenta que los ingredientes y los utensilios de vidrio que se usan en la preparación de los medios pueden contener microorganismos indeseables, por tal motivo los medios recién preparados se deben esterilizar inmediatamente, los tubos que contienen medio se tapan con tapón de algodón o tapas metálicas o plásticas con el fin de evitar la penetración de microorganismos extraños. Otras precauciones que se deben tener en los procedimientos de aislamiento y cultivo de microorganismos es flamear el borde de los tubos y el calentamiento al rojo de la asa o agujas de inoculación.

Esta práctica está destinada a que el estudiante se familiarice con las técnicas fundamentales de siembra empleadas para aislar y desarrollar cultivos microbianos; además de observar las diferentes características de crecimiento como son: turbidez, formación de sedimento, crecimiento en la superficie en el caso de medios líquidos. En medios sólidos se observa la formación de colonias en su extensión, color, opacidad, consistencia y modificación que sufre el medio por el metabolismo bacteriano.

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PROCEDIMIENTO

MATERIAL

*Para el desarrollo bacteriano generalPlacas con Agar nutritivoTubos con caldo nutritivo

*Para desarrollo de hongos y levadurasPlacas con Agar extracto de maltaPlacas con Agar dextrosa Papa

*Medios para pruebas bioquímicas (diferenciación)Tubos con Agar Kligler inclinadoTubos con Agar citrato de Simmons inclinadoTubos con medio SIMTubos con caldo bilis verde brillanteTubos con caldo lactosado

TECNICA

El instructor demostrará por primera vez algunas técnicas de siembra, luego cada estudiante hará personalmente lo siguiente:

a) Inocule los medios líquidosb) Inocule los medios por picadura según técnicac) Inocule las placas y los tubos inclinados en estría en la superficie,

procurando que la cantidad de materia, sea suficiente pero no excesivo con objeto de tener colonias aisladas y poder hacer un estudio del cultivo

d) Incube todos los medios sembrados a 37Ce) Estudie y anote las características de cultivo de las cepas sembradas en

medio líquido, anotando el grado de crecimiento, turbidez, sedimento, crecimiento en superficie y otras características

f) Haga el estudio de los cultivos en picadura anotando grado, forma, la extensión, crecimiento en la superficie, color, opacidad y licuación, etc.

g) Anote las características del cultivo en medios inclinados según su: forma, elevación, superficie, borde, color, opacidad, consistencia, modificación

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que sufre el medioh) Haga el estudio de las colonias sembradas en la superficie anotando: su

forma, tamaño, elevación, estructura, bordes, color, consistencia, etc.i) Las anotaciones que se hagan deben corresponder a las observaciones de:

24, 48 y 72 horas, debiendo ser lo más cuidadosas y concretas posibles.

CUESTIONARIO

1. Describa algunos métodos de siembra en medios líquidos y sólidos

2. ¿Por qué es importante el pH en un medio de cultivo?

3. ¿Cuál es el efecto de la temperatura en el desarrollo de los microorganismos?

4. Compare el desarrollo bacteriano en un medio de cultivo sólido y uno líquido

5. Mencione 5 medios de cultivo para el desarrollo bacteriano e indicando su contenido nutritivo

6. Mencione 3 medios de cultivo para hongos y levaduras y su composición química

7. En un medio líquido ¿cómo espera que sea el crecimiento de un hongo?

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REPORTE

PRACTICA Nº 5

TECNICAS DE SIEMBRA EN MEDIOS DE CULTIVO Y OBSERVACION DE CARACTERISTICAS DE CRECIMIENTO




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PRACTICA Nº 6

TECNICAS DE AISLAMIENTO DE CULTIVOS PUROS DE UNA MEZCLA DE MICROORGANISMOS

OBJETIVO

El objetivo de esta práctica es conocer y aplicar las técnicas para aislar microorganismos y obtener un cultivo puro.

INFORMACION GENERAL

Los microorganismos en su estado y hábitat natural no existen en forma pura, sino en comunidades o poblaciones microbianas mezcladas. Sin embargo, la mayoría de los estudios microbiológicos, se realizan aislando a los microorganismos y estudiando su comportamiento en cultivos puros (cultivo conteniendo solamente un sólo tipo de microorganismos)

PROCEDIMIENTO

* Método para la obtención de cultivos puros

MATERIAL

Agua contaminada, placas con Agar nutritivo, pipetas de 1 ml estériles, tubos con tapón de rosca estériles, agua destilada estéril.

