UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET NIŠ

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Stefan G. Nikolić

Morfološke promene na usnom aparatu larvi hironomida (Ordo Diptera,

Familia Chironomidae) izloženih nanočesticama titanijum dioksida

(ТiO2) u sedimentu

MASTER RAD

Niš, 2018

UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET NIŠ

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Stefan G. Nikolić

Morfološke promene na usnom aparatu larvi hironomida (Ordo Diptera,

Familia Chironomidae) izloženih nanočesticama titanijum dioksida

(ТiO2) u sedimentu

Master rad

Kandidat: Stefan Nikolić Mentor:

Broj indeksa: 252 Dr Đurađ Milošević Niš, 2018

UNIVERSITY OF NIŠ

FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS

DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY

Morphological changes of mouth apparatus on chironomids larvae (Ordo

Diptera, Familia Chironomidae) exposed to TiO2 nanoparticules in the

sediment

Master thesis

Candidate: Stefan Nikolić Mentor:

Students Reg. No. 252 PhD Đurađ Milošević

Niš, 2018

Biografija

Stefan Nikolić rođen je u Zaječaru 05. novembra 1991. godine, od oca Gorana i majke

Biljane.

Osnovnu školu ´´Ljubica Radosavljević Nada´´ u Zaječaru završava 2006. godine kao

odličan đak, a paralelno i osnovnu muzičku školu ´´Stevan Mokranjac´´ takođe u Zaječaru iste

godine. Nakon završetka osnovnog obrazovanja, 2006. godine upisuje srednju medicinsku školu

u Zaječaru, smer medicinska sestra-tehničar koju uspešno završava 2010. godine.

Osnovne akademske studije na Prirodno-matematičkom fakultetu u Nišu upisuje 2010.

godine na Departmanu za biologiju i ekologiju. 2016. godine završava osnovne akademske

studije i iste godine upisuje master akademske studije, smer Biologija.

Zahvalnica

Srdačno se zahvaljujem svom mentoru, dr Đurađu Miloševiću na pruženoj nesebičnoj pomoći prilikom realizaciji master rada. Želeo bih isto da iskažem ogromnu zahvalnost na svim datim savetima, pozitivnim kritikama, pomoći, lepim rečima i predavanjima, motivaciji i podršci tokom svih ovih godina mog studiranja. Hvala Vam !!! Takođe, zahvaljujem se kolegi Dušanu Đorđeviću za pomoć oko pisanja master rada, kao i doktorantima Dimitriji Savić i Aci Đurđeviću na dobronamernim sugestijama pri izradi master rada kao i za pomoć tokom eksperimentalne faze istraživanja i lepim trenutcima provedenim kako na terenu i u laboratoriji, tako i tokom studentskih dana. Želeo bih da se zahvalim kolegama: Milošu Krstiću, Vladici Jovanoviću, Petru Radojkoviću, Stefanu Petkoviću, Miroljubu Đurđanoviću, Nikoli Mladenoviću, Milanu Živkoviću, Milanu Stanisavljeviću, Petru Iliću, Aleksandru i Saši Cvetkoviću, Bogosavu Stojiljkoviću, Danilu Peniću kao i koleginicama: Hristini Zakić, Mileni Petrunović, Milici Žikić, Milici Stanković, Kristini Nikolić, Milici Stojičič, Andrijani Vukadinović, Dragani Anđelković, Evi Mitić, Tini Stojadinović, Nastasji Manić, Aleksandri Stojanović, Mariji Jovanović, Sandri Stanimirov, Jovani Stanković, Mileni Veličković, Mariji Nikić, Dariji Milenković, Bojani Bošković, Jeleni Kričak, Bojani Vidojković, na nezaboravnim studentskim danima. Takođe i mom društvu: Slobodanu Zlatkoviću, Dejanu Zlatkoviću, Milanu Ignjatoviću, Daliboru Pavloviću, Milici Đorđicović, Višeslavi Bocoković, Milanu Singuliroviću, Milošu Đorđeviću, Aleksandru Mitroviću, Aleksandru i Dušanu Đorđeviću, Darku Stanimirov, Milici Gocić, Nikoli Adamoviću, Tomici Kostić, Danijelu Petrunoviću, Milošu Najdanoviću, Ivani Stančić, Milanu Tomiću, Milanu Rašiću, Tijani i Tamari Peševski, Tamari Vukić kao i mnogim drugima na divnom prijateljstvu do sada, a nadam se da ćemo i u daljem životu biti tu jedni za druge kako u lošem, tako i u dobrom ! Onima kojima sam nenamerno zaboravio da se zahvalim, ovom prilikom se izvinjavam !

Ni manju zahvalnost ne dugujem čiki Dejanu i strini Danijeli, sestri Milici i bratu Aleksandru, deda Lazi i deda Bori, sestri Dragani Aleksić, , kao i pokojnim bakama Milici i Mirjani koji su uvek bili tu za mene !!! Ovaj završni master rad posvetio bih svojim divnim roditeljima

Biljani i Goranu i najdivnijoj sestri Ivani, kojima dugujem najveću

zahvalnost, ne samo tokom studiranja, nego i u dosadašnjem životu na

svemu !!! Hvala im na bezuslovnoj podršci, ne samo tokom svih ovih

godina školovanja, već najviše na pomoci da zajedno dodjemo do

ostvarenja mog sna, a to je da postanem profesor !!! HVALA VAM !!!

Sažetak

Larve vrste Chironomus tentans (Ordo Diptera, Familia Chironomidae) koriste se u

standardnim bioesejima po protokolima za testiranje toksičnosti supstanci u sedimentima

slatkovodnih ekosistema. Pokazalo se da izloženost toksinima tokom razvića larvi dovodi do

morfoloških promena na glavenoj čauri, a posebno mentumu, što je i bio predmet ovog

istraživanja.

Testirane su sredinski relevantne koncentracije nanočestica: 2.5; 25 i 250 mg/kg TiO2, a

ICP-MS analizom potvrđeno je da larve unose nanočestice u organizam. Metodom tradicionalne

morfometrije praćeno je osam morfoloških parametara na mentumu izloženih larvi i pokazalo se

da tri parametra statistički značajno variraju između tretmana.

Rezultati ukazuju na veliki potencijal vrste Chironomus tentans kao bioindikatora

zagađenja sedimenata nanočesticama.

Ključne reči: hironomide, bioesej, TiO2 nanočestice, ekotoksikologija, biomonitoring voda,

OECD protokol, tradicionalna morfometrija

Abstract

Chironomus tentans larvae (Ordo Diptera, Familia Chironomidae) are used in standard

bioessey researches for testing effects of toxic supstances in freshwater sediments. Many

researches indicates that exposure to toxic supstances have negative influence on larval

development stadium of chironomidae, specially, inducing morphological changes on mouth

apparatus of larvae, more precisely, deformities on larvae mentum.

Relevant concentrations of TiO2 nanoparticules were tested: 2.5, 25 i 250 mg/kg TiO2,

and ingestion of nanoparticules by larvae was confirmed by ICP-MS analysis. With traditional

morphometry method, eight morphological parameters were monitored on the mentum of

exposed larvae, out of which three showed statisticaly signifficant difference among treatments.

Results indicates that larvae of C. tentans have great potential as bioindicators of

sediment pollution level by toxic supstances.

Keywords: chironomidae, bioessey, TiO2 nanoparticles, ecotoxicology, water

biomonitoring, OECD protocol, traditional morphometry

Sadržaj

1. UVOD ......................................................................................................................................................... 1

1.1 Biomonitoring ..................................................................................................................................... 1

1.2 Testovi ekotoksičnosti ......................................................................................................................... 3

1.2.1 Morfometrijske analize u testovima toksičnosti .......................................................................... 6

1.3 Zagađenje akvatičnih ekosistema ....................................................................................................... 8

1.3.1 Nanotehnologija i nanоčestice u akvatičnom ekosistemu ........................................................ 10

1.3.2 Biološki efekti metala ................................................................................................................. 11

1.3.3 Titanijum dioksid - TiO2 .............................................................................................................. 12

1.4 Akvatični makroinvertebrati kao biondikatori .................................................................................. 13

1.4.1 Chironomidae u ekotoksikološkim istraživanjima ..................................................................... 15

1.4.2 Biološki testovi uticaja TiO2 na larve hironomida ...................................................................... 19

1.5 Chironomus tentans – opšte karakteristike ...................................................................................... 22

1.5.1 Životni ciklus familije Chironomidae .......................................................................................... 22

1.5.2 Građa larve Chironomidae ......................................................................................................... 23

2. CILJEVI ISTRAŽIVANJA ............................................................................................................................. 26

3. MATERIJALI I METODE ............................................................................................................................ 27

3.1 Test organizam .................................................................................................................................. 27

3.2 Testirana supstanca .......................................................................................................................... 29

3.3 Bioesej – postavka eksperimenta ..................................................................................................... 30

3.3.1 Tradicionalna morfometrijska analiza ........................................................................................ 31

3.3.2 ICP-MS analiza ............................................................................................................................ 32

3.4. Statistička obrada podataka ............................................................................................................ 32

4. REZULTATI I DISKUSIJA ............................................................................................................................ 33

5. ZAKLJUČAK .............................................................................................................................................. 41

Literatura .................................................................................................................................................... 42

1

1. UVOD

1.1 Biomonitoring

Životna sredina je sve ono što nas okružuje i svaka čovekova aktivnost je direktno ili

indirektno povezana sa njom. Kroz antropogenu aktivnost, čovekova sredina se suočila sa novim

i potencijalno opasnim supstancama koje do tada nisu bile prisutne u prirodi (Oehlmann i

Markert, 1999).

Okvirna procena je da u životnu sredinu dospeva oko 150.000 različitih supstanci

antropogenog porekla (Slobodnik, 2013). Neki od glavnih organskih zagađivača antropogenog

porekla su: herbicidi, insekticidi, policiklična aromatična jedinjenja, perhlorati i sl. Među

neorganskim jedinjenjima prisutni su zagađivači: metali, amonijak, fosfati, nitrati i nitriti (Wright

i Welbourn, 2002). Ovi zagađivači se drugačije nazivaju hazardne supstance, prema Okvirnoj

Direktivi o vodama (eng. Water Framework Directive–Directive 2000/60/EC) i među njima se

izdvajaju pojedine koje karakteriše visoka toksičnost, perzistentnost i visoka stopa

bioakumulacije. Sve ove zagađujuće supstance neophodno je uključiti u opšti monitoring, pri

čemu se formiraju liste prioritizacije na osnovu stepena štetnosti. Dozvoljene koncetracije ovih

supstanci u akvatičnim ekosistemima su određene zakonskim regulativama, a osnovni

regulatorni dokument je Direktiva o standardima u vodenim ekosistemima (eng. Environmental

Quality Standards Directive - EQS, 2008/105/EC).

Praćenje stanja životne sredine u cilju njenog očuvanja i sprečavanja štetnih efekata

ksenobiotika na celokupan živi svet podrazumeva skup metoda koje se mogu objediniti

terminom monitoring. Prema definiciji Programa za životnu sredinu Ujedinjenih nacija (eng.

United Nations Environmental Program - UNEP) monitoring predstavlja svako ponovljeno

merenje, sa definisanim ciljem, jednog ili više hemijskih ili bioloških parametara prema unapred

određenom rasporedu u prostoru i vremenu, koristeći metode koje su uporedive i

standardizovane. Monitoring omogućava kontinuiranu kontrolu i prepoznavanje neprirodnih

promena u spoljašnoj sredini. Dva osnovna tipa monitoring, kojima se može za proceniti rizik od

2

dejstva zagađujućih materija na organizme i pratiti kvalitet životne sredine, su hemijski i biološki

monitoring (De Zwart, 1995).

Hemijski monitoring daje informacije o pristustvu i nivoima kontaminanata, čime se

omogućava procena izloženosti organizama, međutim ovaj vid monitoringa ne govori ništa o

efektima koje kontaminanti imaju na biološke sisteme (Lam, 2009). Njime se dobija informacija

o nivou određene grupe zagađivača u životnoj sredini i podaci o izloženosti organizama

ksenobioticima.

Definisanje kvaliteta sredine ili procena ugroženosti može se utvrditi i analizom strukture

živih sistema, polazeći od pojedinačnih organizama pa sve do ekosistema (Lam, 2009). U

ovakvom biološkom monitoringu (biomonitoring) koriste se živi organizmi da bi se procenilo

stanje životne sredine (Despotović, 2013). Metode ovog monitoringa imaju niz prednosti:

praćenje dugoročne izloženosti ekosistema, merenje efekata biodostupnosti ispitivanih jedinjenja

u korelaciji sa njihovom koncetracijom i toksičnošću u organizmu, integrisanje rezultata na

velikom broju jedinki (De Zwart, 1995). Bioindikatorske vrste oslikavaju nivo zagađenja u

ekosistemu, kao i dugoročni uticaj zagađenja (Wayker i Deshmukh, 2012).

Van Gestel i Van Brummelen (1996) predložili su četiri različita nivoa biomonitoringa:

➢ suborganizmalni nivo – uključuje korišćenje biomarkera, pri čemu je na nivou

biohemijskih i fizioloških procesa moguće utvrditi odstupanje od zdravog stanja;

➢ organizmalni nivo – uključuje korišćenje organizama kod kojih se prati

preživljavanje, rast, reprodukcija i slični parametri u laboratorijskim testovima toksičnosti;

➢ populacioni nivo – korišćenjem biondikatora prate se efekti promene u genetičkoj

strukturi, starosnoj strukturi ili gustini populacije;

➢ ekosistemski nivo – promene u sastavu, gustini i diverzitetu vrsta mogu ukazati na

efekte zagađenja na biocenoze.

3

Biomarkeri predstavljaju merljive promene parametara bioloških sistema (koji mogu biti

hemijskog, fizičkog ili biološkog tipa) koje reflektuju interakciju između biološkog sistema i

određenog zagađivača (Who, 1993). Glavna prednost korišćenja biomarkera je mogućnost

detekcije subletalnih bioloških efekata, koji predstavljaju rani upozoravajući signal u vidu

odgovora koji se prvo dešava na fiziološkom ili molekularnom nivou za kojim slede promene na

višim nivoima biološke organizacije (Lam, 2009).

