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UNIVERSIDADE DO CEUMA
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA
MESTRADO ACADÊMICO
MARCOS VINÍCIUS DE OLIVEIRA QUEIROGA
AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE
MARCADORES FENOTÍPICOS E DE ATIVAÇÃO
EM LINFÓCITOS DE PACIENTES PORTADORES
DE HEPATITE C CRÔNICA
SÃO LUÍS
2013
MARCOS VINICIUS DE OLIVEIRA QUEIROGA
AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE MARCADORES FENOTÍPICOS E DE
ATIVAÇÃO EM LINFÓCITOS DE PACIENTES PORTADORES DE
HEPATITE C CRÔNICA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biologia Parasitária do CEUMA para obtenção do título de Mestre em Biologia Parasitária. Orientador: Prof. Dr. Marcos Augusto Grigolin Grisotto
São Luís
2013
iii
Queiroga, Marcos Vinícius de Oliveira
Avaliação da expressão de marcadores fenotípicos e de
ativação em linfócitos de pacientes portadores de hepatite c
crônica. / Marcos Vinícius de Oliveira Queiroga. São Luís:
UNICEUMA, 2013.
102 p.: il.
Dissertação (Mestrado) – Curso de Biologia Parasitária.
Universidade CEUMA, 2013.
1. Vírus da Hepatite C. 2. Imunofenotipagem. 3. Linfócitos T
CD8+CD161high I. Grisotto, Marcos Augusto Grigolin (Orientador)
II. Grisotto, Marcos Augusto Grigolin (Coordenador). III. Título.
CDU: 616.36-002
Q3a
iv
MARCOS VINICIUS DE OLIVEIRA QUEIROGA
AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE MARCADORES FENOTÍPICOS E DE
ATIVAÇÃO EM LINFÓCITOS DE PACIENTES PORTADORES DE
HEPATITE C CRÔNICA
A Comissão julgadora da Defesa do Trabalho Final de Mestrado em Biologia Parasitária, em sessão pública realizada no dia __/__/____, considerou o(a) candidato(a):
( ) APROVADO(A) ( ) REPROVADO(A)
BANCA EXAMINADORA
______________________________________________________________
1º Examinador:
______________________________________________________________
2º Examinadora:
______________________________________________________________
3º Examinador:
______________________________________________________________
Orientador: Marcos Augusto Grigolin Grisotto
v
RESUMO
A hepatite C é uma doença infecciosa que atinge cerca de 130 milhões
de pessoas no mundo, que causa alterações significativas no sistema
imunológico dos afetados, que na maioria dos casos evolui de forma crônica
com tendência a complicações graves por falhas de diagnóstico precoce e
tratamento eficaz, como a cirrose hepática e o hepatocarcinoma. Este estudo
objetivou avaliar características imunofenotípicas de linfócitos e monócitos de
uma amostra de 29 pacientes com hepatite C crônica antes do tratamento,
comparando-os com 16 controles saudáveis, através da análise do sangue
periférico por Citometria de Fluxo com o intuito de avaliar possíveis
marcadores de prognóstico. Os pacientes cronicamente infectados com HCV
apresentaram freqüências significativamente reduzidas de linfócitos T
CD8+CD161high, linfócitos estes com indícios de padrão de atividade Th17,
tanto entre as células CD8+CD56+ (NKT) quanto nas CD8+CD56- (linfócitos
típicos). Apesar disso, nos pacientes, estas subpopulações celulares
apresentaram maiores índices de ativação medidos pela expressão de CD69.
Os linfócitos T totais também apresentam maiores freqüências tanto em
números absolutos, quanto em percentual de células ativadas, medidos
através da expressão de HLA-DR em suas membranas. Em relação à
molécula de CD81, o principal receptor para o HCV, verificou-se que a
expressão é maior em linfócitos T CD4+ e CD8+, mas não em monócitos. Já
os linfócitos B, além terem freqüências relativamente aumentadas nos
pacientes em relação aos controles, também apresentaram aumento
significativo da expressão de Toll Like Receptor 2 (TLR2) e de CD81 em suas
membranas. Apesar destas alterações, não foram observadas diferenças
significativas no número total e percentual de células T CD4+ regulatórias ou
ativadas, fato que pode estar relacionado ao curso geralmente silencioso e
difícil detecção da infecção.
Palavras chave: vírus da hepatite C (HCV), imunofenotipagem, linfócitos T
CD8+CD161high, crônico.
vi
ABSTRACT
Hepatitis C is an infectious disease that affects around 130 million
people throughout the world and causes significant changes in patients’
immune system, most of the time progressing to a chronic form, tending to
serious complications, like liver cirrhosis and cancer, due to lack of an early
diagnosis or a not always efficient treatment. The objective of this study was
to evaluate immunophenotypic features of lymphocytes and monocytes of 29
subjects chronically infected by HCV before treatment, comparing them with
16 health controls through the analysis of their blood samples with Flow
Cytometry, in order to evaluate possible prognostic markers. Subjects
chronically infected with HCV show significant reduced frequencies of T-
Lymphocytes CD8+CD161high in both subtypes, CD8+CD56+ (NKT cells)
and CD8+CD56- (typical lymphocytes), which have been correlated with a
possible Th17 response pattern. In spite of that, on subjects, these cell
populations presented greater activation levels checked by the expression of
CD69. Total T-lymphocytes also displayed higher frequencies in absolute
numbers as much as in the percentage of activated cells measured by the
expression of HLA-DR on their membranes. In relation to CD81 molecule, the
main HCV receptor, it was found that it was overexpressed on the
membranes of T CD4 and CD8 lymphocytes, but no differences were found
on monocytes. When it comes to B-lymphocytes, besides their higher
frequencies on subjects as well as the frequencies of these cells expressing
Toll Like Receptor 2 (TLR2) when compared to controls, they also have a
higher expression of CD81 on their membranes. Despite all of these
alterations, it was not observed significant differences on the total number and
percentage of regulatory or even activated T CD4+ cells, a fact that may be
related to the usually silent and hardly detectable course of the disease.
Keywords: Hepatitis C Virus (HCV), Immunophenotyping, T-Lymphocytes
CD8+CD161high, chronicle.
vii
SUMÁRIO
RESUMO ____________________________________________________ v
ABSTRACT __________________________________________________ vi
LISTA DE FIGURAS ___________________________________________ ix
LISTA DE TABELAS ___________________________________________ xii
LISTA DE ABREVIAÇÕES _____________________________________ xiii
1. INTRODUÇÃO ____________________________________________ 16
1.1. Aspectos históricos e epidemiológicos .............................................. 16
1.2. Virologia ............................................................................................ 19
1.3. Resposta do hospedeiro ao HCV ...................................................... 24
1.4. Células NK, NKT CD8+ e padrão Th17 ............................................. 29
2. OBJETIVOS ______________________________________________ 33
2.1. Geral ................................................................................................. 33
2.2. Específicos: ....................................................................................... 33
3. MATERIAIS E MÉTODOS ___________________________________ 34
3.1. Delineamento do Estudo ................................................................... 34
3.2. População Estudada ......................................................................... 34
3.3. Coleta de material ............................................................................. 35
3.4. Processamento das amostras ........................................................... 35
3.5. Análise Estatística ............................................................................. 36
viii
4. RESULTADOS ____________________________________________ 38
4.1. População estudada .......................................................................... 38
4.2. Linfócitos T Totais ............................................................................. 38
4.3. Linfócitos T CD8+ .............................................................................. 40
4.4. Linfócitos T CD4+ .............................................................................. 45
4.5. Linfócitos B ........................................................................................ 47
5. DISCUSSÃO _____________________________________________ 50
CONCLUSÕES _______________________________________________ 59
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS _______________________________ 60
ANEXOS ____________________________________________________ 69
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Representação das estruturas do vírus da hepatite C. (Hepatology,
2012)19
Figura 2: Representação da poliproteína viral e proteínas que surgem com as
clivagens durante a replicação viral (Rehermann, 2009). _______________ 20
Figura 3: Distribuição mundial dos genótipos do HCV (Fang, Chow et al.,
1997). ______________________________________________________ 21
Figura 4: Esquematização dos ciclo de replicação do HCV na célula
hospedeira. (Pharmaceuticals, 2000-2010) _________________________ 24
Figura 5: Resposta imune inata autócrina (A) e parácrina (B) gerada pelo
HCV ao infectar o hepatócito. As setas vermelhas representam os
mecanismos inibitórios virais de escape a essa resposta (Rehermann,
2009)_______________________________________________________Er
ro! Indicador não definido.
Figura 6 Análise da distribuição de CD161 em linfócitos TCD8. (A) Seleção
de células fortemente positivas na expressão de CD8 com baixa
granulosidade. (B) Exclusão de células com tamanho ou granulosidade
incompatíveis com linfócitos íntegros. (C) Separação de linfócitos TCD8 em
três subgrupos, de acordo com a presença forte (high), fraca (med) ou nula
(neg) de CD161 em sua membrana plasmática. _____________________ 41
Figura 7: Freqüência de células CD8+CD161high no grupo de pacientes
virgens de tratamento e de controles saudáveis. _____________________ 41
Figura 8: Separação de dos linfócitos CD8+ (A) em células NKT CD8+CD56+
(B) e linfócitos TCD8 típicos CD8+CD56- (C). _______________________ 42
Figura 9: Freqüência relativa de células NKT (CD8+CD56+) em relação ao
total de células CD8+. ___________________ Erro! Indicador não definido.
x
Figura 10: Freqüências relativas de células CD161high dentre os linfócitos
TCD8 típicos CD8+CD56- (A) e células CD8+CD56+ NKT (B). __________ 43
Figura 11: Expressão de CD69 por células TCD8+ (A) e células T
CD8+CD161high (B). __________________________________________ 43
Figura 12: Freqüência de células CD69+ na subpopulação de células
CD8+CD161high (A) e nas células T CD8+ totais (B). _________________ 44
Figura 13: Expressão de CD81 pelas células T CD8 totais (A) e por células
CD8+CD161+ (B). _____________________________________________ 44
Figura 14: Freqüências de células CD8+CD81high em pacientes e
controles(A). ExpressÃo de CD81 medida pela mediana de fluorescência em
células CD8+CD161- de pacientes e controles (B). ___________________ 45
Figura 15: Freqüência de células CD4+ (A) em relação ao tamanho e
granulosidade compatíveis com Linfócitos (B). Análise comparativa da
intensidade de fluorescência de CD81 (C) em pacientes (azul) e controles
(Vermelho). Divisão das subpopulações de células T CD4+ Reguladoras
(Treg) (CD25+CD127low) e Ativadas (CD25+CD127high) (D). __________ 46
Figura 16: Freqüência de células T CD4+ Regulatórias (Treg) (A) e Ativadas
(B) nos portadores crônicos de HCV e controles. Expressão de CD81 por
células T CD4+ nos portadores crônicos de HCV e controles (C). _______ 47
Figura 17: Seleção de linfócitos T por expressão positiva de CD3 (A) com
tamanho e granulosidade compatíveis com linfócitos T (B). Foram
selecionadas células com expressão negativa de CD14 (C) para posterior
análise de expressão de HLA-DR por células CD3+(D). _______________ 39
Figura 18: Freqüências relativas de linfócitos T totais de pacientes e controles
(A). Freqüência células Cd3+ HLA-DR+ por pacientes e controles (B). ___ 40
xi
Figura 19: Figura 20: Seleção de células CD19+ (A), CD14- (B). Expressão
do TLR2 (C) e TLR4 (D) em linfócitos B (CD19+). Análise comparativa da
intensidade de fluorescência de CD81 (E) entre Paciente (vermelho) e
controle (Azul). _______________________________________________ 48
Figura 21: Freqüências relativas (A) e expressão de CD81 de Linfócitos B
CD19+ (B). Expressão de ,TLR2 (C) e TLR4 (D) por células B no grupo de
pacientes e controles. __________________________________________ 49
Figura 22: Análise de monócitos pela separação de células CD14+ (A) com
tamanho e granulosidade compatíveis com monócitos (B). Freqüência de
monócitos com alta expressão de HLA-DR (C).Iintensidade de fluorescência
de TLR2 (D), TLR4 (E) e CD81 (F) em monócitos.Erro! Indicador não
definido.
Figura 23: Freqüências de monócitos HLA-DR+ em pacientes e controles.