TECNICA: METODO DE DILUCION

a) Disponga usted en una gradilla 5 tubos estériles, tapados y coloque en cada uno de ellos 9 ml de agua o solución salina estéril. Numere sus tubos (1 al 5)

b) Con una pipeta estéril mezcle usted en el tubo 1, 1 ml de solución problema (suspensión de bacterias)

c) Mezcle perfectamente el contenido del tubo 1 y pase 1 ml de él al tubo 2, después de mezclar perfectamente, pasar 1 ml de éste al tubo 3, y así sucesivamente hasta terminar en el tubo 5, en éste último mezclar perfectamente y

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desechar 1 mld) Verter 1 ml de cada dilución a cajas de petri estériles, distribuya

uniformemente en toda el área de la caja funda el Agar nutriente y deje enfriar a 45C aproximadamente y añada a las cajas homogenizando, deje solidificar, enumere sus cajas a cada dilución. Dejar una caja más sin inóculo como control de esterilidad de Agar

e) Incube las placas a 37C, durante 24-48 horas; invirtiéndolas y determine las diferentes formas bacterianas que encuentre, para lo cual necesita hacer un estudio de la morfología colonial y morfología bacteriana, afinidades tintoriales de los individuos que integran cada colonia.

Tome resultados. Aislar por el método de estrías, colonias típicas de: bacterias, levaduras y hongos, para conservarlos como cultivos puros.

METODO DE LAS ESTRIAS

a) Tome una asada de agua contaminada e inocule por estría la superficie de una placa de Agar nutritivo, según instrucciones

b) Deje una placa sin inocular como control de esterilidad del Agar y de la técnica de preparación de placas

c) Invierta las placas e incúbelas placas a 37C. Haga las observaciones correspondientes a las 24-48 horas y reporte resultados.

CUESTIONARIO

1. Señale usted concretamente las ventajas y dificultades del método de diluciones y el de estrías para aislar cultivos puros.

2. Indique usted cuando se debe emplear cada uno de los métodos anteriores.

3. ¿Qué objeto tiene el invertir las placas al incubarlas?

4. ¿Qué es un cultivo puro?

5. ¿Qué es un cultivo mixto?

6. ¿Cómo se pueden conservar los cultivos puros?

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7. ¿Qué es un cepario?

8. ¿Es importante la conservación de un cepario en una institución educativa?

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REPORTE

PRACTICA Nº 6

TECNICAS DE AISLAMIENTO DE CULTIVOS PUROS DE UNA MEZCLA DE MICROORGANISMOS




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PRACTICA Nº 7 Y 8

PRUEBAS RELACIONADAS CON EL METABOLISMO BACTERIANO

OBJETIVO

El objetivo de esta práctica es la siembra de microorganismos puros en diferentes medios de cultivo para estudiar su metabolismo.

INFORMACION GENERAL

Las numerosas y variadas reacciones bioquímicas que constituyen el metabolismo sintético y energético de los microorganismos se realizan y controlan por medio de las enzimas. Los carbohidratos son fuente principal de energía y estructuras de carbono para la síntesis de sustancias celulares, se ha comprobado que los azúcares simples como glucosa y galactosa, son iniciadores de las reacciones metabólicas.

Existen muchos compuestos que contienen nitrógeno y que también participan en el metabolismo de una célula viva. Ejemplos de ellos tenemos a las proteínas, urea y algunos compuestos inorgánicos como las sales de amonio y nitratos.

Las reacciones bioquímicas en el metabolismo bacteriano se conocen como pruebas bioquímicas y son importantes porque en base a éstas se pueden identificar a las bacterias y que en la actualidad son de gran ayuda para el microbiólogo en la identificación de grupos de bacterias de interés sanitario como en el caso del grupo Coliformes.

PROCEDIMIENTO

MATERIAL

Medios de cultivo, tubos con Agar Kligler, tubos con medios SIM, tubos con caldo urea, tubos con caldo RM-VP, tubos con Agar citrato de Simmons, tubos con caldo lactosado, tubos con gelatina, tubos con caldo bilis verde brillante, placas con Agar endo, placas con Agar SS.

