metode pcr 2

Problem 1 : Metode PCR dan Mutasi DNA

Metode PCR

Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu metode enzimatis dengan

melipatgandakan suatu sekuen nkleotida tertentu secara eksponensial dengan cara in vitro atau

dengan kata lain ialah suatu teknik untuk mengamplifikasi atau memperbanyak DNA target

hingga 1 juta kali lipat dari jumlah DNA awal. DNA yang dikopi oleh PCR umumnya berkisar

antara 100-600 pasangan basa nitrogen. Pada proses PCR, komponen-komponen yang berperan

antara lain;

Primer

Primer merupakan DNA untai tunggal atau oglionukleotida yang berfungsi untuk menginisiasi

maupun mengakhiri proses polimerisasi DNA. Primer yang dapat disintesis oleh DNA

Synthesizer ini harus didesain sedemikian rupa agar komplemen dengan basa nitrogen DNA

template. Ukuran primer cukup kecil, hanya sekitar 20-30 basa nitrogen.

Enzim DNA Polimerase

Enzim ini berfungsi untuk mensintesis DNA baru sesuai dengan DNA template. Umumnya,

terdapat beberapa jenis DNA polimerase pada proses replikasi DNA biasa, yaitu DNA

polimerasi I dan III, namun pada PCR tidak digunakan kedua jenis enzim tersebut, melainkan

digunakan enzim Taq DNA polimerase. Hal ini dikarenakan enzim DNA polimerase biasa tidak

tahan pada suhu yang terlalu tinggi sehingga resiko kerusakannya besar apabila mengalami

proses denaturasi PCR. Enzim Taq Polymerase memiliki kelebihan, yaitu aktif pada suhu tinggi

sehingga tidak rusak ketika proses denaturasi. Enzim ini diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus

dan berfungsi untuk mengkatalisator sintesis DNA baru dari arah 3’ ke 5’ menghasilkan DNA

baru 5’ ke 3’.

dNTP (deoxynucleotide triphosphate)

dNTP berfungsi sebagai ‘building blocks’ pada proses polimerisasi, dan terdiri dari 4 macam

basa nitrogen (Adenin, Timin, Guanin dan Cytosin), serta disebut dATP, dTTP, dGTP dan

dCTP. Pada DNA polimerase, dNTP ini digunakan sebagai bahan untuk mensintesis DNA baru.

Buffer dan Ion Logam

Biologi Molekular 1


Larutan buffer berfungsi untuk menstabilkan DNA polimerase agar reaksi polimerisasi berjalan

secara optimum. Sementara itu, Ion logam seperti Mg2+ juga sangat berpengaruh dalam proses

primer annealing, denaturasi dan aktivitas enzim.

Terdapat tiga tahapan utama yang dilakukan pada metode Polymerase Chain Reaction (PCR),

diantaranya adalah;

1. Denaturasi

Pada proses ini, untai ganda DNA dipanaskan pada suhu 900 – 950 C (umumnya 940C) selama

20-30 detik. Akibat dari pemanasan, ikatan hidrogen antara basa nitrogen pada untai ganda akan

melemah sehingga putus dan menjadi duah buah untai tunggal DNA. Namun, ikatan kovalen

antara gula deoksiribosa dan fosfat tidak putus. Pada proses ini, semua reaksi enzimatis juga

dihentikan.

Gambar 1. Proses Denaturasi

2. Annealing

Annealing adalah proses penempelan primer pada DNA template yang komplemen atau yang

cocok urutan basa nitrogennya. DNA yang ditempeli oleh primer ini mengapit DNA target, dan

dimulai dari posisi 3’. Proses ini dilakukan pada suhu 40 – 650 C selama 20-40 detik, bergantung

pada berapa panjangnya dan urutan basa nitrogen pada primer. Ada 2 buah primer yang

digunakan, masing- masing menempel pada untai tunggal DNA yang telah dihasilkan pada

Biologi Molekular 2


proses denaturasi. Ikatan hidrogen yang stabil akan terjadi ketika primer menempel pada untai

tunggal DNA yang komplemen. Setelah itu, enzim polimerase berikatan dengan primer-template

untuk memulai replikasi DNA baru.