Biondikator je pojedinačni organizam koji svojim prisustvom, odsustvom ili ponašanjem

daje informacije o uslovima u sredini u kojoj živi.

Idealni bioindikatorski organizmi bi trebalo da zadovolje naredne kriterijume: mogućnost

akumuliranja visokih koncetracija zagađivača bez visoke stope mortaliteta; sesilan način života

ili slaba pokretljivost; široka rasprostranjenost; kratak životni vek; visok fekunditet, visoka

abundanca; jednostavno uzorkovanje i gajenje u laboratorrji (Zhou et al, 2008).

Biomonitoring se sprovodi primenom dva različita pristupa:

➢ in situ (monitoring direktno u životnoj sredini na određenom lokalitetu),

➢ ex situ (proučavanje uticaja supstanci u laboratorijskim uslovima).

1.2 Testovi ekotoksičnosti

Testovi ekotoksičnosti su biološki eksperimenti (bioeseji) u kojima se testira uticaj

hemikalija ili određenih sredinskih faktora na odrećene test vrste, tj. bioindikatore. Testovi

ekotoksičnosti sastavni su deo ex situ bioloških monitoringa. Koriste se u proceni rizika novih i

postojećih hemikalija kao i za sprovođenje monitoringa stepena zagađenosti okoline tj. kvaliteta

životne sredine (Ratte, Hammers-Wirtz i Cleuvers, 2003).

U svakom testu se meri efekat ispitivanog jedinjenja kroz praćenje jedne ili više varijabli,

koje se nazivaju krajnje tačke (eng. ´´endpoints´´). Efekti koji se prate mogu biti letalni ili

subletalni. Termin ´´endpoint´´ se odnosi na biološki parametar koji se meri, odnosno posmatra

(preživljavanje, broj jaja, veličina ili težina, nivo enzima …). Kod kvantitativnih varijabli (npr.

4

mortalitet) subletalni efekat je iskazan u vidu promena broja jedinki koje su pogođene, a kod

kontinuiranih varijabli (npr. stopa rasta) iskazan je procentom promene prosečnog nivoa

varijable tj. krajnje tačke. Kod oba tipa praćenih varijabli rezultati se upoređuju sa kontrolom

(Rate, Hammers-Wirtz i Cleuvers, 2003). Kontrola je referentno stanje bez prisustva polutanta tj.

ksenobiotika.

Biološki testovi sprovode se na osnovu standardnih protokola, te se mogu međusobno

upoređivati i moguće je proveriti tačnost izvedenog testa ponovnim izvođenjem pod istim, tačno

defeinisanim uslovima (Rate, Hammers-Wirtz i Cleuvers, 2003).

Postoje dve vrste ekotoksikoloških testova (Markert et al., 2003):

➢ akutni testovi (kratkoročni testovi - posmatrani su parametri poput mortaliteta ili

imobilizacije jedinke; predmet istraživanja su direktno organizmi, tj. jedinke);

➢ hronični, tj. prolongirani testovi (dugoročni testovi - posmatrane promene parametra koje

se odigravaju u određenom vremenskom periodu i tiču se efekata toksikanata na stopu

reprodukcije, rasta ili neki drugi fiziološki proces; predmet istraživanja su viši nivoi

ekološke organizacije - populacije)

Obzirom da se ekotoksikološki testovi koriste u kontroli hemikalija i proceni kvaliteta

komponenti životne sredine, svaki standardizovani test mora da da približno iste rezultate u

različitim laboratorijama i u istoj laboratoriji u različitom vremenu. Da bi se dostigla visoka

ponovljivost i konzinstentnost uslovi testa moraju da budu striktno regulisani. Kako bi rezultati

ekotoksikoloških testova bili verodostojni, istraživanja se vrše prema standardizovanim načelima

Dobre Laboratorijske Prakse (eng. Good Laboratory Practice - GLP) (OECD, 1998b), kao i po

principima i standardima koje su definisale internacionalne organizacije: OECD (eng.

Organisation of Economics Cooperation and Development), CEN (eng. Comite of Europende

Normalisation) i ISO (eng. International Organization for Standardization) (Ratte, Hammers-

Wirtz i Cleuvers, 2003). Od 1980-ih različite organizacije (OECD, CEN, ISO, ASTM) razvijaju

pravilnike za ovakve testove.

5

Ukoliko se test ponavlja nekioliko puta ili se sprovodi u istom trenutku na različitim

mestima, rezultati neće biti potpuno isti usled biološke varijabilnosti test organizama koji su

uključeni, kao i zbog određenih varijabli koje je nemoguće potpuno kontrolisati u laboratorijskim

uslovima. Uzroci varariranja u ekotoksikološkim testovima mogu biti genetske i ekološke

prirode (Ratte, Hammers-Wirtz i Cleuvers, 2003).

Prilikom postavljanja eksperimenta, pojedine ekološke faktore je lako kontrolisati, kao

što je temperatura, svetlost i tip podloge. Postoje faktori koje je teže kontrolisati (npr.

snabdevanje hranom približno istog kvaliteta), a koji imaju veliki uticaj na razvoj test

organizama i na efekte eksotoksikanata (Soares i Calow 1993; Ratte, Hammers-Writz i Cleuvers,

2003). Pored toga, postoji prirodna varijabilnost kod samih organizama, kaja je posledica

genetske varijabilnosti. Sve ove varijacije izazivaju “šum” u rezultatima, jer mogu zamaskirati

efekte ispitivane supstance, pa se tokom sprovođenja eksperimenata teži svodjenju ove

varijabilnosti na minimum.

Akvatična toksikologija bavi se proučavanjem jedinjenja koja se ispuštaju u akvatične

ekosisteme, a to mogu biti sintetičke i prirodne materije. Proučava se efekat i uticaj na akvatične

organizme na raznim nivoima organizacije: od subcelularnog, preko nivoa jedinke, do nivoa

zajednice i čitavog ekosistema (Rand i Petrocelli, 1985).

Tridesetih godina prošlog veka, krenuo je intenzivan razvoj ekotoksikologije voda, što je

započeto akutnim testovima na ribama. Naredne dve decenije razvili su se tzv. bioeseji u

“teglama za zimnicu”, gde se javila potreba za standardizacijom testiranja pa su tegle masovno

počele da se koriste za testiranje, a metodologija je usklađivana u različitim istraživačkim

institucijama (Rand i Petrocelli, 1985).

Biološki testovi su razvijani tokom decenija, a uobičajeni su: standardizovani test akutne

toksičnosti (obično trajanja od 24 do 29 sati) i test hronične toksičnosti (obično traje 7 i više

dana) (Moore, 2006). U ovim testovima mere se parametri, kao što su: stopa preživljavanja, rast,

reprodukcija i sl., pri različitim koncentracijama ispitivane supstance uz obavezan kontrolni test.

6

Za procenu rizika zagađenja vodene sredine od strane pojedinih polutanata u biološkim

testovima koriste se mnoge vrste algi, beskičmenjaka i riba, a najčešći standardni akvatični test

organizmi su: Pimephales promelas (vrsta klena), dafnije-račići iz reda Cladocera ( npr. Daphnia

magna), biljni komarci (Chironomus tentans, Chironomus riparius) i kalifornijska pastrmka

(Oncorhynchus mykiss) (Rand i Petrocelli, 1985).

Pojedine zelene alge (npr. Chlorella vulgaris), koriste se kao standardni test organizmi

predstavljajući primarne producente. U ulozi primarnih konzumenata koriste se Daphnidae, ali i

predstavnici zglavkara, među kojima je i grupa hironomida, čije se vrste ne koriste samo u

proceni stanja zagađenosti vodenih ekosistema određenim toksikantima, več se rade i studije u

kojima se proučava prirodna varijabilnost i prilagođenost larvi pojedinih vrsta hironimida na

promenu različitih sredinskih faktora (kiseonik, osvetljenost, ishrana i sl.) (Markert et al. 2003).

1.2.1 Morfometrijske analize u testovima toksičnosti

Morfometrija se odnosi na kvantitativnu analizu forme, odnosno koncepta koji obuhvata

veličinu i oblik (Breno, Leirs i Van Dongen, 2011). Metode morfometrije primenjuju se u

mnogim naučno istraživačkim radovima, u biologiji ove metode korišćene su za proučavanje

telesnih mera i oblika neke vrste. Jedinke određene vrste u populaciji imaju karakteristične

telesne mere uz manje ili veće varijacije. Različiti faktori utiču na promenljivost morfoloških

parametara kod jedinki, kao što su uslovi sredine, mutacije ili razvojne promene u obliku, prema

tome glavni cilj morfometrije je statistički ispitati uticaj različitih faktora na promenu oblika.

Morfometrijske analize mogu se podeliti na

1. tradicionalne

2. geometrijske

7

1.2.1.1 Tradicionalna morfometrija

Tradicionalna morfometrija se zasniva na jednostavom merenju distanci, uglova i

površina delova nekog organizma. Ona predstavlja spoj kvantitativne morfologije, koja daje

ulazne podatke i multivarijantnih statističkih metoda kojima se obrađuju ti podaci.

Metode tradicionalne morfometrije uključuju merenje vrednosti datih parametara bez

uzimanja u obzir geometrijske konfiguracije među datim parametrima (Holland, 2009).

Analiziraju se mere kao što su dužina, širina, masa i proporcije, prema tome tradicionalne

morfometrijske metode su uopšteno mere veličine. U slučajevima kada su relativne ili apsolutne

veličine od značaja, metode tradicionalne morfometrije pokazale su se izuzetno korisnim, kao što

je istraživanje rasta, te kada su mere veličine bitne u istraživanjima funkcionalne morfologije.

Metode tradicionalne morfometrije mogu biti izuzetno korisne u biomonitoringu i proučavaju u

kojoj meri pojedini zagađivači imaju uticaja na morfološke promene jedinki u ekotoksikološkim

testovima (Vidović, 2017).

1.2.1.2 Geometrijska morfometrija

Metode geometrijske morfometrije najčešće se koriste u istraživanjima evolucione i

razvojne biologije. Ove metode pružaju veliki izbor analitičkih alata koja se koriste u

proučavanju asimetrije, takođe nude fleksibilan pristup za kvantifikovanje morfoloških varijacija

koje se kasnije mogu koristiti za analizu asimetričnosti. Ova metoda omogućuje analizu celog

oblika jedinke, nezavisno od veličine, a rezultati daju jasna logička razdvajanja veličine i oblika

koji su konceptualno različiti jedni od drugih iako mogu biti u korelaciji bioloških podataka

(Klingenberg, 2015). Stoga se ove metode, kao sofisticiranije i preciznije preporučuju u

biomonitoringu u kome se prate vrlo suptilni efekti zagađujućih supstanci.

8

1.3 Zagađenje akvatičnih ekosistema

Slatkovodni ekosistemi su najveći rezervoari slatke vode za čovečanstvo! Ovi ekosistemi

su značajni transportni koridori, imaju veliki značaj u proizvodnji energije, a značajan su i izvor

hrane.

Ovi ekosistemi su u stalnoj biohemijskoj dinamici, čiji intenzitet zavisi od niza abiotičkih

i biotičkih faktora koji prostorno i vremenski neprekidno variraju. Na dinamiku procesa u

ekosistemu utiču prirodni faktori iz spoljašne sredine (npr. atmosferske padavine), ali i faktori

koji su rezultat ljudskih aktivnosti koje mogu imati negativne posledice na vodene ekosisteme.

Zagađenje vode je globalni ekološki problem (S. Simić i V. Simić, 2009). Zagađena

voda je element životne sredine koji je izmenjen i kvantitativno i kvalitativno odstupa od

prirodnih, fizičkih, hemijskih i bioloških osobina i izaziva nepoželjne posledice u vodenim

ekosistemima, pri čemu nanosi štetu biotičkoj komponenti, ljudskom zdravlju i ograničava

mogućnost njene upotrebe.

Čovekovim direktnim i indirektnim uticajem menja se struktura i funkcija vodenih

ekosistema (Lazarević et al. 2010). Delovanjem čoveka kroz urbanizaciju, industriju,

poljoprivredu i menjanje tokova reka, dolazi do promena u vodenim ekosistemima koje dovode

do destrukcije ekosistema, fizičkih promena staništa, promena u hemiji vode i promena u sastavu

vrsta (Li et al. 2010).

Vodeni ekosistemi u urbanoj i suburbanoj okolini su u velikoj meri pod uticajem čoveka i

u njih dospevaju velike količine zagađujućih materija. Bilo koja materija u velikim i neprirodnim

količinama, koja se nađe u vodi može da bude zagađujuća materija (Simić i Simić, 2009).

Trofičnost vodenih ekosistema, tj. nivo organske produkcije, zavisi od tipa i intenziteta prometa

materije, od protoka energije i visine organske produkcije. Antropogeni uticaj dovodi do

povećanja stepena zagađenja, pri čemu se povećava eutrofičnost vodenih ekosistema. Usled

različitih tipova zagađenja, trofički odnosi, tačnije odnosi u lancima ishrane, mogu biti

poremećeni što može imati posledice po populacije različitih vrsta u biocenozi. Izvori zagađenja

9

mogu biti prirodni (vulkanske erupcije, produkti požara…) ili antropogeni i u osnovi se mogu

podeliti u dve grupe (Simić i Simić, 2009):

➢ tačkasta zagađenja

➢ difuzna zagađenja

Komunalne otpadne vode, otpadne vode iz industrija i fabrika, kao i drugi izvori koji

direktno ispuštaju zagađujuće materije kroz cevi i kanale u vodene ekosisteme definisani su kao

tačkasti izvori zagađenja (eng. point source pollution). Uticaj ovakvih izvora zagađenja se u

veliko meri oseća u vodenim ekosistemim, međutim lako ih je uočiti, registrovati i moguće ih je

kontrolisati zakonodavno (Simić i Simić, 2009).

Difuzni izvori zagađenja (eng. non point source pollution) su prostorno široko

rasprotranjeni, tj. ne potiču iz jedne tačke. Javljaju se ređe i u kraćim vremenskim intervalima od

izvora tačkastog zagađenja (Simić i Simić, 2009). Nastaju kada se padavine kreću kroz i preko

zemljišta, noseći sa sobom zagađenja koja dospevaju do podzemnih voda ili do većih tokova

reka, jezera i močvara pri čemu ostavljaju veći stepen posledica u ovim ekosistemima. Glavni

izvori difuznog tipa zagađenja su: otpadna voda sa urbanih površina (ulice, travnate površine,

bašte…), veštačka đubriva i pesticidi koji se spiraju sa poljorpivrednih površina, otpadna voda

pri eksploataciji ruda (Simić i Simić, 2009).

