METODOLOGA PARA LA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES EN BOVINO CARNE

Jos Denis Osuna Amador, No de Jess Medina Crdova, Sandra Luz Velzquez Alcal, Ricardo Ortega Prez, Jos Luis Espinoza Villavicencio

Centro de Investigacin Regional del Noroeste Campo Experimental Todos Santos La Paz, Baja California Sur, Mxico. Julio de 2014

Folleto Tcnico Nm. 12 ISBN: 978-607-37-0263-8

Tiraje: 500 ejemplares

La impresin de la presente publicacin y la informacin contenida en esta, se realiz con el apoyo otorgado al INIFAP durante el proceso de

investigacin por la Fundacin Produce Baja California Sur, A.C.

www.gobiernofederal.gob.mx www.sagarpa.gob.mx www.inifap.gob.mx

SECRETARA DE AGRICULTURA, GANADERA, DESARROLLO RURAL, PESCA Y ALIMENTACIN

Lic. Enrique Martnez y Martnez Secretario

Lic. Jess Aguilar Padilla Subsecretario de Agricultura y Ganadera

Lic. Arturo Osornio Snchez Subsecretario de Desarrollo Rural

Lic. Ricardo Aguilar Castillo Subsecretario de Alimentacin y Competitividad

Lic. Marcos Bucio Mujica Oficial Mayor

INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACIONES FORESTALES,

AGRCOLAS Y PECUARIAS

Dr. Pedro Brajcich Gallegos Director General

Dr. Manuel R. Villa Issa Coordinador de Investigacin, Innovacin y Vinculacin

M.Sc. Arturo Cruz Vzquez Coordinador de Planeacin y Desarrollo

Dr. Eduardo Francisco Berterame Barqun Coordinador de Administracin y Sistemas

CENTRO DE INVESTIGACIN REGIONAL DEL NOROESTE

Mtro. Jorge Alberto Senz Flix Director Regional

Dr. Jess Arnulfo Mrquez Cervantes Director de Investigacin, Innovacin y Vinculacin

Dr. Ramn Antonio Armenta Cejudo Director de Planeacin y Desarrollo

Lic. Jos Silva Constantino Director de Administracin

CAMPO EXPERIMENTAL TODOS SANTOS

M.C. Jos Denis Osuna Amador Director de Coordinacin y Vinculacin del INIFAP en B.C.S.

Jefe del Campo Experimental Todos Santos

INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACIONES FORESTALES, AGRCOLAS Y PECUARIAS

CENTRO DE INVESTIGACIN REGIONAL NOROESTE CAMPO EXPERIMENTAL TODOS SANTOS

Metodologa para la transferencia de embriones en ganado bovino

M.C. Jos Denis Osuna Amador Director de Coordinacin y Vinculacin del INIFAP en B.C.S.

M.C. No de Jess Medina Crdova

Investigador del C.E. Todos Santos

Ing. Sandra Luz Velzquez Alcal Investigador del C.E. Todos Santos

Dr. Ricardo Ortega Prez

Profesor-Investigador, Departamento Acadmico de Zootecnia, UABCS

Dr. Jos Luis Espinoza Villavicencio

Profesor-Investigador, Departamento Acadmico de Zootecnia, UABCS

La Paz, Baja California Sur, Mxico Julio de 2014

Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrcolas y Pecuarias Progreso No. 5 Barrio de Santa Catarina Delegacin Coyoacn. C.P. 04010, Mxico, D.F. Telfono: (55)-3871-8700

Primera edicin 2014 ISBN: 978-607-37-0263-8 La presente publicacin se termin de imprimir en el mes de julio de 2014, en la imprenta Ciudad de Los Nios, calle Revolucin S/N entre 5 de Febrero y Cuauhtmoc, Colonia Pueblo Nuevo. La Paz, Baja California Sur, Mxico. C.P. 23060. Telfono: (612) 122-0327, 122-9595. No est permitida la reproduccin total o parcial de esta publicacin, ni la transmisin de ninguna forma o por cualquier medio, ya sea electrnico, mecnico, fotocopia, por registro u otros medios, sin el permiso previo y por escrito de la institucin.

CONTENIDO

Pgina I. Introduccin................................................... II. Biotecnologas reproductivas.................... III. Seleccin de donantes................................

Criterios genticos.......................................... Criterios no genticos.....................................

IV. Manipulacin del ciclo estral......................

Superovulacin de donantes.......................... V. Transferencia de embriones........................

Tcnicas de recoleccin................................. Identificacin de los embriones...................... Estadios de desarrollo del embrin................ Calificacin de los embriones......................... Tcnica de transferencia................................ Conservacin de embriones...........................

VI. Manejo de las receptoras...........................

Caractersticas de las receptoras.................. Sincronizacin de receptoras........................ Sincrona donante-receptora.........................

VII. Resultados y recomendaciones.............. VIII. Literatura citada.......................................

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I. Introduccin

El mejoramiento gentico ha jugado un papel esencial en el desarrollo de la ganadera, el cual consiste en aplicar principios biolgicos, econmicos y matemticos, con el fin de encontrar las estrategias ptimas para aprovechar la variacin gentica de los animales y con ello maximizar su calidad, siendo la identificacin y el uso de registros las herramientas que ms han impactado en sta, adems de la evaluacin y seleccin de animales, y la distribucin del material gentico seleccionado mediante tecnologas reproductivas como la inseminacin artificial y transferencia de embriones. En Baja California Sur la obtencin de animales de alta calidad gentica para incrementar la produccin de carne y leche, se ha hecho importando animales a costos elevados, en ocasiones con limitada adaptacin y con resultados en mejora gentica a largo plazo. Al respecto, la transferencia de embriones permite acelerar el mejoramiento gentico del ganado ya que tambin se aprovecha la gentica del lado materno, lo cual disminuye el intervalo entre generaciones y favorece el proceso de seleccin obteniendo un gran nmero de progenie de donadoras valiosas. Por lo anterior, en el presente documento se describen las caractersticas y procedimientos bsicos para desarrollar e implementar la tecnologa de transferencia de embriones en forma adecuada.