Erro! Indicador não definido.
xii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Sumário da epidemiologia do HCV em vários países da África, Ásia
e Oceania (Sievert, Altraif et al., 2011). _____________________________ 3
xiii
LISTA DE ABREVIAÇÕES
ADAR – Adenosine Deaminase RNA-specific
ALT – Alanina aminotransferase
AST – Aspartato aminotransferase
CCR – CC Chemokine Receptor
CD – Cluster of Differentiation
cDCs – Conventional Dendritic Cells
CLDN – Claudine
CMV – Cytomegalovirus
CTL – Cytotoxic T Lymphocytes
CXCL – Chemokine (C-X-C motif) Ligand
CXCR – Chemokine (C-X-C motif) Receptor
DNA – Deoxyribonucleic Acid
EBV – Epstein Barr Virus
EDTA - Ethylenediaminetetraacetic Acid
EHSSS – Enhanced Hepatitis Strain Surveillance System
FACS – Fluorescence-activated Cell Sorting
FoxP3 – Forkhead Box P3
GBD – Global Burden of Disease
GBV-C – GB virus type-C
HAV – Hepatitis A Virus
HBsAg – Hepatitis B surface Antigen
HBV – Hepatitis B Virus
HCV – Hepatitis C Virus
HGV – Hepatitis G Virus
HIV – Human Immunodeficiency Virus
HLA - Human Leukocyte Antigen
HuH-7 - Human Hemochromatotic type-7
HVR – Hipervariable Regions
IFN – Interferon
IGS – Interferon Gene Stimulated
IL – Interleucina
xiv
IRES - Internal Ribosome Entry Site
IRF – Interferon Regulatory Factor
JAK/STAT – Janus Kinase / Signal Transducers and Activation of
Transcription
Kb – Kilobases
KDa - Kilodalton
LDL – Low-density Lipoprotein
MHC – Major Histocompatibility Complex
NANBH – Non-A Non-B Hepatitis
NK – Natural Killer
NKT – Natural Killer T
NR – Não-Respondedor
NS – Non-structural
NTRs – Non-translated Regions
OAS - Oligoadenylate Synthetase
ORF – Open Reading Frame
PCSK-9 – Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin type 9
pDCs – Plasmacytoid Dendritic Cells
PKR – Protein Kinase R
RER – Retículo Endoplasmático Rugoso
RIG-I – Retinoic Acid Induced Gene I
RNA – Ribonucleic Acid
RORT - Retinoic acid-related Orphan Receptor T
RPM – Rotações por Minuto
RPMI - Roswell Park Memorial Institute
RVS – Resposta Viral Sustentada
SINAM – Sistema Nacional de Atendimento Médico
SR-BI – Scavenger Receptor class B type 1
TAPA - Target of the Antiproliferative Antibody
Tc – T citotóxica
TECLE – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
TGF – Tumor Growth Factor
Th – T helper
xv
TLR – Toll-like Receptor
TNF – Tumor Necrosis Factor
Treg – T regulatória
WHO – World Health Organization
16
1. INTRODUÇÃO
1.1. Aspectos históricos e epidemiológicos das hepatites
Desde a década de 50 a ciência estuda as afecções inflamatórias
hepáticas, inicialmente identificando-as como “Hepatite Infecciosa” e
“Hepatite Sérica” (KRUGMAN; WARD; GILES, 1962), e em um segundo
momento, ao se descobrir a natureza viral de ambas, dando-as a
denominação de hepatites A (FEINSTONE; KAPIKIAN; PURCELI, 1973) e B
(BAYER; BLUMBERG; WERNER, 1968), respectivamente. Mas só em
meados dos anos 70, com o desenvolvimento de técnicas sorológicas
específicas para a detecção de pacientes infectados pelos vírus A (HAV) e B
(HBV) da hepatite, constatou-se que a maioria dos casos característicos de
transmissão intrafamiliar da doença se apresentavam negativos para ambos
os vírus. Foi caracterizado então um novo subtipo de hepatite infecciosa
nomeada de Hepatite Não-A Não-B (NANBH) (FEINSTONE et al., 1975), que
apenas em 1989, teve seu agente etiológico identificado pelo Dr. Choo e sua
equipe, após o aprimoramento de técnicas de clonagem molecular (CHOO et
al., 1989), recebendo o nome de Vírus da Hepatite C (HCV).
É impossível saber ao certo a origem específica do vírus, já que
não há amostras de sangue de pacientes infectados datadas de antes da
década de 50. No entanto, levando em conta um parente próximo do vírus
encontrado em primatas do Velho e do Novo Mundo, o HGV/GBV-C, há
especulações de que as origens do HCV datam de até 35 milhões de anos
atrás (SIMMONDS, 2001a). Devido sua via usual de transmissão (contato
sangue-sangue), a disseminação do vírus na raça humana só se deu nos
últimos séculos, com a popularização de utensílios que servem de
intermediários entre hospedeiros, como seringas, lâminas, técnicas de
transfusão sanguínea, dentre vários outros, o que facilitou o surgimento de
mutações e causou o aparecimento de diferentes genótipos, oriundos de um
ancestral comum provavelmente cerca de 500 a 2000 anos atrás, e subtipos
virais há pelo menos 200 anos (SIMMONDS, 2001b).
Sendo assim, até a sua descoberta, o HCV se disseminou pelo
planeta sem qualquer controle humano, e apesar de a última divulgação
17
oficial da Organização Mundial de Saúde (WHO – World Health Organization)
sobre a epidemiologia global do vírus da hepatite C ter sido feita há mais de
10 anos (Global surveillance and control of hepatitis C. Report of a WHO
Consultation organized in collaboration with the Viral Hepatitis Prevention
Board, Antwerp, Belgium, 1999), constatando uma prevalência de cerca de
3%, com 170 milhões de pessoas infectadas pelo HCV (Vírus da Hepatite C),
e estudos mais recentes apontarem uma diminuição dos números,
assumindo-se atualmente que cerca de 130 milhões de pessoas (2,2% da
população mundial) são portadoras do vírus, a hepatite C ainda é
considerada por muitos pesquisadores como a “Epidemia do Século”,
havendo considerável subnotificação em muitos países (ALTER, M. J., 2007;
Global burden of disease (GBD) for hepatitis C, 2004; TE; JENSEN, 2010).
Tal subnotificação ocorre principalmente pela típica evolução
subclínica da doença. Sendo poucos os casos de uma apresentação aguda
significantemente sintomática, o que faz com que uma boa parcela dos
indivíduos infectados pelo vírus, ainda não tenha conhecimento a seu
respeito (DE MARCO et al., 2009).
A prevalência real da hepatite C varia muito entre os países,
dependendo em grande parte, das dificuldades de vigilância e dos fatores
socioeconômicos ligados à transmissão da infecção. Na Europa, essa
prevalência pode variar de 0,1 a 6,0% (RANTALA; VAN DE LAAR, 2008),
chegando a ser menor que 0,5% nos países escandinavos, e maior que 3%
em países como Bulgária, Itália e Grécia (ESTEBAN; SAULEDA; QUER,
2008), sendo assim considerada nos estudos últimos estudos
(MUHLBERGER et al., 2009), como um amplo problema de saúde pública,
levando a altos gastos para a administração de cada país, e necessitando
ainda de vastos melhoramentos quanto ao diagnóstico e tratamento precoce,
vigilância e prevenção.
A Organização Mundial de Saúde calcula que na África hajam
cerca de 31,9 milhões de infectados pelo HCV (Global surveillance and
control of hepatitis C. Report of a WHO Consultation organized in
collaboration with the Viral Hepatitis Prevention Board, Antwerp, Belgium,
1999), sendo mais endêmica nas regiões da África Central, com até 6% de
prevalência, seguida pela África Oriental com 2,4%, enquanto no sul e no
18
leste estima-se ocorrência de apenas 1,6% de pessoas infectadas com o
HCV (MADHAVA; BURGESS; DRUCKER, 2002). Neste continente encontra-
se o país com maior prevalência do mundo, estando o vírus presente em 15 a
20% da população do Egito (ABDEL-AZIZ et al., 2000; STRICKLAND, 2006),
sendo mais comuns em homens adultos e responsabilizando-se por 60 a
78,5% dos casos de carcinoma hepatocelular neste país (LEHMAN;
WILSON, 2009).
Nos Estados Unidos a prevalência do HCV na população tem sido
avaliada pelo Inquérito Nacional de Saúde e Nutrição (National Health and
Nutrition Examination Survey - NHANES), sendo a coleta de dados mais
recente datada de 1999 a 2002, pelo Centro de Controle de Doenças (CDC -
Center of Disease Control), que demonstrou a presença de cerca de 4,1
milhões de pessoas anti-HCV positivas, ou 1,6% da população
(ARMSTRONG et al., 2006), levando em 1998 a um gasto de cerca de um
bilhão de dólares, tanto com a doença, quanto com o controle de suas
comorbidades (LOUIE et al., 2012; RAY KIM, 2002). Já no Canadá, através
do Sistema de Vigilância Avançada em Cepas de Hepatites (Enhanced
Hepatitis Strain Surveillance System - EHSSS), estima-se que 0,8% da
população seja afetada pelo vírus, havendo um pico de prevalência em
jovens e adultos de 15 a 39 anos, tendo ocorrido uma diminuição de 36,4%
na incidência entre 1998 e 2004(WU et al., 2006).
Na América latina, encontram-se prevalências relativamente mais
baixas que no restante do mundo subequatorial, sendo estimada em torno de
1,23%, mas variando de país a país, ou mesmo nas diferentes regiões de
cada país, como no caso do Brasil (MENDEZ-SANCHEZ; GUTIERREZ-
GROBE; KOBASHI-MARGAIN, 2010), onde ainda é desconhecida a
verdadeira dimensão da sua situação epidemiológica atual.
Segundo os dados do Ministério da Saúde, houve uma incidência
de 52.489 casos entre os anos de 1994 e 2005, com uma tendência
temporalmente crescente de incidência devido à maior disponibilidade de
acesso a meios diagnósticos nos serviços públicos e privados. Com base em
cálculos feitos baseados no Censo de 2000 e inquéritos sorológicos feitos em
diversos centros do país, estima-se que devam existir de 400.000 a
19
3.800.000 casos de hepatite C no Brasil, atingindo o equivalente a 0,28 a
2,61% da população (DE ARAUJO et al., 2007).
No Maranhão, os dados mais confiáveis são provindos do Sistema
de Informação de Agravos de Notificação (SINAN) do Ministério da Saúde, e
mostram apenas uma incidência variável da doença nos últimos anos,
variando amplamente entre 1999 e 2007, desde 0,25 a 2,55 casos novos por
100.000 habitantes. Assim, não há estudos conclusivos sobre a real
prevalência da doença no estado.
1.2. Virologia
O vírus da hepatite C é pequeno (55 a 65nm), esférico e
envelopado, apresentando virions com densidades altamente variáveis
(Figura 01), estando as mais infectantes entre 1,15 a 1,17 g/ml, e contendo
dentro de seu envelope externo um núcleo de 30 a 35nm, que encapsula
uma fita simples e positiva de RNA viral com aproximadamente 9,6kb,
relacionada fortemente tanto com o pestivirus quanto com o flavivirus
(OKAMOTO et al., 1991; TAKAMIZAWA et al., 1991), ambos da família
Flaviviridae, dentro da qual foi então classificado como o único representante
do gênero Hepacivirus.
Figura 1: Representação das estruturas do vírus da hepatite C. (Adaptada de HEPATOLOGY, 2012)
Essa estrutura nucleotídica é composta basicamente por uma
“sequência aberta de leitura” ou ORF (Open Reading Frame), ladeada em
suas terminações por duas pequenas “regiões não traduzidas”, ou NTRs
Glicoproteína de Envelope
RNA de fita única
Nucleocapsídeo
20
(Non-Translated Regions), essenciais para a tradução e replicação do RNA.
A ORF decodifica uma poliproteína de cerca de 3008 a 3037 aminoácidos, de
acordo com o isolado viral (CHAMBERLAIN et al., 1997), que é clivada
durante e após a tradução em ao menos 10 produtos com funções diferentes,
sendo três proteínas estruturais (core, envelope E1, e E2) e ao menos sete
proteínas não estruturais, conhecidas como NS1, NS2, NS3, NS4A, NS4B,
NS5A, e NS5B (Figura 02), em grande parte responsáveis pelo evasão do
vírus ao sistema imune do hospedeiro (SHARMA, 2010).