Zagađujuće materije su: različita organska i neorganska jedinjenja, sedimenti, joni teških

metala, neorganski nutrijenti, agensi koji izazivaju bolesti, radioaktivne supstance i topla voda, a

prepoznavanje tipa zagađivača je bitno za prevenciju i prečišćavanje voda kao i za konzervaciju

životne zajednice tog ekosistema (Simić i Simić, 2009).

10

1.3.1 Nanotehnologija i nanоčestice u akvatičnom ekosistemu

Nanotehnologija je interdisciplinarna nauka koja se bavi proučavanjem materija na

nanoskali, pokušavajući da otkrije mogućnosti sinteze, modifikacije i manipulacije materija ovih

dimenzija, dimenzija manjih od milijarditog dela metra. Američka nacionalna nanotehnološka

inicijativa (eng. US National Nanotechnology Initiative) definiše nanotehnologiju kao polje koje

se bavi sistemima i strukturama koje ispoljavaju nove, veoma unapređene fizičke, hemijske i

biološke osobine, i mogu da ulaze u specifične procese koji su posledica njihove nano-veličine

(http://www.nano.gov/nanotech-101/what).

Vizija budućnosti je da se nanotehnološka i biotehnološka otkrića ujedine kako bi nastali

novi nanosistemi i uređaji koji će funkcionisati po biološkim principima (Moore, 2002; Perkel,

2004).

Zabrinutost u protekloj deceniji raste među ekotoksikolozima i patolozima zbog

posledica koje fabrički proizvedeni materijali mogu da izazovu u životnoj sredini. Osim

organskih ksenobiotika, metala i vulkanskog pepela, organizmi nisu bili u dodiru sa

nanomaterijalima u meri u kojoj se susreću danas, pa su njihovi mehanizmi odbrane od

potencijalanih negativnih dejstava ovih nanomaterijala nerazvijeni.

Biološka aktivnost ovih materija zavisi od njihovog naelektrisanja i hemijske

reaktivnosti. Priroda i protok nanočestica kroz ekosisteme nije poznata, jer su one dospele

veštački u prirodu tek pre nekoliko decenija nakon industrijske revolucije. Nekada su jedine

nanočestice u prirodi bile produkt prirodnih procesa: vulkanske prašine, morske soli i produkata

prirodnog sagorevanja (šumski požari) (Moore, 2006). Sama veličina nanočestica utiče na nivo

njihove toksičnosti i patogenost, a treba posvetiti pažnju njihovoj biorazgradnji, jer je to možda

jedan od najsigurnijih načina za kontrolu toksičnosti ovih supstanci u životnoj sredini (Crane i

Handy, 2007).

11

Kod terestričnih organizama, najčešći put unosa nanočestica je putem inhalacije ili

ingestije (Moore, 2002; Brigger et al., 2002; Colvin, 2003; Colvin,2004; Dowling, 2004;

Howard, 2004; Warheit, 2004). Postoje dokazi da sitne čestice nastale sagorevanjem izazivaju

posledice po ljudsko zdravlje (Dowling, 2004; Colvin, 2003, Colvin, 2004; Warheit, 2004;

Howard, 2004; Moore, 2002).

Moore (2006) i Crane i Handy (2007) su izučavali potencijalne biološke efekte

nanočestica i nanomaterijala na organizme u vodenoj sredini. Akvatični organizmi su u dodiru sa

vodom celom površinom tela i mogući su dodatni mehanizmi unosa od onih koji su mogući u

terestričnoj sredini, kao što je prenos preko škrga i površinskih epitela. Na ćelijskom nivou,

putevi ulaska su obično endocitoza ili kaveolarna endocitoza (Moore, 2006).

1.3.2 Biološki efekti metala

Metali predstavljaju poseban tip polutanata koji se u rekama mogu naći putem različitih

aktivnosti, ali najčešće spiranjem podloge rečnog korita ili aktivnostima čoveka (Waykar i

Deshmukh, 2012; Sakan i sar., 2011). Poljorpivreda, industrija i rudarstvo su glavni izvori

zagađenja metalima (Kumar Singh i sar., 2007). Značaj metala kao zagađivača akvatičnih

sistema ogleda se u njihovoj sposobnosti da prodru u organizme i akumuliraju se duž lanaca

ishrane. Najznačajniji metali sa aspekta zagađenja vode su: Zn, Cu, Pb, Cd, Hg, Ni i Cr. Teški

metali kao što su živa, kadmijum, olovo i nikl, kao i policiklična aromatična jedinjenja, odlikuju

se visokim stepenom genotoksičnosti (Johns i Luoma, 1990).

Teški metali u obliku finih čestica prašine dospevaju u atmosferu, odakle se talože u

vodama i tlu. U vodama se brzo razređuju i talože se kao teško rastvorljivi karbonati, sulfati i

sulfidi na dnu vodenih ekosistema. Kada se adsorpcijski kapacitet sedimenta iscrpi, raste

koncetracija jona metala u vodi. Kruženje teških metala u prirodi zavisi od promena kojima

metali podležu. Smatra se da bentosne vrste u velikoj meri akumuliraju metale jer su izloženije

njihovom delovanju od vrsta koje naseljavaju više slojeve vode (Jarić i sar., 2011). Ove vrste su

stoga pogodne kao bioindikatori zagađenja akvatičnih sredina metalima. Zbog toga što sa

12

lakoćom mogu da prodru u telo i izazovu negativne efekte, pre svega oksidativni stres, značajno

je proučiti mehanizme toksičnosti ovih elemenata i bolje razumeti načine delovanja na

organizme.

1.3.3 Titanijum dioksid - TiO2

Titanijum je otkriven u Cornwall-u, Velika Britanija, od strane William Gregor-a još

1791. Naziv je dobio po uzoru na Titane iz grčke mitologije. Široko je rasprostranjen i sačinjava

čak 0.44% Zemljine kore. Ima ga u skoro svim stenama, pesku, glini i zemljištu. Prisutan je i u

biljkama i životinjama, vodenim ekosistemima, dubinskim iskopinama, pa čak i na meteorima i

zvezdama. Dva osnovna minerala koji se koriste za izolovanje titanijuma su ilmenit i rutil. Ovaj

metal je prvi put izolovan kao čist 1910. od strane metalurga Matthew A. Hunter-a redukcijom

titanijum tetrahlorida (TiCl4) sa natrijumom u čeličnom cilindru. Najčešća forma je rutil, koji je

ujedno i najstabilnija forma. Anatas i brukit prelaze u rutil putem zagrevanja (Kazuhito i sar,

2005).

Titanijum dioksid (TiO2), je prirodni oksid titanijuma, ako se upotrebljava kao pigment

naziva se titanijumsko belo ili beli pigment. Titanijum dioksid ima široku primenu kao sastojak

boja, kozmetičkih proizvoda ali i u proizvodnji i bojenju hrane, gde ima oznaku E171

(Dubrovinskaia, 2011).

Slika 1. Strukturna formula titanijum dioksida

(https://sr.wikipedia.org/wiki)

13

U prirodi se nalazi u obliku minerala rutila, dok se za potrebe industrije može sintetisati

putem hloridnog procesa, kada se ruda redukuje ugljenikom, zatim oksiduje hlorom, pri čemu

nastaje titanijum tetrahlorid. Nastali proizvod se destilira i oksidira kiseonikom, pri čemu nastaje

čisti titanijum dioksid, uz regeneraciju hlora. U periodu između 1916. i 2011. godine

pretpostavlja se da je sintetisano oko 165.050. 000 metričkih tona titanijum dioksida širom sveta,

u nano, mikro ili krupnom obliku (Jovanović, 2015).

Ako se upotrebljava kao pigment, naziva se titanijumsko belo, beli pigment 6 ili CI

77891. Prirodno pronađeni oksidi se kopaju u rudnicima, a služe i kao komercijalni izvor

titanijuma. (Fernández-García i Rodriguez, 2007). Ima široku upotrebu: kao sastojak boja, za

bojenje hrane (ima oznaku E171), pri proizvodnji plastike i sličnim proizvodima zbog svoje

otpornosti na ultraljubičasto zračenje (apsorbuje UV zračenje efikasno pretvarajući UV svetlost u

toplotu). Zbog takvih osobina, TiO2 se koristi i u većini krema za sunčanje. Takođe uz UV

zračenje nano čestice titanijum dioksida mogu izazvati nastanak radikala sa antimikrobnim

dejstvom, zahvaljujući ovome koristi se u medicini, u prehrambenoj industriji i kontroli kvaliteta

vode (Ravishankar Rai i Jamuna Bai, 2011). Međutim usled prevelikog izlaganja UV zracima,

TiO2 (E171) može stvoriti i grupu slobodnih radikala koje mogu izazvati oksidativni stres i

oštetiti pojedine organele u ćeliji (Haynes et al., 2017). Fotokatalitičke osobine titanijum

dioksida je otkrio Akira Fudžišima 1967. godine, a otkriće je objavio 1972. U njegovu čast,

proces koji se odvija na površini kristala titanijum dioksida se naziva "Honda-Fudžišima efekt".

1.4 Akvatični makroinvertebrati kao biondikatori

Akvatične makroinvertebrate su organizmi koji velikim delom životnog ciklusa

naseljavaju vodene ekosisteme (Rosenberg i Resh, 1993). Pojedine vrste mogu živeti pri površini

vode (neuston), druge naseljavaju dno (bentos), ali mogu živeti i među submerznom vegetacijom

(epifiton). Obzirom na veliki potencijal, makroinvertebrati su temeljno istraživana grupa, pa je za

većinu vrsta poznat način života, životni ciklus, preferencije za ishranu, stanište. Mnoge vrste su

slabo pokretne, žive sesilnim načinom života, imaju široku rasprostranjenost i u životnoj sredini

14

su osetljive na promene (Paunović, 2007; Marković, 2014) te su se pokazale kao izuzetno

zahvalne za korišćenje u biomonitoringu.

U grupi akvatičnih makroinvertebrata, familija Chironomidae je najširije rasprostranjena,

česta i najbrojnija grupa insekata (makroinvertebrata) u slatkovodnim ekosistemima (Armitage i

sar, 1995).

Chironomini su hironomide čije larve su poznate kao ´´krvavi crvi´´ (eng. bloodworm),

zbog svoje izrazito crvene boje usled prisustva hemoglobina. Ovo je najznačajnija grupa u

familiji hironomida u stajaćim vodama i mogu biti brojne u jako zagađenim sredinama. Značajne

su sa ekološkog, ekotoksikološkog i medicinskog aspekta, pa se sve veći značaj daje njihovoj

biologiji i ekologiji. Detaljna ekologija i životni ciklusi mnogih vrsta još uvek su nepoznati i

mnoge studije se još površno bave njima, a razlog je teška determinacija velikog broja vrsta, kao

i mali broj stručnjaka koji su iz ove oblasti (Pinder, 1986). Prvi pokušaj da se sumira ekologija

hironomida bio je načinjen od strane Thienemann-a (1954).

U ovoj grupi, rod Chironomus najčešći je u laboratorijskim eksperimentima, dok se vrsta

Chironomus tentans najčešće koristi u ekotoksikološkim ispitivanjima i proceni uticaja hemijskih

supstanci na životnu sredinu. To je vrsta čija je populacija trenutno uspešno uspostavljena u

laboratoriji na Prirodnom-matematičkom fakultetu u Nišu (slika 2).

Slika 2. Imago Chironomus tentans u laboratoriji

Foto: Dimitrija Savić (pmf u Nišu)

15

1.4.1 Chironomidae u ekotoksikološkim istraživanjima

Kao posledica zagađenja vodene sredine specijski diverzitet faune u ovim staništima se

postepeno smanjuje, ali se favorizuju organizmi koji su tolerantni na određeni stepen zagađenja,

poput larvi pojedinih vrsta hironomida, koje postaju glavna komponenta zajednice

makroinvertebrata u ovim staništima. Larve hironomida igraju veoma važnu ulogu u lancima

ishrane vodenih ekosistema. Njima se hrane mnoge insektivorne vrste riba kao i pojedine vrste

beskičmenjaka. Larve održavaju i vodeno stanište čistim, konzumirajući i reciklirajući organsku

materiju (Ali, 1991).

Larve familije Chironomida (Diptera) su pogodne za biološka istraživanja sedimenata

slatkovodnih ekosistema iz nekoliko razloga:

➢ većinu svog života larve provode u površinskim sedimentimma, pa su izložene su

uticaju toksikanata direktnim fizičkim kontaktom ili putem ingestije;

➢ imaju kratak životni ciklus, pa je u laboratoriji moguće proizvesti deset ili više

generacija godišnje;

➢ izuzetno brojne u bentosu;

➢ relativno osetljive na polutante.

Iz navedenih razloga, larve hironomida se sve više koriste kao test organizmi u biološkim

istraživanjima (Giesy et al., 1988; Pascoe et al., 1990; Timmermans et al., 1992)

Monitoringom populacije ovih organizama možemo steći saznanja o kvalitetu vode, kao i

efektima prirodnih i antropogenih delovanja. Stresori koji utiču na acidifikaciju, degradaciju

staništa i organsko zagađenje mogu se pratiti i kontrolisati uključuvanjem hironomida u

programe bioprocene (Coffman, 1995). Larve mogu preživeti variranja temperature, pH

vrednosti, koncentracije kiseonika i nivo zagađenja. Jedinke iz familije Chironomidae su odlični

indikatori u detekciji različitih opterećenja staništa i za procenu kvaliteta vode (Lenat, 1983).

16

Deformacije i fluktuiranje asimetričnosti morfoloških karakteristika kod larvi hironomida

prepoznati su kao osetljivi indikatori biološkog stresa i često se koriste u studijama koje se bave

procenama negativnog uticaja čoveka na životnu sredinu. Najčešće korišćene vrste su

Chironomus riparius i Chironomus tentans, na kojima su u jednom takvom istraživanju

posmatrani efekti polutanata iz reke u kojoj je ova populacija živela. Različite koncentracije

olova i 4-nonilfenola pronađene su u jedinkama ove populacije, među kojima je uočena pojava

deformacije usnog aparata (Aramborou et al. 2012).