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II. Biotecnologas reproductivas

La transferencia de embriones (TE) y la inseminacin artificial (IA) son las tecnologas reproductivas ms utilizadas en los sistemas de produccin, sin embargo, a pesar de sus beneficios en los programas de mejoramiento gentico, la proporcin de animales incluidos en ellas es an muy bajo en Amrica Latina. En Mxico, en zonas especializadas en produccin de leche, el porcentaje de vientres tratados con estas tecnologas no supera el 50%, esto atribuido principalmente a motivos econmicos, culturales, as como la falta de capacitacin de productores y tcnicos, siendo la deteccin de celos uno de los factores ms importantes que influye en su efectividad. En trminos generales la TE consiste en recolectar los embriones de una hembra donante y transferirlos a una hembra receptora, la cual se encarga de servir como madre sustituta durante la preez. Se requiere de precisin mediante el uso de gonadotropinas para inducir la superovulacin en la donante, y sincronizar a las futuras receptoras para que estn en celo y ovulen al mismo tiempo que las donantes, siendo la implementacin de protocolos de sincronizacin del celo y ovulacin, herramientas necesarias para el xito de la tecnologa. Para obtener una cra por vaca por ao, es obligatorio que en un periodo de no ms de tres meses posparto la vaca reinicie sus ciclos reproductivos normales e inicie una nueva gestacin. Es importante la correcta deteccin de celos para obtener buenos resultados, tomando en consideracin que la duracin del ciclo

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estral en bovinos es de 18 a 23 das, y la oportunidad de servicio solo de 12 a 18 horas. Para lograr tasas de concepcin aceptables, tanto el espermatozoide como el embrin deben ser depositados en el sitio y momento correcto con relacin a la ovulacin de la hembra, por ello es necesario el conocimiento de tres factores: 1) fisiologa del ciclo estral de la vaca, 2) productos farmacolgicos y sus efectos sobre el ciclo estral de la vaca, y 3) factores de manejo del hato que reduzcan el anestro e incrementen las tasas de preez. III. Seleccin de donantes Es importante seleccionar de manera adecuada a los animales que sern designados como donantes, ya que esto influir directamente en el nmero de embriones viables de un programa de TE. Es poco probable encontrar una vaca donante que cubra todas las necesidades de un ganadero y que adems se adapte a las distintas situaciones y necesidades del mercado, por ello es necesario tomar en cuenta ciertos criterios que se pueden utilizar para mejorar la gentica del hato y hacer ms eficiente el proceso de TE. Criterios genticos: Previo al tratamiento de superovulacin de una donante es indispensable conocer su capacidad de transmisin. Un problema es superovular vacas que no poseen las caractersticas genticas deseables y que aparentan un mayor valor gentico del que poseen realmente.

Es importante tomar en cuenta caractersticas productivas como la buena fertilidad, facilidad de parto,

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buena habilidad materna, pesos al nacimiento, al destete, al ao; adems de las caractersticas morfolgicas de mayor importancia, entre estas: apariencia general, miembros y aplomos, tamao y forma de la ubre. Se recomienda crear un grupo de donantes de lite que contenga del uno al cinco por ciento de los animales presentes en el hato, para asegurar un progreso gentico adecuado. Entre mayor sea la variabilidad gentica de la poblacin de animales, resultar ms interesante el uso de la TE y por lo tanto se conseguir una mayor optimizacin del valor del semen a utilizar. Criterios no genticos: Al decidir el momento de la superovulacin, se deben tomar en cuenta los factores relacionados con el individuo as como tambin los ligados al hato. Cuando se hayan seleccionado las vacas genticamente superiores, es necesario llevar a cabo una segunda seleccin haciendo nfasis en las caractersticas reproductivas. Es importante seleccionar animales sin antecedentes patolgicos como abortos, retenciones placentarias y quistes, debido a que estos afectan la adecuada produccin de embriones, si bien es deseable que los animales propuestos para la superovulacin no presenten una media superior a las tres inseminaciones por gestacin, en el caso de animales de gran valor, pueden ser utilizados como donantes, ya que aunque la respuesta esperada puede reducirse al 50%; estos sern igual de frtiles que los de los animales no repetidores. Para tener la seguridad de que la funcin ovrica normal se ha restablecido, se recomienda detectar dos a tres ciclos estrales completos y regulares

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posparto, lo que conlleva a un intervalo parto superovulacin mnimo de 60 a 90 das, siendo el ptimo de 90 a 120 das. Se debe diagnosticar el estado ginecolgico de la donante a travs de una exploracin rectal, para detectar la presencia de un buen cuerpo lteo (CL), de buena conformacin y el tracto genital sin apreciaciones patolgicas. La seleccin de los machos debe ser entre aquellos de alta y probada fertilidad, que mejoren los defectos de la hembra donante y tratando de evitar el uso de animales que produzcan cras de gran tamao, cuando se vaya a utilizar en vaquillas como receptoras.

a) Factores ligados al individuo: La edad es un factor

importante, siendo la ptima entre los dos y cinco aos. En el caso de las vaquillas, la superovulacin se puede realizar a partir de los 14-15 meses de edad, para ello es importante que los animales presenten un buen desarrollo y una condicin corporal adecuada.