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TECNICAS

1. Medio Agar Kligler inclinado

Sembrar por picadura y estría, se determina producción ácido sulfhídrico requerimiento del carbono de lactosa, glucosa con producción de ácido y gas.

2. Medio de SIM vertical

Sembrar por picadura, se determina producción de ácido sulfhídrico, Indol del triptófano, movilidad, forma de desarrollo.

3. Medios de caldo urea

Se determina aprovechamiento de nitrógeno de urea.

4. Prueba de Voges-Proskauer

Para esta prueba se necesitan 10 ml de caldo RM-VP, se determina desarrollo bacteriano en el caldo. Con producción de acetil-metil carbinol por fermentación de glucosa durante 48-72 horas. Agregue a cada tubo dos gotas de solución cloruro férrico al 2% y 5 ml de KOH al 10%, agite y deje reposar, una coloración rosada indicará reacción positiva.

5. Prueba del rojo de metilo

Para esta prueba se requiere de un cultivo en 5 ml de caldo RM-VP incubado durante 5 días. Después de incubado agregar 5 gotas del indicador rojo de metilo. La prueba es positiva si el medio vira a color rosa.

6. Agar citrato de Simmons

Siembra por picadura y estría. Se determina aprovechamiento de carbono de citrato.

7. Caldo lactosado (medio de enriquecimiento)

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Se utiliza para la prueba presuntiva de Coliformes

8. Caldo bilis verde brillante (medio selectivo)

Se utiliza para confirmar la presencia de Coliformes

9. Medio de gelatina

Siembra por picadura. Se determina licuefacción de la gelatina y forma de desarrollo

10. Placas con Agar endo

Siembra por estría. Medio selectivo en el cual se determina bacilos gram (-), enterobacterias, color característico de la colonia (verde brillante metálico, para E. Coli)

11. Placa con Agar SS

Siembra por estría, es un medio selectivo para el grupo de Salmonella-Shigella, aunque en ocasiones pueden desarrollar otras enterobacterias.

CUESTIONARIO

1. Es necesario un cultivo puro para realizar pruebas bioquímicas ¿Por qué?

2. ¿Qué es una prueba bioquímica?

3. ¿Qué utilidad tienen las pruebas bioquímicas?

4. ¿Qué es una enzima?

5. ¿Qué importancia tienen las enzimas en las reacciones bioquímicas de los microorganismos-medios de cultivo?

6. ¿Qué entiende por metabolismo bacteriano?

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7. Dar 3 ejemplos de subproductos obtenidos por el metabolismo de una bacteria

8. Describa 3 pruebas bioquímicas diferentes a las estudiadas en esta práctica.

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REPORTE

PRACTICA Nº 7 y 8

PRUEBAS RELACIONADAS CON EL METABOLISMO BACTERIANO




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PRACTICA Nº 9

EFECTO DEL MEDIO SOBRE LAS BACTERIAS

OBJETIVO

Conocer algunos efectos del medio ambiente sobre el desarrollo de las bacterias

INFORMACION GENERAL

Las bacterias están casi por completo a merced de su medio ambiente. Como sabemos, algunos microorganismos poseen mecanismos limitados para regular el pH de su alrededor y algunos otros móviles pueden rechazar sustancias nocivas o bien pueden ser atraídos por mecanismos quimiotácticos a una fuente de alimentos.

Otro factor es la temperatura de un medio de cultivo ya que rige los índices de velocidad de crecimiento, multiplicación y muerte de los microorganismos.

Con las radiaciones directas en los cultivos se ha encontrado que tienen dos efectos en los microorganismos. El primero de ellos es la muerte y el otro es la producción de mutantes en la población superviviente.

Las vibraciones sonoras o supersónicas alteran notablemente las células causando rotura de la pared celular y su desintegración total.

Otro factor importante es la presión osmótica, que en el caso de las bacterias es mayor que en los medios de cultivo, por contener concentraciones mayores de sales, aminoácidos y numerosos compuestos orgánicos e inorgánicos; esto crea una tendencia a la entrada de agua al protoplasma por osmosis a través de la membrana citoplasmática semipermeable. En condiciones normales de cultivo, las células mantienen un estado de turgencia.

