Universit de LigeCentre dIngnierie des Protines

Recherche de nouveaux mtabolites secondaires chez les Streptomyces

La Condromycine:

Histoire dun antibiotique mort-n

Matthias Craig

IntroductionStreptomyctesBactries Gram + filamenteuses colonisant les sols

IntroductionStreptomyctesProducteurs de 2/3 mtabolites secondaires utiliss en mdecine et dans lindustrie agroalimentaire

IntroductionStreptomyctesSquenage des gnomes de S. coelicolor et S. avermitilis rvlent la prsence de nombreux clusters cryptiques.

Les bactries pathognes multirsistantes aux antibiotiques posent un grave problme mdical. recherche de nouvelles molcules.

Le groupe Strepto a dcid de rejoindre lensemble du CIP dans cette cette aventure.

Introduction

Quels sont les signaux environnementaux perus dclenchant le passage du mtabolisme primaire au mtabolisme secondaire ?

Criblage de la collection de Streptomyces du CIP pour la recherche de nouveaux antibiotiques

Souche S. sp. G2

Streptomyces sp G2 produit un mtabolite secondaire inhibant la croissance de bactries Gram-positives (MRSA).

Spectre de masse: 1079 Da et prsence dun atome de bore

Il existe trois antibiotiques naturels caractriss contenant un atome de bore* Le tartrolon:

-Produit par Sorangium cellulosumMw = 888 Da

* Laplasmomycine:

Produite par Streptomyces griseusMw = 799 Da

* La boromycine:

Produite par Streptomyces antibioticusMw = 866 Da

Objectifs du doctoratCaractrisation gntique, biochimique et morphologique de la souche G2.

Dtermination des proprits physico-chimiques de lantibiotique.

Optimisation de la production de lantibiotique dans le but de la dtermination de sa structure tridimensionnelle par RMN (en collaboration avec le Professeur Luxen, ULg).

Recherche de la cible de lantibiotique.

Identification des gnes responsables de la biosynthse de la condromycine (clonage et squenage du cluster de gnes).

Rsultats1) Gnotypage de Streptomyces sp G2 en amplifiant, clonant et squencant le gne codant pour les RNA 16S et les Internally transcribed spacers (ITS).

Mise au point des conditions optimales de croissance de S. sp. G2 et de production de condromycine en milieu liquide. 16 h 22 h 40 h 46 h 112 h

TSB + glycrol 1%

MM + glycrol 1%

MM + glucose 1%

MM + chitine 1%

MM + mannitol 1%

MM + GlcNAc 1%

TSB + glycrol 1% + chitine 0,5%

MM + glycrol 1% MM + chitine 1% R2YE

MM + MM + mannitol 1%

Mise au point des conditions optimales de croissance de S. sp. G2 et de production de condromycine sur milieu glos.

Mise au point dun protocole de production et de purification de condromycine.

La souche S. sp. G2 ne produit plus lantibiotique en milieu liquide.

Mutagense chimique au NTG

Substitution: GC AT

NP II NPIV NP V NP VIII S. sp. G2 SP IV SP VIII SP XII tmoin Screening des colonies aprs incubation des spores avec du NTG et caractrisation des mutants potentiels

15 mutants potentiellement surproducteurs

21 mutants potentiellement non producteurs

3 mutants prsentant un phnotype fortement altr

Non producteur S. sp. G2Surproducteur Mutant brun

9 mutants surproducteurs confirms

NP II NPIV NP V NP VIII S. sp. G2 SP IV SP VIII SP XII tmoin

4 cultures de 250 ml en TSB + glycrol 1% + chitine 1%

Purification:

Extraction liquide-liquide

Purification trois pics sur colonne semiprparative.

35 mg pics A, B et C

Activit biologiqueEnterococcusfaeciumEnterococcusfaecalisEnterococcushirae ATCC 9790Enterococcushirae EHREnterococcushirae R40Enterococcushirae SRIEscherichia coliJM109

Proprits physico-chimiquesSpectres UV:

Stabilit thermique etrsistance aux protases.

Spectre de masse.

control90C1h30traitementPronase4 g/mL24 h 37C5795,6597,41267,91282,1

Production et purification de la condromycine sur milieu glos.

100 botes de milieu R2YE (2,5 litres) spores du mutant surproducteur SPXII.