En vacas en produccin, el tiempo entre el parto y la superovulacin est relacionado con el estado reproductivo de la donante, es decir cuando el aparato reproductor est en perfectas condiciones (alrededor del da 60 posparto), adems de haberse observado ms de un celo a intervalos regulares; de esta manera se considera que el momento ideal para superovular est entre los 90 y 120 das posparto.

b) Factores ligados al hato: La nutricin influye directamente en el tiempo transcurrido entre el parto y la superovulacin de la donante, as como tambin

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en el porcentaje de vacas que responden al tratamiento y en la cantidad y calidad de los embriones obtenidos. La vaca elegida como donante debe tener una ptima condicin corporal, procurando que no estn ni gordas ni flacas, es decir con una condicin de 5 en la escala del 1 al 9. Se debe iniciar con una adecuada alimentacin de las donantes mucho antes de que se programe la superovulacin, debido a que las fallas cometidas incluso siete u ocho meses antes se ven reflejadas en la respuesta.

Los factores estresantes como los cambios bruscos en el manejo o la aplicacin de tratamientos preventivos como vacunaciones, pueden afectar la respuesta superovulatoria; asimismo, hacerlo en los meses ms calurosos.

Otro componente de vital importancia es el ganadero o tcnico a cargo de la explotacin, puesto que est en sus manos todo el manejo de los animales y en gran medida el xito de la TE. Debe ser eficiente en la deteccin de celos, ya que de esto depende el inicio de la superovulacin, as como la inseminacin de la donante y la posterior implantacin de los embriones en las receptoras. La presencia de errores en la deteccin de celos, se ver reflejada en la viabilidad de los embriones el da de la colecta, as como en el nmero de gestaciones despus de la transferencia.

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IV. Manipulacin del ciclo estral

Para obtener buenos resultados en la TE, es necesaria la observacin de celos al menos dos veces por da, lo que dificulta la eficiencia de la tecnologa. La manipulacin del ciclo estral para que un grupo de hembras previamente seleccionadas presenten celo y ovulen en un determinado periodo de tiempo, ha estimulado el desarrollo de varias lneas de investigacin. Actualmente existe un gran nmero de protocolos con caractersticas distintas que presentan ventajas y desventajas, por ello es importante conocer la fisiologa reproductiva del bovino, para determinar el mtodo que ms se adapte a nuestras necesidades. Superovulacin de donantes: El fundamento de los tratamientos superovulatorios es producir una gran cantidad de ovulaciones y obtener la mayor cantidad de embriones transferibles en un solo ciclo reproductivo, lo cual se traduce en altas probabilidades de preez. No obstante la respuesta a estos tratamientos es muy variable e impredecible, lo que genera una serie de problemas que afectan tanto la eficiencia como la rentabilidad en los programas de TE. Son varios los factores que influyen en la respuesta a los tratamientos superovulatorios y la produccin de embriones viables de una vaca donante, entre los que destacan los relacionados con el tipo de tratamiento superovulatorio, factores individuales y los ligados al ambiente (Cuadro 1).

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Cuadro 1. Factores que afectan la respuesta superovulatoria de una donante.

Factores relacionados con el tratamiento

Factores inherentes al animal y su ambiente

Momento de inicio del

tratamiento en relacin con el ciclo estral

Tipo de gonadotropina usada Lotes de gonadotropinas Relacin hormona

folculoestimulante (FSH) y hormona luteinizante (LH) de los preparados comerciales

Duracin del tratamiento Dosis total de gonadotropinas Va de administracin de las

gonadotropinas Uso de hormonas adicionales

Estado nutricional Historia reproductiva Edad de la donante Estacin del ao Raza Causas genticas o fisiolgicas Repeticin de tratamientos

superovulatorios

El esquema tradicional de superovulacin (Cuadro 2) comienza el tratamiento con gonadotropinas entre los das ocho y diez del ciclo estral, aproximadamente cuando comienza la segunda onda de crecimiento folicular. Las gonadotropinas ms utilizadas son extractos de pituitaria porcina u ovina, o gonadotropina corinica equina (eCG). Los extractos de pituitaria contienen altas cantidades de FSH y cantidades variables de LH, dependiendo del producto. Generalmente, los tratamientos consisten en dosis decrecientes o constantes durante cuatro o cinco das, y se prefieren los extractos con bajo contenido de LH porque producen embriones de mejor calidad. La eCG tiene una vida media de 40 horas en la vaca y persiste por ms de 10 das en la circulacin sangunea; por ello normalmente se administra en una sola dosis intramuscular.

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Adems de la administracin de gonadotropinas, la donante recibe una dosis luteoltica de prostaglandinas (PGF2) a las 48 horas despus de comenzado el tratamiento superovulatorio, y regularmente presenta celo de 36 a 48 horas pos aplicacin de la PGF2. En caso de transferir embriones frescos, las receptoras debern ser tratadas con PGF2 de 18 a 24 horas antes que las donantes, de manera que el estro de las receptoras coincida con el de las donantes.

Cuadro 2. Esquema de tratamiento de superovulacin en bovinos.