Gambar 2. Proses Annealing

3. Ekstensi / Elongasi

Setelah primer menempel pada template yang komplemen, enzim polimerase memulai sintesis.

Pada tahap ini, proses elongasi terjadi. Suhu yang digunakan berkisar antara 75 – 800 C, namun

umumnya yang dipakai adalah 720 C. Enzim Taq Polimerase yang tahan terhadap suhu tinggi

akan mensintesis DNA baru dari ujung 3’ primer dengan memasangkan nukleotida dNTP pada

template, sehingga pada akhirnya akan dihasilkan 2 buah DNA double strand baru.

Biologi Molekular 3


Gambar 3. Proses Elongasi

Setelah proses elongasi selesai, DNA yang baru terbentuk dipanaskan lagi hingga 940 C

untuk didenaturasi lagi, lalu akan mengalami annealing dan elongasi lagi. Setelah siklus kedua

selesai, akan terbentuk 4 DNA baru. Siklus tersebut terus berulang hingga 20-30 kali sampai

pada akhirnya terbentuk 1 juta kopi DNA baru.

Diagnosa Penyakit dengan PCR

Salah satu aplikasi dari Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah untuk mendiagnosa suatu

penyakit genetis. PCR memperbanyak DNA target dari semula hanya 1 untai ganda DNA

menjadi jutaan untai ganda DNA. Fungsi dari perbanyakan DNA ini adalah untuk memperjelas

bagian dari DNA sequence tersebut agar mudah dilakukan diagnosa penyakit secara akurat sedini

mungkin. PCR dapat digunakan untuk menganalisis penyakit HIV, kanker, human

papilomavirus, malaria, anthrax, asma, Influenza dan TBC. dan sebagainya. PCR juga dapat

digunakan untuk mendeteksi berapa banyak virus yang bersirkulasi di dalam tubuh manusia,

dimana sangat berguna untuk diagnosa awal penyakit. Jika dibandingkan dengan teknik analisis

biasa, PCR merupakan metode yang jauh lebih cepat, sensitif dan spesifik. Sebagai contoh, jika

menggunakan teknik biasa untuk mendeteksi bakteri, perlu dilakukan penumbuhan bakteri di

laboratorium yang memakan waktu hingga 24 jam. Dengan PCR, kita dapat mendeteksi penyakit

hanya dalam waktu beberapa jam. utnuk kali ini kami membahas tentang diagnosa penyakit

Influenza. virus influenza adalah virus yang memiliki 8 segmen gen penghasil 10 protein. salah

satu segmen yang memiliki daerah conserved paling tinggi adalah segmen ketujuh yaitu gen

matriks (m). gen m dapat mendeteksi virus inflenza A yang sebelumnya tidak terdeteksi melalui

Biologi Molekular 4


sistem diagnostik menggunakan primer spesifik pendeteksi subtipe virus influenza A.

pendeteksian virus influenza dengan mengunakan teknik amplifikasi PCR pada gen m telah

dilakukan oleh Fouchier dkk. PCR dapat mendeteksi materi genetik virus influenza A. hal

tersebut dikarenakan teknik PCR memiliki kemampuan mengamplifikasi daerah spesifik dari

virus infuneza A tersebut. Reverse Transcription Polymerase chain reaction (RT-PCR),

merupakan teknik PCR yang mengubah ribonucleic acid (RNA) menjadi complementary

deoxyribonucleic acid (cDNA) dan mengamplifikasi sebagian dari genom melalui penggunaan

primer yang terikat spesifik pada daerah target amplifikasi. teknik RT-PCR itu sendiri dilakukan

dengan satu tahapan reaksi (one-step RT-PCR) dan dua tahapan reaksi (tqo-step RT-PCR). kedua

metode ini dapat mendeteksi gen -- gen dalam virus influenza A. sehingga dapat diketahui

penyakit apa yang menyerang seseorang. primer yang digunakan dalam diagnostik influenza ini

adalah dua pasang primer M, yaitu MAF26-MAR500 dan MAF306 dan MAR744, yang telah

didesain berdasarkan daerah conserved pada sekuen dari gen virus influenza tersebut. untuk

memaksimalkan metode tersebut perlu diuji sensitifitas PCR pendeteksi gen m, yang dilakukan

dengan dilusi bertingkat dari template cDNA atau RNA virus influenza A. uji sensitifitas ini

bertujuan untuk mengetahui tingkat sensitifitas teknik PCR menggunakan pasangan primer M

pendeteksi gen m virus influenza A. uji tersebut dapat mendeteksi virus sampai jumlah yang

terkecil dalam suatu sampel yang diujikan. Penentuan subtipe dari gen pada virus influenza

tersebut telah diteliti oleh alvarez dkk. mereka mendesain pasangan primer untuk teknik one-step