Figura 2: Representação da poliproteína viral e proteínas que surgem com as clivagens durante a replicação viral (Adaptada de REHERMANN, 2009).
Além das diferenças no tamanho de suas ORFs, as várias cepas
de HCV têm uma grande diversidade seqüencial de seus nucleotídeos,
diferenciando-se em diferentes genótipos quando há uma variedade maior
que 30%. Atualmente já existem ao menos 6 genótipos identificados
numericamente de 1 a 6, os quais podem variar em até 50% de sua estrutura,
e mais de cem subtipos (variações entre 15 e 30% dentro do mesmo
genótipo) identificados com letras seqüenciais maiúsculas (A, B, C, etc). A
variabilidade genômica viral chega a ser tanta que é possível encontrar
21
dentro do mesmo indivíduo, cepas ligeiramente diferentes (1 a 5%) umas das
outras, (conhecidas como quasispecies). Essa variabilidade ocorre
principalmente nas glicoproteínas do envelope E1 e E2 (BUKH; MILLER;
PURCELL, 1995; SIMMONDS, 1995), tendo esta última duas HVRs
(Hipervariable Regions, ou Regiões de Hipervariação): HRV-1, formada por
uma seqüência de 27 aminoácidos no terminal N da molécula; e HRV-2,
formada por 9 aminoácidos localizados em contigüidade após HRV-1
(KUMAGAI et al., 2007) devido à alta freqüência de replicação e à falta de
atividade revisora da RNA-polimerase, havendo uma taxa de incorporação
errônea de bases de cerca de 10-3 substituições por locus por ano (MAJOR et
al., 1999).
O genótipo 1 é encontrado em todo o mundo (Figura 3), sendo
ainda o mais prevalente no Brasil, enquanto os outros 5 são restritos a áreas
geográficas específicas, estando os genótipos 2 e 3 também
significativamente presentes no território nacional (LONGO, 2012). Apesar de
todos os genótipos identificados serem hepatotrópicos e patogênicos,
evidências sugerem que as diferenças no fenótipo geradas por essas
variações influenciam no grau de infectividade e patogenicidade de cada
cepa, e por conseqüente na taxa de progressão para cirrose e no risco de
Carcinoma Hepatocelular (SIMMONDS et al., 1996).
Figura 3: Distribuição mundial dos genótipos do HCV (FANG; CHOW; LAU, 1997).
22
Ao entrar na circulação de um novo hospedeiro através do contato
sangue-sangue, o primeiro passo para o vírus é invadir sua célula alvo, neste
caso o hepatócito. Na corrente sanguínea, o HCV se associa naturalmente a
lipoproteínas circulantes, facilitando assim sua fase de adesão inicial à célula
alvo, através dos receptores de LDL. Após a adesão, a penetração do vírus
pela membrana plasmática é um processo de várias etapas lentas e
complexas, envolvendo várias proteínas receptoras da célula do hospedeiro
como glicosaminoglicanas, SR-BI (Scavenger Receptor class B type I),
membros da família Claudina (CLDN1, 6 e 9), dentre várias outros auxiliares
(HELLE; DUBUISSON, 2008). Porém uma proteína específica é considerada
essencial para a ligação do vírus com a célula, o CD81, ou Tetraspanina-8,
membro da superfamília transmembrana 4 (Tetraspanina), contendo 236
aminoácidos aparentemente não modificados após a tradução, estimando-se
um peso molecular de 25,8 kDa, sendo fisiologicamente o alvo do anticorpo
antiproliferativo 1, ou TAPA-1 (ANDRIA et al., 1991), presente em todas as
células nucleadas do corpo.
Tendo sido identificado em 1998, varrendo-se um banco de
expressões de cDNA utilizando um recombinante da proteína estrutural E2 do
HCV como sonda (PILERI et al., 1998), o CD81 executa várias funções,
incluindo adesão celular, metástase por motilidade e ativação celular. Várias
pesquisas já demonstraram uma super-expressão do CD81 nos leucócitos
totais do sangue periférico (KRONENBERGER et al., 2001), em células B
CD5+ (ZUCKERMAN et al., 2003), CD19+ (HOFMANN et al., 2004) e CD8+
(KRONENBERGER et al., 2006) de pacientes infectados pelo HCV, podendo-
se associar o nível de expressão do CD81 ao nível de infecção das células
alvo e de alteração de suas propriedades funcionais. Tais trabalhos também
verificaram uma queda significativa na expressão do receptor durante o
tratamento com IFN-, em pacientes com uma Resposta Virológica Precoce
(RVP, quando o paciente tem HCV-RNA indetectável com 12 semanas de
tratamento), e a manutenção dessa baixa expressão nos pacientes com
Resposta Virológica Sustentada (RVS, quando o HCV-RNA é indetectável 6
meses após o fim do tratamento), em contraste com a super-expressão
verificada nos pacientes não respondedores (NR) ao tratamento, o que
23
impulsionou a pesquisa de novas substâncias capazes de modular a
expressão dessa molécula, sendo a PCSK9 uma das mais promissoras em
estudos in-vitro até o momento (LABONTE et al., 2009).
A proteína estrutural E2 faz uma ligação de alta afinidade com o
loop externo maior do CD81, interagindo também inicialmente com o SR-BI, e
ao final com CLDN1 (HARRIS et al., 2008), tendo então seu nucleocapsídeo
imediatamente liberado dentro do citoplasma. Após a descapsidação, no
interior da célula, o RNA viral, sendo uma fita positiva, é imediatamente
traduzido e replicado pelos ribossomos do Retículo Endoplasmático Rugoso
(RER), ao se ligarem à extremidade 5’-IRES do genoma viral, por um
mecanismo não dependente da sinalização por CAP. A poliproteína formada
é clivada após e mesmo durante a própria tradução, pela ação de proteases
tanto virais quanto celulares, produzindo as proteínas estruturais e não
estruturais anteriormente citadas (GOSERT et al., 2003), destacando-se
neste momento a RNA polimerase RNA-dependente NS5B, que replica o
genoma viral pela síntese de uma fita de RNA negativa que serve de molde
para a produção de várias outras fitas positivas no complexo de replicação da
rede membranosa formado pelas outras proteínas não-estruturais junto com
proteínas da célula hospedeira, sendo tais fitas subsequentemente envoltas
pelo capsídeo no RER, maturadas no complexo de Golgi e posteriormente
liberadas no meio extracelular por exocitose (PENIN et al., 2004), como é
visto na Figura 4.
24
Figura 4: Esquematização dos ciclo de replicação do HCV na célula hospedeira. (Adaptada de PHARMACEUTICALS, 2000-2010)
1.3. Resposta do hospedeiro ao HCV
Por seu caráter tipicamente crônico e silencioso, a hepatite C
raramente é diagnosticada na fase inicial, sendo usualmente detectada em
exames de rotina, que inesperadamente detectam alterações nos níveis de
aminotransferases dos pacientes já cronicamente infectados, o que torna
difícil o estudo da fase aguda em humanos. Sendo assim as informações
obtidas até hoje, em sua maior parte vêm de modelos experimentais de
infecção em primatas (chimpanzés). Por sua vez, estudos in vitro de infecção
só foram possíveis após o desenvolvimento de um meio de cultura de
hepatócitos bem diferenciados permissíveis ao vírus, chamado de células
HuH7, derivados de um carcinoma celular originalmente retirado do tumor de
fígado de um paciente japonês do sexo masculino, em 1982.
A partir de tais modelos, verificou-se que de oito a doze semanas
após o contato com o vírus, ocorre um aumento da Alanina Aminotransferase
(ALT) sérica, em conjunto com as células T e anticorpos HCV específicos na
25
circulação. Além disso, há um aumento de células T HCV-específicas no
fígado, em paralelo com uma queda nas titulações do vírus no sangue. Neste
momento decisivo, 20 a 40% dos pacientes que conseguem desenvolver uma
resposta imunológica Th1 de grande intensidade, evoluem para resolução
espontânea da doença, enquanto o restante permanece cronicamente
infectado, numa batalha constante entre imunidade e mecanismos de evasão
viral que levam o fígado a um estado inflamatório constante e progressivo.
Neste caso, o quadro evolui com cirrose hepática dentro de 20 anos em 40%
dos casos, o que por fim leva a morte por complicações como a hipertensão
portal, distúrbios de coagulação, entre outros, e em cerca de 4% destes, por
hepatocarcinoma celular. Dependendo do genótipo viral, de quando e se
diagnosticados, será observada uma taxa de resolução da infecção com os
tratamentos atualmente disponíveis de apenas 40 a 80%, sendo o restante
dos casos, os maiores responsáveis pelas indicações de transplante hepático
no mundo.
A resposta do hospedeiro à infecção viral inicia-se tão logo ocorra
a invasão do hepatócito pelo vírus, dando início a uma resposta imune inata.
O padrão de fita dupla de RNA gerado durante a replicação viral é
reconhecido dentro dos endossomos, enquanto o Gene I Induzido por Ácido
Retinóico (RIG-I) reconhece a parte da poliuridina da extremidade não
traduzível 3’, quando no citoplasma (SAITO et al., 2008), ambas levando a
cascatas de sinalizações intracelulares que culminarão na síntese de IFN-,
que será secretado e liberado pela célula infectada, induzindo um estado
antiviral nas células vizinhas ainda saudáveis (KAWAI; AKIRA, 2008).
Ao ligar-se ao receptor de IFN- das células vizinhas, o IFN-
desencadeia a produção de várias enzimas, parte delas ajudam no combate
ao vírus ao degradarem tanto RNA viral quanto celular (GUO et al., 2004);
outras desestabilizam unicamente estruturas de RNA de dupla fita (TAYLOR
et al., 2005); e duas outras, a P56 (HUI et al., 2003) e PKR (PFLUGHEBER
et al., 2002), inibem a tradução de RNA em geral.
O HCV, por sua vez, adquiriu em sua evolução vários mecanismos
de escape a essa resposta imune inicial do hospedeiro, tendo como
principais armas as proteínas não estruturais, ou mesmo estruturais como a
26
proteína de núcleo (Core), produzidas durante sua replicação. Em estudo de
cultura celular, foi possível observar a importante ação de algumas proteínas
in vitro, como a NS3/4A, que é capaz bloquear as cascatas de sinalização do
de reconhecimento endossômico e do RIG-1, o que leva à uma diminuição
conseqüente de todos os eventos descritos anteriormente (FOY et al., 2003;
LI et al., 2005). Já a NS5A estimula a produção de IL-8 (POLYAK et al., 2001)
e diminui a expressão de genes estimulados por IFN, além de formar
heterodímeros com a PKR e também de levar a sua inibição (GALE et al.,
1997). A proteína NS3, possivelmente estimula monócitos, induzindo a
secreção de TNF- por estes, o que levaria a uma diminuição na produção
de IFN por parte das Células Dendríticas plasmacitóides (pDCs), além de
sua apoptose (DOLGANIUC et al., 2006), e a proteína de núcleo (Core)
interfere diminui a produção de IFN (LIN et al., 2006), além de ligar-se ao
receptor de complemento de macrófagos e Células Dendríticas
convencionais (cDCs), diminuindo a produção do IL-12, aumentando a
produção de IL-10 (DOLGANIUC et al., 2003), e assim sendo a provável
responsável pela baixa ativação de células T, assim como pelo atraso no
aparecimento de células T específicas para o vírus.
Evadindo então a resposta inicial das células parenquimatosas e
obtendo sucesso em sua replicação, o HCV passa a ser encontrado livre na
circulação e então é captado por diversos outros tipos celulares que por sua
vez, também desempenham papéis específicos no combate viral. A primeira
linha de defesa é provida por células NK e células NKT, cujas populações
encontram-se relativamente elevadas no fígado em comparação com a
periferia. Estas células e outras são ativadas pelo IFN-α, cujos níveis são
extremamente elevados na fase inicial da infecção. Uma vez ativadas, estas
células secretam IFN-γ, o qual inibe a replicação do HCV através de um
mecanismo não citolítico. Além disso, as NKs desempenham um papel
essencial no controle da infecção pelo HCV pois são capazes de eliminar
hepatócitos infectados diretamente através de um mecanismo citolítico
inespecífico e indiretamente através da produção de citocinas que induzem
um estado antiviral (IRSHAD; KHUSHBOO; SINGH, 2008), sendo tal
resposta fortemente influenciada por fatores genéticos. Também foi verificado
27
que as células NK de pacientes infectados aumentam a expressão de
receptores inibitórios e produzem citocinas que atenuam a resposta imune
adaptativa, como TGF-β e IL-10, in vitro (REHERMANN, 2009).