Da 0 Deteccin de celo de la donante Da 9 am Comienzo de la superovulacin-donante

Da 10 medioda Inyeccin de PGF2 -Receptoras

Da 11 am Inyeccin de PGF2 -Donante

Da 13 am Celo de donante y receptora Da 13 pm Primera IA-Donante Da 14 am Segunda IA-Donante

Da 20 Recoleccin de embriones en la donante y congelado o transferencia en receptoras

Para optimizar los resultados, los tratamientos superovulatorios deben iniciarse al comienzo de una onda de desarrollo folicular, antes de la seleccin del folculo dominante, por lo que es recomendable controlar la dinmica folicular y comenzar los tratamientos en el momento ms oportuno.

Existen diversos mtodos para controlar la dinmica folicular del bovino. La mayora se han orientado hacia la disminucin del efecto del folculo dominante (por mtodos fsicos u hormonales), lo que permite el comienzo de una nueva onda folicular en un determinado periodo de tiempo. Por otra parte, un mtodo fsico es la aspiracin de los folculos mediante

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ultrasonografa transvaginal, dando como resultado el comienzo de una nueva onda folicular alrededor de un da y medio despus. El tratamiento superovulatorio consiste en la aspiracin de todos los folculos presentes o la aspiracin del folculo dominante (cuando las vacas estn entre los das cinco y ocho del ciclo) dos das antes de la aplicacin de las gonadotropinas. El resto del tratamiento es similar a los tratamientos convencionales.

Los tratamientos hormonales ms utilizados incluyen el uso de estrgenos y progestgenos, debido a que en cualquier momento del ciclo estral inducen el crecimiento sincrnico de una nueva onda folicular aproximadamente cuatro das despus. El intervalo entre el tratamiento y el inicio de la superovulacin es de cuatro das si utilizamos estradiol-17 o benzoato de estradiol (EB) combinados con una inyeccin de progesterona (P4) en el momento que se coloca el dispositivo con P4. De los estrgenos disponibles en el mercado se obtienen mejores resultados con el EB que con el valerato de estradiol (EV). Este procedimiento es simple, fcil de llevar a cabo por el personal, no depende de la deteccin de celos, y permite producir cantidades similares o superiores de embriones de calidad que con los tratamientos tradicionales, iniciados a los nueve das del celo. El tratamiento previo tiene la ventaja de que en l es posible elegir el momento adecuado para realizar la recoleccin, y de esta manera programar grupos de donantes para recolectar al mismo tiempo. Esto sin duda facilita la aplicacin de la tcnica de transferencia de

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embriones y disminuye los costos, ya que permite elegir el momento de la recoleccin y armar circuitos eficientes de trabajo. V. Transferencia de embriones

La tcnica de TE ha sido usada en casi todos los animales domsticos, y en muchas especies salvajes y exticas. Fue a principios de la dcada de los 70s cuando comenz el gran inters comercial en la TE en el bovino. Las razas europeas de doble propsito eran importadas a Norteamrica, y dada su escasez eran extremadamente valiosas. Como resultado, exista gran incentivo econmico para la aplicacin de la TE; los criadores queran un mtodo que aumentara el porcentaje reproductivo de sus hembras para una provechosa venta de su descendencia. En consecuencia, el uso de la tcnica en animales domsticos fue desarrollada con dinero de los criadores, ms que con fondos para la investigacin. Despus de la IA, la TE se ha convertido en la herramienta ms poderosa para el mejoramiento animal. Varios pases han incorporado programas de TE dentro de los programas de progenie, como ayuda para el mejoramiento gentico en ganado productor de carne y leche. La tcnica de TE comprende varios pasos: 1. La sincronizacin de donantes y receptoras, 2. La superovulacin de las vacas donantes,

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3. La doble IA de las donantes, 4. La coleccin de los embriones, 5. La identificacin, clasificacin y calificacin de los

embriones, 6. La transferencia del embrin a la receptora, y 7. El manejo previo y posterior de las receptoras. Tcnicas de recoleccin: Estas consisten en el lavado interno de los cuernos uterinos. Siete das despus de la IA de la donante, los embriones son recolectados con la ayuda de un catter que es introducido en el tero por la vagina y el crvix. Existen varias clases de catteres para la recoleccin: Foley de dos vas, Foley de tres vas, el modelo Neustadt/Aisch o modificaciones de los mismos realizadas por distintos proveedores. Los catteres ms usados son los Foley de dos y tres vas. Se pueden utilizar una gran variedad de medios de recoleccin, pero el ms popular actualmente es el Dulbeccos Fosfato Buffer Salino (DPBS), debido a que tiene fosfato como buffer, y su pH cambia en forma mnima al ser expuesto a la atmsfera. Un medio de cultivo de embriones ideal ser aquel que se asemeje fsica y qumicamente al medio en que se encontraban los embriones al momento de ser recolectados. Los embriones mamferos estn altamente adaptados al medio uterino de la madre, por lo que se hace imprescindible mantenerlos en condiciones ptimas. El pH debera mantenerse a 7.4 + 0.5, y la osmolaridad (concentracin de sales) en 285-300 miliosmoles/l.

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En sntesis, podemos decir que siete das despus de que la donante fue detectada en celo e inseminada artificialmente, estamos en el momento ptimo para recolectar los embriones. Lo ideal es trabajar con grupos de cuatro o cinco donantes por da por la variabilidad de la respuesta superovulatoria. No es recomendable trabajar con una sola donante por da.