PROCEDIMIENTO

I. Efecto de la temperatura

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Material: Tubos con caldo nutritivo, cultivos de bacterias.

Técnica:a) Inocule cuatro tubos con caldo nutriente (dos asadas)b) Numérelos del I al IV e incúbelos a las siguientes temperaturas, durante 24-48 horas.

TUBO I TUBO II TUBO III TUBO IV

Refrigerador 4C Temp. Lab. 37C 55C

c) Observe crecimiento y anote resultados de acuerdo al siguiente sistema0 no crecimiento+ crecimiento pobre++ buen crecimiento+++ crecimiento excelente

II. Punto término mortal

Material: Termómetro, baño maría, cajas de petri con Agar nutritivo, cultivos en caldo de 24 horas.

Técnica:a) Haga frotis con cada uno de los cultivos que se le proporcionen y tíñalos

al Gram para determinar su purezab) Marque sus cajas con cada una de las temperaturas que se indicaránc) Caliente el agua del baño maría a una temperatura de 45Cd) Después de sembrar una caja de Agar nutritivo que servirá de control,

coloque sus tubos de cultivo en baño maría y déjelos ahí durante 11 minutose) Al final de este período, siembre en cajas de petri (después de enfriados

los cultivos)f) Eleve ahora la temperatura del agua del baño maría a 70C y repita la

operacióng) Incube invirtiendo las cajas a 37C durante 48 horas y anote los resultados

obtenidos

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III. Efecto de rayos ultravioleta

Material: Cajas de petri con Agar nutritivo, cultivos de bacterias

Técnica:a) Inocule sus cajas con Agar nutritivo con los microorganismos

proporcionados (inoculando por toda el área de la caja)b) Coloque un papel negro que cubra la mitad de la caja (quita previamente

las tapas)c) Exponga las cajas a la acción directa de los rayos ultravioleta durante 5

minutos, tape la caja de petri e inviértala.d) Incube a 37C durante 48 horas y anote los resultados

IV. Efecto de la presión osmótica

Material: Tubos con caldo nutritivo con las siguientes concentraciones de NaCl (5%, 10%, 20%, 40%), cultivos bacterianos

Técnica:- Inocule sus tubos con los microorganismos proporcionados- Incube durante 5 días a 37C- Observar cada 24 horas- Hacer frotis y teñir al Gram al quinto día

CUESTIONARIO

1. En base a la temperatura, ¿Cómo se clasifican los microorganismos?

2. ¿Qué entiende por temperatura óptima de crecimiento?

3. ¿Cuál es la respuesta de los microorganismos a temperatura bajo cero?

4. ¿Qué es el pH?

5. ¿Cuál es el efecto del pH en los microorganismos?

6. ¿En qué forma alteran las radiaciones a los microorganismos?

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7. ¿Qué es un microorganismo halófilo?

8. Citar algunas clases de radiaciones microbicidas

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REPORTE

PRACTICA Nº 9

EFECTO DEL MEDIO SOBRE LAS BACTERIAS




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PRACTICA Nº 10

TECNICAS DE OBSERVACION DE HONGOS Y LEVADURAS

OBJETIVO

Aprender las técnicas de observación microscópica de hongos y levaduras para diferenciar sus características morfológicas.

INFORMACION GENERAL

LEVADURAS

Típicamente las levaduras son organismos unicelulares aunque frecuentemente después de la fisión quedan varias células reunidas. Las células de las levaduras son de 20 a 100 veces más voluminosas que la mayor parte de las bacterias y se pueden presentar en forma esférica, ovoide y elipsoidal.

Las levaduras se pueden teñir con colorantes sencillos como el azul de metileno o safranina. La tinción hace más fácil la observación de las células microscópicas, debido a esto se ha creado una tinción especial para levaduras "TINCION GÜSTEIN" que ayuda al microbiólogo a cuantificar el porcentaje de viabilidad de los cultivos de levaduras, que es de gran utilidad en los procesos fermentativos.

HONGOS

Los hongos son plantas que carecen de clorofila, el pigmento verde que efectúa la fotosíntesis. El grupo Eumicetos incluye también hongos voluminosos, comestibles y similares, así como también hongos y levaduras microscópicas.