Durante a hepatite aguda, as células T específicas são ativadas
por partículas virais do HCV promovendo a migração destas células para o
fígado. Uma das principais características da infecção pelo HCV é justamente
o atraso nesta ativação, sendo detectadas células específicas ativadas na
circulação em cinco a nove semanas após a infecção (THIMME et al., 2002),
e anticorpos específicos contra o vírus encontrados de oito a vinte semanas
depois (LOGVINOFF et al., 2004), sendo tal atraso fator determinante para a
perpetuação da infecção.
A resposta das células TCD4+ e CD8+ HCV específicas e a
produção de IFN-γ coincidem com a redução da quantidade de vírus HCV.
Uma vigorosa resposta de células TCD4+ contra vários antígenos virais é
detectada em casos resolvidos. Em contrapartida, nos casos que evoluem
para hepatite crônica, respostas celulares de células TCD4+ são fracas e de
curta duração. A freqüência de células TCD8+ HCV específicas é elevada
durante a fase aguda da infecção (2-8% periféricas), no entanto, diminui à
medida que a persistência do HCV se desenvolve (0,01-1,2%). Vários
estudos têm demonstrado que a resposta citotóxica HCV específica
correlaciona-se inversamente com a carga viral. Além disso, células TCD8+
HCV específicas em pacientes crônicos com hepatite C possuem menos
capacidade de proliferar e produzem menos IFN-γ em resposta aos
antígenos do HCV (KANTO; HAYASHI, 2006). Assim, observa-se que
durante a fase aguda de infecção, no início da resposta específica contra o
vírus, predomina um padrão Th1 anti-HCV, sendo que a persistência do vírus
e conseqüentemente a passagem para a fase crônica, estão relacionados a
uma mudança e prevalência para o padrão Th2 (CABRERA et al., 2004).
Os linfócitos TCD4+ são cruciais na orquestração da imunidade
celular contra o HCV. Estas células reconhecem os peptídeos virais
antigênicos ligados às moléculas de histocompatibilidade (HLA) classe II na
membrana das células infectadas, ativando-se e promovendo o recrutamento
de linfócitos T citotóxicos (CD8+), responsáveis pela eliminação das células
infectadas por vírus e que em conjunto, produzem citocinas que podem inibir
28
a replicação viral. A resposta eficiente aos diferentes antígenos virais,
incluindo os do núcleo (core), está associada a uma evolução benigna da
infecção pelo HCV. O mesmo é observado em um estudo de Barbosa (2008)
o qual demonstrou que à medida que a infecção viral progride, ocorre o
aparecimento de linfócitos T CD4+ específicos que promovem a expansão
clonal de células T CD8+ citotóxicas (CTLs) (LASARTE et al., 1998).
As CTLs vírus-específicas contribuem para o controle do vírus por
mecanismos citolíticos e/ou pela secreção de citocinas como o IFN-γ, IFN-α/β
e TNF-α, os quais induzem a um estado antiviral em células hospedeiras,
como o que ocorre com hepatócitos infectados. Este estado antiviral torna as
células não infectadas resistentes à infecção, interrompendo a replicação
viral além de induzir o aumento da expressão de moléculas de MHC de
classe I (IRSHAD; KHUSHBOO; SINGH, 2008).
Em um estudo realizado com 28 pacientes observou-se a forte
influência de uma resposta imunológica predominantemente Th1 em doentes
com resposta viral sustentada (RVS), com células TCD8+ produzindo altos
níveis de IFN- durante o tratamento. Por outro lado, pacientes Não
Respondedores (NRs) tiveram uma resposta imunológica mais polarizada
para Th2/Tc2 caracterizada por elevados níveis de IL-4 no sangue periférico
no final do tratamento, com uma diminuição posterior durante o seguimento
(TRAPERO et al., 2005).
A persistência do vírus no hospedeiro acaba por estimular não
apenas mecanismos de controle viral, mas também as células imunológicas
responsáveis pelo autocontrole da resposta inflamatória. As células T
regulatórias (Tregs), que perfazem cerca de 5 a 10% das células TCD4+
periféricas, são responsáveis por manter a tolerância e suprimir linfócitos
auto-reativos, mas podem ser induzidas pela presença do vírus através a
persistência dos antígenos ao longo do tempo. Esta atividade pode ser
promovida pela ação de subpopulações de células dendríticas moduladas
pela viremia persistente. As Tregs podem regular a resposta das células
TCD4+ e TCD8+ na infecção persistente, especialmente na inflamação do
fígado, sendo revelado em um estudo que aproximadamente uma em cada
três células TCD4+ no fígado de pacientes cronicamente infectados são
29
FoxP3+, uma forte população de Treg potenciais. Isto poderia ter um efeito
importante sobre a manutenção e o crescimento de células TCD4+
específicas para o antígeno e células TCD8+ (SEMMO; KLENERMAN, 2007).
Em um estudo anterior foi postulado que as células T CD4+CD25+
estão envolvidos na persistência do HCV, tendo sido observado uma
proporção significativamente maior de células T CD4+CD25+ em pacientes
cronicamente infectados em comparação com os espontaneamente
recuperados e controles normais (CABRERA et al., 2004), levantando a
hipótese de a freqüência de células Treg antes e durante a infecção pode
estar relacionada com a cronificação ou resolução espontânea da hepatite.
Além disso, verificou-se que estas células regulatórias suprimiram a secreção
de IFN-γ e a proliferação de células T HCV-específicas em uma dose
dependente, levantando-se também a possibilidade de que a deficiência
intra-hepática na regulamentação destas células pode levar a um aumento da
inflamação e fibrose do fígado, como demonstrado a partir de amostras
colhidas de tecidos hepáticos fibrosados.
1.4. Células NK, NKT CD8+ e padrão Th17
Usual e didaticamente, costuma-se dividir as células do sistema
imune em famílias, linhagens e subgrupos da imunidade inata ou adquirida,
baseando-se tanto na citada expressão de marcadores de membrana, como
na produção de citocinas, sendo muitos desses marcadores, também
moléculas efetoras. In vivo, porém, essa dicotomia não costuma ser tão clara,
e com a crescente identificação de inúmeras células com expressões
diferentes de marcadores, e sendo esses marcadores, usualmente também
efetores, pode ocorrer um entrelaçado de funções tanto inatas como
adquiridas numa mesma célula. É o caso cada vez mais “confuso” dos
linfócitos T, células NK e células NK-T, comumente consideradas como parte
do sistema imune adquirido e inato (as duas últimas), mas que expressam
várias moléculas em comum, como é o caso de uma lecitina do tipo C que
vem sendo amplamente estudada, o CD161, expresso pela maior parte das
células NK e por aproximadamente 24% das células T periféricas (LANIER;
30
CHANG; PHILLIPS, 1994) e permanecendo ainda pouco estudada quanto à
sua função exata nestas células, se apenas fenotípicas, ou se efetoras.
Análises demonstraram a existência de duas populações distintas
de células T CD8+ expressando CD161 em sua membrana, uma com
expressão intensa (CD161high) e outra com expressão intermediária
(CD161int), além de uma população de linfócitos T CD4+ expressando níveis
intermediários da molécula (TAKAHASHI; DEJBAKHSH-JONES; STROBER,
2006). A função exata de cada uma dessas subpopulações celulares ainda
permanece não esclarecida, apesar de estudos posteriores (COSMI et al.,
2008) terem identificado uma grande expressão desta molécula em células T
helper 17 (Th17), quando comparadas com células Th1 e Th2, apresentando
um novo nicho de células T helper que secretam tanto IL-17A e IL-17F, e
expressam o Receptor Órfão do Fator de Transcrição Mestre Relacionado ao
Ácido Retinóico (RORt) necessário para tal resposta (IVANOV et al., 2006),
passando então o CD161 a ser considerado um marcador de células Th17 na
população linfocitária.
O paradigma Th1/Th2 tem sido ampliado com a descoberta sobre
este subconjunto de células efetoras que também produzem interleucinas do
padrão celular Th17. A função primária destas células parece ser a
eliminação de patógenos que não são adequadamente controlados por
células Th1 ou Th2 e também são potentes indutores de inflamação nos
tecidos. Em 2006, três estudos independentes descobriram que uma
combinação de TGF-β e IL-6 é necessária para a diferenciação de células
Th17 e a indução da síntese de IL-17 em células T imaturas (KORN et al.,
2009).
Foi demonstrado que células T CD4+ produtoras de IL-17A e IL-
17F, formam uma linhagem separada, a Th17, que inclui células que
expressam ácido retinóico para a sua diferenciação. Além da IL-17, essas
células também podem produzir IL-22 e IL-21. A IL-17 foi descrita pela
primeira vez em 1995 como uma glicoproteína de aproximadamente 20 kDa
(155 aminoácidos), sendo um importante mediador da inflamação uma vez
que tem efeitos pleiotrópicos sobre tecidos e várias células do sistema
imunológico. Ela mobiliza os neutrófilos, em parte através do aumento da sua
31
sobrevivência local e em parte pela indução de quimiocinas. Dentre os
agentes infecciosos que induzem a um padrão Th17 no hospedeiro podem
ser identificadas espécies de bactérias, fungos e vírus (DE JONG;
SUDDASON; LORD, 2010).
Quando Takahashi et al. (2006) identificou os subgrupos de
células CD8+CD161high e CD8+CD161int, o primeiro grupo foi classificado
como de células anérgicas por não terem se proliferado ou produzido
citocinas no padrão Th1 ou Th2. Porém em um estudo posterior
(BILLERBECK et al., 2010), estas células foram identificadas como
secretoras de IL-17, apresentando um fenótipo compatível com o padrão,
expressando RORt, CCR6, CXCR6 e IL-18R, além de também
apresentarem um baixo potencial citotóxico, quando comparadas aos
linfócitos T CD8+ típicos, tendo em vista a baixa produção de granzima B e
perforina.
A expressão usual do receptor de quimiocinas CXCR6 por parte
destas células instigou vários estudos levantando a possibilidade de sua
importância no combate a infecções localizadas em tecidos específicos,
como o hepático e pulmonar, levando em conta o direcionamento de seu
ligante, o CXCL16, expresso constitutivamente nestes órgãos, além de
também ser induzido pela inflamação em articulações e intestino (FREEMAN;
CURTIS; CHENSUE, 2007; HEYDTMANN et al., 2005; KIM et al., 2001;
NANKI et al., 2005; SATO et al., 2005; WANG et al., 2004), levando então à
busca do papel desta molécula nas infecções hepáticas virais, e a
conseqüente identificação da expressão de CD161 em células T vírus-
específicas circulantes de pacientes com hepatites B e C, além de uma alta
concentração de linfócitos T CD8+CD161+ infiltrantes no tecido hepático dos
mesmos, não sendo encontrados resultados equivalentes nas infecções por
HIV, CMV e EBV, e sendo todas caracterizadas fenotipicamente como
células de memória efetoras (NORTHFIELD et al., 2008). Além disso, a
própria molécula de CD161 tem sido proposta como participante do processo
de migração transendotelial. As células CD4+CD161+ migram através do
endotélio em maior intensidade que as CD4+CD161-, possivelmente pela
32
ligação da molécula a oligossacarídeos ácidos, sendo tal característica
reduzida após a incubação com anti-CD161 monoclonal (POGGI et al., 1997).
Apesar de todos os avanços no estudo dos mecanismos de
sobrevivência do vírus no hospedeiro, os mecanismos específicos desta
interação ainda estão por ser completamente elucidados, sendo necessária
melhor investigação sobre a influência do vírus no comportamento das
células do sistema imune.
33
2. OBJETIVOS
2.1. Geral
Comparar a expressão de marcadores imunofenotípicos em
linfócitos T CD4+, CD8+ e Linfócitos B de pacientes portadores de hepatite C
crônica e controles saudáveis.
2.2. Específicos:
- Avaliar, a expressão do receptor viral CD81 em linfócitos T e B, além
das freqüências absolutas dessas células.
- Analisar a freqüência de linfócitos T CD8+ com alta expressão da
molécula de CD161 e avaliar sua possível correlação com o perfil
Th17
- Avaliar a expressão do marcador específico de ativação CD69 em
células T CD8+.