RT-PCR yang dapat mengamplifikasi 9 subtipe gen dari berbagi spesies dan lokasi yang berbeda.

penentuan subtipe virus dengan menggunakan one-step RT-PCR memiliki keunggulan, yaitu

analisis sekuen dengan cepat dan akurat dari produk PCR dapat menyediakan informasi

epidemiologi yang penting mengenai asal mula virus influenza yang teridentifikasi. selain itu,

seperti yang telah dijelaskan sebelumnya bahwasanya uji sensitifitas dan spesifisitas juga

diperlukan. sensitifitas PCR ntuk mendeteksi virus influenza dapat diartikan sebagai

jumlah/konsentrasi virus terendah dalam sampel yang dapat diukur secara akurat oleh teknik

PCR. Tipe sensitifitas tersebut diukur melalui konsentrasi misalnya mg/dl, dan kopi gen/50 juta

sel. uji spesifisitas PCR dilakukan untuk mengetahui kemampuan teknik PCR mendeteksi virus

influenza A, sehngga dapat membedakan virus dengan bakteri lainnya. uji tersebut dapat

menunjukkan ada atau tidaknya cross-reaction diantara sampel-sampel yang digunakan. Produk

PCR dianalisa dengan elektrophoresis menggunakan gel agarose (Invitrogen) 2 % dalam buffer

Biologi Molekular 5


TAE (Invitogen) dan syber safe (Invitrogen). Hasil PCR masing-masing sebanyak 10 μl

kemudian dicampur dengan loading dye 1 μl. Campuran dimasukkan ke dalam lubang gel

agarosa di dalam elektroforesis chamber. Salah satu lubang diisi dengan marker 100 bp

(Invitrogen) sebanyak 10 μl. Elektrophoresis dilakukan pada 100 volt dan 400 mA dalam buffer

TAE selama 45 menit. untuk jenis penyakit ynag lainnya, konsep diagnostiknya terbilang serupa,

yang membedakan adalah jenis primer yang digunakan untuk seiap jenis virus atau bakteri yang

akan diidentifikasi.

Mutasi DNA

Mutasi DNA adalah kejadian dimana DNA mengalami perubahan kandungan genetik. Mutasi

DNA dapat terbagi menjadi dua yaitu mutasi gen (mutasi titik) dan mutasi kromosom. Mutasi

gen adalah mutasi yang mengalami perubahan di dalam gen. Mutasi gen terbagi menjadi 3 yaitu:

1. Subtitusi

Substitusi adalah mutasi gen yang mengarah ke perubahan kode genetik yang biasarnya terjadi di

kode gen dari urutan basa nitrogennya sehingga protein yang terbentuk salah yang

mempengaruhi pembentukan enzim yang berbeda. Substitusi dapat terbagi dua yaitu transisi dan

transversi. Transisi adalah pergantian basa purin dengan basa purin lainnya atau basa pirimidin

dengan basa pirimidin lainnya. Lalu transversi adalah ketika basa purin digantikan dengan basa

pirimidin dan sebaliknya

Gambar 1. Proses Substitusi transisi

Biologi Molekular 6


2. Delesi

Delesi adalah mutasi yang terjadi ketika terjadinya pengurangan satu atau lebih pasangan

nukleotida pada suatu gen. Hal ini menyebabkan majunya rangkaian nukleutida yang lain

sehingga membuat susunan lain

Gambar 2. Proses Delesi

3. Adisi

Adisi adalah mutasi dimana basa nitrogen menyisip di antara basa nitrogen yang sudah tersusun

di DNA sehingga basa nitrogen lainnya akan mundur dari susunan sebelumnya dan membuat

susunan yang berbeda.