Los hongos están muy difundidos en la naturaleza y ejercen profunda influencia sobre el medio en que viven, pudren la madera, las hojas y otros vegetales, formando el humus que enriquece al suelo y devuelven dióxido de carbono a la atmósfera que aprovechan las plantas verdes; los hongos se utilizan en la industria de fermentaciones para producir ácidos, alcoholes y muchos compuestos y son origen de algunos antibióticos.

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Morfológicamente los hongos están constituidos por el micelio, que es un agregado de filamentos filiformes o hifas. Estas hifas son de dos tipos funcionales: hifas vegetativas, que penetran en el sustrato para absolver las sustancias nutritivas e hifas fértiles que producen las células reproductoras. Estas características de los hongos es lo que hace diferenciarse fácilmente de los demás microorganismos.

PROCEDIMIENTO

MATERIAL REACTIVO CEPAS

Portaobjetos NaOH al 10% Aspergillus spCubreobjetos Azul de metileno Sacharomyces spAsas Lugol Cándida spAguja de disección SafraninaMicroscopio Acido tánico

1. Coloque una gota por separado de NaOH 10%, azul de metileno, Lugol, safranina, sobre un portaobjetos. Tome una muestra de la colonia del medio de cultivo conteniendo desarrollo de colonia de hongos con una asa en forma de gancho y deposítelo sobre las gotas.

Disgregue el micelo, ayudándose de las agujas de disección y coloque sobre el medio en cubreobjetos, observe al microscopio con seco fuerte y seco débil. Dibuje la morfología que observe.

2. Del cultivo de Sacharomyces sp y Cándida sp, haga frotis de la misma manera como si fuera un frotis microbiano.

a) Tíñalo por el método de Gram, obsérvelo en microscopio con inmersiónb) Tíñalo por coloración simple, obsérvelo en microscopio con inmersiónc) Dibuje la morfología que observe.

3. Tinción de Güstein para levaduras

Reactivos

- Solución al 1% de azul de metileno en agua destilada

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- Solución al 5% de ácido tánico en agua destilada- Solución al 1% de safranina en agua destilada

NOTA: Estos reactivos deben prepararse en pequeñas cantidades antes de usarse.

Desarrollo:- Hacer un frotis, dejar secar al aire, fijar al calor pasándolo por la flama (temperatura soportable por la mano) 20 veces.- Teñir con la solución azul de metileno durante 4 minutos. Enjuagar con agua de la llave durante 30 segundos.- Teñir con la solución ácido tánico durante 2 minutos y lavar con agua durante 30 segundos.- Teñir con safranina 1 minuto, enjuagar con agua durante 30 segundos, dejar secar y observar en el objetivo de 40x y 100x.

CUESTIONARIO

1. Describa el proceso más común de reproducción de las levaduras.

2. Dibuje los diferentes tipos de esporas que son comunes en los hongos.

3. Compare la morfología de las bacterias, levaduras y hongos.

4. ¿En qué difieren los hongos de otros vegetales?

5. Describa el procedimiento para obtener un cultivo puro de hongo.

6. Compare las exigencias nutritivas de los hongos y las levaduras.

7. ¿Dónde podemos encontrar levaduras?

8. ¿Qué importancia tiene la tinción Güstein?

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REPORTE

PRACTICA Nº 10

TECNICAS DE OBSERVACION DE HONGOS Y LEVADURAS




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PRACTICA Nº 11

ANALISIS BACTERIOLOGICO DEL AGUA

OBJETIVO

Determinar la calidad bacteriológica de un agua potable

INFORMACION GENERAL

La determinación de la calidad de un agua es de vital importancia para el bienestar de la comunidad, ya que un agua contaminada puede provocar epidemias en una población.

La determinación de la potabilidad de un agua puede hacerse utilizando diferentes índices de contaminación. En este caso se va a determinar la presencia o ausencia de Escherichia Coli, el NMP de coliformes totales, coliformes fecales y la cuenta estándar en placa.

PROCEDIMIENTO

I. Cuenta estándar en placas

Material: Muestra de agua, tubos para dilución, pipetas graduadas de 1 ml esterilizadas, Agar nutritivo.