- Investigar a freqüência de células T CD4 regulatórias e ativadas
circulantes, através da expressão de CD25/CD127 e HLA-DR.
34
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Delineamento do Estudo
Trata-se de um estudo transversal, analítico, individualizado,
observacional, realizado utilizando-se dados e amostras por conveniência
recolhidas de junho de 2010 a junho de 2012, de pacientes com hepatite C
crônica antes de iniciarem o tratamento adquirindo os medicamentos na
Farmácia Estadual de Medicamentos Excepcionais (FEME), e de um grupo
controle de voluntários não portadores da doença.
3.2. População Estudada
Foram avaliadas amostras sanguíneas e exames laboratoriais de
uma amostra por conveniência de 30 pacientes, 18 mulheres e 12 homens,
com idade média de 48 anos, portadores de hepatite C crônica antes de
iniciarem o tratamento, que se encaixaram nos critérios de inclusão e
exclusão descritos a seguir, e aceitaram participar da pesquisa assinando o
termo de consentimento livre e esclarecido (TECLE) em anexo (Anexo A).
Foram incluídos na pesquisa pacientes portadores de:
vírus da hepatite C com detecção persistente de HCV-RNA por mais
de seis meses;
anti-HCV positivo por teste imunoenzimático de terceira geração e;
exame histológico realizado por patologista experiente (quando
excluídas as contra-indicações de tal procedimento), sendo realizada a
graduação e estadiamento da lesão hepática de acordo com o
Consenso Nacional sobre a classificação das hepatites crônicas
(GAYOTTO, 1994).
Não foram incluídos na pesquisa os pacientes:
positivos para o antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg);
positivos para os anticorpos contra o vírus da imunodeficiência
humana dos tipos 1 e 2;
35
portadores de doenças hepáticas de outra etiologia, como doenças
auto-imunes;
que ingeriam mais de 20g de álcool por dia;
portadores de doença hepática descompensada.
Dezoito pacientes saudáveis, sendo 10 mulheres e 8 homens,
entre 18 e 64 anos (média: 35) escolhidos aleatoriamente, sem hábitos de
consumo de álcool ou história de doença hepática, e que aceitaram participar
do estudo assinando o termo de consentimento livre e esclarecido em anexo,
foram utilizados como grupo controle, sendo submetidos aos mesmos
procedimentos realizados no grupo de estudo. Ao primeiro contato, tanto
pacientes quanto controles foram apresentados e assinaram ao termo de
consentimento livre e esclarecido, sendo realizada então a coleta de dados
clínicos, laboratoriais e epidemiológicos, através do questionário em anexo
(Anexo B). Esta pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética em pesquisa
com seres humanos da Universidade do Ceuma sob o protocolo 00427/10,
de 26/07/2010 (Anexo C).
3.3. Coleta de material
Foi coletada uma amostra de cerca de 4 ml de sangue total em
tubos contendo EDTA, por punção venosa periférica, sendo então
imediatamente transportadas em caixa térmica a 4ºC ao laboratório de
Imunologia das Parasitoses da Uniceuma, onde foram processadas para
análise por citometria de fluxo.
3.4. Processamento das amostras
As amostras foram colocadas em tubos de ensaio plásticos,
centrifugadas a 1500nrpm por 5 minutos para a retirada do plasma. As
células do corpo de fundo foram então misturadas a 10ml de tampão de lise
de hemácias contendo 8,3 g NH4Cl, 1g KHCO3, 1,8ml de uma solução de
5% EDTA para cada litro de solução, e agitadas levemente a uma
36
temperatura de 37ºC em banho Maria por 2 minutos para otimização da ação
do cloreto de amônia.
Após o processo de lise, a mistura foi levada novamente à
centrífuga a 1500rpm por mais 5 minutos, ao final dos quais, foi retirado todo
o sobrenadante, sendo obtido um pellet de leucócitos ao fundo do tubo. Estas
células foram então lavadas e centrifugadas (sempre com os mesmos
parâmetros) por duas vezes com 5ml de uma solução contendo 90% de
RPMI e 10% de Soro Bovino Fetal, sendo descartados os sobrenadantes e
então diluídas novamente em 0,5ml da mesma solução, para posteriormente
serem divididas em 10 amostras iguais de 50l, colocadas em placas de
acrílico com poços de fundo em U e adicionados 50l de uma solução com
três anticorpos, cada um ligado a um diferente fluorocrômo (Fitc, Pe ou Pe-
Cy5), diluída em RPMI.
A mistura de leucócitos com os anticorpos conjugados foi então
incubada em geladeira por 30 minutos e logo após lavada e centrifugada
primeiramente com 100l de RPMI, e logo em seguida com 200l de solução
fisiológica de NaCl a 0,9%. Após o descarte do sobrenadante, as células
foram então ressuspensas em 400l solução fisiológica e inseridas em tubos
de FACS, misturadas a 100l de Paraformaldeído a 2% para fixação, sendo
então lacrados os tubos e levados à geladeira até o momento da leitura no
Citômetro de Fluxo (BD FACSCalibur - BD Biosciences), realizado no máximo
até dois dias do processamento.
3.5. Análise Estatística
As análises realizadas pelo citômetro foram interpretadas pelo
programa BD CellQuestTM Pro 5.1, sendo posteriormente analisadas
utilizando o FlowJo 8.7, ambos para o Sistema Operacional Mac OS.
Todas as possíveis diferenças entre os grupos foram analisadas
utilizando o Teste T de Student para amostras independentes e teste F de
variância. Um valor de p<0,05 foi considerado estatisticamente significativo. A
análise estatística foi realizada através do GraphPad Prism for Mac OS X
5.0d (2010).
37
Todos os resultados de médias apresentados a seguir seguirão o
mesmo padrão de Média (para freqüências) ou Mediana (para intensidades
de expressão) ± Erro Padrão, seguido do tamanho da amostra analisada (N).
38
4. RESULTADOS
Através da citometria de fluxo, estudou-se os marcadores externos
de membrana dos Linfócitos T totais, além das subpopulações de linfócitos T
CD8, T CD4 e os Linfócitos B.
4.1. População estudada
Ao total foram analisadas amostras de 30 pacientes cronicamente
infectados e não tratados, doravante denominados nos gráficos apenas como
Pacientes, e 18 pacientes saudáveis, denominados Controles, distribuídos de
acordo com a Tabela a seguir:
Tabela 1: Perfil das amostras selecionadas para o estudo
PACIENTES (n=30) CONTROLES (n=18)
Idade média: 48a (23-68a) 35a (18-64a)
Gênero n(%)
Masculino 12(40%) 8(44%)
Feminino 18(60%) 10(56%)
Genótipo n(%)
1a 8(27%)
1b 10(33%)
1? 4(13%)
2 2(7%)
3 6(20%)
4.2. Linfócitos T Totais
Analisando-se a freqüência média da população de linfócitos T
totais dos pacientes infectados, através do isolamento das células
39
CD3+CD14- com tamanho e granulosidade compatíveis com linfócitos
(Figura 5-A, B e C), assim como a freqüência de expressão do marcador de
ativação precoce HLA-DR (Figura 5-D), que também é uma das variantes da
molécula de MHC de classe II, verificou-se que os pacientes virgens de
tratamento têm tanto uma freqüência média superior de linfócitos T totais no
sangue periférico (Pacientes: 24,1 ± 1,54; N=30 / Controles: 17,3 ± 1,55;
N=15), quanto uma maior freqüência média da expressão de HLA-DR por
estas células (Pacientes: 36,6 ± 2,03; N=30 / Controles: M ± EP = 27,2 ±
2,47; N=15), indicando certa tendência tanto a um maior estado de
proliferação quanto de ativação de linfócitos T em pacientes infectados pelo
HCV, se comparados a controles saudáveis (Figura 6).
Figura 5: Seleção de linfócitos T por expressão positiva de CD3 (A) com tamanho e granulosidade compatíveis com linfócitos T (B). Foram selecionadas células com expressão negativa de CD14 (C) para posterior análise de expressão de HLA-DR por células CD3+(D).
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100
101
102
103
104
AFSC FRESH C.006…Linf. T Totais
FL2-H: FL2-CD3 PE
FL3-H
: F
L3
-HL
A D
R P
EC
Y5
0 53.8
46.20
0 200 400 600 800 1000
0
200
400
600
800
1000
AFSC FRESH C.006…CD3+CD14-
FSC-H: FSC-Height
SS
C-H
: S
SC
-He
igh
t
99.4
100
101
102
103
104
0
200
400
600
800
1000
AFSC FRESH C.006
FL2-H: FL2-CD3 PE
SS
C-H
: S
SC
-He
igh
t
20.7
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
AFSC FRESH C.006…CD3+
FL2-H: FL2-CD3 PE
FL1
-H:
FL
1-C
D1
4 F
ITC
98.7
A B
C D
40
Figura 6: Freqüências relativas de linfócitos T totais de pacientes e controles (A). Freqüência células Cd3+ HLA-DR+ por pacientes e controles (B).
4.3. Linfócitos T CD8+
Considerou-se então como Linfócitos T CD8 todas as células com
alta expressão de CD8, sendo ainda selecionadas apenas as que atendiam
ao tamanho e granulosidade compatíveis com linfócitos (Figura 7).
Analisando a freqüência de expressão do receptor de membrana CD161,
típico de células NK, por estes linfócitos, identificou-se uma distribuição em 3
subpopulações distintas, sendo então classificadas como CD161high, as
células que se apresentam agrupadas com uma grande intensidade de
fluorescência deste marcador; CD161med, as células que tinham expressão
positiva porém em menor intensidade, e CD161-, as que tinham não
expressavam este marcador (Figura 7).
Linfócitos T HLA-DR+
Pacientes (n-30)
Controles (n-15)0
20
40
60
80
%
p=0,0078
Frequência de Linfócitos T Totais
Pacientes (n-30)
Controles (n-15)0
10
20
30
40
50%
p=0,0077
A B
41
Figura 7: Análise da distribuição de CD161 em linfócitos TCD8. (A) Seleção de células fortemente positivas na expressão de CD8 com baixa granulosidade. (B) Exclusão de células com tamanho ou granulosidade incompatíveis com linfócitos íntegros. (C) Separação de linfócitos TCD8 em três subgrupos, de acordo com a presença forte (high), fraca (med) ou nula (neg) de CD161 em sua membrana plasmática.
Analisando as freqüências das células CD8+CD161high
demonstradas, nota-se que o grupo de pacientes infectados pelo HCV
virgens de tratamento tem uma média de freqüências (2,98 ± 0,47; N=28)
significantemente menor quando comparada à dos controles (7,1 ± 1,37;
N=16). Realizando o Teste F, nota-se ainda uma diferença significante
(p=0,0004) na variância de cada amostra (Figura 8).
Figura 8: Freqüência de células CD8+CD161high no grupo de pacientes virgens de tratamento e de controles saudáveis.
Entretanto, este grupo de células CD8+CD161High não é
composto apenas de linfócitos T CD8+ típicos. Dentro dele ainda é possível
encontrar um subtipo de células T conhecido como NKT, por compartilharem
CD8+CD161High
Pacientes (n-28)
Controles (n-16)0
5
10
15
20
25
p=0,0014
%10
010
110
210
310
4
0
200
400
600
800
1000
EBAF T0 FRESH A.002
FL3-H: FL3-CD8 PECY5
SS
C-H
: S
SC
-He
igh
t
5.79
0 200 400 600 800 1000
0
200
400
600
800
1000
EBAF T0 FRESH A.002…CD8+
FSC-H: FSC-Height
SS
C-H
: S
SC
-He
igh
t
96.8
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
DSC T0 CONTR FRESH A.002…Linfócitos T CD8
FL3-H: FL3-CD8 PECY5
FL
2-H
: F
L2
-CD
161
PE
85.6
6.52
7.93
A B C
42
várias características com as células Natural Killer, como a produção de
granzima e a expressão de CD16, e principalmente de CD56, o típico
marcador de células NK. Para verificar qual subgrupo exatamente era o
responsável por essa diminuição na freqüência das células CD8+CD161high
(população linfocitária típica ou de células NKT), separou-se o conjunto de
células CD8+ em dois grupos, de acordo com a presença ou ausência de
expressão de CD56, que pode ser observado na Figura 9.
Figura 9: Separação dos linfócitos CD8+ (A) em células NKT CD8+CD56+ (B) e linfócitos TCD8 típicos CD8+CD56- (C).