Gambar 3. Adisi

Biologi Molekular 7


Penyebab atau faktor-faktor terjadinya mutasi DNA ada pengaruh dari lingkungan yang

ditempati. Hal-hal tersebut biasa disebut dengan mutagen. Mutagen-mutagen dapat dibagi

menjadi:

a. Faktor Fisika

Mutagen fisika adalah mutagen yang berupa radiasi. Radiasi bersifat mutagenic antara lain

adalah sinar kosmis, sinar ultraviolet, sinar gamma, sinar-X, partikel Beta, dan sinar-sinar

lainnya yang memiliki daya ionisasi. Terkadang radiasi ini sering digunakan untuk melakukan

mutasi pada tumbuhan agar memiliki bibit unggul. Radiasi yang dapat membuat mutasi gen

adalah radiasi yang memiliki kemampuan untuk melakukan ionasasi karena hanya dengan

kemampuan ionisasilah sinar tersebut dapat menembus kulit.

b. Faktor Kimia

Banyak sifat kimia yang bersifat mutagenik. Zat kimia ini dapat menjadi mutagen dengan hanya

tersentuh, terhirup ataupun tertelan. Beberapa zat kimia yang bersifat mutagen antara lain zat-zat

pestisida, Formaldehid, Glycidol, dan butadiene deipoxide.

c. Kesalahan saat pengkopian DNA

Kesalahan saat pengkopian terjadi karena kesalahan DNA polimerasi melaksanakan tugasnya

dalam replikasi DNA. Ketika DNA yang akan di replikasi dilepas ikatannya dengan DNA

helikase, DNA polymerase akan mengkopi sisi DNA yang terputus. Pada saat mengkopi basa

nitrogen tersebut terkadang DNA polymerase akan melakukan kesalahan yang sangat jarang

dilakukan sehingga menyebabkan pembentukan mRNA yang memiliki susunan yang salah

sehingga protein yang terbentuk pun salah.

Proses terjadinya mutasi karena faktor tersebut menyerang pada bagian atau proses yang

berbeda. Penyebab mutasi dengan faktor fisika memiliki proses yang sama, berbeda dengan

kesalahan alami DNA tersebut. Penyerangan pada DNA yang memungkinkan terjadinya mutasi

adalah sebagai berikut:

1. Keadaan atau faktor internal

Mutasi spontan terjadi disebabkan oleh keadaan atau faktor internal materi genetik, yaitu:

- Kesalahan pada proses replikasi DNA, dalam hal ini tautomerisasi. Tautomerisasi adalah

proses berpindahnya atom hidrogen dari basa satu ke basa lain. Mutasi yang ditimbulkan

adalah mutasi transisi dan mutasi transversi (sebagai akibat perubahan posisi suatu proton

yang merubah suatu sifat kimia molekul.

Biologi Molekular 8


- Penggelembungan unting saat replikasi, merupakan perubahan secara spontan yang terjadi

pada unting lama maupun baru. Perubahan unting ini akan terjadi mutasi adisi dan delesi.

- Depurinasi dan deaminasi yang merupakan peristiwa kimia yang dapat menyebabkan mutasi.

Pada depurinasi, suatu purin tersingkir dari DNA karena terputusnya ikatan kimia antara

purin dan gula deoksiribosa. Sedangkan pada deaminasi, suatu gugus amino tersingkir dari

basa. Dalam peristiwa depurinasi, jika tersingkirnya purin itu tidak diperbaiki maka disaat

replikasi tidak terbentuk pasangan basa komplementer yang lazim.

2. Faktor lingkungan (Radiasi dan Suhu)

Radiasi sebagai penyebab mutasi yaitu radiasi pengion berenergi tinggi. Perubahan tekanan

oksigen dan suhu berhubungan dengan proses penyinaran juga mengubah mutasi yang

signifikan. Tekanan oksigan yang rendah dapat menurunkan mutasi. Oksigen dapat memperbesar

efek penyinaran, tetapi hanya selama penyinaran berlangsung. Sinar UV tidak menginduksi

ionisasi melainkan meningkatkan kerja atom yang dijumpai. Dalam molekul DNA, senyawa

yang paling digiatkan adalah purin dan pirimidin, karena kedua senyawa tersebut menyerap

cahaya pada panjang gelombang 254-260 nm. Gelombang ini adalah rentang panjang gelombang

UV. Dua produk hasil penyerapan UV adalah hidrat pirimidin dan dimer pirimidin. Efek utama

dari radiasi UV adalah dimerisasi timin yang menimbulkan suatu mutasi tidak langsung dalam

dua cara yaitu:

1) Dimer timin mengganggu helix ganda DNA serta mengambat replikasi DNA secaa akurat.