Técnica:1. Agitar vigorosamente el frasco que contenga la muestra unas 25 veces y tomar 1 ml para hacer las diluciones convenientes.

2. Colocar 1 ml de la dilución en la caja de petri y verter encima Agar nutritivo previamente fundido y enfriado a una temperatura entre 43 y 45 C.

3. Homogenizar, dejar solidificar e incubar invirtiendo las cajas a 35 C.

4. Hacer observaciones a las 24 y 48 horas. Contar el número en aquellas placas en las que haya entre 30 y 300 UFC.

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5. Hacer los cálculos para determinar el número de microorganismos por ml de la muestra original.

II. Técnicas de los tubos de fermentación para coliformes

A. Prueba presuntiva

Material: Muestra de agua, pipetas esterilizadas, graduadas de 10 ml, pipetas graduadas esterilizadas de 1 ml, 5 tubos de fermentación con 10 ml de caldo lactosado de doble concentración, 2 tubos de fermentación con 10 ml de caldo lactosado de concentración sencilla.

Técnica:

1. Inocular 10 ml de la muestra de agua en cada uno de los 5 tubos con caldo de doble concentración.

2. Inocular respectivamente con 1 ml y 0.1 ml los tubos con caldo lactosado de concentración sencilla.

3. Incubar a 35 C. Examinar a las 24 horas para ver si hay presencia de gas. En caso negativo continuar la incubación 24 horas más.

4. A las 48 horas los tubos que hayan permanecido negativos se descartan.

Interpretación:

La formación de cualquier cantidad de gas y turbidez dentro de las 48 horas en los tubos de fermentación constituyen una prueba positiva (presuntiva).

La ausencia de gas se considera como una prueba presuntiva negativa.

Si la prueba presuntiva es positiva hay que proseguir el análisis para confirmar la presencia de miembros del grupo coliformes.

B. Prueba confirmativa

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Material: Tubos positivos de la muestra anterior, tubos de fermentación con caldo-bilis-lactosa-verde-brillante, 1 caja petri con Agar Endo, 1 caja petri con Agar-eosina-azul de metileno, 1 alambre para siembra con asa.Técnica:

En cuanto los tubos de la prueba presuntiva muestren gas, proceder de inmediato a efectuar la siembra en los medios para la prueba confirmativa de la siguiente manera:

1. Tomar del tubo positivo y transferir 1 asada al tubo con caldo bilis-lactosado verde brillante. Incubar a 35 C durante 48 horas.

2. Tomar de alguno de los tubos que dieron la prueba positiva una cantidad muy pequeña con el asa. Sembrar sobre la caja de petri con Endo, utilizando alguna de las técnicas de aislamiento. Incubar a 35 C durante 24 horas invirtiendo la caja.

3. Hacer exactamente lo mismo en la caja de eosina-azul de metileno.

Interpretación:

La formación de gas y turbidez en cualquier cantidad dentro de las 48 horas, constituye una prueba positiva, debiendo entonces continuarse la prueba a la fase de prueba completa.

En las cajas de petri con endo se consideran colonias típicas todas aquellas que son nucleadas tengan o no brillo metálico, como atípicas las opacas, no nucledas, mucoides después de 24 horas de incubación y de color rosa y negativas todas las demás.

En el medio de eosina-azul de metileno se consideran típicas todas aquellas que tengan centro negro (cuando se ven por la parte de abajo, contra la luz) y se denominan nucleadas. Las colonias atípicas son las nucleadas de color rosa y opacas. El resto se consideran como no-coliformes.

C. Prueba completa

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Material: Tubos positivos de la prueba anterior, colonias típicas o atípicas, aisladas en las cajas de petri, tubos de Agar nutritivo inclinado, asa para siembra y alambre recto para siembra, portaobjetos, colorantes y reactivos para coloración Gram.

Técnica:

1. Utilizar los tubos con caldo verde brillante, para proseguir la prueba, siémbrese entonces sobre placas con Endo-o-eosina-azul de metileno, del tubo en cuanto aparezca gas, sin esperar a que pasen las 48 horas.

2. En el caso de preferir las cajas de petri, escójase una colonia que sea típica o atípica y siémbrese en un tubo de fermentación y en el tubo con Agar inclinado, usando el alambre recto para evitar tocar otra colonia.