Não houve diferença significativa nas médias de freqüências da
população de células consideradas NKT CD8+ ao se comparar pacientes aos
controles. No que diz respeito à expressão de CD161high por cada subgrupo
de linfócitos estudado, é possível notar uma diminuição global nas
freqüências relativas, visto que tanto os linfócitos CD8+CD56- (Pacientes: 2,4
± 0,46; N=28 / Controles: 5,47 ± 0,93; N=16), quanto as células CD8+CD56+
(Pacientes: 11,64 ± 2,6; N=27 / Controles: 22,1 ± 4,17; N=16) têm
freqüências médias significantemente diminuídas nos pacientes (Figura 10).
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
DSC T0 CONTR FRESH A.002…Q2: FL3-CD8 PECY5+, FL1-CD56 FITC+
FL3-H: FL3-CD8 PECY5
FL
2-H
: F
L2
-CD
161
PE
89.3
5.36
5.3
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
DSC T0 CONTR FRESH A.002…Q3: FL3-CD8 PECY5+, FL1-CD56 FITC—
FL3-H: FL3-CD8 PECY5
FL
2-H
: F
L2
-CD
16
1 P
E
82.9
7.45
9.66
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
DSC T0 CONTR FRESH A.002…Linfócitos T CD8
FL3-H: FL3-CD8 PECY5
FL1
-H:
FL
1-C
D5
6 F
ITC
0 36.4
63.60
A B
C
43
Figura 5: Freqüências relativas de células CD161high dentre os linfócitos TCD8 típicos CD8+CD56- (A) e células CD8+CD56+ NKT (B).
Verificou-se ainda a freqüência de ativação deste grupo celular
pela expressão do marcador precoce de ativação linfocitária CD69 (Figura
11), e apesar da tendência a menores freqüências de células
CD8+CD161high nos portadores de HCV cronicamente infectados pelo vírus,
observou-se que mesmo em menor número, os linfócitos CD8+CD161high
dos pacientes cronicamente infectados pelo HCV encontram-se em média,
mais ativados do que os dos controles saudáveis (Pacientes: 14,5 ± 2,5;
N=23 / Controles: 5,07 ± 1,05; N=14) (Figura 12A), que reflete também no
grau de ativação dos linfócitos CD8+ totais (Pacientes: 2,1 ± 0,22; N=23 /
Controles: 1,28 ± 0,33; N=14)(Figura 12B).
Figura 6: Expressão de CD69 por células TCD8+ (A) e células T CD8+CD161high (B).
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
MCA FRESH D.006…Linfócitos T CD8
FL1-H: FL1-CD69 FITC
FL
2-H
: F
L2
-CD
161
PE
10.8 1.73
0.9886.5
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
FMT FRESH D.002…Linfócitos CD8
FL1-H: FL1-CD69 FITC
FL3
-H:
FL
3-C
D8
PE
CY
5
96.9 3.14
00
A B
CD8+CD56+CD161high
Pacientes (n-27)
Controles (n
-16)0
20
40
60
80
%
p=0,03
CD8+CD56-CD161high
Pacientes (n-28)
Controles (n-16)0
5
10
15
p=0,002
%
A B
44
Figura 7: Freqüência de células CD69+ na subpopulação de células CD8+CD161high (A) e nas células T CD8+ totais (B).
Ao se analisar a intensidade de expressão do principal receptor
celular do HCV no hospedeiro (CD81) em células CD8+, foi possível notar,
como esperado, que esta é expressa por todas elas (Figura 13A). Porém
notou-se que a intensidade de expressão foi bimodal no que diz respeito aos
linfócitos CD8+, estando agrupadas em dois grupos distintos, um com alta
(CD81high) e o outro com baixa expressão (CD81low) (Figura 13 A e B).
Figura 8: Expressão de CD81 pelas células T CD8 totais (A) e por células CD8+CD161+ (B).
Em relação à freqüência de células CD8+CD81high nota-se que o
grupo de pacientes infectados apresentou um média maior desta
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
MCA FRESH L.005…Linfócitos CD8
FL1-H: FL1-CD81 FITC
FL
2-H
: F
L2
-CD
16
1 P
E
0 15.4
84.60
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
MCA FRESH L.005…Linfócitos CD8
FL3-H: FL3-CD8 PECY5
FL1
-H:
FL
1-C
D8
1 F
ITC
0 65.9
34.10
A B
CD8+CD69+
Pacientes (n-23)
Controles (n-13)0
1
2
3
4
5
%
p=0,0057
CD8+CD161high CD69+
Pacientes (n-23)
Controles (n-14)0
20
40
60%
p=0,0074
A B
45
subpopulação de células CD8+CD81high em relação aos os controles (Figura
14 A).
Além disso, quando analisada a mediana de intensidade de
fluorescência para CD81 (expressão de CD81) por células CD8+CD161-
verificou-se que as células dos pacientes infectados apresentam níveis mais
elevados de expressão que os indivíduos controles, sugerindo que os
pacientes infectados possam ter uma tendência maior à proliferação da
subpopulação de células CD8+CD81high ou mesmo que a infecção possa
determinar o aumento destas células (Figura 14 B).
Figura 9: Freqüências de células CD8+CD81high em pacientes e controles(A). Expressão de CD81 medida pela mediana de fluorescência em células CD8+CD161- de pacientes e controles (B).
4.4. Linfócitos T CD4+
Foram classificadas como linfócitos T CD4+ todas as células com
alta expressão de CD4 com tamanho e granulosidade compatíveis com
linfócitos (Figura 15-A e B). As células T CD4+ foram analisadas em relação
à sua freqüência e expressão de CD81 (Figura 15-C). Além disso, verificou-
se freqüência de células T CD4+ ativadas e regulatórias , que podem ser
subdivididas nestes grupos pela expressão de CD25 e CD127. O subtipo
especializado na regulação da resposta imune inflamatória conhecido como
células T reguladoras (Treg) é caracterizado pela alta expressão do marcador
de ativação CD25 e pela baixa expressão do marcador CD127 (receptor de Il-
7). Por outro lado, as células que expressam concomitantemente altos níveis
Mediana de CD81 em células CD8+CD161-
Pacientes (n-15)
Controles (n-12)0
100
200
300In
ten
sid
ad
e d
e F
luo
rescê
ncia
p=0,0078
Frequência de célulasCD8+CD81high
Pacientes (n-17)
Controles (n-12)0
20
40
60
80
100
%
p<0,0001
A B
46
de CD25 e CD127 determinam os linfócitos T CD4+ ativados que possuem
funções efetoras (Figura 15-D).
Figura 10: Freqüência de células CD4+ (A) em relação ao tamanho e granulosidade compatíveis com Linfócitos (B). Análise comparativa da intensidade de fluorescência de CD81 (C) em pacientes (azul) e controles (Vermelho). Divisão das subpopulações de células T CD4+ Reguladoras (Treg) (CD25+CD127low) e Ativadas (CD25+CD127high) (D).
As análises não mostraram diferença significante entre as
populações de células T CD4 ativadas (CD25+CD127+) ou reguladoras
(CD25+CD127-) de pacientes infectados quando comparadas às dos
controles saudáveis, havendo porém, uma grande variância dessas
populações dentro dos grupos estudados (Figura 16-A e B). Já a expressão
do CD81 foi significantemente mais intensa em pacientes infectados pelo
HCV (Pacientes: 91,2 ± 4,95; N=20 / Controles: 67 ± 5,8; N=15) do que nos
controles (Figura 16-C).
Linfócitos CD4
100
101
102
103
104
FL1-H: FL1-CD81 FITC
0
20
40
60
80
100
% o
f M
ax
BIA CTRL FRESH K.001 99.1
LCS FRESH K.002 99.5
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
ICPP FRESH B .001…Linfócitos T CD4
FL2-H: FL2-CD25 PE
FL
1-H
: F
L1
-CD
12
7 F
ITC
19.6
4.55
0 200 400 600 800 1000
0
200
400
600
800
1000
ICPP FRESH B .001…CD4+
FSC-H: FSC-Height
SS
C-H
: S
SC
-He
igh
t
99.8
100
101
102
103
104
0
200
400
600
800
1000
ICPP FRESH B .001
FL3-H: FL3-CD4 PECY5
SS
C-H
: S
SC
-He
igh
t
0.52
5.76
A B
C D
47
Figura 11: Freqüência de células T CD4+ Regulatórias (Treg) (A) e Ativadas (B) nos portadores crônicos de HCV e controles. Expressão de CD81 por células T CD4+ nos portadores crônicos de HCV e controles (C).
4.5. Linfócitos B
Para a análise dos linfócitos B, foram selecionadas células
CD19+CD14- com tamanho e granulosidade compatíveis com linfócitos, as
quais foram analisadas pela intensidade de expressão de CD81 (Figura 17).
Intensidade de expressão de CD81 em Linfócitos TCD4
Pacientes (n-20)
Controles (n-15)0
50
100
150
Inte
nsid
ad
e d
e F
luo
rescê
ncia
p=0,0031
Frequência de Linfócitos T CD4 Ativados
Pacientes (n-27)
Controles (n-14)0
5
10
15
%p=0,5814
Frequências de CélulasT Regulatórias
Pacientes (n-27)
Controles (n-14)0
5
10
15
20
%
p=0,2114
A B C
48
Figura 17: Seleção de células CD19+ (A), CD14- (B). Expressão do TLR2 (C) e TLR4 (D) em linfócitos B (CD19+). Análise comparativa da intensidade de fluorescência de CD81 (E) entre Paciente (vermelho) e controle (Azul).
Constatou-se um aumento significante na freqüência relativa de
linfócitos B (Pacientes: 3,41 ± 0,45; N=22 / Controles: 1,52 ± 0,24; N=9).
Além disso, verificou-se uma expressão mais intensa do receptor viral CD81
(Pacientes: M ± EP = 70,38 ± 3,941 N=19 / Controles: M ± EP = 53,60 ±
3,516 N=11) (Figura 18).
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
MRPF FRESH E.004…Linf B
FL1-H: FL1-CD14 FITC
FL
3-H
: F
L3
-CD
19
PE
CY
5
95.1
100
101
102
103
104
0
200
400
600
800
1000
MRPF FRESH E.004
FL3-H: FL3-CD19 PECY5
SS
C-H
: S
SC
-He
igh
t
27.7 1.32
6.5264.4
A B
Linf B
100
101
102
103
104
FL1-H: FL1-CD81 FITC
0
20
40
60
80
100
% o
f Max
LCS FRESH J.002 122
BIA CTRL FRESH J.001 33.7
C
49
Figura 18: Freqüências relativas (A) e expressão de CD81 (B) em Linfócitos B no grupo de pacientes e controles.
Frequência de Linfócitos B Totais
Pacientes (n-22)
Controles (n-9)0
5
10
15%
p=0,0148
Mediana da expressão deCD81 em Linfócitos B
Pacientes (n-19)
Controles (n-11)0
50
100
150
Inte
nsid
ad
e d
e F
luo
rescê
ncia
p=0,0077
A B
50
5. DISCUSSÃO
Este estudo teve como objetivo principal identificar eventuais
modificações ocorridas no sistema imune do portador crônico do HCV, com
foco principal nas freqüências e estado de ativação do subgrupo de linfócitos
T CD8 com alta expressão da molécula de CD161, grupo este recentemente
identificado como possível modulador de uma resposta imune no padrão
Th17 no tecido hepático. Além disso, pesquisou-se a expressão de outros
marcadores de membrana em linfócitos T e B, que nos últimos tempos vêm
apresentando algum grau de importância na fisiopatologia e na evolução da
doença, porém ainda não tem seu comportamento nos diferentes estágios da
infecção totalmente descrito. Para tanto, utilizou-se a comparação de um
grupo de pacientes cronicamente infectados pelo HCV e ainda não tratados,
com um grupo de pacientes não infectados.
Inicialmente identificou-se que os pacientes infectados pelo HCV
têm freqüências menores do subgrupo de Linfócitos T CD8 que expressam
grandes quantidades da molécula de CD161 e que, apesar de em menor
número, estas células encontram-se bem mais ativadas nestes pacientes,
que em controles saudáveis, levando em conta a expressão do marcador de
ativação precoce CD69. Este subtipo celular foi identificado por Takahashi et
al. (2006) inicialmente como grupo de células anérgicas, porém esta
conclusão foi tomada por não terem se proliferado ou produzido citocinas no
padrão Th1 ou Th2, não sendo investigados outros padrões de resposta. Já
em um estudo posterior (BILLERBECK et al., 2010), estas células foram
caracterizadas como secretoras de IL-17, apresentando um fenótipo
compatível com o padrão.