Kod kasnijih stupnjeva larvenog stadijuma Chironomidae takođe je moguće uočiti

oštećenja usnog aparata, posebno mentuma, kada su se javljala oštećenja zuba kao rezultat

reakcija na prisustvo polutanata u životnoj okolini. Ovo istraživanje sprovedeno je među 25

rodova Chironominae, Orthocladinae i Diamesinae u oblasti Nova Škotska u Severnoj Americi.

Stepen oštećenja kao i tip deformacije poslužili su kao indikatorske karakteristike pomoću kojih

je bilo moguće proceniti subletalnu dozu toksikanata (testirane su različite koncetracije teških

metala, radioaktivnosti, organofosfata, organohlorida i sličnih ksenobiotika) (Bird, 1994).

Prvi larveni stupanj kod Chironomus riparius koristi se kao najpogodniji za početak

ekotoksikoloških studija koje prate hroničnu toksičnost sedimenta, gde se prati njihov razvoj do

pojave adulta. U većini slučaja vodenih ekosistema koncentracija polutanata i dalje je ispod

letalne doze i može se odrediti tokom vremena pomoću ekotoksikoloških studija. Chironomus

riparius poznat je kao pouzdan indikator stresa usled zagađenja okoline, a otpornost larvi raste

kako i same larve napreduju ka višem stupnju (Watts i Pascoe, 1998).

U poslednje vreme, više pažnje se poklanja larvama hironomide kao i njihovoj

osetljivosti na promene životne sredine. Deformacije koje se razvijaju u odgovoru na prisustvo

toksikanata, označene su kao jako pogodni biomarkeri za određivanje toksičnosti sedimenta i

prisutnost mikropolutanata (Hamilton i Saether, 1971).

U studiji u kojoj je proučavano dejstvo metala na razvoj larvi Chironomidae, različite

koncetracije teških metala u sedimentu, poput bakra i olova, pokazale su štetno dejstvo

izazivajući deformitete delova usnog aparata kod hironomida. Larve trećeg i četvrtog stupnja

17

pokazale su najveći stepen deformacija zuba mentuma. Podloga na kojoj su larve bile uzgajane u

eksperimentalnim uslovima, bila je dijatomejska zemlja, koja se nije pokazala kao najbolji izbor

zbog toga što je izazivala visok stepen mortaliteta larvi (>60%) nezavisno od dejstva teških

metala (Bisthoven i Ollevier, 1998).

Povećanje koncetracije organske materije koje dospevaju u vodene ekosisteme putem

otpadnih voda često mogu dovesti do promena strukture životne zajednice tog ekosistema.

Kombinacije različitih polutanata i komponenti organske materije u potocima Severne Karoline

podstiču pojavu hironomida kao dominantne vrste u zajednici. Na ovaj način larve Chironomidae

možemo smatrati odličnim indikatorskim vrstama i daljom analizom zajednice bentosa možemo

utvrditi u kojoj meri je prisutnost organskog zagađenja uticala na promenu strukture zajednice.

Sa druge strane, uticaj toksičnih jedinjenja, poput teških metala ili drugih polutanata, najbolje je

posmatrati kroz stepen deformacija koje izazivaju na posmatranoj vrsti (Lenat, 1993).

Prema Warwick-u i Tisdale-u (1998), koncentracija jona teških metala, pesticida,

radioaktivnih komponenti i pojedinih kancerogena kod zajednice hironomide u larvenom

stadijumu izazvale su veliki broj poremećaja kod mandibula, premandibula, labralnih lamela i

antena.

Deformiteti mentuma uzimaju se kao najčešći parametri koji se prate tokom sprovođenja

ekotoksikoloških studija. Pored toga se u standardnom testu toksičnosti prate i tradicionalni

subletalni efekti agenasa kao što su: rast, vreme razvića ili stopa izleganja adulta. U oba slučaja

posmatrane karakteristike test organizma mogu pokazati određeni stepen varijabilnosti u odnosu

na specifičnosti postavljenog testa toksičnosti. Subletalni, efekti kod model organizama mogu

zavisiti od tipa supstrata čije fizičke osobine mogu uticati na rast i razviće larvi, kao i na akutne

promene koje se tiču deformiteta delova usnog aparata larvi (Wentsel et al. 1978).

18

Slika 3. Elektronska mikroskopija usnog aparata kod Polypedilum (levo-normalna građa, desno-oštećenje zuba)

(https://www.pmf.ni.ac.rs/download)

U nekim istraživanjima naučnisi su koristili supstrate bazirane na organskoj materiji

(treset) (Batac-Catalan i White, 1982), dok su pojedini koristile podloge na mineralnoj bazi

(kvarcni pesak) (Giesy et al. 1988). Korišćenjem supstrata na bazi minerala, istraživanjem se

pokazalo da dovodi do smanjenja oštećenja zuba mentuma kod larvi Chironomidae. Kasnije je

dokazano da uzgajanjem larvi hironomide na ovakvim podlogama može dati nejasne ili lažno

pozitivne rezultate (Warwick, 1988).

Efekti četiri različita supstrata na rast, razviće, preživljavanje i istrošenost zuba mentuma

kod larvi Chironomus tentans, ispitivani su u laboratoriji od strane Bird-a, 1995. Podloge na

kojima su larve Chironomidae bile uzgajane sastavljene su celuloznog papira u komadićima,

grubog peska, šljunka i sitnog peska. Stepen deformiteta mentuma definisan je u odnosu na tip

podloge i to u jednu od tri kategorije: minimalna oštećenja mentuma, umerena oštećenja

mentuma i znatna oštećenja mentuma. Iako su rezultati pokazali da je celulozna podloga

najpogodnija za uzgajanje kultura Chironomidae, ovo istraživanje nije u potpunosti dalo

statistički značajne podatke na osnovu kojih bi mogli tvrditi da je stepen deformiteta mentuma

direktno povezan sa tipom podloge na kojoj su larve živele. Stepen prirodne varijabilnosti u

okviru ove grupe je izrazito veliki, ujedno su visoke i stope prirodnih i naslednih deformacija

koje larve poseduju, pogotovo je to bitno kada se radi sa kulturama starijih jedinki u

istraživanjima koja se tiču odnosa deformiteta i tipa podloge (Bird, 1995).

19

Ukoliko se kao posmatrani parametar u testovima prati frekvencija deformiteta, izbor

supstrata ne mora biti od kritične važnosti, ukoliko podloga ne uzrokuje preveliko oštećenje zuba

mentuma do te mere da daje nejasne rezultate, koje je teško protumačiti ili pak izaziva visoku

stopu mortaliteta jedinki. Ako pratimo rast i razviće kao ciljne parametre istraživanja, izbor

podloge je od veće važnosti i treba što bolje uskladiti fizičke odlike podloge na kojoj se kultura

testira sa izvornim supstratom (Bird, 1995).

Dimenzije tela mogu biti parametri koji se prate u testovima toksičnosti u zavisnosti

od tipa ishrane larvi. Kvalitet hrane zavisi od prisustva organske materije, mikro-detritusa i

komponenti koje čine nutrijente za larve Chironomidae te utiču na njihov rast i razviće. U

istraživanjima u kojima je ispitivan nutrijent koji najviše doprinosu rastu i razviću jedinki

ustanovljeno je da ishrana na bazi TetraMin® hrane (komercijalna hrana za ribe), daje jedinke sa

najvećim dimenzijama tela, u odnosu na ishranu sa algama i kvascima (Habashy, 2005).

1.4.2 Biološki testovi uticaja TiO2 na larve hironomida

Akutni i hronični testovi sa biljnim komarcima (ordo: Diptera, famillia: Chironomidae)

predstavljaju deo standardne procedure analize supstanici za registraciju agrohemikalija (pod

evropskom direktivom zaštite biljnih produkata 91/414/EEC), kao i biocide. Biocidi su u

evropskom zakonodavstvu definisani kao hemijske supstance ili mikroorganizmi koji imaju za

cilj da unište, odvrate, učine bezopasnim ili vrše kontrolni uticaj na bilo koji štetni organizam

(Paulus, 2006). Rezultati ovih testova koriste se pri proceni rizika i uticaja na životnu sredinu.

OECD protokoli koji se najviše koriste jesu 218: test sa supstancom u sedimentu- OECD, 2004a

(”Sediment water chironomid toxicity test using spiked sediment“) i 219: test sa supstancom u

vodi- OECD, 2004b (”Sediment water chironomid toxicity test using spiked water“). Od 2011.

prihvaćen je i test koji se radi u test sistemu samo sa vodom: akutni imobilizacioni test

(“Chironomus sp. acute immobilization test”). Osmišljen je i test punog životnog ciklusa (prsten

test), koji predstavlja proširenje prethodnih testova. Test se ne završava sa izletanjem adulta, već

20

se imago prebacuju u akvarijum za razmnožavanje, jaja polažu u isti sistem sa test supstancom,

kao onaj iz koga su se izlegli, prati se izleganje larvi (F1 generacija), pa se one prebacuju ponovo

u posude sa supstancom i prate do izletanja. Prate se, dakle, 2 generacije (P i F1), pa se može

pratiti uticaj na reprodukciju, fekuditet i fertilitet, akumulaciju, nasledne efekte i ostale parametre

(Bruns i Weltje, 2009).

Nekoliko studija pokazalo je pojavu deformiteta delova usnog aparata kod hironomida

kao odgovor na prisustvo agenasa, a mnoge od njih bave se korišćenjem tih deformiteta kao

“endpoint”, krajnjih tačaka inidkacije populacije u biološkim testovima (Warwick, 1980a;

Warwick, 1980b; Warwick i sar., 1987; Warwick, 1991; Dermott, 1991; Janssens de Bistoven i

sar., 1992; Lenat, 1993; Bird, 1994; Hamilton i Saether, 1971).

Najskorija ispitivanja uticaja TiO2 na hironomidama (na vrsti Chironomus riparius)

vršili su Tomilinaa i sar. (2015). Praćena je promena bioloških parametara pod uticajem dve

polimorfne modifikacije TiO2- anatasa i rutila. Kao kriterijum za toksičnost su korišćeni sledeći

parametri: mortalitet, promena u linearnoj veličini i pojava morfoloških abnormalnosti u strukturi

usnog aparata nakon 20 dana izlaganja; kao i relativni broj larvi sa deformitetima, procenat

određenih deformisanih struktura i indeks stepena deformacije antena (slika 4). Koncentracije

kojima su izlagane larve su od 0.002 do 20 mg/L TiO2. Stopa preživljavanja u svim

koncentracijama bila je od 50 do 100 %, ne razlikujući se mnogo od kontrole. Linearna veličina

larvi je bila značajno manja nego u kontroli; deformiteti su bili statistički značajni na svim

koncentracijama i na mentumu i na antenama (slika 4); primećena je retardacija metamorfoze

kod larvi, najviše kod larvi III stupnja (anats-65.8% ukupnog broja larvi, rutil-37.9%).

Deformiteti mentuma su primećeni na srednjem i lateralnim zubima: bifurkacija srednjeg zuba,

dodatni zubi u nizu, manjak broja lateralnih zuba i devijacije mandibula; čak se javlja i

depigmentacija mentuma i malformacija na hetama. Na antenama su najveće promene uočene na

segmentima II i IV (savijanje ili iščezavanje segmenata, pojava novih struktura) (slika 4). Pri

ekspoziciji najvećoj koncentraciji TiO2 sve pomenute malformacije su bile izražene. Mehanizam

nastanka deformiteta nije najjasniji, predpostavlja se da deformiteti nastaju usled oštećenja DNK.

(Tomilina i sar, 2015).

21

Slika 4. Deformiteti na mandibulama i antenama Chironomus riparius (Tomilina, 2015)

Međutim, potencijalni biomarkeri zagađenja slatkovodnih ekostema nanočesticama je

nedovoljno istražen i neophodno je usavršiti postojeće i unaprediti nove metode testiranja kako

bi se taj potencijal u potpunosti iskoristio.

22

1.5 Chironomus tentans – opšte karakteristike

1.5.1 Životni ciklus familije Chironomidae

Životni ciklus hironomida (slika 6), kao i kod drugih insekata sa holometabolnim tipom

razvića, sastoji se od 4 faze:

➢ jaje

➢ larva

➢ pupa (lutka)

➢ adult (imago)

Slika 5. Životni ciklus larve familije Chironomidae (Walker, 1987)

Ženke polažu jaja u želatinozni matriks (slika 7), na neku čvrstu i stabilnu podlogu

(kamenje, granje ili žive biljke) (Nolte, 1993). Kod nekih vrsta adulti ženke legu jaja direktno na

površinu vode, nakon čega potonu na dno i iz njih se izlegu larve (familija Telmatogetoninae)

(Armitage et al., 1994).

Broj jaja u paketiću varira, uglavnom se kreće između 20 i 30. Dužina razvića jajeta traje

nekoliko dana i najviše je uslovljena temperaturom (2 do 8 dana). Morfološke karakteristike jaja

takođe mogu poslužiti prilikom determinacije (Nolte, 1993; Vallenduuk i Moller Pillot, 2007).

23

Slika 6. Jaja u želatinoznoj masi (tribus Chironominni) (Nolte, 1993)

Larve provode veći deo života zakopane u sedimentu gde žive, hrane se i razvijaju.

Nakon larvene faze, sledi period pupacije, gde pupe, tj. lutke aktivno plivaju ka površini vode.

Adulti se izležu iz lutki, ostavljajući egzoskelet (exuviae) na površini vode (Kranzfelder et al.

2015).

1.5.2 Građa larve Chironomidae

Larve imaju čvrstu glavu sa antenama, koja nema mogućnost uvlačenja u telo, sa snažnim

mandibulama, mentumom i ostalim delovima usnog aparata u prednjem delu glave. Telo je usko,

mekano i cilindrično. Uglavnom poseduju jedan par lažnih prednjih nogu na prvom segmentu

grudnog dela tela i jedan par lažnih zadnjih nogu na poslednjem telesnom segmentu (´´noge´´

larvi hironimida nemaju tipičnu građu noge insekata, već više liče na pijavke sa sitnim kukicama,

zbog čega se nazivaju lažne noge), gde su smešteni i procerci, sete i jedan do tri (najčešće dva)

para analnih tubula. Neke terestrične hironomide su izgubile jedan ili oba para ´´nogu´´, zbog

specifičnog načina života i biotopa u kome se razvijaju (Epler, 2001).