Los ovarios de la donante deben ser palpados (o examinados por ultrasonografa) para estimar la respuesta al tratamiento superovulatorio. Es mejor comenzar con las que tienen mayor respuesta para poder organizar la transferencia de los embriones frescos y el congelado, en caso de tener ms embriones que receptoras. El medio de recoleccin es vertido al filtro especial Emm-com con una malla de 50 m que permite el paso del medio y no de los embriones. Finalizando el filtrado se lava la malla del filtro con PBS utilizando una jeringa y agua fina; el fluido es recolectado en una caja de Petri y se procede a la bsqueda de los embriones.

Identificacin de los embriones: El dimetro de un ovocito es de aproximadamente 150-190 m, incluyendo el espesor de la zona pelcida (12-15 m). El dimetro del ovocito permanece prcticamente sin variacin desde el estado de clula hasta el estado de blastocisto expandido (Figura 1).

Figura 1. Bsqueda e identificacin de embriones

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El nmero de clulas de un embrin puede ser contado sin dificultad hasta el estado de 16 clulas. Cuando el embrin alcanza el estado de 32 clulas se produce la compactacin en la cual los blastmeros pierden su forma esfrica y comienzan a adherirse entre ellas. En este estado el embrin recibe el nombre de mrula.

Luego los blastmeros comienzan a diferenciarse, y dan origen a dos tipos de clulas, las clulas del trofoblasto y la masa de clulas interna o macizo celular interno (MCI). Las primeras darn origen a la placenta, y el MCI dar origen al feto. A partir de ese momento comienza a formarse una cavidad interna que se denomina blastocele y el embrin comienza a denominarse blastocisto. Es ms fcil distinguir el MCI cuando el embrin se encuentra en el estado de blastocisto, que en el estado de mrula.

La individualizacin de embriones de ocho a diez das de edad es difcil, ya que el embrin eclosiona y la zona pelcida se pierde durante estos das. La zona pelcida refleja la luz del microscopio y se observa como una estructura transparente que rodea la masa celular dejando un espacio vaco denominado espacio perivitelino, que es identificable hasta el estadio de blastocisto. El color de los blastmeros es ms oscuro que el debris celular, lo que facilita la bsqueda. Una buena prctica es mover el debris celular y mucus que se encuentran en la placa, ya que los embriones tienden a adherirse a ella.

Estadios de desarrollo del embrin: En las primeras etapas se denominan de acuerdo al nmero de clulas: dos clulas, seis clulas, ocho clulas, hasta 16 clulas, despus se nombran de manera distinta.

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Mrula (estadio tres): Su aspecto se asemeja al de una mora, los blastmeros son poco visibles, la mayor parte del espacio perivitelino la ocupa la masa de clulas (embrin) y la edad estimada es de cuatro a cinco das. Mrula compacta (estadio cuatro): Los blastmeros se unen y forman una masa compacta. El embrin ocupa el 60-70% del espacio perivitelino (edad estimada 5 a 6 das). Blastocisto temprano (estadio cinco): Se observa una cavidad con fluido o blastocele, aparentando un anillo de sello. El 70-80% del espacio perivitelino lo ocupa el embrin el trofoblasto y el macizo celular interno se pueden diferenciar en forma visual (edad estimada siete das). Blastocisto (estadio seis): La diferencia entre el trofoblasto externo y el macizo celular interno se vuelve ms obvia (ms oscuro), claramente se observa el blastocisto y el embrin ocupa casi por completo el espacio perivitelino (edad estimada siete a ocho das). Blastocisto expandido (estadio siete): El tamao se incrementa 1.2 a 1.5 veces, la zona pelcida se adelgaza aproximadamente una tercera parte con respecto al grosor original, en esta etapa los embriones se pueden encontrar colapsados (edad estimada ocho a nueve das). Blastocisto eclosionado (estadio ocho): Se puede observar al embrin en proceso o totalmente fuera de la zona pelcida, los blastocistos eclosionados son

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esfricos con el blastocele bien desarrollado (nueve a diez das). Calificacin de los embriones: Se realiza para evaluar la calidad del embrin, basndose en las caractersticas morfolgicas, son subjetivas y dependen principalmente de la experiencia del tcnico. El mejor indicador para determinar la calidad de los embriones, es la tasa de preez obtenida despus de ser transferidos. Sin embargo las caractersticas ms importantes a tomar en cuenta para otorgar una calificacin a un embrin son:

1. Forma del embrin. 2. Color y textura de la masa celular. 3. Nmero y compactado de los blastmeros. 4. Diferencia de tamao entre blastmeros. 5. Tamao del espacio perivitelino. 6. Presencia de blastmeros sueltos, degenerados, o

detritus celular. 7. Presencia, nmero y tamao de vesculas (indican

degeneracin). 8. Apariencia de la zona pelcida.

De acuerdo con la Sociedad Internacional de Transferencia de Embriones (IETS), la clasificacin y calificacin de los embriones es la siguiente:

a. Estadio de desarrollo

1= Infertilizado. 2= De 2 a 12 clulas. 3= Mrula temprana. 4= Mrula.

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5= Blastocisto temprano. 6= Blastocisto. 7= Blastocisto expandido. 8= Blastocisto eclosionado. 9= Blastocisto eclosionado en expansin.

b. Calidad 1= Excelentes o buenos (esfrico, simtrico, clulas uniformes). 2= Regulares (imperfecciones ligeras, blastmeros extruidos, vesculas). 3= Malos (alteraciones ms severas, vesculas, clulas degeneradas). 4= Muertos o degenerados.