Em um estudo ainda não publicado deste laboratório (PEREIRA,
2011), encontrou-se uma correlação positiva entre a freqüência de células T
CD8 expressando altos níveis de CD161 e a resposta viral sustentada ao
tratamento da hepatite C, quando o paciente apresenta anti-HCV negativo 6
meses após o tratamento, e por este motivo, no presente estudo avaliou-se a
freqüência dessas células no paciente cronicamente infectado, porém ainda
virgem de tratamento, com o intuito de averiguar a influência da infecção viral
na freqüência desse subgrupo. Curiosamente, como citado anteriormente, as
51
análises feitas mostraram uma tendência global dos pacientes cronicamente
infectados a apresentarem baixas freqüências de células T CD8+CD161high
quando comparados aos controles saudáveis, o que corrobora com o
observado por Northfield et al. (2008), que encontrou uma alta freqüência
dessas células apenas no tecido hepático em si, e não na periferia. Como
não foi possível neste estudo averiguar a freqüência intra-hepática destas
células, não é possível concluir se o próprio vírus é responsável pela
diminuição direta de sua freqüência no sangue periférico como uma maneira
de subverter a resposta imune do paciente ou se, ao levar em conta a
tendência ao direcionamento quimiotático de tais células ao tecido hepático
inflamado pelo CXCR6, tal diminuição de freqüência em pacientes crônicos
não tratados e em pacientes não respondedores deva-se à grande captura
dessa população pelo fígado em atividade inflamatória crônica, o que não
mais acontece no paciente com infecção resolvida após o tratamento, que
então normaliza a freqüência periférica de células CD8+CD161high,
equiparando-se a controles saudáveis.
Tanto Takahashi et al. (2006) quanto Northfield et al. (2008)
identificaram as células T CD8+CD161int como produtoras de IFN- sob
estímulo in vitro, sendo então também de grande importância na resposta
imune contra o HCV. Neste estudo porém, verificou-se que os pacientes
crônicos não-tratados, quando comparados a controles saudáveis têm um
nível de ativação periférica marcado pela expressão de CD69 superior
unicamente nas células do subgrupo CD161high, que como exposto por
Billerbeck et al. (2010), é responsável por uma resposta Th17, estando o
grupo CD8+CD161int sem sinais de ativação. Nenhum dos dois estudos
averiguou o estado de ativação das células periféricas, sendo que este
aspecto permanece por ser investigado. Os únicos resultados semelhantes
encontrados na literatura apontam para o outro direcionamento destes
subgrupos celulares, mostrando exatamente a grande expressão de CD69
por parte de linfócitos T CD4 e CD8 periféricos com expressão intermediária
de CD161 na crise de asma aguda (GONZALEZ-HERNANDEZ et al., 2007),
havendo grande produção de IFN- o qual mantém o equilíbrio da resposta
Th1/Th2, indicando a grande importância de tais células nas respostas
52
inflamatórias de tecidos específicos expressando o CXCL16, como o
pulmonar e o hepático. A demonstração de tal ativação é mais um indício da
crescente importância que vem sendo dada a este grupo celular na resposta
imune ao HCV, levantando mais indícios de que uma resposta Th17 mais
intensa possa ser decisiva na resposta sustentada ao tratamento, ou mesmo
à resolução espontânea após a infecção aguda pelo vírus.
Mais recentemente, tem-se verificado ainda o papel fundamental
do grau de ativação das células NK durante a resposta aguda ao vírus, e sua
correlação com a resolução espontânea da doença. Nas análises realizadas
no presente trabalho, os pacientes cronicamente infectados apresentaram
baixas freqüências de células NKT expressando CD161
(CD8+CD56+CD161high), quando comparados a controles saudáveis,
resultado similar ao encontrado em um estudo recente realizado por Alter et
al. (2011), porém na infecção aguda. Nele, também verificou-se uma
correlação inversa ao padrão linfocitário de expressão do CD161 em células
NK e NKT de pacientes com infecção aguda, sendo a resolução espontânea
relacionada a uma menor expressão desta molécula em células NK nesta
fase (ALTER, G. et al., 2011). Tal correlação inversa deve-se possivelmente
ao fato de a molécula do CD161 desencadear sinais opostos em células T e
células NK, agindo com ativador das primeiras e inibidor das últimas
(ALDEMIR et al., 2005). Curiosamente, o mesmo fenômeno ocorre com a
interação entre a proteína E2 viral e seu principal receptor na célula
hospedeira, o CD81 (CROTTA et al., 2002; TSENG; KLIMPEL, 2002).
O CD81, como esperado, foi encontrado na membrana de todas
subpopulações celulares estudadas, nas amostras de pacientes e controles.
Interessantemente, os linfócitos T CD8 apresentaram uma clara divisão em 2
subgrupos distintos, um com grande expressão de CD81 (high) e outro com
expressão positiva, porém intermediária (low), estando todo o grupo de
células CD8+CD161high dentro do subgrupo CD81high, tanto em pacientes
quanto em controles. Verificou-se ainda que os pacientes apresentaram
freqüências médias das células CD81high maiores que os controles, estando
este aumento relacionado ao grupo de células CD161-. Tais observações
aparentemente são inéditas, levando em conta a completa falta de estudos
publicados na literatura científica fazendo referência a esta dicotomia de
53
expressão do receptor do HCV nos linfócitos TCD8, podendo este ser um
fator importante no processo de infecção viral ou ainda um reflexo do mesmo.
Sendo assim, estudos mais aprofundados devem ser realizados para que
qualquer conclusão sobre a causa desta distribuição bimodal seja tomada,
porém levando em conta tanto a conhecida capacidade do HCV de aumentar
a expressão de CD81 em células infectadas (HOFMANN et al., 2004;
KRONENBERGER et al., 2001; ZUCKERMAN et al., 2002), quanto à
possibilidade viral de também invadir linfócitos (CROTTA et al., 2002; PILERI
et al., 1998; WACK et al., 2001), é possível entender a causa do aumento de
células TCD8 expressando fortemente o CD81 encontrado nos resultados.
Tendo em vista ainda que neste estudo verificou-se uma menor freqüência da
subpopulação de células CD8+CD161high nos pacientes infectados,
subgrupo este especializado na resposta inflamatória direcionada ao fígado,
e que todas estas células encontram-se no grupo com forte expressão de
CD81, pode-se levantar a hipótese de que o vírus interage diretamente com
essa célula, possivelmente subvertendo uma resposta adequada do sistema
imune e ajudando assim no processo de cronificação da infecção.
Analisando linfócitos T CD4 por sua vez, observa-se um quadro
um tanto diferente, tendo em vista a pouca alteração fenotípica encontrada
nos resultados. Os pacientes cronicamente infectados pelo HCV estudados
não apresentaram qualquer diferença do grupo controle em relação à
freqüência de células TCD4 regulatórias circulantes (CD4+CD25+CD127-) ou
à freqüência de células TCD4 efetoras ativadas (CD4+CD25+CD127+). A
única alteração encontrada neste subgrupo, mais uma vez foi o aumento da
expressão de CD81 por parte dessas células, novamente indicando a
possível interação do HCV com os linfócitos dos pacientes.
Alguns estudos já correlacionaram uma resposta Th1 vigorosa por
parte das células CD4, baseada na produção de IL-2 e IFN- com a resolução
espontânea infecção aguda no paciente infectado pelo vírus (TSAI et al.,
1997). Tais estudos, avaliando tanto as células no ambiente hepático de
chimpanzés, quanto na circulação de pacientes recém infectados apontam a
necessidade dessa resposta rápida e eficiente das células CD4 para que haja
um “clearance” total do vírus, apontando a falha desta como uma das
54
principais causas para o processo de cronificação da doença (GERLACH et
al., 1999; THIMME et al., 2002). Sendo assim, como é de se esperar, nos
pacientes cronicamente infectados, as células T CD4 não apresentam sinais
de ativação significativos, indo de acordo com a literatura, que sugere a
existência de uma resposta T CD4 específica no paciente cronicamente
infectado, porém com capacidade proliferativa reduzida (SEMMO et al.,
2007). Tal status é associado ainda com a produção de IFN- sob
estimulação antigênica, mas com muito pouca ou mesmo nula expressão de
IL-2 (SEMMO et al., 2005).
Por ser o CD25 a cadeia do receptor de IL-2, um marcador de
ativação precoce dos linfócitos T CD4+ ou também um marcador de células T
regulatórias quando da expressão concomitante do fator nuclear FoxP3,
como era de se esperar, as análises deste estudo encontraram resultados
similares a estudos anteriores da literatura (ULSENHEIMER et al., 2006), os
quais apontaram para a pouca ativação destas células no paciente
cronicamente infectado. Da mesma maneira, devido à pouca ativação do
sistema, que contribui para que a hepatite C seja uma doença silenciosa na
grande maioria dos casos crônicos, vê-se também um baixo nível de células
T regulatórias que poderiam atuar como reguladoras da ativação excessiva
do sistema.
Muito tem sido investigado para se entender a causa desta falha
na resposta dos linfócitos T CD4, havendo numerosos estudos apontando
para um possível mecanismo de escape viral através de mutações em
epítopos reconhecidos pelos linfócitos (ERICKSON et al., 2001), o que
possivelmente leva também a uma exaustão dessas células gerada pelo
escape de anticorpos neutralizantes e conseqüente ao aumento da viremia
(VON HAHN et al., 2007). Nos anos recentes, a atenção dos pesquisadores
tem se voltado à ação da regulação exercida pelo próprio sistema imune
nestas respostas antivirais, sendo plausível imaginar que o excesso de
regulação possa levar a uma resposta Th1 ineficaz com conseqüente
cronificação da infecção pelo HCV (CABRERA et al., 2004). As células T
reguladoras também expressam o marcador de ativação CD25, sendo
diferenciadas das células T efetoras ativadas pela expressão de FoxP3, ou
55
ainda pela ausência da expressão de outro marcador de ativação precoce, o
CD127. Tais células poderiam, particularmente no fígado em atividade
inflamatória, suprimir respostas tanto de células CD4, quanto de células CD8.
Em um estudo recente, averiguou-se a presença de FoxP3 em cerca de 30%
das células CD4+ do tecido hepático de pacientes portadores de hepatite C
crônica (WARD et al., 2007). Em outro estudo inédito publicado há cerca de 1
ano, múltiplas biópsias foram coletadas antes, durante e após o tratamento
com interferon alfa e ribavirina, e foi constatado um aumento da atividade das
células T regulatórias no fígado, induzido pela terapia, e que a presença de
grandes quantidades destas células no tecido hepático persiste mesmo 6
meses após a terapia bem sucedida, indicando uma continua atividade
regulatória mesmo sem presença detectável do vírus (CLAASSEN et al.,
2011).
Em 2010, um estudo correlacionou a baixa freqüência das células
T regulatórias no fígado com a resolução espontânea após a infecção aguda
pelo HCV (LANGHANS et al., 2010). Já mais recentemente, a alta freqüência
de Tregs no tecido hepático de pacientes cronicamente infectados se
correlacionou positivamente com células CD4 efetoras HCV específicas
ativadas na circulação periférica, e negativamente com o grau de agressão
hepática, sugerindo então que, apesar de serem possíveis responsáveis pela
cronificação da doença, como citado no estudo anterior, no paciente já
cronificado elas exercem um papel protetor para o tecido hepático
(AMOROSO et al., 2012). Vale ressaltar que no estudo aqui realizado, não foi
encontrada uma correlação entre células T regulatórias circulantes ou células
TCD4 ativadas; e o grau de inflamação ou fibrose da biópsia hepática pré-
tratamento dos pacientes.
Tais estudos apontam tanto a importância quanto a dificuldade
existente em se analisar as células no local específico da infecção, o tecido
hepático. Nas analises realizadas no presente estudo, nada foi encontrado de
relevante em relação à freqüência de células T regulatórias no sangue
periférico dos pacientes quando comparados a controles saudáveis, a não
ser a grande variação dessas freqüências que acontecem em ambos os
grupos, sendo necessária a investigação de biópsias hepáticas dos mesmos
56
para melhor entender a relação entre a intensidade expressão dessas células
e o grau de acometimento hepático causado pela atividade inflamatória.