Glavni karakteri koji se koriste kod identifikacije larvi hironomida, nalaze se na glavenoj

kapsuli, u najvećoj meri oni na ventralnoj strani glave, a to su uglavnom: premandibule,

mandibule, mentum, ventromentalne ploče, sete (slika 11). Neke potfamilije poseduju

specijalizovane strukture, kao što su ligula i paraligula (Vallenduuk & Moller Pillot, 2007).

24

Slika 7. Terminologija i izgled najbitnijih karaktera za identifikaciju larvi hironomida (Sæther, 1980)

Među najistaknutijim karakterističnim delovima usnog aprata su parne, zglobne

mandibule (slika 12). One funkcionišu u kosoj ravni između labruma i maxilla. Mandibula je

nazubljena struktura, uglavnom sa spoljnim dorzalnim zubom, dominantnim apikalnim zubom i

2 ili 3 unutrašnja zuba, s tim što dorzalni zub nedostaje kod mnogih taksona. Struktura i veličina

mandibula kod hironomida se najviše koriste za njihovo razvrstavanje po funkcionalnim

grupama ishrane ( Harnisch, 1923; Chernovski, 1949; Thienemann, 1954).

Na mandibulama se mogu uočiti tri vrste seta ili grupa seta:

➢ češljasta seta ili seta mandibularis na mezalnoj subapikalnoj površini;

➢ četkasta seta ili seta subdentalis blizu unutrašnjih zuba;

➢ razgranata seta ili seta interna bazalno na unutrašnjoj strani mandibule.

Ove sete, sa setama na epipharyngis-u služe za prinošenje hrane (Artimage et al., 1995).

25

Slika 8. Različiti oblici mandibula larvi Chironomidae

Foto: Aca Đurđević (pmf u Nišu)

Larve vrsta subfamilije Chironomini su specifično crvene boje zbog prisustva

hemoglobin u krvi. Larve četvrtog stupnja se koriste u identifikaciji, jer se na njima najbolje

uočavaju karakteri. Vrlo su specifične po strukturi glavene čaure i usnog aparata, kao i nastavka

na kraju abdomena. Glava je sklerotizovana sa karakterističnim izgledom delova usnog aparata

koji predstavljaju taksonomski karakter. Oči, kao i kod ostalih jedinki ove subfamilije, su

predstavljene duplim očnim mrljama postavljenim vertikalno. Parapodije tj. lažne noge se nalaze

na prvom torakalnom i poslednjem abdominalnom segmentu. Na terminalnom abdominalnom

segmentu nalaze se parni procerci sa setama. Odrasle ženke je lako razlikovati od mužjaka:

ženke imaju kratke nitaste antene i zdepastiji abdomen, mužjaci imaju duge peraste antene i

izražene genitalne segmente na poslednjem segmentu abdomena. Pupa može biti korišćena pri

identifikaciji, kao i egzuvije, ali je ovakva determinacija vrlo teška i koriste se potpuno drugačiji

ključevi (slika 15) (Hein i Mahadeva, 1992).

26

2. CILJEVI ISTRAŽIVANJA

Osnovni cilj ovog istraživanja je utvrditi efekat sredinski relevantnih koncentracija

nanočestica industrijski proizvedenog titanijum dioksida (TiO2, proizveden za potrebe bojenja

hrane, kao aditiv E171) na larve vrste hironomide Chironomus tentans, kroz praćenje

variranjamorfometrijskih parametara delova usnog aparata

Za realizaciju ovog cilja larve su izlagane nanočesticama u sedimentu u koncentracijama

2.5, 25 i 250 mg/kg TiO2, prateći standardni OECD protokol broj 218 dizajniran da proceni

efekte prolongiranog izlaganja larvi toksikantima u sedimentu (eng. OECD – Organization for

Economic Cooperation and Development, test 218 Sediment-Water Chironomid Toxicity Using

Spiked Sediment). Efekat je ispitivan praćenjem morfoloških promena na mentumu larvi

metodom klasične morfometrije.

Podaci korišćeni za obradu rezultata ovog master rada preuzeti su iz istraživanja

doktoranda Dimitrije Savić-Zdravković i rada: An environmentally relevant concentration of

titanium dioxide (TiO2) nanoparticles induces morphological changes in the mouthparts of

Chironomus tentans. Chemosphere, 211, pp.489-499. (Savić-Zdravković, D., Jovanović, B.,

Đurđević, A., Stojković-Piperac, M., Savić, A., Vidmar, J. and Milošević, D., 2018.)

27

3. MATERIJALI I METODE

3.1 Test organizam

Kako bi se formirala laboratorijska populacija, larve hironomida prikupljene su na

lokalitetu starog korita reke Nišave (slika 19). Pre nego što je eksperiment nastavljen u

kontrolisanim uslovima u laboratoriji, larve su podvrgnute identifikaciji. Nakon identifikacije,

uzgajane su u akvarijumima sa regulisanom temperaturom, svetlosnim režimom i dotokom

kiseonika. Larve su uzgajane u laboratoriji do eklozije pupe u adulte. U svrhu praćenja svih faza

životnog ciklusa hironomida, kao i stvaranja čiste kulture vrste Chironomus tentans, prva

generacija potomaka nakon polaganja jaja izolovana je u posebne akvarijume.

Slika 9. Lokalitet uzorkovanja staro korito Nišave kod Ledene Stene.

(http://i47.tinypic.com/5af140.jpg)

Akvarijumi za uzgoj u laboratoriji su konstruisani od komercijalno dostupnog stakla.

Iznad svakog akvarijuma nalazila se rojilica napravljena od drvenog okvira i mrežice koja je

prekrivala otvore kako bi se sprečilo bekstvo adulta. Zapremina akvarijuma iznosila je 80l,

dubina vode u akvarijumu bila je približno 15cm (slika 19). Akvarijum je bio opremljen

28

pumpicom za aeraciju, kako bi se populacija snabdevala kiseonikom. Voda u akvarijumu sastoji

se od česmenske i destilovane vode u odnosu 1:1, dok je temperatura održavana 21 ± 0,5ºC.

Slika 10. Akvarijum za uzgoj hironomida u laboratoriji

Foto: Dimitrija Savić (pmf u Nišu)

Bitan faktor koji utiče na razviće larvi hironomida jeste fotoperiod kao i temperatura na

kojoj je kultura uzgajana, promena malih vrednosti u okviru ovih faktora može dovesti do

odlaganja izleganja adulta (Maier, Kosalwat i Knight, 1990). Prema tome odnos svetlosti i mraka

u eksperimentu imitirao je smenu svetlosnih perioda u prirodnim uslovima (16 sati svetlosti i 8

sati mraka). Fizičko-hemijski parametri vode konstantno su praćeni, poput tvrdoće 7,3 ± 0,25

°dH i provodljivosti 325 μS/cm3, kao i pH 7,2.

Za ishranu je korišćen TetraMin® (mešavina riblje hrane u čiji sastav ulaze: riba i riblji

proizvodi, belančevine, ulja, masti, biljni proizvodi, školjke, žitarice, kvasac, lecitin, minerali,

šećeri, alge). 1g mešavine riblje hrane rastvaran je u 10ml destilovane vode, pre dodavanja u

akvarijum (slika 20).

29

Slika 11. Priprema mešavine TetraMin® riblje hrane

Foto: Dimitrija Savić (pmf u Nišu)

Materijal koji se pokazao kao najbolja podloga za uzgoj hironomida u laboratoriji jeste

celulozni papir. Ubrus papiri su natopljeni acetonom u svrhu dezinfekcije, nakon toga tretirani su

destilovanom vodom, tačnije ispirani su dok se ne ukloni miris acetona, potom je papir kuvan u

destilovanoj vodi 1h na 100°C i time je dobijena smesa za formiranje substrata.

3.2 Testirana supstanca

Za potrebe eksperimenta obezbeđen je komercijalno dostupni titanijum dioksid, sastojak

hrane E171, proizveden od strane italijanske kompanije Fiorio Colori Spa. Prema Brunauer-

Emmett-Teller površinskoj analizi supstance, TiO2 poseduje specifičnu površinu od 6.14 m2 g/1,

volumen pora je 0.12 cc g/1, dok dijametar pora iznosi 2.97 nm. Čestice belog praha titanijum

dioksida odlikuju se amorfno sferičnim oblikom sa jasno izraženim ivicama prema transmisionoj

elektronskoj mikroskopiji. Titanijum dioksid u eksperimentu korišćen je u vidu rastvora sa

koncentracijama 2.5; 25 i 250 mg E171 TiO2 po 1 kg sedimenta. Pripremljene koncentracije

suspenzije titanijum dioksida, izložene su sunčevoj svetlosti, da se inkubiraju u toku perioda

jednog dana. Tokom vremena za koje su suspenzije bile izložene, zabeležena je solarna radijacija

od 477.81 W/m2 (merenje je vršeno uz pomoć Davis Vantage Pro2TM aparata, instaliranog na

krovu zgrade). Suspenzije nano-TiO2 su potom pomešane sa kvarcnim peskom i dodate u test

posude koje su bile napunjene mešavinom obične i dejonizovane vode. Test posude su ostavljene

u laboratoriji par dana kako bi se rastvorene supstance u njima staložile.

30

3.3 Bioesej – postavka eksperimenta

Dizajn eksperimenta formiran je prema OECD protokolima, tačnije sproveden je test br.

218 dizajniran da proceni efekte prolongiranog izlaganja larvi toksikantima u sedimentu (OECD,

2016). Larve su izložene rastućim koncentracijama TiO2 u sedimentu koji se sastojao od

mešavine kvarcnog peska sa sledećim koncentracijama titanijum dioksida: 2.5, 25 i 250 mg E171

TiO2 po 1 kg sedimenta. Izabrane koncentracije predstavljaju količinu TiO2 koja ne izaziva

značajne promene u stopi mortaliteta kod larvi, kako je procenjeno prema Švajcarskom modelu

sedimenta Evropskih voda (≈2.5 mg kg/1; Gottschalk et al., 2009).

Test posude bile su staklene tegle (zapremine 600ml, dijametra 8 cm) u koje je dodat

sediment u sloju od 2 cm, pomešan sa dejonizovanom i česmenskom vodom (pH 6.52±0.4;

tvrdoća vode 7.3 °dH; provodljivost vode 325 μS/cm3). Po 20 larvi prvog stupnja stavljene su u

svaku test posudu, sa temperaturom vode od 21 ± 1 ºC, konstantnom aeracijom i dnevno-noćnim

ritmom 16:8h (svetlost:mrak). Rastvor odgovarajuće koncentracije TiO2 dodat je mokrom

sedimentu i blago i podjednako pomešan sa njim. Kao sediment u bioeseju korišćen je kvarcni

pesak pomešan sa dejonizovanom vodom. Kontrolna grupa postavljena je na isti način, samo bez

koncentracije TiO2 u podlozi. Eksperiment je rađen u triplikatu (po tri ponovaka svake

koncentracije i tri ponovka kontrole).

Kako bi larve hironomida bile praćene kroz kompletni larveni ciklus, obuhvatajući faze

od prvog do četvrtog stupnja razvića, po dvadeset larvi prvog stupnja prebačeno je u test posude

četiri dana nakon izleganja. Posle osam dana larve su dostigle četvrti stupanj razvića. Kako bi

bilo sigurno da su larve dostigle poslednji stupanj razvića, eksperiment je nastavljen do

jedanaestog dana, nakon čega je testiranje okončano i larve su pokupljene iz svih posuda. Larve

su sačuvane u 70% etanolu.

31

3.3.1 Tradicionalna morfometrijska analiza

U svrhu morfometrijskih merenja glavene kapsule hironomida su uklonjene i kuvane na

100°C u 15% KOH tokom 15 minuta, kako bi se omekšala gula i glave pripremile za izradu

mikroskopskih preparata. Ukupno 206 glavenih kapsula postavljeno je na mikroskopske pločice

koristeći Berlezov medijum, u ventralnoj poziciji kako bi se posmatrali mentumi. Preparati su

ostavljeni da se suše 20 dana. Glavene kapsule posmatrane su pod mikroskopom na 100x i 200x

uvećanju i fotografisane uz pomoć Leica MZ16A stereomikroskopa sa 10x/21B okularnim i 10x

i 20x uvećanjem objektiva. Fotografije su dobijene uz pomoć Leica DFC320 Digital Camera

system kamere. Merenja su vršena pomoću ImageJ softvera.

Radi analize morfoloških promena, definisano je i mereno osam distanci na mentumu.

Odabrane su distance koje se koriste u identifikaciji vrsta i predstavljaju taksonomski karakter za

datu vrstu. Merene su sledeće distance u mikormetrima (µ) (Slika 21):

M1 = distanca između Setae submenti;

M2 = distanca između vrhova poslednjih lateralnih zuba;

M3 = širina baze centralnog, tj. medijalnog zuba;

M4 = širina baze unutrašnjeg, tj. prvog

lateralnog zuba (levo);

M5 = širina baze unutrašnjeg, tj. prvog

lateralnog zuba (desno);

M6 = distanca između vrha centralnog i vrha

poslednjeg lateralnog zuba (levo);

M7 = distanca između vrha centralnog i vrha

poslednjeg lateralnog zuba (desno);

M8 = visina mentuma (distanca između vrha

centralnog zuba i linije koja spaja Setae

submenti);

Slika 12. Šema merenih rastojanja na mentumu Chironomus

tentans za tradicionalne morfometrijske analize.

Foto: Dimitirja Savić (PMF Niš)

32

3.3.2 ICP-MS analiza

Da bi dokazali da su larve hironomida u ovom israživanju unosile nanočestice u

organizam, nakon završenog eksperimenta izvršena je ICP-MS analiza tela larvi. Nakon

dekapitacije, tela larvi hironomida oprana su destilovanom vodom kako bi se uklonile moguće

nano čestice TiO2 sa površine, izmerena im je masa i potom su sačuvane u 70% etanolu radi

dalje ICP-MS analize.