3. Incubar ambos tubos a 35 C durante 24 y 48 horas. Observar la presencia o ausencia de gas en el tubo de fermentación. Hacer la tinción de Gram.

Interpretación:

La formación de gas en el tubo de fermentación y la presencia de bacterias Gram negativas, no esporuladas, se considera como una prueba completa positiva.

D. Prueba diferencial o reacciones IMVIC

1. Prueba del Indol

Material:

Tubos con medio SIM, tubos positivos de la prueba anterior a las cajas de petri, reactivo de Kovac, alambre recto para siembra, pipetas graduadas de 1 ml.

Técnica:

a) Seleccione una colonia típica bien aislada de alguna de las placas de la prueba confirmativa y siembre ahí, tomando con el alambre recto en un tubo con

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medio SIM. Incube 24 horas a 35 C.

b) Agregue 0.2 a 0.3 ml del reactivo de Kovac y agite. Deje reposar durante 10 minutos y observe el resultado.

Interpretación:

El color rojo que aparece en la capa superficial del alcohol amílico constituye una prueba positiva. Si se observa. Una coloración anaranjada puede ser indicativa de la presencia del escatol y la reacción se considera como ±. Si persiste el color original del reactivo (amarillo) la prueba se considera como negativa.

2. Prueba del rojo de metileno

Material:

Tubos con 10 ml de caldo MR-VP, solución indicadora de rojo de metilo.

Técnica:

a) Sembrar de alguna de las colonias típicas de los medios de Endo-o-eosina-azul de metileno, al tubo con caldo MR-VP utilizando el alambre recto.

b) Incubar 5 días a 35 Cc) Añadir 10 gotas de indicador

Interpretación:

Si aparece un color rojo la prueba se considera positiva, si el color es amarillo la prueba es negativa.

3. Prueba de Voges-Proskauer

Material:

Cajas de petri de la prueba confirmativa, tubos de 10 ml con caldo MR-VP, solución de alfa naftol, solución de hidróxido de potasio, tubos de hemólisis, pipetas graduadas de 1 ml.

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Técnica:

a) Inocular el tubo con caldo MR-VP con alguna de las colonias típicas seleccionadas en las cajas de Endo o eosina-azul de metileno, utilizando el alambre recto.

b) Incubar a 35 C durante 48 horas.c) Tomar 1 ml de cultivo y añadirle 0.6 ml de solución de alfa-naftol y 0.2

ml de solución de KOH.

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Interpretación

Si aparece una coloración rosa o rojiza en los tubos al cabo de 2 a 4 horas la prueba se considera positiva. La lectura debe hacerse precisamente a este lapso, pues los resultados leídos después de las 4 horas no tiene validez.

4. Prueba de citrato de sodio

Material:

Cajas de petri con colonias típicas o atípicas en los medios de Endo o eosina-azul de metileno; tubos con medio citrato de Simmons, alambre recto para siembras.

Técnica:

a) Inocule sobre la superficie del tubo con medio de citrato, una pequeñísima cantidad del cultivo.

b) Incube a 35 C durante 72 a 96 horas.

Interpretación:

El crecimiento, aunado al vire del indicador, constituye una prueba positiva. Si no se ve que haya cambiado el color del medio la prueba se toma como negativa.

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E. Tablas

Tabla del número más probable (NMP), de organismos coliformes.

¡Error! Marcador no definido.Núm. de tubos que dieron reacción positiva

Núm. más probables en 100 ml

Límites del NMP

5 de 10 ml 1 de 1 ml 1 de 0.1 ml Inferior Superior0 0 0 0 0 5.90 0 0 2 0.05 131 0 0 2.2 0.05 131 1 0 4.4 0.52 142 0 0 5 0.54 192 1 0 7.6 1.5 193 0 0 8.8 1.6 293 1 0 12 3.1 304 0 1 15 3.3 464 0 0 20 5.9 484 1 0 21 6.0 535 0 0 38 6.4 3305 0 1 96 12 3705 1 0 240 12 3,700