Identificou-se ainda neste estudo um aumento na expressão de
CD81 por parte dos linfócitos T CD4 totais, provavelmente induzida pela
própria interação do vírus com as células como citado no caso das células
CD8, e indo de encontro a um estudo similar, que além de identificar este
aumento na expressão do receptor para o vírus, viu que, ao contrário dos
linfócitos T CD8, esta expressão não diminui com o tratamento da doença e
também não decai após este, mesmo nos pacientes que resolvem a infecção,
fato que ainda necessita de investigação para melhor entendimento
(KRONENBERGER et al., 2006).
Ao se analisar a população de linfócitos T como um todo (CD3+)
bem como seus níveis de ativação pela expressão de HLA-DR, encontrou-se
um aumento tanto na freqüência total destes, com uma tendência maior à
linfocitose nos portadores crônicos do HCV, quanto à freqüência destas
células expressando HLA-DR. As proteínas do HLA são as correspondentes
humanas das moléculas do complexo principal de histocompatibilidade
(MHC) observadas na maioria dos vertebrados, que no homem são
codificadas por um grupo de genes presentes no cromossomo 6. Estas
moléculas são responsáveis pela apresentação de antígenos em células APC
porém foram originalmente descritas como marcador de ativação em
linfócitos T. Observou-se um aumento da expressão de HLA-DR por células
CD3+, indicando aumento de ativação no compartimento de linfócitos T,
resultados estes similares porém não iguais aos de Neau-Cransac et al., que
em 2005 encontrou contagens de linfócitos similares entre pacientes e
controles, porém freqüências maiores de linfócitos CD4 e não de CD8, e
também um aumento na expressão de HLA-DR por linfócitos T Totais, tanto
às custas de células CD4 e CD8 (NEAU-CRANSAC et al., 2005).
Ao verificar células usualmente consideradas como efetoras da
imunidade adquirida, apresentando em sua superfície o MHC de classe II,
novamente adentra-se campos ainda não muito elucidados tanto da
imunologia quanto da fisiopatologia do HCV, levantando-se então várias
questões quanto a razão e a importância deste aumento de expressão do
HLA-DR nos linfócitos dos pacientes infectados.
57
Atualmente sabe-se que os linfócitos T, além de células efetoras,
também podem agir como apresentadores não-convencionais de antígenos,
havendo evidências de que, além da molécula de MHC classe II, estas
células também expressam, tanto constitutiva como induzidamente, as
moléculas coestimulatórias CD80 e CD86, que acabam por realizar a
interação com o TCR e as moléculas de CD28 e CD152 de outras células T,
ocorrendo assim uma interação T-T com conseqüente ativação da célula
latente. Acontece que esta estimulação, acaba por gerar células T anérgicas,
possivelmente devido ao baixo influxo de Ca++ gerado por esta interação na
célula T receptora do sinal. Tal influxo diminuído acaba por interferir na
produção de IL-2 pela célula, porém não altera a produção de IL-4, causando
assim a perda do padrão de resposta Th1 que seria gerado caso a
estimulação fosse adequada (HOLLING; SCHOOTEN; VAN DEN ELSEN,
2004), havendo também evidências de que essas células T anérgicas teriam
ação reguladora tanto sobre células T quanto sobre APCs (CHAI et al., 1999;
TAAMS et al., 1998).
O fato de pacientes com Hepatite C crônica apresentarem
aumento na expressão de HLA-DR nos linfócitos T demonstrado tanto neste
quanto em outros estudos, junto com a já conhecida e citada anergia
encontrada nas células T destes pacientes, decorrida de uma falha em uma
resposta Th1 vigorosa no momento da infecção aguda, levanta a
possibilidade de que tal interação de células T apresentando antígenos por
MHC de classe II para células T imaturas tenha papel efetivo no processo de
cronificação da infecção, sendo então necessária uma investigação
adequada para melhor elucidação da fisiopatologia do HCV.
No presente estudo, quando comparados a controles saudáveis,
os pacientes cronicamente infectados pelo HCV apresentaram maiores
freqüências de linfócitos B. Além disso, dentro deste grupo de linfócitos
houve uma maior intensidade de expressão da molécula de CD81 em suas
membranas.
O aumento das freqüências de células B nos pacientes
cronicamente infectados já foi descrito por vários autores que comprovaram a
existência de um aparente processo linfoproliferativo benigno, possivelmente
associado à capacidade de infecção direta destas células pelo HCV, e sua
58
replicação dentro delas, mais especificamente em pacientes que
desenvolvem crioglobulinemia mista (SANSONNO et al., 2007), havendo
ainda possibilidade de desenvolvimento de malignidade a partir de tal
processo (ZIGNEGO; PILUSO; GIANNINI, 2008).
A expansão dos linfócitos B deriva principalmente poucas células
intra-hepáticas encontradas em focos específicos de expansão, cada foco
derivando de um único progenitor (RACANELLI et al., 2001), sendo
diretamente relacionada a altas concentrações virais no tecido hepático
(DAMMACCO et al., 2000) e também a manifestações extra-hepáticas da
hepatite C, como o franco linfoma não-Hodgkin de células B (SANSONNO et
al., 2004), sendo interessante então, a investigação futura da influência da
intensidade de replicação das células B nos pacientes cronicamente
infectados para o aparecimento de complicações linfóides, assim como o
melhoramento dos protocolos de acompanhamento dos portadores do vírus.
Assim como este, outros estudos também evidenciaram um
aumento na intensidade de expressão do CD81 em linfócitos B
(KRONENBERGER et al., 2006; KRONENBERGER et al., 2001;
ZUCKERMAN, 2003), sendo que em um estudo de 2011, ao contrário do
encontrado nos já citados, houve a relação entre a intensidade de expressão
dessa molécula no linfócito B e a resposta ou não do paciente ao tratamento
com interferon e ribavirina (SOLDEVILA et al., 2011).
59
CONCLUSÕES
Quando comparados a controles saudáveis, os pacientes
portadores de hepatite C crônica apresentam:
Menores freqüências de células CD8+CD161high tanto
CD56+ quanto CD56-;
Maiores freqüências de células CD8+CD161high
expressando marcador de ativação CD69;
Maiores freqüências de linfócitos T CD8+ ativados;
Maiores freqüências de células CD8+CD81high
Maior expressão de CD81 (mediana de fluorescência) em
linfócitos T CD4+, CD8+ e linfócitos B (Cd19+);
Maior tendência à linfocitose (CD3+) com freqüências
relativamente aumentadas tanto de linfócitos B quanto T;
Maiores freqüências de linfócitos T ativados medidos pela
expressão de HLD-DR;
Maiores freqüências de linfócitos B expressando TLR2 e;
Maiores freqüências de Monócitos expressando HLA-DR.
60
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69
ANEXOS
Anexo A - Termo de Consentimento livre e esclarecido aplicado aos
pacientes
CENTRO UNIVERSITÁRIO DO MARANHÃO
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO
MESTRADO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE ESCLARECIDO
Eu, ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------------
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------- (nome do sujeito da pesquisa,
nacionalidade, idade, estado civil, profissão, endereço, RG), estou sendo convidado a participar de
um estudo denominado Aspectos Imunofenotípicos e Epidemiológicos Envolvidos na Resposta
ao Tratamento da Hepatite C, cujos objetivos e justificativas são: Pesquisar os aspectos
imunofenotípicos, funcionais e epidemiológicos envolvidos na resposta ao tratamento da
hepatite C no Maranhão. Através de exames de sangue (citometria de fluxo) serão estudados os
marcadores fenotípicos e a freqüência de células T CD4+ CD8+, CD161, CD81, HLA-DR, em
pacientes respondedores e não respondedores ao tratamento para a hepatite C, fazendo um
estudo comparativo para verificar se há relação entre a resposta imunológica e carga viral. O
estudo pretende contribuir para melhorar o entendimento dos aspectos da resposta
imunológica envolvidos na patogenia da hepatite C, oferecendo novas alternativas para o
controle da doença, melhoria no diagnóstico e prognóstico dos pacientes infectados pelo vírus
HCV.
A minha participação no referido estudo será no sentido de: permitir a coleta de sangue
para o exame de citometria de fluxo. Fui alertado de que, da pesquisa a se realizar, posso esperar
alguns benefícios, tais como: avaliar através de exame específico como esta minha resposta
imunológica às doenças virais, especificamente hepatite C, contribuindo assim para fornecer
material de estudo à ciência para que no futuro novas alternativas e propostas de tratamento
estejam disponíveis para outras pessoas contaminadas pelo vírus.
Recebi, por outro lado, os esclarecimentos necessários sobre os possíveis desconfortos e
riscos decorrentes do estudo, levando-se em conta que é uma pesquisa, e os resultados positivos ou
negativos somente serão obtidos após a sua realização. Assim, o desconforto corresponde a uma
picada de agulha em veia do braço para realização do exame de sangue, sendo que não há
riscos previsíveis.
Estou ciente de que meu nome ou qualquer outro dado ou elemento que possa, de qualquer
forma, me identificar, será mantido em sigilo.
70
Também fui informado de que posso me recusar a participar do estudo, ou retirar meu
consentimento a qualquer momento, sem precisar justificar, e de, por desejar sair da pesquisa, não
sofrerei qualquer prejuízo à assistência que venho recebendo. Foi-me esclarecido, igualmente, que
não existem métodos alternativos de exames para esta pesquisa.
Os pesquisadores envolvidos com o referido projeto são Marcos Vinicius de Oliveira
Queiroga (Mestrando em Biologia Parasitária) eProf. Dr. Marcos Grisotto (Orientador), e com eles
poderei manter contato pelo telefone: (98) 3214-4277 ramal 4336. A apresentação deste termo e a
obtenção do consentimento serão realizadas pelo pesquisador Marcos Vinicius de Oliveira
Queiroga.
É assegurada a assistência durante toda pesquisa, bem como me é garantido o livre acesso
a todas as informações e esclarecimentos adicionais sobre o estudo e suas conseqüências, enfim, tudo
o que eu queira saber antes, durante e depois da minha participação. Os contatos serão estabelecidos
por telefone entre o pesquisador e o sujeito da pesquisa e/ou seu responsável, para as informações
que se fizerem necessárias. Caso haja necessidade de exame confirmatório, o sujeito da pesquisa será
encaminhado pelo pesquisador por transporte particular até o laboratório do CTA-Lira.
Enfim, tendo sido orientado quanto ao teor de tudo aqui mencionado e compreendido a
natureza e o objetivo do já referido estudo, manifesto meu livre consentimento em participar, estando
totalmente ciente de que não há nenhum valor econômico, a receber ou a pagar, por minha
participação. Fica estabelecido que receberei uma cópia deste documento.
No entanto, caso eu tenha qualquer despesa decorrente da participação na pesquisa, haverá
ressarcimento na forma seguinte: em dinheiro ou depósito em conta corrente médiante comprovação
material de eventual despesa. O ressarcimento inclui as despesas que o voluntário tem com a
participação na pesquisa e que não teria se não participasse. De igual maneira, caso ocorra algum
dano decorrente da minha participação no estudo, serei devidamente indenizado, conforme determina
a lei.
Nome e assinatura do sujeito da pesquisa
Contatos:
Endereço:
Telefone:
E-mail:
Local e data
------------------------------------------------ --------------------------------------------------------------
Marcos Vinicius de Oliveira Queiroga Prof. Dr. Marcos Grisotto
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Anexo B – Questionário Laboratorial e Epidemiológico
Nome:________________________________________________________
Endereço:_____________________________________________________
Sexo: o ( ) Masculino o ( ) Feminino
Idade: _______ anos
Cor da pele: o Branca o Parda o Negra
Dosagem de ALT: o T1: ______ o T2: ______ o T3: ______ o T4: ______ o T5: ______
Anti-HIV: o T1: o T4 ou T5:
HBsAg o T1: ______ o T4 ou T5: ______
Anti-HBc: o T1: ______ o T4 ou T5: ______
Estadiamento de lesão hepática e:
72
Descrição: _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Genótipo do HCV: o ( ) 1 o ( ) 2 o ( ) 3 o ( ) Outro
73
Anexo C – Parecer de Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa
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75
76
Anexo D – Comprovante de submissão
77
Anexo E – Manuscrito submetido a Revista Brasileira de Medicina Tropical