2) Kesalahan yang kadag-kadang terjadi selama proses sel memperbaiki DNA yang rusak seperti

DNA yang mengandung dimer timin.Suhu diketahui menyebabkan terjadinya peristiwa

terjadinya poliploidi.

Kemudian dengan radiasi, mutagen ini dapat menyebabkan kerusakan dengan

memutuskan ikatan fosfor dan oksigen. Dengan terputusnya ikatan ini, gen dalam DNA akan

mengalami mutasi karena DNA yang terputus akan berusaha untuk memperbaiki kerusakan

dengan menyambungkan dirinya ke DNA yang lain sehingga menyebabkan kondisi yang disebut

denga translokasi. Translokasi ini akan menyebabkan terbentuknya protein yang berbeda.

3. Penyebab Mutasi dalam Lingkungan yang Bersifat Kimiawi

Penyebab mutasi dalam lingkungan kimiawi disebut sebagai mutagen kimiawi. Mutagen

kimiawi dapat dipilah menjadi tiga kelompok yaitu: analog basa, agen pengubah basa (basa

modifying agent), dan agen penyela (intercalating agent).

Biologi Molekular 9


a. Analog Basa

Senyawa-senyawa yang tergolong analog basa adalah yang memiliki struktur molekul yang

sangat mirip dengan yang dimiliki basa pada umumnya terdapat pada DNA. 5-bromourasil

adalah sutu analog timin. Proses mutasi yang terjadi adalah posisi gugus 5 ditempati oleh gugus

brom, padahal sebelumnya ditempati oleh gugus metal (CH3). Keberadaan gugus bro mini

menyebabkan terubahnya distribusi muatan serta meningkatkan peluang perubahan tautomerik.

b. Agen Pengubah Basa (Basa Modifying Agent)

Senyawa yang tergolong agen pengubah basa yaitu mutagen yang secara langsung mengubah

struktur maupun sifat kimia basa. Yang termasuk kelompok ini adalah agen demiasi (diaminating

agen), agen hidroksilasi (hydroxylation agent) serta agen alkilasi (alkylating agent). Asam nitrit

(HNO2) menyingkirkan gugus amino (-NH2) dari basa guanine, sitosin dan adenine. Perlakuan

asam nitrit dengan sitosin menghasilkan urasil yang berpasangan dengan adenine sehingga

terjadi mutasi transisi (selama replikasi) C G menjadi T A.

Agen pengubah basa sebagai agen hydroksilasi, mutagen hydroxylamine NH2OH

bereaksi khusus dengan sitosin, mengubahnya dengan menambah gugus hidroksil (OH),

sehingga terbentuk hidroxylaminosytosine yang hanya berpasangan dengan adenine, dan sebagai

akibatnya terjadi mutasi transisi C G menjadi T A.

Agen alkilasi MMS (Methilethane Sulfonate) mengintriduksi gugus alkil misal ( -CH3-

CH2-CH3) ke dalam basa dalam sejumlah posisi. Dalam hal ini agen alkilasi menyebabkan

perubahan pada basa yang berakibat terbentuknya pasangan yang tidak lazim.

c. Agen Interkalasi

Mutagen kimia berupa agen interkalasi bekerja dengan cara melakukan insersi antara

basa-basa berdekatan dengan pada satu atau dua unting DNA. Contoh agen interkalasi antara lain

proflavin, acridine, ethidium bromide, dan dioxin. Jika agen interkalasi melakukan insersi antara

pasangan basa yang berdekatan pada DNA template (pada waktu replikasi) maka suatu basa

tambahan dapat diinsersikan pada unting DNA baru berpasangan dengan agen interkalasi.

Setelah beberapa kali terjadi replikasi yang diikuti oleh hilangnya agen interkalasi, akibat yang

muncul adalah terjadinya suatu mutasi rangka (frameshift mutation) karena insersi suatu

pasangan basa, mutasi rangka juga dapat dikerenakan karena delesi satu pasang basa.