Koncentracija titanijum dioksida u uzorcima larvi izmerena je pomoću ICP- MS metode

masene spektrofotometrije (eng. inductively coupled plasma mass spectrometry). U cilju

određivanja koncentracija titanijum dioksida E 171 korišćenja je jednačina:

TiO2 konc. = (konc. Ti u uzorcima larvi – konc. Ti u kontroli) * masena vrednost

TiO2/Ti. Pri čemu je masena vrednost TiO2/Ti = 1.6684

3.4. Statistička obrada podataka

Tradicionalna morfometrija

Jednofaktorska analiza varijansi (ANOVA) i Post Hoc LSD procedura je korišćena za

testiranje varijabilnosti osam morfometrijskih parametara, izmerenih na larvama hironomida

uzgajanih u kontrolnim uslovima i tretmanima sa tri različite koncentracije TiO2 u podlozi.

Mereni parametri predstavljaju distance između definisanih tačaka na mentumu i opisani su u

prethodnom tekstu (3.3.1 Tradicionalna morfometrijska analiza).

ICP-MS analiza

Rezultati analize statistički su testirani jednosmernom ANOVA metodom, praćena Post

hoc Tukey HSD procedura. Pre ANOVA analize, podaci su obrađeni kako bi se utvrdila

normalnost i homogenost vrednosti rezultata, koristeći Kolmogorov-Smirnov (sa Lilliefors

stepenom značajnosti ispravki), Shapiro- Wilk i Levene statističkim metodama.

33

Kako bi utvrdili da li postoji statistički značajna povezanost između koncentracije TiO2 u

telima hironomida i koncentracija TiO2 u podlozi, sproveden je neparametrijski korelacioni test,

tačnije Spearmanov korelacioni test - Spearmen rho.

4. REZULTATI I DISKUSIJA

ICP-MS analizom dokazano je da se sa povećanjem količine nanočestica TiO2 u

sedimentu povećava i njihova količina u telima larvi hironomida. Ovo predstavlja dokaz da su

larve unosile nanočestice u organizam, a možemo i predpostaviti da su ih unosile zajedno sa

hranom iz podloge. Rezultati analize prikazani su u tabeli 1:

Tabela 1- rezultati ICP-MS analize količine TiO2 u telima larvi hironomida nakon završenog eksperimenta

Koncentracija TiO2 u sediment

(mg TiO2 po kg sedimenta) 2.5 25 250

Ti02 koncentracija u C.tentans larvama

Srednja vrednost ± SD

(mg TiO2 po kg mokre mase jedinki)

67.30 ±

38.45a

493.63 ±

173.20b

6850.77 ±

4244.60c

*tretmani a i b su statistički različiti od tretmana c (p<0.05)

Osnova praćenja stanja životne sredine (monitoringa) je dobijanje dovoljnog broja

pouzdanih informacija na osnovu kojih se može vršiti ekološka procena rizika (eng. Ecoligical

risk assessment - ERA) (Despotović, 2013). Određivanje stepena rizika od zagađenja predstavlja

proces praćenja intenziteta i mogućnost uticaja određene toksične materije na spoljašnu sredinu

(Suter, 1993; Despotović, 2013). ERA je razvijena da bi se utvrdio štetan uticaj različitih

hemikalija na spoljašnu sredinu i obezbedila kvantitativna osnova za kategorizaciju i poređenje

različitih oblika rizika, kao i razumevanje rizika (Despotović, 2013). Da bi se monitoring vršio

na adekvatan način neophodno je odrediti i adekvatne biomarkere i praktične metode testiranja

za svaku toksičnu materiju.

34

Stoga je u ovom radu testirana metoda koja je izuzetno praktična, često korišćena kao

standardna laboratorijska procedura i jednostavna za primenu, a za organizam na kome se

supstanca testira odabran je standardni organizam po OECD protokolima koji naseljava

slatkovodne ekosisteme Srbije: Chironomus tentans.

Osetljivost na promene u životnoj sredini, dostupnost vrsta kao i brojnost jedinki,

ekološki značaj, neki su od glavnih kriterijuma koji test organizmi moraju imati kako bi bili

odabrani za procenu rizika zagađenja životne okoline. Zbog različite osetljovisti vrsta na različite

toksikante, ne postoji idealan test organizam za određeni tip hemikalije, jer svaki organizam

drugačije reaguje na određenu koncetraciju pojedinih polutanata, iako se prate isti parametri.

Ustanovljeno je da se prema organizaciji trofičkih nivoa, u ekotoksikološkim testovima koriste

organizmi koji su za dati nivo najbolji (Ratte et al. 2003).

Hironomide su holometabolni insekti, pa prolaze kroz potpunu metamorfozu tokom

hroničnih testova, a nakon izletanja, vrlo je lako razlikovati muške i ženske jedinke. Kompletan

životni ciklus Chironomus riparius na 20ºC u laboratoriji se završava za 25 dana, što je period

dovoljan za proučavanje hronične izloženosti (Bruns i Weltje, 2009). Sve ove karakteristike čine

C.tentans dobrim i kvalitetnim bioindikatorom, pritom je moguće naći jedinke u slatkovodnim

staništima Srbije, te je stoga ovo idealan test organizam koji je i korišćen u datom istraživanju.

U nastavku prikazani su rezultati dobijeni obradjenih podataka putem metode

tradicionalne morfometrije. U ovom istraživanju mereno je ukupno osam parametara – rastojanja

između tačno definisanih tačaka na mentumu. Sumirane vrednosti merenih parametara prikazane

su u tabeli 2:

35

Tabela 2 – Prikaz dobijenih vrednosti merenih rastojanja na mentumu. Pri čemu je: M1 = distanca između Setae

submenti, M2 = distanca između vrhova poslednjih lateralnih zuba, M3 = širina baze centralnog, tj. medijalnog

zuba, M4 = širina baze unutrašnjeg lateralnog zuba (levo), M5 = širina baze unutrašnjeg lateralnog zuba (desno), M6

= distanca između vrha centralnog i vrha poslednjeg lateralnog zuba (levo), M7 = distanca između vrha centralnog i

vrha poslednjeg lateralnog zuba (desno), M8 = visina mentuma (distanca između vrha centralnog zuba i linije koja

spaja setae submenti).

TRETMAN replikat broj

jedinki

merena rastojanja u µ (srednja vrednost)

M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8

kontrola pesak

I 19 204.8536 196.6981 52.13911 29.06679 29.23458 105.3739 105.6901 136.2619

II 14 219.6943 209.4681 56.63714 31.36443 31.16186 111.5099 111.7817 144.8207

III 13 213.9879 208.8863 52.41992 32.43192 31.75554 110.1515 110.1201 138.6181

prosečno 15.33 212.8453 205.0175 53.73206 30.95438 30.71732 109.0118 109.1973 139.9002

Kontrola papir

I 14 192.9714 180.5211 47.0925 27.62357 26.38671 97.755 99.33643 128.9261

II 15 218.7176 211.8719 55.89967 32.34713 31.83593 113.1329 114.9408 146.5255

III 13 200.0339 200.1056 49.26277 30.82877 31.27108 109.3628 106.4631 133.3182

prosečno 14 203.9077 197.4995 50.75165 30.26649 29.83124 106.7502 106.9134 136.2566

2,5 TiO2

I 17 212.4075 208.4861 54.36253 32.31947 31.43294 108.6595 111.3244 140.9377

II 14 212.8329 207.0442 53.31643 31.39136 30.31079 109.5432 109.8721 140.7799

III 7 223.3213 224.767 53.06657 35.09543 32.28757 120.3061 121.3947 152.0707

prosečno 12.6 216.1872 213.4324 53.58184 32.93542 31.34377 112.8363 114.1971 144.5961

25 TiO2

I 15 211.2909 209.531 53.42027 30.14893 30.26673 112.5583 113.2299 142.366

II 14 207.793 206.8591 54.1525 31.30557 30.41714 110.8274 109.3828 139.8286

III 12 223.3989 215.919 54.33508 33.90283 32.55092 113.203 114.6533 141.0624

prosečno 13.6 214.161 210.7697 53.96928 31.78578 31.07826 112.1962 112.422 141.0857

250 TiO2

I 14 209.4187 205.1519 55.06336 30.41743 30.37336 109.2335 109.7809 138.9182

II 11 212.2503 209.0514 53.20748 31.85432 31.01489 111.407 111.7849 141.02

III 13 212.7478 209.2684 53.41457 31.89223 31.07805 111.5397 112.0276 141.4435

prosečno 12.6 211.4722 207.8239 53.89514 31.38799 30.8221 110.7267 111.1978 140.4606

36

Uporedni prikaz dužina merenih distanci na mentumu vizuelno je prikazan na grafiku 1:

Analizom grafika 1 možemo primetiti da parametri M1 i M2 pokazuju veliku

varijabilnost medju tretmanima, dok su parametri M3, M4 i M5 skoro potpuno identičnih dužina.

Jednofaktorska analiza varijansi (one-way ANOVA) je pokazala da tri (M2, M4 i M7) od

osam parametara, koliko ih je ukupno uključeno u studiju, statistički značajno variraju (p<0.05)

između kontrole i tretmana (Tabela 3 i 4):

- M2 - distanca između vrhova poslednjih lateralnih zuba:

- M4 - širina baze unutrašnjeg lateralnog zuba (na levoj strani mentuma);

- M7 - distanca između vrha centralnog i vrha poslednjeg lateralnog zuba (na desnoj strani

mentuma).

Grafik 1 - Rezultati merenja distanci na mentumu tretiranih larvi – uporedna analiza srednjih vrednosti

merenih parametara na različitim tretmanima.

37

Tabela 3- Deskriptivna statistika vrednosti merenih parametara koji statistički značajno variraju među tretmanima

(distanca između vrhova poslednjih lateralnih zuba - M2, širina baze unutrašnjeg lateralnog zuba (na levoj strani

mentuma)-M4 i distanca između vrha centralnog i vrha poslednjeg lateralnog zuba (na desnoj strani mentuma)-M7.

Deskriptivna Statistika

TRETMANI N

Jedinki

Srednja

vrednost

rastojanja

u µ

Std.

Deviation

Std.

Error

95% Confidence

Interval for Mean Minimum

u µ

Maximum

u µ Lower

Bound

Upper

Bound

M2

Kontrola 46 204.02 13.015 1.919 200.16 207.89

183.49 235.68

2.5 TiO2 38 210.95 15.05 2.44 206.00 215.90

185.27 238.23

25 TiO2 41 210.48 11.17 1.74 206.95 214.01

193.94 230.76

250 TiO2 38 208.98 12.16 1.97 204.98 212.98

190.09 232.55

Total 163 208.42 13.10 1.02 206.39 210.45

183.49 238.23

M4

Kontrola 46 30.71 2.62 .38 29.93 31.49

25.48 36.46

2.5 TiO2 38 32.48 3.049 .49 31.48 33.49

25.10 37.64

25 TiO2 41 31.64 2.59 .40 30.82 32.46

25.14 37.23

250 TiO2 38 31.63 2.84 .46 30.70 32.57

26.96 43.38

Total 163 31.57 2.82 .22 31.14 32.01

25.10 43.38

M7

Kontrola 46 108.79 6.91 1.01 106.74 110.84

96.94 122.40

2.5 TiO2 38 112.64 8.29 1.34 109.91 115.37

99.15 131.05

25 TiO2 41 112.33 6.79 1.06 110.18 114.47

99.86 127.10

250

TiO2 38 112.32 7.03 1.14

110.01 114.64 98.39 125.72

Total 163 111.40 7.37 .57 110.26 112.54 96.94 131.05

38

Tabela 4 - Jednofaktorska analiza varijansi (one-way ANOVA).

Vrednosti označene * pokazuju statističku zančajnost

ANOVA Analiza Sum of Squares df Mean Square F Sig.

M2 Between Groups 1318.46 3 439.48 2.638 .049* Within Groups 26489.63 159 166.60

Total 27808.09 162

M4 Between Groups 65.92 3 21.97 2.853 .039* Within Groups 1224.46 159 7.70

Total 1290.3 162

M7 Between Groups 439.22 3 146.40 2.778 .043* Within Groups 8378.27 159 52.69

Total 8817.49 162

Parametar M2 (rastojanje među vrhovima poslednjih zuba) je statistički značajno (M2,

ANOVA F=2.638, p<0.05) varirao između testiranih tretmana gde je kontrola imala značajno

(Post hoc LSD) uže mentume od hironomida gajenih u tretmanima sa 2.5 i 25 TiO2 (Grafik 2):

Grafik 2 - Variranje parametra M2 medju tretmanima.

a<b Tretman obeležen oznakom a je statistički značajno različit od tretmana b ( p<0.05).

39

Identičan obrazac variranja su pokazali parametri širina osnove prvog levog lateralnog

zuba (M4, ANOVA F=2.853, p=0.039) i distanca između vrha medijalnog zuba i poslednjeg

lateralnog sa desne strane (M7, ANOVA F=2.778, p=0.0430). Ovi parametri su pokazivali

najmanje vrednosti u kontroli, a najveće u tretmanu sa 2.5 TiO2 (Grafici 3 i 4):

Grafik 3- Variranje parametra M4 medju tretmanima.

a<b Tretman obeležen oznakom a je statistički značajno različit od tretmana b (p=0.039).

Grafik 4 - Variranje parametra M4 medju tretmanima.

a<b Tretman obeležen oznakom a je statistički značajno različit od tretmana b (p=0.0430)

40

Na osnovu grafika se može zaključiti da je rastojanje medju vrhovima poslednjih zuba na

mentumu najmanje u kontroli, te da se drastično povećava pri izloženosti TiO2. Ovaj obrazac se

ponavlja i kod ostalih merenih rastojanja koja pokazuju statistički značajno variranje između

tretmana. Baza prvog lateralnog zuba (na levoj strani mentuma) je uža u kontroli u odnosu na

tretmane, i to statistički značajno manja u odnostu na 2.5 tretman. Desna strana mentuma, tj.

rastojanje izmedju vrha medijalnog i vrha poslednjeg lateralnog zuba je kraća u kontroli u

odnosu na tretmane. Rezultati pokazuju tendenciju proširenja određenih delova usnog aparata pri

izloženosti nanočesticama TiO2

Ovo je suprotno od vrednosti rezultata analize geometrijske morfometrije koje je radjena

na istom uzorku od strane Savić-Zdravković i saradnika (Savić-Zdravković et al. 2018). Rezultati

geometrijske morfometrije pokazuju tendenciju sužavanja mentuma. Ovakvi rezultati ukazuju na

neophodnost daljih detaljnijih analiza.