Los embriones deben ser transferidos antes de su salida de la zona pelcida que suele ocurrir alrededor del da nueve o diez, es decir aquellos que se encuentran en estado de mrula o blastocisto. Los embriones de calidad uno resultan los mejores para congelar y son los ms comercializados; los de calidad dos resultan en buenos porcentajes de preez si se les transfiere frescos, pero los resultados de preez son menores cuando se les congela. Los de calidad tres no deben ser congelados, y tienen ndices de preez regulares a malos si son transferidos frescos. La calidad de los embriones es una de las variables que condicionan los resultados. Si se tiene control sobre la condicin corporal y la sincrona de la receptora, una buena calificacin de los embriones nos permitir predecir el porcentaje de preez a obtener con la

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transferencia. Se pueden obtener porcentajes de preez de entre 40 y 60% con embriones frescos y congelados. Tcnica de transferencia: El mtodo no quirrgico de transferencia es usado con mucho xito por la mayora de los tcnicos. Generalmente se utilizan pajillas francesas de 0.25 ml, un pipeta desechable de plstico con punta metlica y descarga lateral (IMV, Francia), y una pistola para TE (IMV, Francia) (Figura 2).

Figura 2. Preparacin de pistola para transferencia de embriones

La hembra receptora se ubica en una trampa y se procede a la palpacin para ubicar el ovario que contiene el cuerpo lteo (Figura 3). Despus se administra anestesia epidural baja (xilocana al 2%) y se limpia la regin perineal y la vulva.

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Figura 3. Identificacin de ovario con cuerpo lteo

El embrin se coloca dentro de una pajilla esterilizada (0.25 ml) de la siguiente forma (Figura 4):

a. Aspiracin de un pequeo volumen de medio de

mantenimiento. b. Aspiracin de una burbuja de aire. c. Aspiracin de un pequeo volumen de medio de

mantenimiento. d. Aspiracin de una burbuja de aire. e. Aspiracin del embrin con un pequeo volumen

de medio de mantenimiento. f. Aspiracin de una burbuja de aire. g. Aspiracin de un pequeo volumen de medio de

mantenimiento. h. Aspiracin de una burbuja de aire. i. Aspiracin de medio de cultivo hasta llenar la

pajilla.

Figura 4. Metodologa para cargar el embrin en una pajilla para su

posterior transferencia o conservacin

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La primera columna de medio humedece el algodn y el alcohol polivinlico del extremo cerrado de la pajilla, esto para que un lado permanezca sellado y no permita la salida del embrin antes de ser transferido. La pajilla con el embrin se coloca dentro de la pistola de TE, y sta dentro de la pipeta plstica. Para depositar el embrin en la hembra receptora se puede utilizar la tcnica recto cervical, procurando realizar este procedimiento con la mayor rapidez posible, en el caso de una persona diestra se introduce la mano izquierda, el tcnico sujeta el crvix a travs de la pared del recto. La pipeta se introduce en el canal cervical, y posteriormente se introduce en el cuerno ipsilateral al CL. El embrin es depositado en el tercio anterior del cuerno uterino. La pistola es removida suavemente y se retira la mano del recto (Figura 5).

Figura 5. Depsito de embrin en hembra receptora mediante la

tcnica recto cervical Con la tcnica se pueden obtener buenos porcentajes de preez (60% con embriones frescos y 40 a 50% con embriones congelados), siempre y cuando las receptoras estn sanas, con ciclos reproductivos normales y con buen estado nutricional. Normalmente, una vaca promedio produce por tratamiento

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superovulatorio entre 10 y 12 ovulaciones con 8 a 10 embriones recuperados, de los cuales cinco o seis son transferibles, lo que resulta en tres o cuatro posibles cras. Un ltimo factor a tomar en cuenta en la TE es el factor humano, de tal manera que las tasas de fertilidad pudieran variar de un 20% a un 60% segn la habilidad de cada tcnico. As pues, la experiencia del operador es fundamental no solo en la palpacin, sino en la transferencia para evitar cualquier dao a la receptora y as conseguir el mayor nmero de gestaciones.

Conservacin de embriones: Una vez obtenidos los embriones, podrn ser transferidos a las hembras receptoras, debidamente preparadas con antelacin, tan pronto como sea posible. Sin embargo, los embriones tambin pueden ser conservados a bajas temperaturas (0C - 4C), sin que se aprecie una prdida de viabilidad en las primeras 24 horas, decreciendo en un 50% a las 48 horas y se pierde totalmente a las 120 horas. Por lo tanto, la congelacin a -196C es la mejor opcin para la conservacin y transporte de embriones, esta permite el mantenimiento de la viabilidad embrionaria por largos perodos de tiempo y contribuye a incrementar el rendimiento de un programa de superovulacin al no perder embriones cuando no se dispone del nmero suficiente de receptoras (Figura 6). Es importante resaltar que solo los embriones de excelente calidad y con un grado de desarrollo normal sern adecuados para ser sometidos al proceso de congelacin. La congelacin es un proceso fsico-

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qumico gobernado por el calor y el transporte de sustancias entre las clulas y su medio externo. Para controlar esto se han utilizado una serie de compuestos crioprotectores con caractersticas similares; estos compuestos protegen a las clulas de los efectos dainos de las altas concentraciones de solutos, a medida que avanza la congelacin. Inicialmente los crioprotectores se adicionaban y retiraban del embrin mediante su inclusin en soluciones sucesivas de concentracin crecientes y decrecientes, en la actualidad este proceso se puede realizar en un solo paso, descongelando y transfiriendo los embriones de forma similar a como se realiza una inseminacin artificial y con resultados de gestacin semejantes. El descenso lento de la temperatura (0.3C - 0.5C/min) permite realizar la inmersin en nitrgeno lquido (a -196C) desde temperaturas comprendidas entre -30C a -40C, posibilitando la descongelacin rpida de los embriones, de manera similar a la realizada con el semen.