Tabla con la interpretación de las reacciones IMVIC

¡Error! Marcador no definido.Bacteria

Indol Rojo deMetileno

Voges-Proskauer

Citrato

Escherichia ColiVariedad zIVariedad II

+-

++

--

--

Escherichia freundil (intermedia)Variedad IVariedad II

-+ +

+--

±+

Aerobacter aerogenesVariedad IVariedad II

-± -

-++

±+

Consigne todos los resultados y obtenga el NMP en 100 ml

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DETERMINACION DE COLIFORMES FECALES

Se han utilizado en muchas partes del mundo y empleado diversas modificaciones, pruebas a temperaturas elevadas para la separación de los organismos del grupo Coliforme en aquellos que tienen origen fecal de aquellos que no proceden de las heces. La prueba a temperatura elevada constituye un procedimiento confirmativo que indica el origen fecal o no fecal de las cepas. Se aplican a las pruebas presuntivas positivas y no directamente a la muestra en estudio. En la prueba, que constituye un procedimiento abreviado, sirve para evaluar la contaminación de una agua cruda para determinar los procedimientos de tratamiento.

OBJETIVO

Demostrar el origen fecal de un agua cuya prueba presuntiva ha resultado positiva.

MATERIAL

Tubos presuntivos de la prueba positivaTubos con caldo ECBaño maría a 44.5 C +/- 0.5 CAsa para siembra

PROCEDIMIENTO

1. Inocular por cada tubo positivo uno con caldo EC, utilizando una asa2. Incubar a 44.5 C durante 24 horas. No dejar pasar más de media hora entre la inoculación y la incubación.

INTERPRETACION

Se considera una reacción positiva, que indica origen fecal, la producción de gas en el tubo de fermentación a las 24 horas o antes de ese lapso.

RESULTADOS

Consigne tabulando los resultados en la tabla para NMP

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CUESTIONARIO

1. ¿Por qué es importante determinar la calidad bacteriológica de una agua potable?

2. Describa los principales indicadores bacteriológicos de contaminación de un agua.

3. ¿Qué significado sanitario representa la presencia de E. Coli en un agua potable?

4. ¿Cómo define al grupo Coliforme?

5. ¿Por qué es importante determinar la presencia o ausencia del Vibrio cholerae en un agua para consumo humano?

6. Investigue la técnica de filtros Millipore para determinar Coliformes

7. Explique si Salmonella puede estar presente en el agua como contaminante

8. Investigue las normas de calidad bacteriológica para un agua potable

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REPORTE

PRACTICA Nº 11

ANALISIS BACTERIOLOGICO DEL AGUA




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BIBLIOGRAFIA

AMADOR/MOTA DE LA GARZA/AVILES (1990). Manual de laboratorio de Microbiología Sanitaria. Editorial I.P.N., México.

BURDON, KENNETH (1982). Microbiología. Editorial Publicaciones Culturales, México.

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DELAAT, ADRIAN (1983). Microbiología. Editorial Interamericana, México.

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FROBISHER/FUERST (1976). Microbiología. Editorial Interamericana, México.

MADIGAN, MICHAEL (1991). Microbiología. Editorial Prentice-Hall, México.

MARQUEZ, ORALIA (1977). Manual de Prácticas de Microbiología. Editorial Nacional, México.

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PELCZAR/REID/CHAN (1993). Microbiología. Editorial McGraw-Hill, México.

WALTER/MCBEE/TEMPLE (1980). Introducción a la Microbiología. Editorial Cecsa, México.

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Instituto Tecnológico de Sonora Dirección de Investigación y 5 de febrero No. 818 sur Estudios de Posgrado Teléfono (64) 17-04-91 Apdo. 541 Tel/Fax (64) 17-03-76/17-50-45 85000 Ciudad Obregón, Sonora, México

COORDINACION DE LABORATORIOS

17 de junio de 1996

Q. Rosa Amelia Beltrán E.Jefe del Depto. de Química e Ing. Química

Por este conducto le envío el borrador del Manual de Prácticas de Microbiología I, esperando que las dudas que tenga me las haga saber para aclarárselas.

Sin otro particular por el momento, quedo a sus órdenes y aprovecho la ocasión para enviarle un cordial saludo.

A t e n t a m e n t e,

Ing. Anacleto Félix FuentesCoord. de los Laboratoriosde la DIEP

Miembro de la Asociación Nacional de Universidades e Institutos de Enseñanza Superior

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