Biologi Molekular 10


Sickle cell anemia merupakan penyakit keturunan yang disebabkan oleh adanya mutasi

gen yang terjadi di dalam sel. Mutasi gen ini terjadi akibat adanya kesalahan dalam translasi pada

saat pembentukan protein, kesalahan ini mempengaruhi pembentukan asam amino sehingga

berakibat fatal dengan terbentuknya struktur sel darah merah yang berbeda (berbentuk sel sabit).

Dalam sintesis protein dapat terjadi kesalahan penerjemahan kode yang diterima oleh

DNA. Jika terjadi kesalahan ini, maka protein yang tersusun/terbentuk juga akan keliru sehingga

enzim yang dihasilkan kemungkinan salah. Misalnya, kodon GAA yang seharusnya

diterjemahkan menjadi asam glutamate tetapi oleh RNA-t dibaca menjadi GUA yang

diterjemahkan menjadi valin, atau AAA yang diterjemahkan menjadi lisin. Pada penyakit sickle

cell anemia, terjadi kelainan struktur hemoglobin. Globin tersusun dari dua pasang rantai

polipeptida. Hal ini menyebabkan polipeptida yang dihasilkan tidak sesuai dengan perintah

DNA. Kesalahan ini berpengaruh pada proses pembentukan hemoglobin. Hemoglobin normal

seharusnya mengandung asam glutamate, tetapi karena terjadi kesalahan dalam penerjemahan,

hemoglobin mengandung valin atau lisin. Hal ini menyebabkan hemoglobin menghasilkan sel

sabit. Jadi kesalahan RNA-t menerjemahkan kode-kode genetik dari DNA juga merupakan salah

satu mekanisme mutasi gen.

Referensi:

HYPERLINK "http://www.pharmaceutical-technology.com/projects/roche/roche8.html"http://

www.pharmaceutical-technology.com/projects/roche/roche8.html

HYPERLINK "http://www.virtualmedicalcentre.com/health-investigation/pcr-polymerase-

chain-reaction/60"http://www.virtualmedicalcentre.com/health-investigation/pcr-polymerase-

chain-reaction/60

Campbell, N. A. Reece, J. B. 2009. Biology Eighth Edition. San Fransisco: Pearson

Education, Inc.

Tjahsari Andi Mulia. 2009. Tesis : DETEKSI DAN PENENTUAN SEROTIPE VIRUS DENGUE

TIPE 4 DARI NYAMUK AEDES AEGYPTI DENGAN MENGGUNAKAN METODE

REVERSE TRANSCRIPTASE-POLYMERASE CHAIN REACTION (RT-PCR) DI KOTA



MEDAN. Fakultas Kedokteran : Universitas Sumatera Utara

Yuliawuri hartiyowidi. 2008. Skripsi : Optimasi Reaksi PCR untuk Deteksi Gen Matriks

(m)

virus influenza A. Fakultas Matematika Ilmu Pengetahuan Alam : Universitas Indonesia.

Rozaliyani Anna, dkk. 2011. Pemeriksaan Real-Tme PCR dalam Diagnosis Pneumonia

Pneumocystis. Departemen Pulmonologi dan Ilmu Kedokteran Respirasi : Universita

indonesia.

Anonim. Mutasi DNA Makhluk Hidup.

Sumber: http://id.shvoong.com/exact-sciences/biology/2187587-mutasi-dna-mahluk-hidup/

#ixzz2LmOGEwHi. (20 Februari 2013, 20:10 WIB)

Adamsan. Siklemia. http://www.ad4msan.com/sicklemia. (24 Februari 2013, 10:15 WIB)

Anonim. Mutasi. http://biologimediacentre.com/mutasi/. (23 Februari 2013, 21:30 WIB)


http://id.shvoong.com/exact-sciences/biology/2187587-mutasi-dna-mahluk-hidup/#ixzz2LmOGEwHi

http://id.shvoong.com/exact-sciences/biology/2187587-mutasi-dna-mahluk-hidup/#ixzz2LmOGEwHi

http://biologimediacentre.com/mutasi/

http://www.ad4msan.com/sicklemia

metode pcr 2

Documents