Hironomide su vrlo specifične po strukturi glavene čaure i usnog aparata, te se ove

strukture koriste u samoj identifikaciji vrsta. Međutim, u ekotoksikološkim ispitivanjima, kao što

je i navedeno u uvodu, ove strukture reaguju na zagađujuće supstance u sredini i menjaju svoju

morfologiju. Shodno ovome, nekoliko decenija unazad, deformiteti usnog aparata larvi

hironomida posmatraju se kao potencijalni indikatori prisutnosti zagađenja u prirodnim vodenim

ekosistemima (Warwick, 1990; Bird, 1994; Groenendijk et al., 1998; Janssens De Bisthoven et

al., 1998; Meregalli et al., 2000; Gerhardt et al., 2006). Međutim, ova metoda se pokazala kao

nedovoljno efikasna i neophodno je razviti nove metode i “endpoint” parameter koji se trebaju

pratiti u standardnim testovima. Stoga, zbog neobjektivnosti i nekonzistentnosti u proceni

prisustva deformiteta, u datom istraživanju praćeni su klasični morfometrijski parametri sa

precizno definisanim tačkama na mentumu larvi.

41

5. ZAKLJUČAK

Rezultati tradicionalne morfometrijske analize ukazuju da razlike među mentumima larvi

gajenih na podlogama sa različitim koncentracijama nanočestica TiO2 postoje. Pokazalo se da su

mentumi u kontrolama uži od mentuma u tretmanima, tj. merena rastojanja su statistički

značajno veća u tretmanima u odnosu na kontrolu. Merena rastojanja predstavljaju standardne

dužine koje se koriste u identifikaciji vrsta i predstavljaju taksonomski karakter za datu vrstu.

Rezultati ove analize izuzetno su značajni, jer ukazuju na to da i strogo definisani taksonomski

karakteri mogu varirati u stanju stresa, tj. pod uticajem izloženosti kontaminantima.

Od ukupno osam merenih parametara, samo tri se pokazalo osetljivo na tretiranje

nanočesticama. Ovakvi rezultati ukazuju na mogućnost korišćenja datih parametara u budućim

ekotoksikološkim ispitivanjima. Činjenica da ostali parametri, tj. rastojanja na mentumu, ne

variraju značajno među tretmanima, ukazuje na to da ih potencijalno treba isključiti iz budućih

istraživanja i time skratiti vreme analize.

Rezultati celokupnog istraživanja ukazuju na to da je Chironomus tentans dobar indikator

prisustva nanočestica u sedimentu akvatičnih ekosistema. Pre svega, pokazalo se da larve unose

TiO2 iz podloge u svoj organizam pomoću ICP-MS analize. Takođe, merenje rastojanja izmedju

definisanih tačaka na mentumu larvi, koristeći se tradicionalnim morfometrijskim metodama,

može pokazati efekat delovanja nanočestica na larve. Međutim, nije neophodno meriti više od tri

rastojanja na mentumu, tj: distancu između vrhova poslednjih lateralnih zuba; širinu baze prvog

levog unutrašnjeg lateralnog zuba i distancu između vrha centralnog i vrha poslednjeg lateralnog

zuba sa desne strane. Naravno, ovo istraživanje je neophodno sprovesti na većem broju

ponovaka i većem broju jedinki kako bi se ovaj trend proverio i potvrdila osetljivost datih

prametara na uticaj nanočestica TiO2. Neophodno je razmotriti i nove, sofisticiranije metode

analize morfoloških promena, kao što je metoda geometrijske morfometrije.

Ovakva istraživanja neophodno je sprovesti u većem obimu kako bi se uspostavila

standardna, ponovljiva metoda detekcije efekata TiO2 nanočestica, koja bi se mogla koristiti u

standardnim testovima toksičnosti.

Literatura

Ali, A., 1991: Perspectives on management of pestiferous Chironomidae (Diptera), an emerging

global problem. Journal of the American Mosquito Control Association 7: 260- 281.

Arambourou H, Beisel J-N, Branchu P, Debat V., 2012: Patterns of Fluctuating Asymmetry and

Shape Variation in Chironomus riparius (Diptera,Chironomidae) Exposed to

Nonylphenol or Lead. Plos one. Vol. 7. pp. 11.

Armitage, D., P., Pinder, L., C., V., P., Cranston, S., 1995: The Chironomidae. Biology and

ecology of non-biting midges. Chapman and Hall, UK.

Armitage, P., Cranston, P.S., Pinder, L.C.V. 1994: The Chironomidae: Biology and

Ecology of Non-biting Midges. Chapman and Hall, London. pp. 572.

Batac-Catalan, Z., White, S., 1982: Creating and Maintaining Cultures of Chironomus

tentans(Diptera: Chironomidae).Entomology News. Vol.93. pp. 54–58.

Bell, H. L., 1970: Effect of pH on the life cycle of the midge Tanytarsus dissimilis. – Canadian

Entomology. pp.102: 636-639.

Bird, G. A., 1994: Use of chironomids deformities to asses environmental degradation in the

Yamaska river, Quebac. Environmental Monitoring and Assesment. Vol. 30. pp. 163-

175.

Bird, G. A., 1995: Deformities in Cultured Chironomus tentans larvae and the influence of

substrate on growth, survival and mentum wear. Environmental Science Branch.

Bisthoven L., Ollevier, F, 1998: Experimental Induction of Morphological Deformities in

Chironomus riparius Larvae by Chronic Exposure to Copper and Lead. Environmental

contamination and toxicology. Vol. 35. pp. 249-256.

Breno, M., Leirs, H., Van Dongen, S., 2011: Traditional and geometric morphometrics for

studying skull morphology during growth in Mastomys natalensis (Rodentia Muridae).

Journal of Mammalogy. pp. 92(6): 1395-1406.

Brigger I., Dubernet, C., Couvreur, P., 2002: Nanoparticles in cancer therapy anti diagnosis.

Advance Drug Delivery Review. pp. 2002(54):631–51.

Brundin, L., 1966: Transantarctic relationships and their significance, as evidenced by

chironomid midges with a monograph of the subfamilies Podonomidae and

Aphoroteniinae and the austral Hetagyae. Kunglica Svenska Vetenskapakademiens

Handlingar. Pp.11, 1-471.

Bruns, E., Weltje, L., 2009: The chironomid full life-cycle test Validation report. First draft.

Chernovski, A. A. 1949: Indetification of larvae of the midge family Tendipedidae. Izdatestvo

Akademii nauk SSSR. National Lending Library for science and Tehnology. Boston spa.

Coffman, W. P., 1995: The chironomidae: biology and ecology of non-biting midges. Chapman

and Hall, London, pp. 436–447.

Colvin, V. L., 2003: The potential environmental impact of engineered nanomaterials. Nature

biotechnology. pp. 21(10), 1166.

Colvin, V. L., 2004: Sustainability for nanotechnology: making smaller safer and changing the

way industry thinks in the process. The Scientist. pp.18(16), 26-28.

Crane, M., Handy, R., D., 2007: An assessment of regulatory testing strategies and methods for

characterizing the ecotoxicological hazards of nanomaterials. Report for Defra,

London,UK.

De Zwart, D., 1995: Monitoring water quality in the future. Biomonitoring. National Institute for

Public Healt and Environmental Protection. Bilthoven. The Netherlands. pp. 1-81.

Dermott, R. M., 1991: Deformities in Larval Procladius spp. and Dominant Chironomini from

the St. Clair River. Hydrobiology. pp. 219, 171–185.

Despotović, S., 2013: Parametri antioksidacionog zaštitnog sistema i koncentracija teških metala

u visceralnoj masi odabranih vrsta puževa i školjki Dunava, Tise i Velike Morave.

Doktorska disertacija. Biološki fakultet. Univerzitet u Beogradu.

Dubrovinskaia N. A., Dubrovinsky L. S., Ahuja R., 2001: Experimental and Theoretical

Identification of a New High-Pressure TiO2 Polymorph. Physics Review Letter. pp. 87:

27-550.

Dowling, A., 2004: Development of nanotechnologies. Mater Today. pp.30–51.

Epler, J. H., 2001: Identification manual for the larval Chironomidae (Diptera) of North and

South Carolina. North Carolina Department of Environment and Natural Resources.

Fabricius, 1805: Hemilucilia segmentaria (Fabricius, 1805) (Diptera: Calliphoridae) as new

biological vector of eggs of Dermatobia hominis (Linnaeus Jr., 1781) (Diptera:

Oestridae) in Reserva Biológica do Tinguá, Rio de Janeiro, Brazil.

Fernández-García, M., Rodriguez, A., J., 2007: Metal oxide nanoparticules. Nanomaterials:

Inorganic and Bioinorganic Perspectives. Brookhaven National Laboratory.

Ferrington, L.C., 2008: Global diversity of non-biting midges (Chironomidae; Insect-Diptera) in

freshvater. Hydrobiologia. pp.595(1):447-455.

Gerhardt, A., Orendt, C., Dettinger-Klemm, A., Janssens de Bisthoven, L., Michiels, S., Otto C.

J., Vogt, C., 2006: Chironomiden: potential und Einsatzmöglichkeiten im Biomonitoring

von Gewässern-ein Überblick. DGL-Mitteilungen. pp. 49–57.

Giesy, J. P.,Graney, R. L.,Newsted, J. L., Rosiu, C. J.,Benda, A., Kreis, R. G., Horvath, F. J.,

1988: Comparison of Three Sediment Bioassay Methods Using Detroit River Sediments.

Environmental Toxicology Chemistry. pp. 483–498.

Gottschalk, F., Sonderer, T., Scholz, R. W., Nowack, B., 2009: Modeled environmental

concentrations of engineered nanomaterials (TiO2, ZnO, Ag, CNT, fullerenes) for

different regions. Environmental science and technology. pp.43(24), 9216-9222.

Groenendijk, D., Postma, J., Kraak, M., & Admiraal, W., 1998: Seasonal dynamics and larval

drift of Chironomus riparius (Diptera) in a metal contaminated lowland river. Aquatic

Ecology. pp. 32(4):341–351.

Habashy, M. M., 2005: Culture of Chironomid larvae (Insecta-Diptera-Chironomidae) unde

different feeding systems. Egyptian Journal of Aquatic research. pp. 403-418.

Hamilton, A.L., O.A. Sæther, 1971: The occurrence of characteristic deformities in the

chironomid larvae of several Canadian lakes. Canadian Entomologist . Vol.103. pp.363-

368.

Harnish, O., 1923: Metamorphosis und system der Gattung Cryptochironomus. Ein Beitrag zum

Problem der Differenzierung der Entwicklungstande der Chironomidaen. Zoology Abt.

Syst. Georg. Biol. Tiere. pp. 47: 271-308.

Haynes, V. N., Ward, J. E., Russell, B. J., Agrios, A. G., 2017: Photocatalytic effects of titanium

dioxide nanoparticles on aquatic organisms current knowledge and suggestions for future

research. Aquatic Toxicology.

Hein, J., Mahadeva, M., N., 1992: Rearing and Maintaining Midge Cultures (Chironomus

Tentans) for Laboratory Studies. The American Biology Teacher. pp. 236-240.

Holland, E., 2009: Limitations of traditional morphometrics in research on the attractiveness of

faces. Psychonomic Bulletin and Review. pp.16(3): 613-615.

Howard, T.M., Crosskey, R.W., 2004: A revised taxonomic and geographical inventory of world

blackflies (Diptera: Simuliidae). London: Natural History Museum.

Janssens de Bisthoven, L. G., Timmermans, K. R., Ollevier, F., 1992: The Concentration of

Cadmium, Lead, Copper and Zinc in Chironomus thummi Larvae (Diptera,

Chironomidae) with Deformed Versus Normal Mentum. Hydrobiology. pp.141-149.

Janssens de Bisthoven, L., Gerhardt, A., Soares, A. M. V. M., 2005: Chironomidae larvae as

bioindicators of an acid mine drainage in Portugal. Hydrobiologia. pp.532: 181–191.

Janssens De Bisthoven, L., Nuyts, P., Goddeeris, B., Ollevier, F., 1998: Sublethal parameters

in morphologically deformed Chironomus larvae: clues to understanding their

bioindicator value. Freshwater Biology. pp.39(1):179–191.

Jarić, I., Višnjić-Jeftić, Ž., Cvijanović, G., Gačić, Z., Jovanović, LJ., Skorić, S., Lenhard, M.,

2011: Determination of differential metal and trace element accumulation in liver, gills,

intestine and muscle of starlet (Acipenser ruthenus) from the Danube River in Serbia by

ICP-OES. Microchemistry Journal. pp. 98, 77-81.

Jovanović, B., 2015: Critical review of public health regulations of titanium dioxide, a human

food additive. Integrated environmental assessment and management. pp.11(1), 10-20.

Johns, C., Luoma, C.N., 1990: Arsenic in benthic bivalves of San Francisco Bay and the

Sacramento/San Joaquin River delta. Science Total Environment. pp. 673- 684.

Kazuhito, H., Hiroshi, I., Akira, F., 2005: TiO2 Photocatalysis: A Historical Overview and

Future Prospects. Japanese Journal of Applied Physics. pp. 8269–8285

Kranzfelder P., Anderson A., Egan A., Ferrignton L. C., 2015: Use of Chironomidae (Diptera)

Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies.

Journal of visualized experiments.

Klingenberg, C. P., 2015: Analyzing Fluctuating Asymmetry with Geometric Morphometrics:

Concepts, Methods, and Applications. Symmetry. pp. 7(2): 843-934.

Kumar Singh, R., Chavan, S. L., Sapkale, P. H., 2007: Heavy metal concentrations in water,

sediments and body tissues of red worm (Tubifex sp.) collected from natural habitats in

Mumbai, India. Environment Monitoring Assessment. pp.129, 471-481.

Lam, P. K. S., 2009: Use of biomarkers in environmental monitoring. Ocean Coast. Manage. pp.

348-354.

Lazarević, M., Milovanović, D., Simonović, P., Simić, V., Simić, S., Cakić, P., Paunović, M.

2010: The Danube in Serbia. Institut za biološka istraživanja ”Siniša Stanković”,

Beograd. pp. 15-30.

Lenat, D. R., 1993: Using mentum deformities of Chironomus larvae to evaluate the effects of

toxicity and organic loading in streams. The North American Benthological Society. pp.