Figura 6. Conservacin de embriones a -196C

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VI. Manejo de las receptoras

La fertilidad es el diagnstico ms fiable de la viabilidad embrionaria, adems de ser el principal objetivo de cualquier tcnica artificial de reproduccin. Existen una serie de factores que conciernen al tipo de tcnicas empleadas para la transferencia y sincronizacin entre donantes y receptoras, al embrin y a la receptora, que son los que determinan el xito o el fracaso de la TE. Caractersticas de las receptoras: Diversos factores se deben tomar en cuenta a la hora de seleccionar animales para organizar un lote de futuras receptoras de embriones, entre otros los ms importantes a considerar son:

a) Edad: La utilizacin de vaquillas como receptoras

frente a vacas ofrece superiores tasas de gestacin (53% vs 71%), mayor facilidad de manejo por su uniformidad y menores costos. Deben ser seleccionadas aquellas vaquillas que ciclen normalmente y hayan alcanzado un 45-55% de su peso adulto, con un buen desarrollo y condicin corporal.

b) Nutricin: El aporte energtico y una condicin corporal adecuada (de 5 a 6) son los principales factores que condicionan el xito en la consecucin de la gestacin. Las receptoras deben estar en un estado positivo de energa y la racin en todos sus componentes (protena, energa, vitaminas y minerales) debe ser equilibrada.

En caso contrario habr que suplementar hasta satisfacer las necesidades de cada animal, cualquier

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cambio deber realizarse gradualmente, siendo recomendable mantener a las posibles receptoras con la misma dieta por lo menos desde seis semanas antes de la transferencia y mantenerla hasta los dos meses de gestacin.

c) Estrs: El estrs puede interferir en casi todos los

aspectos de la reproduccin, tales como el celo, la ovulacin, el desarrollo embrionario y la gestacin. En la receptora, varias pueden ser las causas de estrs, como climticas, nutricionales y en muchas ocasiones el trato recibido por el ganadero. En el manejo de las receptoras se ha de evitar en lo posible cualquier factor estresante; as, en el hato de receptoras se debe mantener su composicin y tamao para evitar todo conflicto y trastorno de la conducta estral que impida la identificacin del animal en celo. Los corrales deben disponer de condiciones apropiadas, instalaciones cmodas y elementos de sujecin seguros para su manejo. El acostumbramiento de los animales al manejo que recibirn el da de la transferencia favorecer el incremento de las tasas de gestacin.

Sincronizacin de receptoras: Consiste en la sincronizacin de celos entre donante y receptora, tratando de hacer coincidir lo mejor posible el estadio de desarrollo embrionario con su correspondiente estado uterino, siendo el margen de desequilibrio aceptable de 1 da para que no represente un efecto adverso. Para la sincronizacin de celos de las receptoras existen actualmente en el mercado los anlogos de prostaglandina F2 (PGF2) y los progestgenos. Las

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receptoras a las cuales para su sincronizacin con la donante se les administran PGF2 (con o sin progestgenos), presentan tasas de gestacin significativamente superiores en comparacin con las que son utilizadas tras la observacin de un celo natural. Sincrona donante-receptora: La obtencin de tasas aceptables de preez por transferencia de embriones depende parcialmente de que el celo de receptoras y donantes este dentro de una sincrona aceptable, cuyo rango puede variar si los embriones son frescos o congelados. Lo ideal con embriones congelados es no tener una asincrona mayor a 24 horas. En cambio con embriones frescos se puede llegar a transferir embriones en receptoras que estn entre el da cinco y nueve del ciclo. Sin embargo hay una pequea disminucin de preez cuando nos alejamos de las 36 horas de asincrona en relacin con la donante. El estadio del ciclo de la receptora y el porcentaje de preez tambin estn relacionados con la calidad embrionaria. Varios experimentos han demostrado que embriones de excelente calidad soportan ms el asincronismo que los embriones regulares o malos. Asimismo, se obtuvieron los mayores porcentajes de preez con embriones regulares o malos en receptoras que entraron en celo despus que la donante. Esto puede estar relacionado con el hecho de que en los embriones de calidad pobre, el desarrollo embrionario retardado es frecuente, por lo que el ambiente uterino proporcionado por una receptora en un estadio ms temprano del ciclo resulta ms propicio para este tipo de embrin.

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VII. Resultados y recomendaciones

El INIFAP en Baja California Sur incluy dentro de sus programas de validacin y transferencia de tecnologa, la TE mediante la tcnica no quirrgica usando embriones congelados, para lo cual fueron seleccionadas 10 receptoras, en las que se implement el siguiente protocolo de sincronizacin: El diagnostico de gestacin se realiz mediante palpacin y ecografa transrectal a los 56 das, el porcentaje de preez fue de 33.3%, menor a los porcentajes promedio reportados para esta tecnologa, esto probablemente como resultado de la poca del ao en que se realiz (septiembre), donde se presentaron temperaturas elevadas en la zona.

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Ante lo expuesto, para optimizar los resultados es importante tomar en cuenta las siguientes recomendaciones:

Asignar tcnicos experimentados, las tasas de fertilidad pudieran variar de un 20% a un 60% de acuerdo a la habilidad de cada tcnico.

Contar con registros reproductivos del hato, esto nos facilitar la seleccin de los mejores animales y con ello obtener los mayores beneficios de esta tecnologa.

Es importante que tanto donantes como receptoras presenten un buen desarrollo y una condicin corporal adecuada (CC= 5 a 6).

En verano la presencia de celos y las tasas de preez se reducen significativamente, por lo tanto no se recomienda en esta poca del ao.

Contar con el equipo adecuado, pajillas francesas de 0.25 ml, pipeta desechable de plstico con punta metlica y descarga lateral (IMV, Francia), y una pistola para TE (IMV, Francia), as como corrales de manejo y trampa para la correcta sujecin de los animales.

Descongelar correctamente los embriones a 30C durante 30 segundos.

Es importante mantener el nivel adecuado de nitrgeno en el termo para no afectar la viabilidad de los embriones.

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VIII. Literatura citada

Colazo, M. G. y Mapletoft, R. J. 2007. Estado actual y

aplicaciones de la transferencia de embriones en bovinos. Ciencia veterinaria vol. 9, 1.

Cutini, A., Teruel, M. y Cabodevila, J. 2000. Factores que determinan el resultado de la transferencia no quirrgica de embriones bovinos. Revista Taurus. 7: 28-39.

De la Fuente, M. J., 2009. Produccin de embriones Bovinos in vivo: Manipulacin embrionaria para incrementar la produccin bovina. XXXII Curso Internacional de Reproduccin Animal, Madrid, Espaa. 77 - 106.

Fernndez, A., Daz, T. y Muoz, G. 2007. Produccin In vitro de Embriones Bovinos. Revista de la Facultad de Ciencias Veterinarias. 48 (1): 51 - 60.

Galina, C. y Valencia, J. 2008. Reproduccin de animales domsticos. Edit. Limusa, S.A. de C.V. Mxico. Pp. 543 - 569.

Mapletoft, R. J. 2006. Bovine Embryo Transfer. IVIS Reviews in Veterinary Medicine, I.V.I.S. (Ed). International Veterinary Information Service, Ithaca NY. Disponible en URL www.ivis.org, ltima actualizacin 17-noviembre-2006.

Mapletoft, R. J. y Hasler, J. F. 2005. Assisted reproductive technologies in cattle: a review. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 24 (1): 393 - 403.

San Primitivo T., F. 2001. Livestock genetic improvement in the second half of the 20

th century. Archivos de

zootecnia vol. 50, 192: 517-546.

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Agradecimientos

El Campo Experimental Todos Santos, a travs de los autores del presente folleto, agradece a la Fundacin Produce Baja California Sur, A.C., por su apoyo y financiamiento mediante el proyecto titulado Implementacin de tcnicas para el mejoramiento gentico en explotaciones ganaderas. Al M.V.Z. Ramiro Estrada Bautista, presidente de la Asociacin Ganadera Local Llanos de Magdalena, as como al resto de los productores y tcnicos del Estado, que siempre han mostrado inters en colaborar con las actividades de validacin y transferencia de tecnologa propuestas por el Campo Experimental Todos Santos a travs de mdulos demostrativos, cursos y talleres. A Loreto Ros Arce y David Israel Zavala Hirales, estudiantes de la carrera de Ingeniero en Produccin Animal de la UABCS, por su activa participacin y colaboracin en los cursos de capacitacin as como en las actividades de campo.

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PERSONAL INVESTIGADOR

CAMPO EXPERIMENTAL TODOS SANTOS

M.C. JOS DENIS OSUNA AMADOR

osuna.jose@inifap.gob.mx DICOVI EN B.C.S. y

JEFE DE CAMPO DEL CETODS

DR. JESS NAVEJAS JIMNEZ navejas.jesus@inifap.gob.mx

INGENIERIA DEL RIEGO

DR. J.A. CRISTOBAL NAVARRO AINZA

navarro.cristobal@inifap.gob.mx

FRUTALES

M.C. RIGOBERTO MEZA SNCHEZ

meza.rigoberto@inifap.gob.mx

RECURSOS GENETICOS FORESTALES

ING. ERASMO GUTIERRES PREZ gutierres.erasmo@inifap.gob.m

FRIJOL Y GARBANZO

La presente publicacin se termin de imprimir en el mes de julio de 2014, en la imprenta Ciudad de Los Nios, Revolucin S/N entre 5 de Febrero y Cuauhtmoc, Colonia Pueblo Nuevo. La Paz, Baja California Sur, Mxico. C.P. 23060. Telfono: (612) 122-0327, 122-9595.

Su tiraje consta de 500 ejemplares

La serie de Folletos Tcnicos est integrada por publicaciones cuyo objetivo es difundir informacin de utilidad prctica para los agentes de cambio, relacionada con conocimientos concretos y detallados sobre principios, procesos y procedimientos de un cultivo, especie de ganado o forestal. La informacin puede tener cobertura nacional, del rea de influencia de un CIR, CE, o de una localidad geogrfica especifica dentro del rea de influencie de un CE.

COMIT EDITORIAL DEL

CAMPO EXPERIMENTAL TODOS SANTOS

Presidente M.C. Jos Denis Osuna Amador

Secretario Dr. Jess Navejas Jimenz

Vocales M.C. Rigoberto Meza Snchez Ing. Erasmo Gutirres Prez

Diseo de portada M.C. No de Jess Medina Crdova

Edicin y Revisin

Comit Editorial del C.E. Todos Santos

Fotografa M.C. No de Jess Medina Crdova

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