Condromycine extraite du milieu glos en prsence dactate dthyle.

Purification par HPLC (colonne C18) et sparation des trois pics. 150 mg

Spectre de masse des pics A, B et C

Et cest lembarde Pic A: 1254,7 Actinomycin D : 1255,4Pic B: 1268,8 Actinomycin C2 : 1269,4Pic C: 1282,8 Actinomycin C3 : 1283,5

Condromycine = Actinomycine?

Masses trs prochesSpectre dabsorption similaireMme activit (actif contre les gram +)Mme spectre RMN du proton

CONDROMYCINE

ACTINOMYCINE

ObjectifsCaractrisation gntique, biochimique et morphologique de la souche G2.

Dtermination des proprits physico-chimiques de lantibiotique.

Optimisation de la production de lantibiotique dans le but de la dtermination de sa structure tridimensionnelle par RMN (en collaboration avec le Professeur Luxen, ULg).

Recherche de la cible de lantibiotique.

Identification des gnes responsables de la biosynthse de la condromycine (clonage et squenage du cluster de gnes).

S. sp. G2 = Sous-espce de S. griseusMasse, spectre UV, stabilit thermique, stabilit en fonction du pH, hydrophobicit, Se lie lADN empchant la transcription en ARN hautement toxique.

Recherche de nouveaux mtabolites secondairesCriblage de la collection de Streptomyctes du CIP.

Gnotypage des souches non identifies

Recherche de nouveaux mtabolites secondairesCriblage de la collection de Streptomyctes du CIP.Mthodologie dasR

Facteur de transcription pliotropique.

Mtabolisme de la GlcNAc.Scan du gnome de S. coelicolor pour identifier les sites dre (dasR-responsive element). ActII-4 et redZ.

Recherche de nouveaux mtabolites secondaires2) Mthodologie dasR

DNA array BAP29 vs S. coelicolor M145

M145

BAP29ActII-4redZ

Recherche de nouveaux mtabolites secondaires2) Mthodologie dasR.DNA array BAP29 vs S. coelicolor M145

coelicheline

Recherche de nouveaux mtabolites secondaires2) Mthodologie dasRDNA array BAP29 vs S. coelicolor M145

Gray spore pigment

Recherche de nouveaux mtabolites secondaires2) Mthodologie dasR DNA array BAP29 vs S. coelicolor M145

Gnes SCO6273 SCO6288 rguls par scbR et scbA en amont desquels on retrouve un site dre.

scbRscbA

Recherche de nouveaux mtabolites secondaires2) Mthodologie dasR

DNA array BAP29 vs S. coelicolor M145

SCO6280 = KasOSCO6273

Recherche de nouveaux mtabolites secondaires Et en pratique 1 2 3 4 1 = M145 MM + mannitol 1%

2 = BAP29 MM + mannitol 1%

3 = M145 MM + GlcNAc 1%

4 = BAP29 MM + GlcNAc 1%

M145dasRMMMM + GlcNAc

Recherche de nouveaux mtabolites secondaires BAP29 MM + GlcNAc 1%

Spot noir provenant de la TLC

Recherche de nouveaux mtabolites secondaires 1 2 3 4

1 = M145 LB + glucose 1%

2 = BAP29 LB + glucose 1%

3 = M145 LB + chitine 1%

4 = BAP29 LB + chitine 1%

Recherche de nouveaux mtabolites secondaires

Jus de culture BAP29 LB + glucose 1%Pic 1

Pic 2

Spot fluorescent provenant de la TLC

PerspectivesEffet de la GlcNAc sur dautres Streptomyctes.

Streptomyces clavuligerus 1 2 3 4 5 6

1 = MM + mannitol 1%2 = MM + GlcNAc 1%3= MM + glucose 1%4 = MM + glucose 1% + GlcNAc 1%5 = MM + chitine 1%6 = MM + chitine 1% + GlcNAc 1%

PerspectivesPCR pour identifier les souches de la collection possdant le gne dasR.

Inactivation du gne Rveil de mtabolites cryptiques?

Etudier le mtabolome des souches de la collection sur diffrents milieux en prsence de diffrentes sources de carbone et dazote.

Nouveau(x) mtabolite(s) caractriser

Merci pour votre attention

Sbastien Rigali et toute lquipe streptoBernard JorisJrme Paris

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