265-269.

Lenat, D. R., 1983: Chironomid taxa richness: natural variationand use in pollution assessment.

Freshwater Invertebrate Biology. pp. 192–198.

Li, L., Zheng, B., Liu, L., 2010: Biomonitoring and bioindicators used for river ecosystems:

definitions, approaches and trends. Procedia Environment Science. pp. 1510-1524.

Linnaeus, C., 1758: Systema Naturae, ed. Tomus I.

Markert B. A., Breure A. M., Zechmeister H. G., 2003: Bioindicators and Biomonitors. Elsevier

Science Ltd. Kidlington, Oxford. pp. 240.

Marković, V., 2014: Morfološka varijabilnost i distribucija roda Theodoxus Montfort, 1819

(Neritomorpha, Gastropoda) u centralnom delu Balkanskog poluostrva i na južnom

obodu Panonske nizije. Doktorska disertacija, Biološki fakultet, Univerzitet u Begradu.

Marziali, L., Armanini, D. G., Cazzola, M., Erba, S., Toppi, E., Buffagni, A., Rossaro, B., 2010:

Responses of Chironomid larvae (Insecta: Diptera) to ecological quality in Mediterranean

river mesohabitats (South Italy). River Research Applications. pp.26: 1036-1051.

Maier, K. J., P. Kosalwat, A. W. Knight, 1990: Culture of Chironomus decorus (Diptera:

Chironomidae) and the Effect of Temperature on its Life History. Environmental

Entomology. pp. 1681–1688.

Meregalli, G., Vermeulen, A. C., Ollevier, F., 2000: The use of chironomid deformation in an in

situ test for sediment toxicity. Ecotoxicology Environmental Safety. pp. 47(3):231–238.

Moller Pillot, H., 2009: Chironomidae Larvae, Biology and Ecology of the Chironomini. Zeist,

The Netherlands, KNNV Publishing.

Moller Pillot, H. K. M., 2009: Chironomidae larvae of the Netherlands and adjacent Lowlands.

Biology and ecology of the Chironomini. KNNV Publishing, Zeist, The Netherlands.

Moore, M. N., 2002: Biocomplexity: the post-genome challenge in ecotoxicology. Aquatic

toxicology. pp.59(1), 1-15.

Moore, M. N., 2006: Do nanoparticles present ecotoxicological risks for the health of the aquatic

environment? Environment international. pp. 32(8), 967-976.

Nolte, U., 1993: Egg masses Of Chironomidae (Diptera): a review, including new observations

and a preliminary kay. Scandinavian Entomology Limited. pp. 4:35-75.

OECD, 2016: Nanomaterials in Waste Streams Current Knowledge on Risks and Impacts.

OECD Publishing.

OECD, 2016: Nanomaterials in Waste Streams Current Knowledge on Risks and Impacts.

OECD Publishing.

OECD, 2016: Sediment-Water Chironomid Toxicity Using Spiked Sediment.

Oehlmann, J., Markert, B. A., 1999: Okotoxikologie. Ecomed.

Orendt, C., Spies, M., 2012: Chironomini (Diptera: Chironomidae: Chironominae): Keys to

Central European Larvae Using Mainly Macroscopic Characters.

Pascoe, D., Brown, A. F., Evans, B. M. J., McKavanagh, C, 1990: Effects and Fate of Cadmium

during Toxicity Studies with Chironomus riparius – The Influence of Food and Artificial

Sediment. Environment Contamination Toxicology. pp.19, 872–877.

Paunović, M., 2007: Struktura zajednica makroinvertebrata kao indikator tipova tekućih voda

Srbije. Doktorska disertacija, Biološki fakultet, Univerzitet u Begradu.

Paulus, W., 2006: Directory of Microbicides for the Protection of Materials and Processes.

Springer Netherland, Berlin 2006.

Perkel, J., M., 2004: Nanoscience is out of the bottle. The Scientist. pp.17(15):20–3.

Pinder, L.C.V., 1986: Biology of freshwater chironomidae. Annual Review Entomology. Pp.

31:1-23.

Rand, Gary, M., Petrocelli, Sam, R., 1985: Fundamentals of aquatic toxicology: Methods and

applications. Washington: Hemisphere Publishing. ISBN 0-89116-382-4.

Ratte, H. T., Hammers-Wirtz, M., Cleuvers, M., 2003: Ecotoxicity testing. In Trace Metals and

other Contaminants in the Environment. Elsevier. pp. 221-256.

Ravishankar Rai, V., Jamuna Bai, A., 2011: Nanoparticles and their potential application as

antimicrobials.Mysore: Formatex.

Reiss, F., 1968: Verbreiting lakustrischer Chironomiden (Diptera) des Alpengebietes. Annual

zoology fenn. pp. 5: 119-125.

Rosenberg, D.M., Resh, V. H., 1993: Freshwater biomonitoring and benthic macroinvertebrates.

Chapman & Hall, New York.

Savić-Zdravković, D., Jovanović, B., Đurđević, A., Stojković-Piperac, M., Savić, A., Vidmar, J.

and Milošević, D., 2018. An environmentally relevant concentration of titanium dioxide

(TiO2) nanoparticles induces morphological changes in the mouthparts of Chironomus

tentans. Chemosphere, 211, pp.489-499.

Simić S., Simić V. 2009. Ekologija kopnenih voda. (Hidrobiologija I). Biološki fakultet

Univerziteta u Beogradu. Prirodno-matematički fakultet Univerziteta u Kragujevacu.

Zemun. Alta Nova, 1-295.

Sæther, O.A., 1980: Glossary of chironomid morphology terminology (Diptera: Chironomidae).

Entomology Scandinavian Supplies. pp.14:1-51.

Sakan, S., Đorđević, D., Dević, G., Relić. D., Anđelković, I., Đuričić, J., 2011: A study of trace

element contamination in river sediments in Serbia using microwave-assisted aqua regia

digestion andmultivariate statistical analysis. Microchemistry Journal. pp.99, 492-502.

Slobodnik, J., 2013: Emerging Environmental Pollutants in the Context of Risk Assessment of

European River Basin. UNESCO Conference on Emerging Pollutants in Water, Belgrade,

Serbia. pp. 35-38.

Soares, A. M. V. M., Calow, P., 1993: Seeking standardization in ecotoxicology. Progress in

standardization of aquatic toxicity tests. pp.1-6.

Suter, G.W. H., 1993: Ecological Risk Assessment. Lewis Publishers, Boca Raton, Fl, USA

.

Thienemann, A., 1954: Chironomus.Leben, Verbreitung und wirtshaftsliche Bedeutung der

Chironomiden. Binnengewasser. pp. 20: 1-834.

Timmermans, K. R., Peeters, W. and Tonkes, M.: 1992: Cadmium, Zinc, Lead and Copper in

Chironomus riparius (Meigen) Larvae (Diptera, Chironomidae): Uptake and Effects.

Hydrobiology. pp. 241, 119–134.

Tomilina, I. I., Gremyachikh, V. A., Grebenyuk, L. P., Smirnov, E. A., Golovkina, E. I., 2015:

Changes in biological parameters of freshwater animals under the impact of various

crystal modifications of titanium dioxide nanoparticles. Inland water biology. pp. 8(3),

309-318.

Townsend, C., Hildrew, A., Francis, J., 1983: Communiti structure in some soutern English

stream: the influence of physicochemical factors. Freshwater Biology. pp.13(6):521-544.

Vallenduuk, H., Moller Pillot, H., 2007: Chironomidae Larvae, General ecology and

Tanypodinae, Zeist, The Netherlands, KNNV Publishing.

Van Gestel, C. A. M., Van Brummelen, T. C., 1996: Incorporation ofthe biomarker concept in

ecotoxicology calls for a redefinition of terms. Ecotoxicology. pp. 217-225.

Vidović, I., 2017: Povezanost fluktuirajuće asimetrije i fitnesa dagnje (Mytilus galloprovincialis

Lamarck, 1819) uvjetovanog okolišem. Sveučilište u Zagrebu. Doktorska disertacija.

Walker, I. R., 1987: Chironomidae (Diptera) in paleoecology. Quatery Science Review. pp.6:

29–40.

Warheit, D. B., 2004:Nanoparticles: health impacts? Materials today. pp. 7(2), 32-35.

Warwick W. F., 1990: Morphological deformities in chironomidae (Diptera) larvae from the Lac

St. Louis and Laprairie Basins of the St. Lawrence River. Journal Great Lakes Research.

pp. 16(2):185–208.

Warwick, W. F., Fitchko, J., McKee, P. M., Hart, D. R., Burt, A. J., 1987: The Incidence of

Deformities in Chironomus spp. from Port Hope Harbour, Lake Ontario. Journal Great

Lakes Research. pp.13, 88–92.

Warwick, W. F., Tisdale, A. N., 1988: Morphological deformities in Chironomus,

Cryptochironomus and Procladius larvae (Diptera:Chironomi-dae) from two

differentially stressed sites in Tobin Lake, Saskatchewan. Canadian Journal of Fish-eries

and Aquatic Sciences. pp. 1123-1144.

Warwick, W. F., 1980: Pasqua Lake, Southeastern Saskatchewan: A Preliminary Assessment of

Tropic Status and Contamination Based on the Chironomidae (Diptera). Pergamon Press,

Oxford. pp. 255– 267.

Warwick, W. F., 1980: Palaeolimnology of the Bay of Quinte, Lake Ontario: 2800 Years of

Culture Influence. Canadian Fish Aquatic Science. pp. 117.

Warwick, W. F., 1988: Morphological Deformities in Chironomidae (Diptera) Larvae as

Biological Indicators of Toxic Stress. Advances in Environmental Science and

Technology. John Wiley & Sons, New York. pp. 281–320.

Warwick, W. F., 1991: Indexing Deformities in Ligulae and Antennae of Procladius Larvae

(Diptera: Chironomidae): Application to Contaminant-stressed Environments. Canadian

Journal Fish Aquatic Science. pp. 48, 1151–1166.

Watts, M., Pascoe, D., 1998: Selection of an appropriate life-cycle stage of Chironomus riparius

Meigen for use in chronic sediment toxicity testing. Chemosphere. pp. 1405 1413.

Waykar, B., Desmukh, G., 2012: Evaluation of bivalves as bioindicators of metal pollution in

freshwater. Environment Contamination Toxicology. pp. 88, 48-53.

Wentsel, R., McIntosh, A., McCafferty,W. P., 1978: Emergence of the Midge Chironomus

tentans When Exposed to Heavy Metal Contaminated Sediment. Hydrobiology. pp 195–

196.

Who International Programme On Chemical Safety – IPCS, 1993: Biomarkers and risk

assessment: concepts and principles. Environmental Health Criteria 155. World Health

Organization. Geneva, Switzerland.

Wright, D., Welbourn, P., 2002: Environmental toxicology. The press syndicate of the

University of Cambridge, Cambrige UK.

Zhou, Q., Zhang, J., Fu, J., Shi, J., Jiang, G., 2008: Biomonitoring: an appealing tool for

assessment of metal pollution in the aquatic ecosystem. Analitical Chemistry Acta. pp

135-150.

www.ncbi.nlm.nih.gov

http://www.nano.gov/nanotech-101/what

http://www.oecd.org/

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

Accession number, ANO: Identification number, INO:

Document type, DT: monograph

Type of record, TR: textual / graphic

Contents code, CC: Master thesis

Author, AU: Stefan Nikolić

Mentor, MN: Đurađ Milošević

Title, TI: Morphological changes of mouth apparatus on chironomids larvae

(Ordo Diptera, Familia Chironomidae) exposed to TiO2

nanoparticules in the sediment

Language of text, LT: Serbian

Language of abstract, LA: English

Country of publication, CP: Republic of Serbia

Locality of publication, LP: Serbia

Publication year, PY: 2018

Publisher, PB: author’s reprint

Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.

Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes)

51 p. ; graphic representations: 12pics; 4 graphs; 4 tabels;

Scientific field, SF: Biology

Scientific discipline, SD: Ecology

Subject/Key words, S/KW: chironomids, bioessey, ecotoxicology;

UC 591.1:595.

77+549.514.6+552.5 Holding data, HD: Library

Note, N: Abstract, AB: In this research effects od TiO2 nanoparticles (E171 food

color aditiv) are examined on mouthpart deformities of

chironomid larvae (Chironomus tentans), using methods of

tradional morphometry. Experiment was designed on OECD

protocol (OECD – Organization for Economic Cooperation

and Development), test number 218.

Accepted by the Scientific Board on, ASB:

Defended on, DE:

Defended Board, DB: President:

Member:

Member, Mentor:

ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Редни број, РБР:

Идентификациони број, ИБР:

Тип документације, ТД: монографска Тип записа, ТЗ: текстуални / графички Врста рада, ВР: мастер рад

Аутор, АУ: Стефан Николић

Ментор, МН: Ђурађ Милошевић Наслов рада, НР:

Морфолошке промене на усном апарату ларви хирономида (Ordo

Diptera, Familia Chironomidae) изложених наночестицама титанијум

диоксида (ТiO2) у седименту

Језик публикације, ЈП: Cрпски Језик извода, ЈИ: Eнглески Земља публиковања, ЗП: Р. Србија Уже географско подручје, УГП: Р. Србија Година, ГО: 2018 Издавач, ИЗ: ауторски репринт Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33. Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога)

51 стр. ; граф. прикази: 12, табела: 4 графика: 4;

Научна област, НО: Биологија Научна дисциплина, НД: Екологија Предметна одредница/Кључне речи, ПО: хирономиде, биоесеј, екотоксикологија...

УДК 591.1:595.

77+549.514.6+552.5 Чува се, ЧУ: библиотека

Важна напомена, ВН: уколико је рад рађен ван факултета (у лабораторији)

Извод, ИЗ: У овом раду истраживан је ефекат наночестица индустријски

произведеног титанијум диоксида (TiO2, произведен за потребе

бојења хране, као адитив Е171). Праћене су морфолошке промене

ментума код ларви хирономиде Chironomus tentans методом

класичне морфометрије. Експеримент је дизајниран на основу ОЕЦД

протокола (енг. OECD – Organization for Economic Cooperation and

Development) број 218.

Датум прихватања теме, ДП:

Датум одбране, ДО:

Чланови комисије, КО: Председник:

Члан: Члан, ментор: