Metodologie Cellulari Dott.ssa Valeria Crippa

UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI MILANO

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INDICE 1. Le colture cellulari ..................................................................................................................................... 4

1.1 La storia delle colture cellulari ......................................................................................................... 4

1.2 Vantaggi e svantaggi delle colture cellulari ..................................................................................... 5

1.3 Fonti cellulari ..................................................................................................................................... 6

1.4 Substrati per colture cellulari ........................................................................................................... 7

1.5 Morfologia delle cellule di mammifero............................................................................................ 8

1.6 Principali tipi di colture cellulari ....................................................................................................... 9

1.7 Colture primarie e linee cellulari .................................................................................................... 17

1.8 Le cellule staminali .......................................................................................................................... 18

2. Mantenimento di una coltura cellulare. ................................................................................................ 21

2.1 Ciclo o curva di crescita. ................................................................................................................. 21

2.2 Mantenimento della vitalità di una coltura cellulare. ................................................................... 23

2.3 Terreni per le colture cellulari. ....................................................................................................... 29

2.4 Conservazione delle cellule in azoto liquido .................................................................................. 33

3. Laboratorio per colture cellulari. ........................................................................................................... 35

3.1 Sterilità e contaminazione. ............................................................................................................. 35

3.2 Classificazione degli agenti biologici .............................................................................................. 36

3.3 Attrezzature necessarie per colture cellulari. ................................................................................ 36

3.4 Cura e mantenimento del laboratorio ........................................................................................... 43

3.5 Aspetti di sicurezza delle colture cellulari ...................................................................................... 43

3.6 Sterilizzazione del materiale per le colture cellulari ...................................................................... 43

3.7 Contaminazioni delle colture cellulari ........................................................................................... 46

4. Colture batteriche ................................................................................................................................... 48

4.1 Utilizzo di colture di batteri in biologia molecolare ...................................................................... 48

4.2 Crescita dei batteri .......................................................................................................................... 49

4.3 Colture batteriche solide e liquide ................................................................................................. 50

4.4 Conservazione dei batteri ............................................................................................................... 51

4.5 Trasformazione dei batteri ............................................................................................................. 51

4.6 Amplificazione dei batteri .............................................................................................................. 53

4.7 Estrazione del DNA plasmidico dai batteri..................................................................................... 53

4.8 Ceppi batterici: E.coli TOP 10 ......................................................................................................... 54

5. Vettori batterici ....................................................................................................................................... 55

5.1 Vettori plasmidici per batteri (o plasmidi) ..................................................................................... 55

5.2 Batteriofagi ..................................................................................................................................... 62

5.3 Cosmidi ............................................................................................................................................ 65

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5.4 Vettori e dimensioni degli inserti clonabili .................................................................................... 67

5.5 Laboratorio per i batteri ................................................................................................................. 67

6. La trasfezione: vettori virali e non virali ............................................................................................... 68

6.1 Sistemi di trasferimento genico (trasduzione)............................................................................... 68

6.2 Ottimizzazione del processo ........................................................................................................... 68

6.3 Fattori che influenzano la trasfezione ............................................................................................ 69

6.4 Metodi di Trasfezione ..................................................................................................................... 69

6.5 Il cargo ............................................................................................................................................. 70

6.6 I vettori ............................................................................................................................................ 74

6.7 Lavorare con i virus ......................................................................................................................... 99

6.8 Tipo di trasfezione: transiente o stabile? .................................................................................... 100

6.9 Sistemi inducibili ........................................................................................................................... 102

6.10 Scopo della trasfezione ............................................................................................................. 108

7. Tecnologie di editing del genoma ........................................................................................................ 112

7.1 Modifiche genomiche ................................................................................................................... 112

8. Tecniche di microscopia a fluorescenza ............................................................................................... 120

8.1 Luminescenza ................................................................................................................................ 120

8.2 Fluorescenza .................................................................................................................................. 120

8.3 Proteine fluorescenti .................................................................................................................... 122

8.4 Microscopio a fluorescenza. ......................................................................................................... 123

8.5 Applicazioni della fluorescenza in biologia cellulare ................................................................... 126

8.6 Applicazioni della fluorescenza .................................................................................................... 131

9. SAGGI SULLE COLTURE CELLULARI ....................................................................................................... 136

9.1 Saggi di vitalità cellulare ............................................................................................................... 136

9.2 Tecniche per lo studio della genesi tumorale. ............................................................................. 138

10. La Citofluorimetria ............................................................................................................................ 141

10.1 Citofluorimetro ......................................................................................................................... 141

10.2 Analisi dei dati ........................................................................................................................... 149

10.3 Controlli ..................................................................................................................................... 152

10.4 Applicazioni ............................................................................................................................... 153

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1. Le colture cellulari

Sono sistemi artificiali in cui cellule isolate dal loro ambiente, libere od organizzate in tessuti od

organi, messe in condizioni di vivere all’interno di un sistema definito, nel quale continuano a svolgere

le loro funzioni specifiche e si accrescono per un tempo limitato oppure indefinitamente. Le colture

cellulari vengono anche definiti sistemi di cellule disperse che rappresentano il grado estremo di

dissociazione di un organismo multicellulare.

1.1 La storia delle colture cellulari

La storia delle colture cellulari è relativamente recente e rappresenta la storia dello sviluppo delle

tecniche di coltura in vitro. Agli inizi del secolo XX ebbero inizio i primi studi riguardanti l’ambiente

cellulare; e numerosi ricercatori tentarono di isolare cellule dagli organismi e di mantenere vitali in

coltura frammenti di tessuto, riuscendo anche, in alcuni casi, ad effettuare esperimenti di breve

durata. Dunque, si iniziò ad ipotizzare che le cellule viventi fossero capaci di vivere in modo

autonomo. Tuttavia però, tale supposizione non condusse ad effetti pratici nel campo della biologia

sperimentale e bisognava attendere l'inizio del ventesimo secolo per i primi esperimenti riguardanti

gli studi sull'ambiente cellulare. Infatti, all'inizio del XX secolo, diversi ricercatori tentarono di isolare

gruppi di cellule degli organismi e di mantenere tali cellule vive riuscendo, anche in alcuni casi, ad

effettuare degli esperimenti di breve durata. Nel 1885 Wilhelm Roux riuscì a portare a termine i primi

esperimenti di espianto mantenendo il cervello di un embrione di pollo in una soluzione salina calda

per alcuni giorni; in questo modo si dimostrava che, le cellule di embrione di pollo, al di fuori

dell'animale, potevano sopravvivere per un certo periodo di tempo. Nel 1907 fu la volta del biologo

statunitense Ross G. Harrison, che condusse i primi esperimenti su colture di cellule animali,

utilizzando dei campioni di midollo spinale di anfibio. La scelta di questo sistema era basata sul fatto

che i tessuti animali a sangue freddo non necessitavano di un mantenimento a temperature diverse

da quelle della temperatura ambiente; e quindi, fu effettuata per la prima volta, una coltura in vitro

di frammenti di tessuto coltivando il midollo spinale di rana su un substrato biologico rappresentato

da un coagulo di linfa. Tale sperimentazione permise al biologo di dimostrare che le fibre nervose

(assoni) non erano altro che prolungamenti (o estensioni) delle singole cellule nervose. Questi

esperimenti possono essere considerati una pietra miliare nello studio del sistema nervoso in vitro;

infatti, grazie anche allo sviluppo di successive tecniche di cultura, è stato possibile ricreare in vitro

delle reti neurali che vengono utilizzate come modello di studio per analizzare i processi di

autorizzazione del sistema nervoso. Nel 1909 Francis Peyton Rous, medico virologo statunitense,

dimostrava la possibilità di mantenere in vita in una soluzione salina cellule d’embrione di pollo; e

scopriva anche che nei polli il sarcoma poteva essere indotto non solo trapiantando delle cellule

tumorali ma anche iniettando un filtrato di tali cellule. Più tardi fu provato che tale filtrato conteneva

un agente microscopico infettivo estratto dalle cellule stesse, un RNA-virus denominato in seguito

virus del sarcoma di Rous. Questa scoperta fu molto importante perché diede vita alla teoria

dell'origine virale dei tumori valse a Raus il premio Nobel. Nel 1913 il chirurgo e biologo francese

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Alexis Carrel diede notevoli contributi alla tecnica di coltivazione delle cellule in vitro, perché riuscì a

mantenere delle porzioni di tessuto di dimensione di circa 1-2 mm di diametro in specifici terreni di

coltura, in condizioni asettiche e soprattutto in condizioni osmotiche e termiche il più possibile simili

a quelle fisiologiche. Si svilupparono così le prime tecniche per la propagazione in serie di diversi tipi

di cellule, dimostrando che era assolutamente possibile la crescita ed il mantenimento di cellule in

coltura in un mezzo necessariamente asettico. Nel 1943 W.R. Earle riuscì ad ottenere le prime linee

continue di cellule di mammifero; questo fu un passo molto importante per lo sviluppo delle colture

cellulari in vitro. Molto importante fu anche la scoperta condotta nel 1951 da George Otto Gey, il

quale riuscì per la prima volta ad isolare, mettere in coltura e pagare una linea cellulare di origine

tumorale umana. In questo modo realizzava la prima linea cellulare in cultura continua, cioè una linea

cellule che era in grado di propagarsi in maniera indefinita. Tale linea cellulare prese il nome di linea

cellulare HeLa dal nome della paziente dalla quale fu espiantato il tumore. Negli stessi anni, Rita Levi

Montalcini, conduceva esperimenti fondamentali che la portarono alla scoperta della presenza di un

fattore di crescita molto importante per le cellule del sistema nervoso, ovvero il cosiddetto NGF

(Nerve Growth Factor). Harry Eagle, nel 1955, compì la prima indagine sistematica sugli elementi

nutritivi essenziali, necessari affinché una coltura cellulare possa essere mantenuta. e iniziò così a

formulare in primi terreni per colture cellulari. L’utilizzo delle colture cellulari nel campo della ricerca,

con il tuo punto di partenza effettiva nella metà del secolo scorso, negli ultimi anni è diventato pratica

comune grazie anche al miglioramento delle tecnologie, delle tecniche di sterilità e allo sviluppo di

terreni di cultura sempre più specifici e complessi. Grazie a questi fattori favorevoli, le colture cellulari

hanno avuto uno sviluppo rapidissimo che ha avuto ricadute applicative in moltissimi campi della

biologia e della medicina, permettendo una migliore comprensione dei meccanismi cellulari e

molecolari con il vantaggio di un minore ricorso alla sperimentazione in vivo. Per colture cellulari si

intendono, gruppi di cellule che vengono coltivate in condizioni controllate al di fuori del loro

ambiente naturale. Tali metodologie possono costituire un ottimo modello di studio per diverse

applicazioni della biologia cellulare e molecolare, della genetica, dell’oncologia, della ricerca di base

fino ad arrivare alle applicazioni per la ricerca di nuove strategie terapeutiche per diverse patologie.

1.2 Vantaggi e svantaggi delle colture cellulari

VANTAGGI. Un grossissimo vantaggio delle colture cellulari è legato al fatto che si riduce

l'utilizzo di animali per la sperimentazione in vivo. Quindi l'utilizzo di colture cellulari riduce o

addirittura, in alcuni casi, limita il sacrificio di animali vivi. I vantaggi delle colture cellulari sono diversi,

il principale vantaggio è quello di costituire un abbondante e omogeneo materiale di studio poiché

queste possono essere propagate. Un altro grossissimo vantaggio è legato al fatto che le colture

cellulari possono essere congelate e recuperate anche a distanza di anni. Un altro importante

vantaggio dall’utilizzo di una coltura cellulare è dato dalla facilità di controllo delle condizioni di

crescita di queste cellule, che possono essere modulate a piacimento; infatti si può interferire con il

pH, la temperatura, l’osmolarità, i nutrienti. Quindi le condizioni di crescita sono facilmente

controllabili dall'operatore. Le colture cellulari sono molto più economiche rispetto a quelle in vivo e

consentono di ottenere una risposta nell’arco di poco tempo, a volte ore o pochi giorni, cosa che

difficilmente si ottiene con un modello in vivo. Un altro grande vantaggio è che è possibile acquistare

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delle colture cellulari, in quanto esistono delle banche pubbliche di linee cellulari, e questo garantisce

l’omogeneità e la riproducibilità degli esperimenti. Nel corso degli ultimi anni, le colture cellulari,

possono essere facilmente robotizzate e, ovviamente anche in questo caso, si ha un guadagno in

termini di tempo e di riproducibilità degli esperimenti.

SVANTAGGI. Sicuramente lo svantaggio principale è che la coltura cellulare è diversa dalla

situazione in vivo, perché è necessario considerare che nel momento in cui si fa una cultura di cellule

disperse si vanno a perdere tutte quelle informazioni che derivano dal fatto che una cellula,

normalmente nell'animale, e integrata all'interno del tessuto ed è capace di interagire con le cellule

vicine che spesso sono dello stesso tipo; ma al contempo, il tessuto stesso è integrato all’interno di

un organo e ciò garantisce anche l’interazione tra cellule differenti tra loro. Questo ci fa comprendere

come nella situazione in vitro si avrà sicuramente la perdita dei rapporti tridimensionali, la perdita

dell'integrazione tra cellule diverse e di conseguenza si potrebbero ottenere delle risposte diverse

rispetto a quelle che si potrebbero ottenere nell’animale. Un altro problema scaturisce dal fatto che,

nel momento in cui si va a sviluppare una linea cellulare in vitro, molto spesso per poter mantenere

questa linea del tempo e avere materiale abbondante per lo studio è necessario trasformare queste

cellule in cellule e che sono in grado di crescere e duplicarsi in maniera indefinita nel tempo, e quindi

capaci di acquisire delle caratteristiche simili a quelle delle cellule tumorali. Come ben noto, le cellule

tumorali sviluppano delle caratteristiche completamente diverse rispetto alla cellula di partenza per

quanto riguarda l’aspetto metabolico caratteristico ovviamente della durata del ciclo cellulare

piuttosto che il ciclo cellulare stesso; dunque anche in questo caso i risultati che possiamo ottenere

potrebbero essere diversi rispetto a quelli ottenuti dalle stesse cellule quando queste vengono

studiate all'interno di un organismo vivente. Un ultimo svantaggio è dato dalla facilità di conta-

minazione di una coltura cellulare da altri tipi cellulari o da microrganismi, quali per esempio batteri

e virus, che anche in questo caso la presenza di un agente contaminante può andare ad alterare il

metabolismo cellulare.

1.3 Fonti cellulari

La maggiore fonte di approvvigionamento delle colture cellulari sono le banche cellulari, presso le

quali le colture cellulari vengono generate, stabilizzate, studiate, amplificate e distribuite ai laboratori

interessati. Le fonti di provenienza sono tre:

1. Banche cellulari. La principale banca cellulare è la ATCC (American TypeCulture Collection) in

USA; ma oltre a questa possiamo distinguere la corrispettiva tedesca, ovvero la DSMZ

DeutscheSammlungvon Mikroorganismenund Zellkulture (German Collection of Micro-

organismsand Cell Cultures), la ECACC (EuropeanCollection of AnimalCell Culture) in UK e la

corrispettiva giapponese, la JCRB (JapaneseCollection of ResearchBioresources). I vantaggi

dell’ottenere delle linee cellulari direttamente dalle banche cellulari sono molteplici:

a. sono di facile acquisizione;

b. ne viene garantita l’assenza di contaminanti (contaminant–free);

c. vengono vendute con documentazione dettagliata che comprende il certificato di garan-

zia e tutte le informazioni necessarie e utili alla loro coltivazione; ovvero, tale certificato

informa nel dettaglio sul tipo di cellula, la sua origine, il terreno di coltura da utilizzare per

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la crescita e per il congelamento, le caratteristiche di crescita, la morfologia, il numero dei

passaggi in coltura ed il cariotipo.

2. Altri laboratori. In alcuni casi si può ottenere una linea cellulare da un altro laboratorio

attraverso particolari accordi;

3. Animali. Molto spesso è possibile ottenere tali linee cellulari direttamente a partire da animali.

Bisogna tener presente che tutte le linee cellulari, anche quelle che vengono acquistate in

banche cellulari, hanno origine a partire da animali e in alcuni casi da biopsie umane. Quindi

gli animali sono la fonte principale per la generazione delle culture cellulari, ottenibili attra-

verso due differenti procedure:

a. separazione delle stesse da fluidi biologici come il sangue a seguito di un prelievo ematico

sull’animale;

b. oppure, attraverso l’asportazione (espianto) di un organo o tessuto e successiva disso-

ciazione dei frammenti multicellulari che, mediante trattamento con agenti enzimatici o

chimici, sono ridotti ad una popolazione di singole cellule.

La sospensione cellulare così ottenuta viene messa in “coltura”, cioè trasferita in contenitori

appositi contenenti miscele di sostanze inorganiche ed organiche necessarie al sostenta-

mento delle cellule. Tutte queste sostanze, nel loro insieme, fanno parte di quello che viene

chiamato terreno di crescita.

1.4 Substrati per colture cellulari

Il primo substrato è stato il vetro. Tuttavia, non tutte le cellule sono in grado di aderire al vetro (o alle

plastiche); infatti quelle che non aderiscono spontaneamente richiedono l’utilizzo di sostanze che,

rivestendo la superficie in vetro, ne permettono l’adesione. Tra le più usate possiamo trovare:

1. Collagene;

2. Polilisina;

3. Poliornitina;

4. Laminina;

5. Matrigel.

Tutte queste sostanze costituiscono la matrice extra cellulare sono responsabili della formazione di

questa rete proteica che viene sfruttata dalle integrine di membrana per poter aderire. Ovviamente

esistono dei fattori di adesione differenti e specifici per le diverse linee cellulari. Infatti, vi sono diversi

tipi di collagene a seconda del tipo cellulare che si vuole far crescere:

a. Collagene di tipo I, utile per il muscolo, gli epatociti, le cellule del ganglio spinale, le cellule di

Schwann;

b. Collagene di tipo II, utile per i condrociti;

c. Collagene di tipo IV, utilizzato per le Cellule endoteliali, epiteliali, muscolari, e nervose.

Tra tutti il fattore di adesione polilisina, insieme alla laminina, è quello più utilizzato e che può essere

condivisa per diversi tipi cellulari.

Il matrigel, è un substrato particolare di recente formulazione sviluppato per alcuni tipi di colture

cellulari, in particolar modo per le cellule staminali e per quelle pluripotenti indotte. È di origine

biologica che si ottiene a partire da una linea cellulare tumorale, nello specifico cellule di sarcoma di

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topo particolarmente ricche in proteine della matrice extracellulare, che possono essere quindi

recuperate e rese disponibili per la coltura di altre cellule. La composizione del matrigel (come tutti

tipi di matrici di origine biologica) è variabile da lotto a lotto. Per questo motivo che la composizione

è indicata come approssimativa: laminina per circa il 60%, collagene circa il 30%, entactina circa l’8%

e fattori di crescita e metalloproteine circa il 2%. In maniera generale, quando si utilizza un terreno,

una matrice o un siero di natura biologica, cambiando il lotto, è assolutamente necessario testare

nuovamente le condizioni di crescita per assicurarsi che le condizioni stabilite con il lotto precedente

siano valide anche con il nuovo lotto.

Oggi, la maggior parte delle colture in adesione vengono cresciute non su vetro ma su plastica, ma-

teriale più economico e facile da produrre nonostante sia molto più inquinante rispetto al vetro

stesso. Esistono due tipologie di plastica per colture cellulari:

1. Substrato in plastica non trattato, utilizzato per le cellule in sospensione;

2. Substrato in plastica trattato, al fine di favorire la crescita delle cellule in adesione.

L’aspetto dei due tipi di contenitori in plastica è esattamente identico, per cui è strettamente neces-

sario che l’operatore controlli le specifiche di acquisto indicate sulla confezione prima del loro utilizzo.

È importante tener presente che le piastre per colture batteriche possono essere usate per colture

cellulari in sospensione ma non per colture cellulari aderenti.

In cosa consiste il trattamento della plastica per renderla adatta ad una coltura cellulare in adesione?

Le piastre per colture cellulari aderenti sono composte da un materiale plastico in polistirene; il

trattamento che si utilizza fa sì da renderle più idrofile e cariche negativamente. In tal modo il

polistirene lega stabilmente la fibronectina e la vitronectina presenti nel siero che permettono l’ade-

sione di diversi tipi di cellule.

Tra i vari contenitori che vengono molto spesso adoperati si possono distinguere:

1. Flasks, ovvero dei contenitori a forma di bottiglia, utilizzate solitamente per mantenere la

linea cellulare e per amplificarla (a causa della loro ampia superficie di crescita rispetto agli

altri due tipi di contenitori. La chiusura ermetica tramite il tappo ne facilita il trasporto e lo

spostamento di questi contenitori.

2. Multi Well-plates, contenitori multi-pozzetto; questo formato di contenitore è spesso scelto

nel momento in cui bisogna effettuare un esperimento in diversi replicati su una determinata

linea cellulare.

3. Dishes, dischetti che presentano un diametro variabile.

1.5 Morfologia delle cellule di mammifero

Le colture cellulari vanno regolarmente osservate per esaminare la loro morfologia. Questo serve per

capire lo stato di salute della coltura cellulare e osservare eventuali contaminazioni. Dal punto di vista

morfologico le cellule di mammifero animale possono essere classificate in quattro tipologie:

1. Fibroblasti. Sono cellule bipolari o multipolari, hanno forma allungata e crescono adese al

substrato.

2. Epiteliale. Le cellule hanno una forma poligonale e dimensioni regolari. Crescono adese al

substrato in isole.

3. Linfoblastoide. Le cellule hanno forma sferica e solitamente crescono in sospensione.

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4. Endoteliale. Sono cellule appiattite, con un nucleo centrale. Hanno uno spessore di 1-2 µm e

diametro di 10-20 µm.

Inoltre vi può essere una quinta categoria: 5. Neuronale. Possono avere forma e dimensioni differenti. Sono dotati di un corpo cellulare

molto grande da cui dipartono estroflessioni corte, chiamate dendriti (o assoni nel caso dei motoneuroni). Vengono classificati in: a. Neuroni di tipo I, caratterizzati da lunghi assoni; b. Neuroni di tipo II, caratterizzati da un corpo privo di assoni (solamente dendriti).

1.6 Principali tipi di colture cellulari

Distinguiamo due tipi principali di cultura cellulare:

1. Colture di microrganismi.

2. Colture di cellule e di tessuti animali. Queste colture possono essere distinti in tre tipi di

colture cellulari:

a. Colture cellulari primarie;

b. Colture cellulari secondarie;

c. Linee cellulari.

COLTURE CELLULARI PRIMARIE. Definiamo primaria una coltura cellulare che viene generata

direttamente isolando le cellule a partire da un tessuto o un organo di un animale.

Il vantaggio principale è dato dal fatto che le cellule che si ottengono direttamente a partire dall’ani-

male per disgregazione di un tessuto o di un organo, hanno caratteristiche biochimiche e metaboliche

molto simili a quelle delle cellule in vivo, se non identiche. Lo svantaggio principale che si riscontra

nell’utilizzo di colture cellulari primarie è dovuto al fatto che tali cellule presentano una durata di vita

limitata, e di conseguenza possono essere mantenute in coltura per un tempo ridotto. Le colture

cellulari primarie possono essere distinte in tre grandi categorie:

1. colture d’organo. Consiste nell’espianto di un organo o parte di un organo e successiva-

mente mantenuto in coltura. Sono essenzialmente delle colture a breve termine (con una

durata che va a alcuni giorni a poche settimane dopo l’espianto). Sono delle colture che

vengono scelte e utilizzate quando è necessario effettuare degli studi di morfologia, di dif-

ferenziamento e di fisiologia; ovvero quando più generalmente è importante studiare le varie

interazioni tra le diverse cellule che costituiscono un organo. Questo è possibile perché

affinché l’organo mantenga inalterato il rapporto tra le sue cellule costituenti. Solitamente

viene espiantato l’organo nella sua totalità quando si lavora con gli embrioni, oppure porzioni

d’organo se queste vengono espiantate da animali adulti. Il problema principale delle culture

d'organo è dovuto al fatto che, poiché viene coltivato un tessuto tridimensionale prelevato

dal suo normale ambiente di crescita, nel momento in cui viene estratto, la rete vascolare che

lo irrora viene meno, e di conseguenza la parte più interna di tale organo tende a fenomeni

necrotizzanti, a seguito della mancanza di ossigeno e materiale nutritizio. Quindi, le limitazioni

principali riguardano le dimensioni, in quanto l’organo che viene espiantato e mantenuto in

coltura non deve avere dimensioni superiori al millimetro cubo. L'organo viene prelevato

dall'animale, e qualora di parta da un animale adulto è necessario sezionare l’organo con uno

strumento apposito, il vibratomo, in modo tale da ottenere delle porzioni d’organo che

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rispettino le caratteristiche sopra citate, ovvero che siano sufficientemente piccole da

consentire l’interscambio di nutrienti e materiale gassoso anche nelle parti più interne

dell’organo. Ovviamente se si parte da un organo ottenuto da un embrione o da un feto

animale, questo sarà più piccolo e facilmente coltivabile nella sua totalità (senza necessità di

sezione). Una volta espiantato, l’organo viene coltivato in opportuni contenitori che permet-

tono uno scambio gassoso sufficiente (ci deve essere un grande spazio d'aria per permettere

la corretta ossigenazione e lo scambio di CO2 a tutte le cellule che costituiscono l’organo

stesso). Il mezzo di coltura nel quale l’organo viene immerso deve essere necessariamente di

natura liquida o semisolido.

2. colture di frammenti di tessuto. Una piccola porzione di tessuto viene mantenuta in coltura,

general-mente amplificata. Le colture di frammenti di tessuto consentono di ottenere delle

cellule isolate e senza che sia necessario disgregare il tessuto questo è un vantaggio rispetto

all’ottenimento di colture primarie di cellule disperse perché le procedure che sono

necessarie per disgregare le cellule da un tessuto spesso sono dannose per le cellule stesse;

e quindi in alcuni casi, durante il processo di disgregazione, si assiste a fenomeni di

immortalità cellulare. La coltura diretta di un frammento di tessuto, invece, riduce tale

fenomeno. Vengono effettuate sezioni molto piccole di tessuto, e successivamente poste in

contenitori opportuni per colture cellulari (in presenza ovviamente di un terreno di crescita).

Tali sezioni di tessuto tenderanno ad aderire al substrato che gli viene fornito, e le cellule

costituenti il tessuto cominciano, dopo qualche giorno, a duplicarsi tutto intorno al

frammento in modo da ricoprire il substrato (alone di cellule). Se il frammento di tessuto viene

spostato in diversi punti della superficie del substrato, alla fine come risultato, si ottiene un

monostrato di cellule che origina dal tessuto di partenza.

3. colture di cellule disperse. Sono la tipologia di colture primarie più utilizzate. Nel caso

specifico, tali cellule vengono disaggregate in modo da formare un singolo strato che può

crescere in adesione su un altro substrato. Ad esempio possono essere ottenuti dal sangue

(in questo caso otterremo delle colture di linfociti, o macrofagi), si possono ottenere dei

neuroni (se partiamo dal tessuto nervoso) degli epatociti (attraverso il tessuto epatico) e così

via. Per poter ottenere una coltura di cellule disperse è necessario disgregare l’espianto di

tessuto (o di organo); seppur necessario, molto spesso, il processo di disgregazione porta alle

morte di alcune delle cellule originariamente presenti all'interno del tessuto e, ovviamente,

alla selezione delle cellule che sono in grado di sopravvivere e che daranno origine alla cultura

primaria vera e propria. Esistono due metodi di colture cellulari, a seconda che le cellule

interessate per la coltivazione crescano normalmente in adesione o in sospensione.

a. Colture in sospensione. Le cellule che crescono in sospensione possono crescere in un

mezzo normalmente liquido, (come ad esempio le cellule del sangue, alcuni tipi di cellule

trasformate o tumorali) senza aderire ad un substrato; mentre quasi tutte le altre cellule

sono cellule che necessitano di un substrato su cui aderire per poter crescere. Tali cellule,

nel momento in cui si origina la coltura primaria, possono essere mantenute in contenitori

(flask) non trattati allo scopo di aumentare l’adesione al substrato (adesione sfavorita), e

che necessitano di volumi di terreno di coltura elevati in modi da garantire una grande

superficie di scambio sufficiente alla crescita. Solitamente le colture in sospensione

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vengono tenute in agitazione su piastre magnetiche o su flask rotanti, per favorire tale

scambio in maniera perfettamente omogenea. Attraverso una visione al microscopio a

diversi ingrandimenti, è possibile osservare che, le cellule in sospensione presentano una

morfologia tondeggiante dovuta, per l’appunto, alla mancata adesione al substrato.

b. Colture in adesione. La maggior parte delle cellule dei vertebrati (ad eccezione di quelle

ematopoietiche) necessita di adesione ad un substrato per poter crescere (ancoraggio-

dipendenti). Tali cellule, solitamente, crescono formando una monostratificazione in due

dimensioni (2D). L'adesione di una cellula ad un substrato coinvolge le proteine della

membrana plasmatica, in particolar modo dei recettori che prendono il nome di integrine

i quali sono in grado, normalmente, di aderire con le proteine della matrice extracellulare.

Quindi, la crescita della maggior parte dei tipi cellulari dipende dalla presenza nel terreno

di crescita, e ovviamente anche sul substrato di crescita, di fattori di adesione che possono

essere sfruttati dai recettori di membrana (integrine) per poter aderire con il terreno di

crescita presente sulla piastra di coltura. La maggior parte delle cellule richiedono un certo

periodo di tempo per sintetizzare la matrice cellulare, quindi per favorire una coltura per

adesione vengono forniti dei fattori di adesione esogeni (che molto spesso sono presenti

all’interno del siero che viene addizionato al terreno di crescita). Da una visione al miscro-

scopio ottico, le cellule che crescono in adesione, si presentano con una morfologia ben

distinguibile.

Vantaggi e svantaggi delle colture in adesione. Le colture in adesione per via della loro mor-

fologia ben definita presentano tre grossi vantaggi, ovvero:

a. permettono di valutare in maniera molto rapida l’effetto che un determinato trattamento

può avere sulle cellule stesse in termini di modifiche morfologiche. Questa valutazione

infatti, risulta molto più complessa per le cellule che crescono in sospensione

b. sono facilmente manipolabili, perché per poter sostituire il terreno quando questo è stato

consumato è sufficiente aspirarlo e aggiungere un terreno fresco; mentre per le colture

in sospensione è necessario effettuare operazioni di separazione delle cellule dal terreno

che prevede l’utilizzo di centrifughe.

c. Rendono possibili le metodiche di colorazione, quindi metodiche citochimiche e immuno-

istochimiche direttamente sul supporto di crescita.

Il più importante svantaggio è legato alla superficie di crescita correlata alla quantità di cellule

necessarie (possibilità di utilizzo di microcarriers).

Vantaggi e svantaggi delle colture in sospensione. Le colture in sospensione presentano due

importanti vantaggi:

a. L’accrescimento di altre cellule all’interno dello stesso contenitore è direttamente pro-

porzionale al volume occupato;

b. Ridotte manipolazioni per l’utilizzo sperimentale.

Gli svantaggi invece sono direttamente correlati alle colture in adesione e riguardano l‘accre-

scimento per monostratificazione.

Come si realizza una coltura primaria in vitro. Per poter realizzare una coltura primaria in

vitro si deve partire da un animale vivo o da una biopsia umana. E’ assolutamente necessario avere

una licenza per l’ottenimento e l’utilizzo di cellule primarie, approvata da un comitato etico.

12

Attualmente esistono, sia a livello industriale sia anche a livello universitario, delle facilities dedicate

nei centri di ricerca per ottimizzare i costi (es. da un animale sacrificato cercare di ottenere più di un

solo tipo cellulare).

Fonti del materiale da coltura. Se si parte da un animale, si può scegliere di partire da un animale

adulto piuttosto che da un embrione e viceversa. Ovviamente, tessuti di partenza diversi avranno una

capacità proliferativa differente; ad esempio partendo da una cellula uovo, i tessuti presenti al suo

interno hanno una capacità proliferativa maggiore rispetto ai tessuti ottenuti da un embrione o da

un tessuto adulto (molti dei tessuti adulti presentano scarsa attività proliferativa per via della

presenza di una quantità maggiore di assetti cellulari già specializzati e che hanno perso tale capacità

proliferativa). È necessario capire se le cellule che si vogliono coltivare provengono a un tessuto o da

un organo, oppure se si trovano libere nel fluido biologico; e, a seconda se queste provengono da un

tessuto o da un fluido biologico, la tecnica di isolamento è differente. Nel momento in cui si vuole

generare una coltura cellulare di provenienza animale, è necessario fisare uno start-point che parta

o dall’embrione o dal tessuto adulto. Durante la scelta dello start-point, bisogna tener presente che

i tessuti adulti, oltre ad essere poco proliferativi, sono anche più difficili da disgregare e possiedono

una matrice extracellulare più strutturata. Inoltre, riguardo ai tessuti embrionali, anche se questi sono

caratterizzati da elevata attività proliferativa e presentano una resa più alta aderendo meglio al

substrato e, di conseguenza, sono più facili da mantenere in vita. Pero, non è detto che queste ultime,

se introdotte in una coltura in vitro, vadano con certezza ad assumere caratteristiche della linea

cellulare differenziata presa come oggetto di studio. Un’altra domanda che bisogna porsi quando si

va a generare una coltura cellulare riguarda lo start-point sano o malato, o meglio: si vuole partire da

un tessuto sano o tumorale? Se si parte da tessuti tumorali, questi danno vita a linee cellulari continue

con una durata di vita illimitata (ciò determina una maggiore disponibilità del materiale cellulare di

studio). Di contro, i tessuti sani danno vita a colture cellulari primarie che sono colture con una durata

di vita limitata. Però, come detto precedentemente, una cellula tumorale può avere delle caratteristi-

che metaboliche e proliferative molto diverse dalla cellula tumorale di partenza da cui si è generata.

Ottenimento di cellule primarie. A seguito dell’ottenimento dell’autorizzazione da parte del comitato

etico si procede con l’espianto.

1. Inizialmente l’animale viene profondamente anestetizzato, e di seguito sacrificato seguendo

le indicazioni del comitato etico.

2. Successivamente viene asportato un tessuto o un organo e dissezionato meccanicamente

(sminuzzato con l’utilizzo di un bisturi per disgregare le cellule che lo compongono).

3. Il tessuto disgregato viene posto a contatto con degli agenti enzimatici con azione degradativa

nei confronti della matrice extracellulare. Tra questi il più utilizzato è la tripsina, che attacca

le proteine della matrice cellulare interrompendo i legami adesivi cellula-cellula o cellula-

substrato.

4. Attraverso l’aggiunta di un inibitore al siero, viene bloccata la digestione enzimatica che

potrebbe progredire fino alle proteine della membrana plasmatica e danneggiare la cellula

stessa e le sue funzionalità.

5. Terminata la fase di separazione delle cellule, a seguito di una valutazione attraverso conta

cellulare, queste possono essere seminate (petri/flask/multiwell) o, in alcuni casi, mantenute

in sospensione.

13

Generalmente quando si vuole ottenere una linea cellulare primaria a partire da un tessuto o da un

organo, o da un fluido biologico è necessario ricordare alcune regole generali:

1. il grasso e il tessuto necrotico vanno eliminati attraverso l’utilizzo di un bisturi. Questa

operazione va effettuata con strumenti adatti, cercando di limitare i danni. Operazione da

fare sotto uno stereomicroscopio (cappa flusso orizzontale);

2. gli enzimi usati per la disgregazione devono essere inibiti (con l’aggiunta di siero) ed eliminati

(la sospensione cellulare viene sottoposta ad una blanda centrifugazione);

3. la concentrazione delle cellule nella coltura primaria deve essere superiore a quella che

servirà nella subcoltura per via del mancato attecchimento di un variabile percentuale di

cellule (ad esempio, alcune delle cellule coltivate in partenza possono non sopravvivere alla

degradazione enzimatica, e quindi nel giro di poche ore andranno incontro a morte).

4. Usare un terreno ricco di nutrienti per favorire la ripresa e l’attecchimento delle cellule

selezionate dl tessuto.

Alla fase di dissociazione enzimatica segue una fase di separazione dei vari tipi cellulari da una sospen-

sione cellulare mista; questo avviene molto spesso quando anziché partire da un tessuto si parte da

un organo o da un fluido biologico, per cui si ottengono tanti tipi cellulari diversi che necessitano di

essere separati. La separazione può avvenire in diversi modi (sfruttando diverse tecniche):

1. Separando le cellule in base alle loro dimensioni o peso centrifugandole a bassa velocità con

l’ausilio di sostanze che creano gradienti a diversa densità (Percoll, Ficoll);

2. Sfruttando diversa attitudine ad aderire a diversi substrati utilizzando specifiche molecole di

adesione;

3. Marcando le cellule con anticorpi fluorescenti specificici (reazione di coniugazione antigene-

anticorpo) che riconoscono delle specifiche proteine di membrana; successivamente vengono

separandole con uno strumento detto FACS (fluorescence activated cell sorting) che sfrutta le

differenze in scattering della luce o di fluorescenza delle cellule (metodo applicato per

separare cellule fluorescenti in una popolazione mista);

4. Utilizzando terreni di crescita selettivi che favoriscono la crescita solo di alcuni tipi cellulari

presenti in soluzione, piuttosto che altri.

Le cellule in sospensione sono più facili da ottenere rispetto alle cellule in adesione, però hanno lo

svantaggio di veicolare con sé, all'interno del fluido biologico, anche possibili agenti patogeni; per tale

ragione devono essere manipolate con estrema cautela. Esiste la possibilità di acquistare da diverse

companies, cellule primarie in coltura o congelate. Le cellule in sospensione (sangue, spermatozoi

ecc) sono cellule differenziate, quindi essendo cellule post-mitotiche non possono essere tenute in

cultura per un tempo molto lungo; per tale motivo è molto importante, ai fini della pianificazione di

un esperimento, coordinare molto bene il timing dell’esperimento con isolamento delle cellule a

partire dal fluido biologico. Il problema del timing è importante per tutte le cellule in colture primarie,

le quali sono caratterizzate da una vita abbastanza breve. A meno che non vengano trasformate

spontaneamente in una linea cellulare, ovvero una coltura cellulare in grado di replicare in modo indefinito

nel tempo (anche definita linea continua). La vita di un cellulare non è in relazione al tempo cronologico di

cultura ma dipende dal numero delle duplicazioni cellulari a cui tale cellula va incontro. La figura 1, rappre-

senta lo sviluppo di una coltura primaria. Generalmente, quando si dà il via per una coltura primaria,

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le cellule aderiscono al substrato e, se queste non sono in fase post-mitotica, cominciano a replicare

occupando tutto lo spazio fornito loro per la coltura.

Figura 1. Evoluzione di una coltura cellulare primaria.

Nel momento in cui queste occupano tutta la superficie, quello è effettuare un'operazione che si

chiama subcultura, cioè andare a staccare le cellule dal substrato su cui crescono e successivamente

seminarle su dei substrati nuovi. Questa operazione permette di mantenere la coltura in attività

replicativa costante. Generalmente se la coltura è di tipo primario, a seconda del tipo di cellule di

partenza (ad esempio cellule embrionali piuttosto che adulte) è possibile ottenere un numero di

divisioni cellulari variabile. Difatti, ogni cellula ha una vita biologica specifica che è determinata

sostanzialmente dal numero di duplicazioni alle quali è andata incontro, ed è legato strettamente alla

lunghezza dei suoi telomeri. Ad un certo punto, se la cellula non subisce mutazioni in geni di regolazio-

ne del ciclo cellulare, questa interrompe la sua attività proliferativa divenendo senescente e andando

incontro a morte per apoptosi (morte programmata). Però, talvolta accade che alcune cellule subi-

scono delle mutazioni spontanee nei geni di regolazione del ciclo cellulare e acquisiscano la capacità

di replicarsi in modo indefinito (linea cellulare continua).

COLTURE CELLULARI SECONDARIE. Sono le colture propagate in vitro a partire dalla coltura

primaria quando, giunta a confluenza, bisogna provvedere ad una subcoltura in un nuovo recipiente

e con terreno fresco. La sopravvivenza di una coltura può variare anche ampiamente:

1. colture a termine, la cui curva di crescita si conclude dopo un certo numero di replicazioni;

2. colture continue che crescono illimitatamente (a seguito di una generazione spontanea);

3. colture continue immortalizzate (attraverso manipolazione genetica).

COLTURA

SECONDARIA

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Colture a breve termine. Possono essere colture secondarie che ottengono da colture primarie

che dopo un certo numero di replicazioni vanno incontro a senescenza e quindi a morte. Le colture a

breve termine direttamente originate da una coltura primaria hanno le caratteristiche più simili alle

cellule dalle quali si sono originate e rispecchiano la situazione in vivo di quest’ultime. Presentano un

corredo cromosomico diploide con lo stesso cariotipo. Sono capaci di crescere sia in adesione che in

sospensione; e, qualora crescano in adesione al substrato, risentono dell’inibizione da contatto con

le cellule adiacenti. Una coltura a breve termine non si divide in modo indefinito, ma presenta un

numero limitato di cicli cellulari; tale numero risulta inversamente proporzionale all’età dell’animale

dal quale sono stati prelevati i tessuti. Lo svantaggio principale delle colture a breve termine è legato

al numero limitato di cellule e ciò non consente una replicazione all’infinito. Un altro svantaggio è

dovuto all’isolamento che diviene complesso da effettuare ogni qualvolta si ha bisogno della coltura

cellulare, proprio perché per poter ripetere l’esperimento è necessario ripartire dalla disgregazione

del tessuto stesso. Questi limiti ed altri motivi hanno indotto i ricercatori ad isolare dei ceppi cellulari

clonali che fossero capaci di crescita illimitata: le linee cellulari continue.

Linee cellulari continue. Sono cellule rese "immortali" mediante l’inserimento di un oncogene che

fa sì che le cellule diventino tumorali; oppure spontaneamente. il vantaggio di avere una linea

cellulare continua è che questa può crescere in maniera infinita. Questo garantisce all’operatore di

disporre sempre di materiale cellulare per gli esperimenti. Tali cellule, però, presentano lo svantaggio

di non essere sempre fedeli alla realtà (in vivo) nel momento in qui queste vengono rese immortali

(simili a quelle tumorali e non più simili alla cellula di partenza); dunque è sempre necessario

riconfermare i dati di questo ottenuti in vitro con un modello in vivo. Le proprietà caratteristiche che

vengono acquisite da una coltura primaria nel momento in cui viene trasformata in una linea continua

sono le seguenti:

1. alterata morfologia cellulare, alcune delle caratteristiche, nel caso delle cellule differenziate,

vengono perse;

2. perdita dell’inibizione da contatto;

3. perdita dell’inibizione densità dipendente;

4. perdita dipendenza dall’ancoraggio;

5. modificazione del fenotipo;

6. capacità di andare incontro ad un numero illimitato di divisioni;

7. alterazioni del cariotipo;

8. acquisizione di capacità tumorigenetiche;

9. capacità di crescita in terreni semi-solidi;

10. modificazione dello stato di differenziamento.

Metodi di immortalizzazione delle cellule primarie. Le tecniche di immortalizzazione sono differenti:

1. spontanea, come le cellule HeLa che furono isolate da George Gey nel 1951 direttamente dal

carcinoma umano della cervice uterina, l’immortalizzazione di questo tipo prevede modifiche

del tutto spontanee in geni con attività regolatoria per il ciclo cellulare;

2. chimica-fisica, mediante radiazioni UV, di tipo mirata;

3. hTERT (human telomerase reverse transcriptase). Trasfezione di un plasmide codificante per

telomerasi; usato per cellule umane.

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Si è scoperto che è possibile utilizzare delle proteine virali per indurre l’immortalizzazione cellulare.

Infatti, alcuni geni virali possono essere utilizzati per immortalizzare cellule di mammifero:

1. T antigen di Simian virus 40 (SV40), 2. Epstein Barr virus (EBV), 3. E1A and E1B di Adenovirus, 4. E6 and E7 di human Papillomavirus (HPV).

L’antigene T di SV40 è il più utilizzato. Questi geni virali immortalizzano le cellule inattivando i tumor

suppressor genes (agenti su due proteine regolatrici del ciclo cellulare, ovvero la p53, e la Rb). L’atti-

vazione della proteina p53 in seguito a danni al DNA o da ipossia porta all’arresto del ciclo cellulare

in G1 e all’induzione dei geni che riparano il DNA. Se il danno non viene riparato, la cellula va in

apoptosi. Questo è il motivo per cui l’inattivazione di tale proteina non induce un blocco del ciclo

cellulare, nessun riparo del DNA e le cellule possono continuare a replicare in maniera continua. A

questo punto, il mancato controllo dei geni regolatori sul DNA può indurre a modificazioni di tipo

genomico; dunque le linee immortalizzate in questo modo possono acquisire delle caratteristiche

molto diverse rispetto alla cellula di partenza. La proteina Rb, normalmente regola il ciclo cellulare

andando a legarsi al fattore di trascrizione E2F inducendo l’attivazione dei geni che portano la cellula

in fase S. La proteina Rb viene regolata da un sistema di fosforilazioni che portano ad un suo cambia-

mento conformazionale che fa perdere l’affinità di legame per il fattore E2F e l’avvio e la progressione

della fase S. L’antigene T di SV40, agisce su entrambe queste due proteine, andando a sequestrare

da una parte la proteina p53 e dall’altra l proteina Rb fosforillata che non può temporaneamente

legare il fattore E2F. La conseguenza dell’antigenetica T di SV40 è la mancata inibizione del ciclo

cellulare; le cellule non esercitano più controllo né sul danno al DNA né riguardo la selezione di

nutrienti corretti per la duplicazione, continuando a proliferare per un tempo indefinito. Un’altra

strategia che può essere adottata per l’immortalizzazione delle cellule è quella di sovra esprimere il

gene che codifica per la telomerasi, ovvero l’enzima deputato alla sintesi di telomeri e che è molto

attivo nelle cellule di natura embrionale e di tipo staminale. Il mantenimento in attività della

telomerasi fa sì che i telomeri risultino sempre di una determinata lunghezza, non permettendo alla

cellula di divenire senescente e successivamente apoptotica (fasi nelle quali i telomeri, normalmente,

risultano più corti). Un'altra tecnica che permette l'immortalizzazione di una linea cellulare primaria

è quella degli ibridomi; utilizzata nel momento in cui si vuole studiare delle cellule altamente

differenziate, e che di conseguenza, presentano capacità replicative molto basse o addirittura nulla

(basti pensare alle cellule post-mitotiche come i motoneuroni). Questa tecnica consiste nella fusione

di una cellula differenziata con una cellula tumorale e, tra i vari cloni che si formano, si va a selezionare

il clone con il maggior differenziamento che ha acquisito capacità replicative infinite. Generalmente

tale fusione avviene tra cellule della stessa specie (ibridomi topo-topo) oppure tra specie differenti

(topo-uomo, dove in questo caso la cellula differenziata è quella di topo e la cellula tumorale sarà

quella umana). Gli ibridomi possono essere mantenuti in coltura inalterati, anche se talvolta lo

svantaggio può essere rappresentato dal fenomeno di de-differenziamento durante i passaggi di

coltura, che fa prevalere la componente tumorale rispetto alla componente differenziata. Le cellule

ibride topo-topo sono generalmente più stabili di quelle topo-uomo. In tal caso si perdono più

frequentemente i cromosomi umani. Per l'ottenimento degli ibridomi si utilizza una tecnica che

prevede il trasferimento genico mediato da cromosomi. Questa tecnica permette la fusione di due

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cellule in un’unica cellula ibrida utilizzando il polietilenglicole (PEG); attraverso la combinazione del

materiale cromosomico delle due cellule madri (corredo cromosomico raddoppiato) mediante la

fusione dei nuclei. Solitamente anche se i nuclei appaiono fusi, i cromosomi rimangono distinti. Tale

operazione porta alla formazione di una generazione clonale successiva; per tale ragione è im-

portante, nelle prime fasi, andare a selezionare quel clone che presenta le caratteristiche di nostro

interesse, ovvero che abbia capacità replicative infinite e aspetto metabolico e fenotipico quanto più

simile alla cellulla non tumorale (differenziata). Talvolta però, come anticipato sopra, con il proseguire

della coltura, il de-differenziamento può essere dovuto anche al fatto che gli ibridomi possiedono un

corredo cromosomico duplicato e altamente instabile perché spesso durante a duplicazione possono

essere persi uno o più cromosomi in maniera indistinta. Un esempio di ibridoma è la formazione di

motoneuroni immortalizzati (come l’NSC), ottenuti a partire da una coltura primaria di motoneuroni

fusa mediante l’utilizzo di PEG con cellule tumorali di neuroblastoma. L’NSC è stato ottenuto a partire

da cellule di neuroblastoma N18TG2 fuse con dei motoneuroni primari di topo; la coltura ottenuta a

dato vita a due linee clonali (SNC19 e SNC34) di motoneuroni immortalizzati con le caratteristiche

mantenute dai motoneuroni dai quali hanno avuto origine. Da una visione al microscopio ottico è

possibile osservare, in modo netto, tali caratteristiche prettamente motoneuronali per la presenza

dei lunghi assoni che dipartono dal pirenoforo. La tecnica degli ibridomi, oggigiorno, viene utilizzata

per la sintesi degli anticorpi monoclonali. Inizialmente l’animale viene immunizzato con un particolare

antigene e, successivamente, vengono selezionate quelle cellule in grado di produrre un determinato

anticorpo di interesse. Tali cellule selezionate vengono poi fuse con delle cellule tumorali in modo da

ottenere una linea cellulare che sia in grado di produrre l’anticorpo monoclonale di interesse.

1.7 Colture primarie e linee cellulari

Scelta della linea cellulare. Quando si lavora con una coltura cellulare è importante scegliere la linea

cellulare più opportuna. La scelta viene fatta in base allo studio che deve essere compiuto; ovvero se

si studio, ad esempio, una patologia neurologica la scelta viene indirizzata verso l’utilizzo di cellule

neuronali e così via. I fattori che bisogna considerare sono i seguenti:

1. la specie (ad esempio uomo, topo ecc);

2. le caratteristiche funzionali;

3. l’utilizzo di una linea cellulare finita o continua come start-point;

4. l’utilizzo di cellule normali o trasformate come start-point;

5. le condizioni di crescita.

Di solito la prima scelta, nel momento in cui si inizia la sperimentazione, cade sull’utilizzo di linee

cellulari continue le quali sono più abbondanti, facili da reperire e mantenere in coltura e soprattutto

non richiedono alcun sacrificio di animali. Non sempre però è possibile utilizzare le linee continue,

infatti se ad esempio bisogna studiare un determinato organo in un determinato modello animale,

meglio partire da colture primarie. Quando si ha l’esigenza di studiare cellule umane, queste

potrebbero essere più difficili da ottenere (soprattutto se queste non sono cellule immortalizzate)

per via delle limitazioni legislative.

Esempi di linee cellulari. Una delle linee più utilizzate è la HEK293 human embryonic kidney,

cellule di origine umana, ottenute mediante trasformazione (immortalizzazione) virale di normali

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cellule embrionali di rene. Molto facili da crescere e trasfettare. Dal tessuto renale di scimmia

vengono isolate le COS 1,7, cellule epiteliali immortalizzate attraverso l’antigene T di SV40. Le cellule

CHO (chinese hamster ovary) sono state isolate dal tessuto ovarico del criceto, particolarmente

utilizzate per lo studio di espressione genica poiché facilmente trasfettabili. Alcune cellule di origine

neuronale sono le PC12, molto utilizzate per il differenziamento e hanno la caratteristica peculiare di

crescere con una morfologia poco differenziata in assenza di NGF o acido retinoico; in caso contrario

l’aggiunta di questi due fattori di crescita ne premette il differenziamento a neuroni maturi. In seguito

possiamo distinguere le cellule Jurkat che sono cellule che si accrescono in sospensione; le cellule

HeLa di adenocarcinoma, precedentemente citate riguardo la loro aggressività e la loro capacità di

contaminare facilmente altri tipi di cellule e, dunque, per tale ragione si prestano molto bene per gli

studi di crescita tumorale in vitro. Le cellule NHI-3T3, sono dei fibroblasti di topo che spesso vengono

utilizzate non tanto come materiale di studio ma per fornire un substrato di crescita per altre linee

cellulari.

1.8 Le cellule staminali

Finora si è visto come ottenere delle line cellulari continue in vitro a partire dall’espianto di un tessuto

o di un organo animale, oppure da un fluido biologico; come stabilire una coltura primaria e come in

alcuni casi tale coltura primaria può essere indotta a modificazioni che gli consentono di replicare in

maniera indefinita. E’ molto importante per un ricercatore avere a disposizione tanto materiale

biologico per poter condurre le sue analisi, evitando di dover partire sempre dall’animale. Sempre in

quest’ultimo esistono delle cellule primitive non specializzate in grado di generare cellule figlie sia

identiche alla cellula madre, sia differenziate lungo una o più linee cellulari, cioè trasformate in diversi

altri tipi di cellule. Tali cellule, dette staminali, sono in grado di replicare in maniera indefinita. Per

poter essere definita staminale una cellula deve soddisfare due proprietà:

1. autorinnovamento, cioè capacità di compiere un numero illimitato di cicli replicativi

mantenendo il medesimo stadio differenziativo. Il processo replicativo avviene attraverso

mitosi mantenendo sempre le caratteristiche della cellula di partenza. Questo permette

di mantenere una riserva di cellule indifferenziate che prende il nome di nicchia staminale.

2. potenza, cioè capacità di dare origine a una o più specie cellulari tramite il differen-

ziamento. Quest’ultimo corrisponde alla capacità di queste cellule di riuscire a specializ-

zarsi in cellule con caratteristiche fenotipiche, biochimiche e metaboliche diverse dalla

cellula di partenza. È un processo molto più complesso, che richiede una moltitudine di

passaggi ed è finemente regolato. Le cellule staminali, in base alla potenza, possono esse-

re suddivide in 4 grossi gruppi:

a. cellule totipotenti, possono generare tutti i tipi cellulari, svilupparsi in un intero orga-

nismo e persino in tessuti extra-embrionali (es. blastomeri);

b. cellule pluripotenti, possono generare più tipi cellulari diversi e specializzarsi in tutti i

tipi di cellule di un individuo adulto ma che, a differenza delle cellule totipotenti, non

sono in grado di generare le cellule che compongono i tessuti extra-embrionali;

c. cellule multipotenti, possono differenziarsi solamente in alcuni tipi di cellule;

d. cellule unipotenti, possono generare solamente un tipo di cellula specializzata.

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Classificazione in base alla fonte e alla funzione delle cellule staminali. Le cellule staminali

possono essere classificate in base alla fonte di ottenimento (staminali embrionali o adulte). Per

quanto riguarda le cellule staminali embrionali, queste possiedono la maggiore potenza; infatti nei

tessuti embrionali si ritrovano cellule totipotenti (le quali possono produrre anche i tessuti extra-

embrionali, ottenute dall’oocita fecondato fino allo stadio di morula), multipotenti e pluripotenti. Nei

tessuti adulti, invece si ritrovano unicamente cellule multipotenti o unipotenti.

Secondo la sorgente di derivazione si possono anche classificare in 4 tipi:

1. Staminali embrionali, dalle cellule interne di una blastocisti (cellule pluripotenti),

2. Staminali fetali, (multipotenti), presenti nell'utero, nel corso dello sviluppo fetale (gastrula) e

ottenute da feti abortiti spontaneamente o da interruzioni di gravidanza;

3. Staminali amniotiche, presenti nel liquido amniotico che circonda il feto durante la gestazione;

4. Staminali adulte, non specializzate, reperibili tra cellule specializzate di un tessuto specifico e

prevalentemente multipotenti.

Le cellule staminali embrionali e fetali servono alla formazione dell’organismo, invece le cellule

staminali. Le cellule staminali adulte servono ad assicurare il ricambio cellulare (che avviene nor-

malmente durante la nostra vita) e anche ad intervenire in caso di danno a livelli di organi (deputate

al mantenimento dell’omeostasi tissutale). Le cellule staminali adulte si trovano in diverse sedi tra

cui cervello, occhi, fegato, ossa e nei muscoli. Queste possono essere multipotenti e dare origine

solo ad alcuni tipi di cellule (ad esempio le cellule del sangue); oppure unipotenti, capaci di generare

un solo tipo di cellula specializzate.

Le cellule staminali sono un’ottima fonte di cellule per generare una coltura in vitro per la loro capaci

di autorinnovarsi. Le cellule staminali possono essere prelevate a vari livelli (dall’embrione feconda-

to, dalla blastula, gastrula, dal feto o dall’individuo adulto) per dare origine ad una linea cellulare in

vitro che, se in opportune condizioni, può mantenere la sua capacità di autorinnovamento; in alcuni

casi, se esposta a dei fattori specifici può essere indotta a differenziamento secondo la linea cellula-

re di interesse. Esistono, tuttavia, una serie di problemi etici legati all’utilizzo delle cellule staminali

per la ricerca dove il prelievo in animali di tali cellule è regolamentato da una commissione etica che

dà la sua approvazione su protocolli e sperimentazioni previste. L’utilizzo delle cellule staminali,

soprattutto quelle embrionali, sono le più interessanti dal punto di vista della ricerca, che proprio per

la loro totipotenza, possono dar origine a tutte le cellule di un organismo e ottenere cellule specifiche

differenziate utili alla ricerca. Per ovviare a queste problematiche etiche, gli studiosi han-no cercato

di trovare una soluzione per ottenere delle cellule con delle caratteristiche di auto-rinnovamento

tipica delle cellule staminali e la capacità di differenziamento in alcune linee cellulari.

Cellule iPSCs. Una scoperta molto importante, valsa poi il premio nobel ad uno scienziato

giapponese Shinya Yamanaka, è quella della riprogrammazione delle cellule adulte fino allo stato di

pluripotenza, così da ottenere una linea di cellule staminali pluripotenti indotte denominate iPSCs

(induced PluripotentStem Cells). L’obbiettivo principale dello studio di questo scienziato era quello di

riuscire riprogrammare dei fibroblasti per ottenere delle cellule pluripotenti indotte capaci di

differenziare in diverse linee cellulari (sostanzialmente quelle appartenenti ai tre foglietti germinativi:

endoderma, mesoderma ed ectoderma) partendo da cellule somatiche. La pluripotenza indotta è

stata ottenuta inizialmente da fibroblasti di topo e, nell’anno successivo anche da fibroblasti umani,

portando alla riespressione di determinati fattori (successivamente denominati fattori di Yamanaka,

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l’Oct3/4, il Sox2, il KIf4 e c-Myc) in modo da riprogrammare queste cellule ad uno stadio di

pluripotenza. La riprogrammazione dei fibroblasti prevedeva l’espianto di un frammento di cute

tramite biopsia. Successivamente si è cercato di ottenere queste cellule da una fonte più accessibile

qualora si volevano ottenere delle cellule umane; per tale ragione, degli studi hanno consentito la

riprogrammazione di cellule presenti nei fluidi biologici a partire dai linfociti, oppure particolari tipi di

cellule che possono essere rintracciate nelle urine. Da questo passo avanti si è ottenuto un notevole

vantaggio circa la facilità di ottenimento di tali cellule con un prelievo ematico, piuttosto che con una

biopsia di cute. Attraverso queste tecniche innovative si potuto cambiare radicalmente la storia delle

colture cellulari. Un secondo vantaggio sta nel fatto che è possibile ottenere una linea cellulare a

partire da un soggetto malato e che possono costituire un vero e proprio modello di studio. Lo

svantaggio di questa cellula è che nel momento in cui si va a riprogrammare una cellula somatica, le

mutazioni epigenetiche probabilmente verranno mantenute anche nelle replicazioni successive di

tale cellula riprogrammata. Se osservate al microscopio ottico, queste cellule, presentano peculiari

caratteristiche morfologiche che vi attribuiscono una forma tondeggiante di piccola dimensione e

che si accrescono attraverso colonie. Hanno la capacità si svilupparsi su due substrati differenti: su

una matrice biologica come il matrigel, oppure su un mono-strato di fibroblasti di topo che vengono

seminati, portati a confluenza e successivamente ne viene inibita la replicazione portandoli a

senescenza. Questi fibroblasti forniscono la matrice extracellulare di supporto utile alla crescita di

queste cellule. Molto importanti per queste cellule sono le condizioni di crescita poiché queste

devono essere mantenute allo stato indifferenziato. Per far questo, è importante che il terreno di

crescita venga sostituito tutti i giorni per mantenere attivi gli otto fattori di crescita necessari a

garantire la pluripotenza di queste cellule. Tra questi otto fattori, quelli più importanti che si

consumano rapidamente, e che devono essere costantemente reintegrati, sono l’FGF2 e TGF-beta1.

Limitazioni delle cellule iPSCs. La limitazione principale, per ora, è legata al costo; infatti il manten-

imento dei terreni di coltura sia per quanto riguarda la pluripotenza che per il differenziamento di

queste cellule ha un costo parecchio elevato. Un’altra problematica è legata al fatto che queste

cellule mantengono le modificazioni epigenetiche anche nelle generazioni future. Possono essere

caratterizzate da instabilità genomica e, in alcuni casi, risulta difficoltoso ottenerle.

21

2. Mantenimento di una coltura

cellulare.

2.1 Ciclo o curva di crescita.

Per poter coltivare una linea cellulare in vitro è necessario essere a conoscenza delle caratteristiche

della sua curva di crescita; questo perché ogni linea cellulare segue delle fasi ben precise di crescita

che vanno sotto il nome di curva di crescita. Tale curva non va confusa con il ciclo cellulare. È

fondamentale conoscere i parametri di crescita del ciclo replicativo delle cellule che si vuole coltivare.

Il ciclo di crescita infatti determina:

1. la densità di semina;

2. il tempo d crescita;

3. la durata di un esperimento;

4. il momento adatto per il prelievo del campione;

5. Il metabolismo cellulare.

Generalmente, all'interno di una cultura cellulare, le cellule si trovano in fasi diverse del ciclo di

crescita e, di conseguenza, si comportano in modo diverso rispetto di parametri biologici come la

proliferazione, le attività enzimatiche, la sintesi di prodotti specifici, la glicolisi, la respirazione

cellulare e l'interazione con la matrice extracellulare. Il ciclo di crescita può essere suddiviso in 3 fasi:

1. FASE LAG (o fase iniziale) di adattamento – in tale fase tutte le cellule ricostituiscono tutte le

strutture che erano state precedentemente modificate o danneggiate in seguito al distacco

dal substrato precedente. Nello specifico, si osserva un riassemblaggio del citoscheletro e

sintesi delle proteine strutturali e della matrice extracellulare e il ripristino di tutti quegli

elementi che erano stati danneggiati durante il distacco. La fase LAG corrisponde anche al

tempo immediatamente successivo alla coltura e alla semina e, proprio a causa del riadat-

tamento cellulare al substrato, il numero delle cellule in attività proliferativa è minimo (fase

di latenza).

2. FASE LOG (o fase logaritmica) in cui si osserva una crescita esponenziale. La fase Log segue

immediatamente la fase di adattamento, infatti, non appena le cellule si sono adattate alle

nuove condizioni di crescita, queste cominciano a duplicare in modo esponenziale. La durata

di questa fase è direttamente proporzionale al numero di cellule che sono state seminate in

un determinato terreno, al grado di crescita delle cellule e alla densità minima di inibizione

della proliferazione. In questa fase, circa il 90% delle cellule è in fase attiva di divisione, per

cui la fase LOG è quella in cui il modello della linea cellulare risulta maggiormente ripro-

ducibile (è la fase migliore per la vitalità cellulare, per raccogliere i campioni e per effettuare

gli esperimenti poiché questi hanno un identico grado di riproducibilità nel tempo). Bisogna

tener presente che le cellule non sono sincronizzate, cioè sono distribuite in maniera casuale

nel ciclo cellulare.

22

3. FASE PLATEAU (o fase stazionaria) in cui non si osservano più replicazioni. Tale fase inizia con

la fase terminale della fase logaritmica quando tutte le cellule hanno occupato tutto lo spazio

a loro disposizione, diventano confluenti e la replicazione viene rallentata a causa

dell’inibizione da contatto. Si assiste anche ad un rallentamento dell’accrescimento che, a

seguito di un mancato intervento sulla coltura, porta a senescenza e successivamente a morte

cellulare.

Figura 2. Ciclo di crescita.

Durante la curva di crescita di una coltura cellulare si possono osservare due diversi tipi di arresto

della crescita associati a due diversi fenomeni di inibizione:

1. INIBIZIONE DA CONTATTO. Si osserva qualora alle cellule venga a mancare l’ancoraggio con

il substrato. L’aumento in numero delle cellule all’interno della coltura cellulare fa sì che le

cellule diventino troppo confluenti e si riducano gli spazi per ancorare nuove cellule sul

substrato di partenza. Questo ne determina il blocco della crescita e della replicazione. L’inibi-

zione da contatto viene meno nelle cellule tumorali, quindi la crescita cellulare non si arresta

e le cellule si dispongono su più strati.

2. INIBIZIONE DA DENSITA’. È associata ad un blocco della crescita per la mancanza dei

nutrienti. In questo caso anche le cellule tumorali risentono dell’inibizione da densità e arre-

stano la loro crescita. Ovviamente le cellule tumorali, riescono a raggiungere delle densità di

crescita più alte perché possono disporsi in multistrati.

DIAGRAMA DI CRESCITA. È possibile disegnare un diagramma di crescita che dipende dal tipo

di cellule in coltura (le linee di coltura primaria avranno una velocità di crescita molto diversa rispetto

alle cellule immortalizzate oppure rispetto a cellule tumorali). Nel diagramma di crescita viene

23

rappresentato il tempo (sull’asse delle ascisse) e la densità (sulle ordinate). Si può osservare una fase

iniziale di adattamento con attività accrescitiva e replicativa molto bassa. La fase successiva è la fase

di accrescimento esponenziale (o fase logaritmica) che inizia solitamente dopo un giorno

dall’inserimento delle cellule sul nuovo substrato di coltura e, di solito, ha una durata di circa 2-3

giorni. Alla scadenza di tale periodo bisogna intervenire sulla coltura, altrimenti le cellule arrestano

la loro crescita per raggiungimento della confluenza. Dal diagramma della curva di crescita è possibile

estrapolare più informazioni tra cui:

1. il tempo di raddoppiamento (la più importante), ovvero il tempo (di solito a metà della fase

logaritmica) necessario a raddoppiare di concentrazione;

2. la saturazione da densità (S.D.), che si verifica qualora non venga effettuato un cambio del

terreno al tempo di raddoppiamento (operazione fortemente consigliata per mantenere la

coltura in attiva divisione).

2.2 Mantenimento della vitalità di una coltura cellulare.

L’analisi della curva di crescita fornisce informazioni su quando effettuare delle operazioni sulla

coltura cellulare in modo tale da mantenerla vitale nel tempo. Le operazioni che possono essere

apportate ad una coltura cellulare sono: il cambio del terreno oppure la subcultura.

CAMBIO DEL TERRENO. Il cambio del terreno viene effettuato prima della subcultura, quando

le cellule non sono ancora confluenti (possibilmente) e soprattutto quando si osserva un aumento

della velocità di crescita che presuppone un attivo metabolismo cellulare e un consumo rapido dei

nutrienti. Ovviamente il cambio del terreno di crescita è strettamente dipendente dal tipo cellulare

in esame (le cellule post-mitotiche consumeranno meno terreno rispetto alle cellule tumo-rali), e dal

volume nel quale si sta effettuando la coltura cellulare (ad esempio le cellule in sospensione

necessitano di un cambio di terreno più frequente rispetto a quelle che crescono in adesione).

SUBCULTURA. Una subcoltura (o passaging) è la rimozione del terreno, il distacco delle cellule

ed il trasferimento di un’aliquota di cellule da una coltura precedente in una nuova con terreno di

crescita fresco, in modo tale che le cellule non si trovino mai in una situazione di confluenza eccessiva

che porti all’arresto della crescita per inibizione da densità o da contatto.

Come si effettua una subcultura. La modalità di ottenimento della subcultura dipende fatto di avere

cellule in sospensione o in adesione. Per le cellule che crescono in sospensione è necessario mescola-

re bene la coltura, prelevare un’aliquota, lavare con eccesso di terreno fresco e in fine effettuare la

conta in modo da determinare la densità e stabilire il numero di cellule da seminare. Successivamente

è necessario risospendere l’aliquota su terreno fresco e seminare la nuova sospensione cellulare in

contenitori per coltura cellulare alla concentrazione opportuna. Molto più complessa è la subcultura

di una coltura cellulare che cresce in adesione. Partendo da una coltura cellulare primaria ottenuta

per disgregazione di un tessuto animale (o da biopsia umana), la prima volta che questa coltura arriva

a confluenza ed è necessario effettuare la subcultura rappresenta un’importante fase di transizione,

perché il primo passaggio è quello che ci consente di generare una linea cellulare secondaria e

generalmente effettuato quando la linea cellulare è cresciuta in modo da occupare tutto il substrato

disponibile. Quanto appena detto è importante poiché si cerca di massimizzare il numero di cellule

provenienti da una coltura primaria. Nel momento in cui si deve effettuare una subcultura di una

24

cultura che cresce in adesione, bisogna tener conto che le cellule vanno staccate dal substrato e che

l’adesività di queste al nuovo substrato è dipendente da proteine che usano come cofattore il calcio

e il magnesio. Dunque il distacco può essere effettuato utilizzando degli enzimi specifici (tripsina

addizionata con EDTA) che agiscono andando a degradare le proteine della matrice extracellulare,

oppure prevede l’utilizzo di metodi meccanici (ad esempio screaper, ovvero dei bastoncini che con-

sentono di staccare meccanicamente le cellule dal substrato di crescita; oppure irrigando con terreno

di crescita l’intera coltura in modo da favorirne il distacco). La tripsina è un enzima proteolitico (serin-

proteasi ottenuto da pancreas di bovino) che rompe i legami peptidici delle proteine extracellulari

che costituiscono il substrato su cui le cellule sono ancorate. La temperatura ottimale per il suo

funzionamento è 37°C ma funziona anche a temperatura ambiente. Generalmente è attiva dopo 5-

10 minuti. Viene addizionata ad EDTA, un agente chelante di calcio e magnesio, che sottrae questi

ioni alle proteine della membrana per il loro legame alla matrice, e favorisce il funzionamento della

tripsina. La tripsina viene inattivata dalle proteine presenti nel siero. Non deve essere lasciata agire

per un tempo abbastanza lungo perché potrebbe danneggiare le proteine della membrana plasma-

tica. Oltre alla tripsina esistono anche altri metodi enzimatici alternativi (Acutase e TryPLE) entrati in

commercio recentemente, meno aggressivi (maggiore efficacia) ma più costosi. Un’alternativa alla

Tripsina è l’Acutase, un enzima di origine marina scoperto recentemente, il quale esplica un’azione

proteolitica e colagenolitica. E’ utilizzato per il distacco delle colture primarie e delle cellule staminali

per la minore aggressività rispetto alla tripsina. Data la sua origine di tipo vegetale ha come vantag-

gio, rispetto alla tripsina, quello di non contenere proteine di origine animale o batteri.

Subcoltura di cellule in monostrato. Generalmente avviene secondo i seguenti step:

1. Inizialmente viene aspirato il terreno di coltura consumato. Tale operazione consente di

eliminare eventuali detriti cellulari o cellule morte.

2. Il monostrato viene lavato solitamente con terreno privo di siero, perché altrimenti questo

inattiverebbe la tripsina.

3. Viene aspirato anche il terreno di lavaggio.

4. Si introduce l’enzima proteolitico (tripsina o Acutase) in un volume sufficiente a coprire il

monostrato.

5. Successivamente si procede all’incubatura per circa 5-10 minuti ad una temperatura di 37 °C.

6. Verificare il distaccamento delle cellule, una volta trascorso il tempo di incubazione, attraverso

l’osservazione della flasks.

7. Viene bloccata l’azione della tripsina aggiungendo terreno con siero.

8. Procedere come dal primo punto della subcoltura di cellule in sospensione.

Conta cellulare. Durante la sub-coltura è possibile contare le cellule presenti nella sospensione cellu-

lare e determinare la concentrazione (procedura caldamente consigliata). L’informazione ottenuta

permetterà di effettuare una semina di un preciso numero di cellule, e quindi di standardizzare la

procedura e rendere quanto più riproducibile l’esperimento di interesse. Quanto si effettua una sub-

coltura bisogna evitare di seminare un numero di cellule troppo basso rispetto alla superficie a dispo-

sizione per la crescita; ma anche di seminare un numero di cellule troppo elevato. Il problema di una

semina troppo bassa è che questa richiede troppo tempo per arrivare a confluenza e, molto spesso,

questo provoca un arresto della crescita e l’avvio della fase senescente che le porta a morte. A tal

proposito bisogna ricordare che, ai fini dell’accrescimento, le cellule hanno bisogno di essere suf-

25

ficientemente vicine per poter interagire tra loro. Al contrario, una densità di semina troppo elevata

porta le cellule a confluenza in maniera rapida e i risultati sperimentali che si ottengono spesso non

sono riproducibili (perché viene a mancare la fase iniziale di adattamento in seguito al distacco dal

substrato per ripristinare i componenti danneggiati). Per effettuare una conta cellulare si utilizzano

delle cellette di conta, che consistono in dei reticoli con un volume noto, normalmente utilizzati

contare il numero di cellule al microscopio. Uno dei reticoli utilizzati per la conta è la camera di Burker,

fondamentalmente strutturato in nove quadrati più grandi delimitati da tre righe parallele con

all'interno quadrati e rettangoli delimitati da due righe parallele. I quadrati di solito hanno una

dimensione nota, ovvero un 1 mm di lato in modo tale che si conosca il volume delle camere minori.

Quindi, dalla area del quadrato si ottiene 1 mm quadrato, lo spessore della camera 1/10 di mm e il

volume e 1/10mm cubo. Tali informazioni serviranno per il calcolo della densità all’interno della

sospensione.

Figura 3. Camera di Burker.

È possibile inserire pochi microlitri della sospensione cellulare all’interno del vetrino di conteggio che

si distribuiranno all’interno del reticolo sfruttando il riempimento per capillarità e poi, successi-

vamente contare le cellule presenti in tre quadrati grandi (ciascuno composto da 9 quadrati minori)

e calcolarne la media.

1 2 3

4 5 6

7 8 9

26

Nella figura 4 viene proposto un esempio di conteggio cellulare utilizzando la camera di Burker. I

numeri non corrispondono ai pallini effettivamente rappresentati nel disegno. Supponiamo di aver

contato nel primo quadrato 63, nel secondo 70 e nel terzo 56 cellule. Viene fatta la media e si

ottengono 63 cellule da considerare in 1/10 di mm cubo (il volume all’interno del quale è stata posta

la sospensione cellulare). Dalla conversione dei mm cubi in mL si ottiene che la sospensione cellulare

sarà concentrata di 630.000 cellule per mL. Riassumendo in calcoli:

63 + 70 + 56 = 186 cellule contate nei tre quadrati

Densità: 186 : 3 = 63 cellule in media in 1/10 mm3

Conversione: 63 cellule in 104 mL = 63 x 104 = 630.000 cellule/mL

Dove 104 è il fattore di diluizione della cameretta.

Figura 4. Esempio di conta.

27

ESERCIZIO 1

ESERCIZIO 2

Calcolare la densità di una sospensione cellulare sapendo che la conta effettuata in 3 quadrati della camera di Burker è di 93, 105, 87 cellule. A. 950.000 cel/ml B. 95.000 cel/ml C. 950 cel/ml D. 95 cel/ml Risoluzione. media = (93 + 105 + 87)/3 = 95 cellule densità = media x fattore di diluizione della cameretta = 95 cell x 104 ml = 950.000 cel/ml.

Calcolare il numero di cellule presenti in una sospensione cellulare sapendo che la conta effettuata in 3 quadrati della camera di Burker è di 25, 37, 28 cellule e che il volume della sospensione è pari a 8 ml. A. 2,4 mln B. 240.000 C. 24.000 D. 240 Risoluzione. media = (25 + 37 + 28)/3 = 30 cellule densità = media x fattore di diluizione della cameretta = 30 cel x 104 = 300.000 cel/ml cellule totali = densità x volume finale = 300.000 cel/ml x 8 ml = 2,4 milioni di cellule.

28

ESERCIZIO 3

ESERCIZIO 4

Data una sospensione cellulare X, indicare il volume da prelevare per effettuare una semina di 10 pozzetti di una mw da 24 pozzetti a 70000 cell/pozzetto, sapendo che la conta in camera di Burker delle cellule presenti nella sospensione X è: 143; 137; 140.

A. 5 ml B. 500 ul C. 50 ul D. 5 ul Risoluzione. media = (143 + 137 + 140)/3 = 140 cellule densità = 140 cel x104 ml = 1.400.000 cel/ml cellule da seminare = 70.000 x numero di pozzetti = 700.000 cellule volume da prelevare = numero cellule / densità = 700.000 / 1.400.000 = 0,5 ml

Data una sospensione cellulare X, indicare il volume da prelevare per effettuare una semina di 10 pozzetti di una mw da 24 pozzetti a 70000 cell/ml, sapendo che: - la conta in camera di Burker delle cellule presenti nella sospensione X è 143 – 137 - 140 - Il volume da seminare in un pozzetto di una mw24 è di 0.5 ml

A. 2,5 ml B. 250 ul C. 25 ul D. 2,5 ul Risoluzione. media = (143 + 137 + 140)/3 = 140 cellule densità = 140 cel * 104 ml = 1.400.000 cel/ml volume da seminare = volume del pozzetto x numero dei pozzetti = 0,5 x 10 = 5 ML cellule da seminare = 70.000 cel/ml x volume da seminare = 70.000 cel/ml x 5ml = 350.000 cellule volume da prelevare = numero cellule / densità = 350.000 / 1.400.000 = 250 ul

29

2.3 Terreni per le colture cellulari.

I requisiti fondamentali dei terreni di coltura sono principalmente tre:

1. Fornire tutti i composti necessari alle cellule (sostanze elementari per la costruzione delle

macromolecole, substrati per il metabolismo energetico, vitamine, etc.);

2. Deve contenere un sistema tampone per mantenere il pH entro i limiti fisiologici;

3. Non deve contenere fattori tossici per le cellule.

I primi medium in cui sono state cresciute delle cellule in coltura sono quelli estratti da fluidi corporei,

tessuti di animali. Come abbiamo visto in precedenza, la formulazione di un vero e proprio terreno

specifico per le colture cellulari eucariotiche fu fatta da Harry Eagle nel 1955, il quale comprese che

le cellule di mammifero crescevano ad una determinata temperatura (37°C), sature d’umidità, in un

mezzo acquoso stamponato a pH = 7.3–7.4 (condizioni fisiologiche). Successivamente i medium natu-

rali sono stati sostituiti da quelli sintetici, poiché questi erano facilmente riproducibili e standardiz-

zabili. In commercio sono disponibili numerose formulazioni di terreni chimicamente definiti per la

coltivazione di cellule. Solo alcuni di questi terreni sono in realtà utilizzati su larga scala e si possono

acquistare come terreni liquidi oppure come miscele di componenti in polvere da sciogliere e

sterilizzare in laboratorio. Il terreno di coltura viene scelto in base alle caratteristiche e alle esigenze

del tipo cellulare utilizzato. I terreni di coltura sono caratterizzati dall’avere una formulazione dei

nutrienti utile a soddisfare le diverse esigenze di crescita. Le cellule, infatti, necessitano di fattori

nutrizionali di base per crescere in vitro come:

1. Acqua – è il costituente fondamentale dei terreni di coltura liquidi e rappresenta la

percentuale maggiore dell’ambiente cellulare;

2. Amminoacidi – Tutte le cellule necessitano di 12 aa essenziali: arginina, cisteina, tirosina, iso-

leucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptofano, istidina e valina. Inoltre

anche la glutammina è necessaria per le cellule, in quanto l’azoto contenuto nella glutammina

è l’unica fonte di purine e pirimidine per gli acidi nucleici e per NADH e NADPH. Sono tutti

della serie L (levogira). La glutammina è un amminoacido altamente instabile che nel tempo

si converte in una forma non utilizzabile dalle cellule. Deve essere aggiunta al terreno appena

prima dell’uso. Adesso ci sono formulazioni di glutammina stabile. L’aggiunta di amminoacidi

non essenziali stimola la crescita e prolunga la vitalità delle cellule.

3. Vitamine - Agiscono da coenzimi o gruppi prostetici nei processi metabolici cellulari. Quelle

più presenti sono la biotina, colina, folato, nicotinammide, pantotenato, piridossale, ribo-

flavina, tiamina. Di solito possono essere presenti anche nel siero.

4. Sali minerali inorganici, ioni ed elementi in tracce – Le cellule necessitano di elementi di base

come sodio, potassio, calcio, magnesio, azoto e fosforo; ma anche di elementi in tracce come

molibdeno, vanadio, ferro, zinco, rame e manganese. I sali inorganici influiscono in modo

determinante sulla capacità delle cellule di aderire al substato (ioni calcio) e sulla protezione

delle cellule dalle fluttuazioni del pH dovute a variazioni ambientali e a prodotti del catabo-

lismo (ioni bicarbonato/fosfato).

5. Carboidrati (monosaccaridi come il glucosio) – Le colture cellulari usano glicolisi aerobica e

anaerobica per produrre energia. La capacità di assorbimento delle cellule varia per i diversi

30

monosaccaridi, la più alta è per il glucosio, la più bassa per il galattosio. I terreni sono addizio-

nati solitamente da glucosio ad alta (4.5 g/L) o bassa (1 g/L) concentrazione;

6. Supplementi organici – vengono aggiunti nei medium complessi. Tra questi supplementi

distinguiamo proteine, peptidi, nucleosidi, lipidi ecc. Vengono aggiunti solo se la concentra-

zione del siero è bassa.

7. Somatomedina (IGF) e Ormoni – Le cellule per crescere richiedono IGF ed ormoni per

stimolare la crescita e mantenere la funzionalità e lo stato cellulare. Presenti di solito nel siero.

8. Fattori di crescita.

PRESSIONE OSMOTICA. La pressione osmotica è un parametro molto importante che viene

regolato anche dal terreno di crescita, poiché le cellule necessitano di un ambiente isotonico per la

loro crescita garantito dalla corretta composizione del terreno di crescita (in combinazione con la CO2

presente nell’incubatore). La pressione osmotica del sangue umano è circa 290 mOsm/kg che è la

pressione osmotica ideale per le colture cellulari umane.

SISTEMA TAMPONE. Il pH ideale per la maggior parte delle cellule è 7.2-7.4 (leggermente

alcalino), un pH diverso può essere molto dannoso per le cellule. La principale sostanza che causa

variazioni di pH è la CO2 prodotta con il metabolismo cellulare. Infatti l’anidride carbonica può reagire

con l’acqua per produrre l’acido carbonico secondo la seguente reazione:

CO2 + H2O ↔ H2CO3 ↔ H+ + HCO3- (1)

quindi, tutti i medium sintetici vengono addizionati di un sistema tampone (generalmente bicarbo-

nato, NaHCO3). Hanno potere tampone le soluzioni contenenti in concentrazioni approssimativa-

mente uguali:

1. un acido debole e il suo sale con una base forte (CO2/HCO3);

2. una base debole e il suo sale con un acido forte (NH3/NH4+).

Tale soluzione resiste al cambiamento in seguito ad aggiunte contenute di un acido o di una base. La

scelta di una soluzione tampone dipende dal valore di pH che deve essere mantenuto costante.Un

sistema molto usato è il tampone bicarbonato che richiede un apporto di CO2 nell'incubatore e

bicarbonato nel medium. La percentuale di CO2 deve essere del 5% accuratamente controllato (e

mantenuta costante), perché governa la stabilità del sistema tampone; motivo per cui gli incubatori

hanno un sensore e un regolatore dell’afflusso di CO2 al loro interno. Infatti, la presenza di CO2 e del

tampone bicarbonato giocano sull'equilibrio della reazione (1), garantendo che il sistema tampone si

trovi ad una corretta concentrazione e che funzioni nella maniera adeguata.

CO2

CO2

Aria

Acqua

A

31

Tale sistema tampone esplica la sua funzione sia in eccesso di CO2 nell’aria che tende a disciogliersi

nel terreno di coltura e tamponata dal bicarbonato; oppure viceversa, qualora la concentrazione di

ioni H+ fosse troppo elevata all’interno del terreno (che ne risulterebbe acidificato), l’H+ reagisce con

la CO2 attraverso la reazione inversa e, quello che si osserverebbe, è la liberazione della CO2 nell’aria.

I terreni, solitamente, sono provvisti di un sistema che consente di andare a valutare rapidamente

ogni singola variazione del pH. Questo è reso possibile grazie all’aggiunta di un indicatore, il rosso

fenolo, dal colore caratteristico a pH fisiologico di 7.3. Quando il pH si abbassa (6,8 – 7), questo in-

dicatore, può virare verso il giallo; oppure, se il pH cresce (> 7,6) vira verso il rosa magenta. La condi-

zione più frequente che si può osservare è quella in cui l’indicatore vira al giallo; tale situazione è

indice dell’aumento eccessivo dell’attività metabolica cellulare (duplicazione) responsabile di un

incremento degli ioni H+ che acidificano il terreno che pian piano si sta consumando è necessita di

essere sostituito (o addirittura una subcultura). Il colore viola indica che le cellule non sono meta-

bolicamente attive o che la regolazione della CO2 è errata. Alcuni laboratori (e alcune linee cellulari)

non utilizzano questo tipo di sistema tamponante, e utilizzano incubatori "a secco" senza CO2. Si

utilizzano sistemi tampone che non prevedono l’utilizzo del bicarbonato. Quello più utilizzato è

l’HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethansulfonic acid) che garantisce la stabilizzazione del

pH delle cellule. I terreni tamponati con HEPES sono utili quando le cellule vive devono essere mani-

polate per tempi lunghi fuori dall’incubatore. in questo caso la CO2 dell’atmosfera non è sufficiente

a mantenere il pH neutro per cui il terreno si alcalinizza con conseguente danno per le cellule. La

necessità di scambiare gas (soprattutto CO2) con l’esterno, ha fatto sì che il contenitore per coltura

cellulare dovesse prevedere tale scambio. I primi contenitori (flasks non ventilati) in plastica ave-

vano il coperchio che doveva essere leggermente svitato per consentire gli scambi; attualmente

invece, i contenitori flasks ventilati, sono caratterizzati da un tappo forato e provvisto di filtro che

permette gli scambi e garantisce che la soluzione all’interno non venga contaminata da agenti

atmosferici.

TERRENI DI COLTURA PIU’ UTILIZZATI. I terreni di coltura più utilizzati nella coltura delle cellule

sono principalmente tre:

1. MEM (Minimum Essential Medium) – più utilizzato;

2. DMEM (Dulbecco’s Modification of MEM);

3. RPMI (Roswell Park Memorial Institute Medium).

Questi terreni differiscono tra loro per il contenuto in glucosio, amminoacidi e sali minerali. Ogni

coltura cellulare ha uno specifico terreno di crescita. Se si acquista una coltura da una banca cellulare,

generalmente, viene indicato il terreno di crescita più adatto. Qualora si vogliano effettuare delle

colture di determinate linee cellulari è necessario compiere degli esperimenti su diversi terreni a

diverse concentrazioni per stabilire quello ideale. Nel MEM sono contenuti 12 amminoacidi non

essenziali, vitamine e alcuni Sali inorganici. Il DMEM, a differenza, è quattro volte più ricco in ammi-

noacidi, vitamine e glucosio rispetto al MEM; inoltre nel DMEM vengono addizionati il ferro e il rosso

fenolo. Solitamente il terreno di coltura viene acquistato e, al momento dell’uso, deve essere comple-

tato attraverso l’aggiunta di glutammina stabile, antibiotici (penicillina e streptomicina per ridurre la

contaminazione batterica) e il siero (il cui tipo e percentuali variano a seconda del tipo cellulare).

IL SIERO. Viene addizionato ai terreni di coltura per favorire la crescita cellulare. È un liquido

ottenuto dal plasma degli animali dopo la coagulazione. Generalmente, per le colture di cellule

32

eucariotiche, viene utilizzato il siero di bestiame come quello bovino. Quello che si predilige è il Cattle

serum che comprende il bovine calf serum (siero di vitello), new born calf serum (vitello neonato),

fetal bovine serum (siero fetale bovino, il più utilizzato). Il siero fetale bovino proviene dall’animale

partorito con taglio cesareo, quello di vitello neonato proviene dall’animale nato entro le 24 ore,

mentre il siero di vitello proviene da animali nati da 10-30 giorni. La scelta del siero appena nato con

taglio cesareo non è casuale, infatti l’animale prima del parto non era mai venuto a contato con

l’ambiente esterno e ha sviluppato il minor numero di anticorpi possibili. Questo diviene vantaggioso

perché si riduce la risposta immunitaria da parte delle cellule che vengono esposte a questo fluido

biologico. Sieri umani ed equini sono utilizzati solo in casi particolari.

Componenti del siero. I componenti che si ritrovano nel siero fanno parte di tre classi principali:

1. proteine, che sono i componenti principali, infatti il siero è molto ricco in albumine e globuline

(carrier per minerali, acidi grassi, ormoni), contiene fattori come la fibronectina e fetuina (che

promuovono adesione), altri fattori inibitori per la tripsina come l’alfa2-macroglobulina, e la

transferrina (lega il ferro presente nel terreno rendendolo meno tossico e maggiormente bio-

disponibile).

2. fattori di crescita, come PDGF, TGFb, EGF, FGF, IGF;

3. ormoni, come l’insulina (facilita l’uptake di glucosio), l’idrocortisone (adesione e proliferazione

cellulare, ad alte dosi è citostatico e differenziante).

4. nutrienti, come amminoacidi, glucosio, chetoacidi, lipidi, etanolamina, fosfoetenolamina;

5. minerali, tra cui ferro, rame, zinco e oligoelementi associati a proteine come ad es. selenio

che detossifica dai radicali liberi;

6. Inibitori, sostanze inibenti la proliferazione cellulare come tossine batteriche date da conta-

minazioni del siero, oppure dalla presenza di anticorpi presenti nelle g globuline del siero.

Solitamente per ridurre al minimo la risposta cellulare, il siero prelevato dal bovino deve

essere decomplementato, ovvero sottoposto an trattamento che prevede l’utilizzo di calore

(30 min a 56°C) per distruggere le molecole del complemento e le immunoglobuline che

possono essere presenti. La cascata di reazione del complemento porta alla lisi cellulare, e

quindi alla morte della nostra coltura.

Problemi nell’utilizzo del siero. Il problema principale legato all’utilizzo del siero animale è rappre-

sentato dal fatto che, essendo un fluido biologico, la sua composizione non è costante ma varia da

lotto a lotto principalmente per il fatto che deriva da animali diversi. Quindi è necessario ritestare la

compatibilità del siero ad ogni cambio di lotto. Il problema della mancanza di costanza nella compo-

sizione del siero ha fatto sì che i componenti del siero essenziali per la crescita cellulare per alcune

linee cellulari fossero stati analizzati e identificati, e questo ha permesso di mettere a punto terreni

“chimicamente definiti” che contengono alcuni dei costituenti del siero in quantità note.

Sieri speciali. Tra i sieri speciali possiamo distinguere:

1. Heat inactivated FBS: siero trattato a 56°C x 30 minuti per inattivare le proteine del comple-

mento.

2. Charcoal FBS: siero privato di ormoni. Questo siero viene utilizzato molto frequentemente

sugli studi cellulari in cui si vuole evidenziare l’effetto di un determinato ormone fornito alla

coltivazione.

33

3. Exosome-depleted FBS: siero privato di esosomi (vescicole extracellulari); questo viene utiliz-

zato nello studio delle vescicole extracellulari per la comunicazione tra le cellule.

4. Embryonic Stem Cell FBS Qualified: testato per ES e iPSC. È un siero specifico formulato per le

cellule staminale e per le iPSC.

5. Dialyzed FBS: a bassa concentrazione di piccole molecole.

Terreni speciali. Esistono una serie di terreni formulati per la crescita di particolari tipi cellulari o

particolari applicazioni.

2.4 Conservazione delle cellule in azoto liquido

Le cellule animali possono essere conservate nel tempo attraverso congelamento per poterle uti-

lizzare all’occorrenza. La conservazione prevede l’utilizzo di azoto liquido. L'azoto liquido è inerte,

privo di colore e di odore, e si trova ad una temperatura di -196 °C. Deve essere maneggiato con cura,

infatti il contatto accidentale con l'azoto liquido o con il gas che si sviluppa può provocare gravi ustioni

da freddo. Nel caso in cui il contatto sia prolungato le conseguenze possono essere lesioni molto gravi

da congelamento, dei tessuti anche a livello profondo.

COME AVVIENE LA CONSERVAZIONE. Per non restarne a corto, in laboratorio le cel-lule

provenienti da linee immortalizzate, o staminali embrionali o linee cellulari ibride vengono congelate

in azoto liquido dopo. Le cellule vengono riposte in contenitori adeguati e congelate lentamente e

poi poste in azoto liquido (-196°C). Le cellule possono restare in azoto anche per anni. Al contrario,

lo scongelamento deve essere al quanto rapido, infatti queste vengono riportate rapidamente a 37°C,

e possono essere seminate in piastre, aderiscono al substrato (che deve essere ricco di siero per

favorirne l’adattamento in fase LAG), dove cominciano a crescere e a riprodursi.

Velocità ideale di congelamento. Il raffreddamento deve essere tanto lento da evitare il formarsi di

ghiaccio intracellulare e nello stesso tempo tanto rapido da non danneggiare la cellula per disidra-

tazione; in queste condizioni il materiale biologico ha buone possibilità di sopravvivenza dopo scon-

gelamento. Un raffreddamento troppo rapido porta alla formazione di ghiaccio intracellulare ed

extracellulare, mentre un raffreddamento troppo lento conduce alla presenza di ghiaccio extra-

cellulare. La formazione del ghiaccio deve essere evitata in entrambi i casi perché induce la rottura

delle membrane cellulari. Se la velocità di raffreddamento è troppo lenta la cellula è esposta a

concentrazioni crescenti di soluti extracellulari. Se la velocità di congelamento è troppo alta si avrà la

formazione di nuclei di cristallizzazione sia nella soluzione esterna, sia all’interno della cellula. Con il

procedere del raffreddamento i nuclei si trasformano in grossi cristalli di ghiaccio. Il danno cellulare

è meccanico. I cristalli interni spaccano gli organuli subcellulari.

Crioprotettori. Oltre a regolare la velocità di congelamento, di solito vengono addizionate delle

sostanze (come glicerolo o DMSO- dimetilsolfossido) a diversa composizione chimica che hanno in

comune elevata solubilità in acqua e tossicità dipendente dalla concentrazione di utilizzo. Vengono

addizionati alla sospensione cellulare prima che questa venga congelata. La loro azione pro-ettiva si

esplica in vari modi:

1. con un’azione diretta sulla membrana cellulare;

2. si sostituiscono all’acqua e diminuiscono la formazione dei cristalli di ghiaccio;

34

3. abbassano il punto di congelamento della soluzione e permettono una maggiore

disidratazione delle cellule durante il congelamento lento.

Congelamento. Per effettuare un corretto congelamento si opera nello stesso modo di una sub-

coltura. Le cellule vengono staccate dal substrato di crescita e si procede con l’eliminazione del terre-

no di crescita e successivamente risospese in un volume ridotto di terreno di crescita addizionato

elevate concentrazioni di siero (il doppio di quella utilizzata normalmente). Al termine di tale opera-

zione si addiziona il crioprotettore. Dopo di che, le cellule vengono poste in crio-wallars (dei conteni-

tori che resistono alle basse temperature), e a loro volta posti in contenitori più grandi che consento-

no la riduzione della temperatura di 1 °C al minuto in modo da effettuare un congelamento

sufficientemente lento da non consentire la formazione di cristalli ma sufficientemente veloce da

garantire un congelamento corretto. Normalmente vengono congelati a -80 °C per una notte e, il

giorno successivo, vengono trasferiti in azoto liquido. Esistono diversi contenitori di azoto liquido in

formati differenti che consentono di contenere al loro interno dai 1000 ai 2000 crio-wallars; ma vi

sono anche sistemi di congelamento più grandi utilizzati dalle banche cellulari.

35

3. Laboratorio per colture cellulari.

3.1 Sterilità e contaminazione.

Il requisito fondamentale di un laboratorio per colture cellulari è la sterilità. È assolutamente

necessario mantenere le colture cellulari prive di contaminazione da parte di altre colture, da bat-

teri, da lieviti e virus. La contaminazione, infatti, può portare a variazioni significative del normale

metabolismo cellulare e, di conseguenza, ad una alterata interpretazione dei risultati ottenuti. Oltre

a garantire la stabilità bisogna proteggere le cellule in coltura (prodotto). Le maggiori fonti di conta-

minazione possibili in un laboratorio di coltivazioni cellulari sono generalmente dovute:

1. all’operatore, che può portare con sé virus, batteri ed altri agenti patogeni contaminanti che

possono essere presenti sulle mani, naso e bocca, abbigliamento, attraverso l’esecuzione di

una tecnica inadeguata, o addirittura, dovuta a conoscenze inadeguate di come bisogna

operare in un laboratorio di colture cellulari.

2. alle attrezzature presenti, in particolar modo il bagnomaria utilizzato per scaldare i terreni di

crescita; le centrifughe, gli incubatori, contenitori di gas e azoto liquidi, pipette ecc.

3. altri contaminanti quali additivi, cellule, materiale per coltura, terreni di coltura.

Dunque, l’operatore deve conoscere come operare in modo che questi contaminanti non possano

raggiungere la coltura cellulare. Non va dimenticato che le colture cellulari rappresentano del mate-

riale biologico e quindi è particolarmente importante, ai fini di una adeguata preservazione, che

vengano adottate delle procedure che consentano la protezione di chi lavora a contatto con le colture

cellulari. Le principali fonti di rischio per l’operatore sono le linee cellulari stesse, specialmente

quando si utilizzano linee cellulari umane (es linfociti) o primarie, in quanto sono portatrici di poten-

ziali agenti contaminanti per l’uomo. Altri esempi di fattori di rischio per l’operatore sono dovuti a

prodotti chimici speciali per le colture cellulari (DMSO, estrogeni, TPA ecc.). Per ridurre tali rischi,

l’operatore deve porre maggiore attenzione sull’importanza dell’utilizzo dei dispositivi individuali di

protezione (DPI). Tra tutti questi dispositivi di protezione che vengono forniti in un laboratorio, quelli

che sono necessari all’interno di un laboratorio microbiologico sono essenzialmente due:

1. camice bianco, il principale DPI da portare solo nell'area delle colture cellulari per evitare che

divenga un possibile vettore di contaminazione per le colture stesse. Deve consentire la

protezione di tutte le parti esposte, specialmente in tutti quei casi in cui si verifica uno sversa-

mento di liquidi. Ove è possibile, deve prevedere la possibilità di una allacciatura a collo e di

stringere i polsini (con un elastico o con un bottone) in modo tale da garantire la massima

protezione delle braccia e che non ci siano parti di pelle esposte all’ambiente.

2. guanti di lattice/nitrile – le mani sono la parte del corpo più contaminata e che si contamina

per prima. Un presupposto per poter lavorare in un laboratorio di colture cellulari l’igiene

personale delle mani, prima di indossare i guanti e nuovamente una volta terminato il lavoro.

I guanti possono essere di diversi materiali, quelli più comuni sono in lattice (o in nitrile in caso

di allergie).

È consigliato evitare di portare gioielli come braccialetti e, se si lavora senza guanti, non portare anelli,

perché sono una buona fonte di sporcizia, e quindi di contaminazione. Quindi è importante:

36

1. indossare i dispositivi di protezione individuale;

2. lavorare in condizioni di pulizia e ordine più possibile;

3. seguire delle procedure specifiche, che vengono fornite all’operatore.

3.2 Classificazione degli agenti biologici

RISCHIO BIOLOGICO. Prima della manipolazione di un determinato agente biologico è

necessario conoscere il rischio ad esso associato.

Livello di rischio. Viene definito sulla base della capacità che un determinato agente biologico può

avere di causare danni all’uomo: agenti ad alto, medio e basso rischio.

Esistono dei decreti legislativi in cui gli agenti biologici vengono classificati in quattro gruppi a seconda

del rischio. (Decreto Legislativo N° 81/08 - Allegato XLVI: Elenco degli agenti biologici classificati).

1. agente biologico del gruppo 1. Agente che presenta poche probabilità di causare malattie in

soggetti umani;

2. agente biologico del gruppo 2: un agente che può causare malattie in soggetti umani e

costituire un rischio per i lavoratori; è poco probabile che si propaghi nella comunità; sono di

norma disponibili efficaci misure profilattiche o terapeutiche (es. Escherichia coli; Clostridium

Tetani; Herpes simplex virus tipi 1 e 2);

3. agente biologico del gruppo 3: un agente che può causare malattie gravi in soggetti umani e

costituisce un serio rischio per i lavoratori; l'agente biologico può propagarsi nella comunità,

ma di norma sono disponibili efficaci misure profilattiche o terapeutiche (es. virus rabbia; virus

AIDS; virus epatite C)

4. agente biologico del gruppo 4: un agente biologico che può provocare malattie gravi in

soggetti umani e costituisce un serio rischio per i lavoratori e può presentare un elevato

rischio di propagazione nella comunità; non sono disponibili, di norma, efficaci misure

profilattiche o terapeutiche (es. virus Ebola; Virus della febbre emorragica di Crimea/Congo).

3.3 Attrezzature necessarie per colture cellulari.

Tra le apparecchiature indispensabili presenti in un laboratorio microbiologico troviamo:

1. CAPPE (O CABINE) STERILI DI SIUREZZA BIOLOGICA – Sono considerati dei dispositivi di

protezione collettiva. Difatti, sono attrezzature che impediscono la diffusione degli aerosol e

degli schizzi verso l’operatore e l’ambiente esterno. In alcuni casi, tali dispo-sitivi, possono

anche garantire la sicurezza del campione prevenendo (o riducendo al minimo) la possibilità

di contaminazioni esterne e crociate. Le cappe di sicurezza biologica sono inefficaci per i rischi

di natura chimica. In un laboratorio biologico sperimentale si indica comunemente una cappa

di sicurezza biologica come “cappa sterile”.

Funzionamento. Si basa sulla presenza di flusso laminare unidirezionale di aria sterile, filtrato

attraverso dei filtri HEPA. Questo flusso laminare, fa sì che i contaminanti possano essere

allontanati dall’area di lavoro e, soprattutto, la presenza di un flusso laminare evita la forma-

zione di vortici e di conseguenza massimizza l’effetto protettivo del flusso d’aria stesso.

L’efficacia di una cappa sterile dipende dalla presenza dei filtri HEPA (High Efficiency

37

Particulate Air). Tali filtri sono costituiti da fibre di vetro ripiegate più volte (a fisarmonica) in

modo da aumentare la superficie filtrante. Vengono posti in serie, in modo tale da aumentare

la capacità del filtro stesso di allontanare tutte quelle particelle che abbiano una dimensione

superiore a 0,3 µm di diametro. Appunto, l’efficienza è la capacità di tali filtri di trattenere

particelle di 0,3 mm di diametro e deve essere compresa tra 99,97% e 99,99%.

Cappe a flusso verticale. La loro efficacia dipende:

a. dal flusso dell’aria,

b. dalla capacità di contenimento,

c. dall’integrità dei filtri HEPA

d. dalla loro posizione nella stanza in relazione alle correnti di aria e ai movimenti del

personale (vanno poste lontano dalle zone di passaggio e da correnti d’aria pro-

venienti da porte, finestre e dall’impianto di aerazione che siano diverse da quelle

create dalla cappa stessa perché tali correnti esterne d’aria potrebbero alterare il

flusso presente nella cappa e ridurre a capacità di funzionamento della cappa stessa).

Esistono tre tipi di cappe di sicurezza biologica a flusso verticale: classe I, classe II e classe III.

a. Classe I – sono dotate di un filtro HEPA allo scarico per proteggere l’ambiente dalla

fuoriuscita di microorganismi. Si basano principalmente sul riciclo dell’aria all’interno;

viene filtrata l’aria in uscita ma non quella in entrata, di conseguenza tale aria circo-

lante immessa all’interno della cappa non è sterile e nemmeno in grado di proteggere

il campione da contaminazione. Tuttavia sono ideate per proteggere l’operatore e

l’ambiente esterno da qualsiasi agente contaminante. Come tutte le cappe a flusso

verticale sono provviste di apertura frontale. La protezione dell’operatore è possibile

grazie al flusso di aria diretto dall’esterno all’interno della cappa attraverso l’apertura

frontale. La protezione dell’ambiente avviene per la presenza di un filtro HEPA nel

sistema di scarico. Sono adatte per impieghi con agenti biologici a basso medio rischio

(agente biologico di classe I). Nello schema di preparazione della cappa di classe I si

possono distinguere:

• Una zona di preparazione, facilmente decontaminabile con pannelli rimovibili;

• Il filtro HEPA di espulsione e di parziale riciclo;

• Un filtro a carbone attivo in caso di riciclo nello stesso locale.

b. Classe II – è una cappa ventilata aperta frontalmente progettata per la protezione:

• dell’operatore

• dei prodotti al suo interno

• dell’ambiente circostante.

Nelle cappe di classe II anche l’aria in ingresso viene filtrata. Queste, infatti, sono

dotate di:

• un filtro HEPA di espulsione dell’aria (come le cappe di classe I);

• un filtro a carbone attivo in caso di riciclo nello stesso locale.

• un filtro HEPA di ricircolo che ne garantisce la sterilità dell’aria che grazie ad un

flusso verticale, cade dall’alto sul campione manipolato sul piano di lavoro.

• una zona per decontaminazione;

38

• un filtro HEPA (è quello più importante perché garantisce la filtrazione dell’area

in entrata).

c. Classe III – Queste cappe consentono di operare con agenti biologici ad alto rischio

(agenti biologici di classe III e IV). Sono cappe ventilate totalmente chiuse a tenuta

d’aria (non presentano alcuna apertura con l’esterno) e mantenute a pressione

negativa, in modo tale che nessun agente presente dentro la cappa possa uscire

all’esterno; e soprattutto, impedisce il contatto diretto tra questo e l’operatore. L’aria

in ingresso passa per un filtro HEPA e quella in uscita passa per due filtri HEPA posti in

serie. Il lavoro viene svolto con guanti a manica in gomma attaccati alla cappa.

Cappe a flusso orizzontale. Una cappa a flusso orizzontale non fornisce protezione all’opera-

tore (che viene investito direttamente dall’aria contaminata proveniente dall’interno della

cappa) e per l’ambiente. Non sono dei dispositivi di protezione collettiva. Il loro utilizzo

all’interno del laboratorio è destinato a quelle situazioni in cui si vuole proteggere unicamente

il campione (a patto che questo sia a basso rischio, o nullo per l’operatore). Generalmente

vengono utilizzate quando si vogliono coltivare delle cellule primarie a partire da cellule di

origine animale; in questo caso, l’unico interesse è quello di proteggere il campione dalla

contaminazione (il flusso orizzontale è quello che garantisce la maggiore protezione). In

alternativa si predilige l’utilizzo di una cappa di classe II (ai fini della protezione dell’operatore),

quando vengono manipolate sostanze con rischio superiore a quello degli agenti di classe I.

Sterilizzazione. A seguito dell’utilizzo di una cappa di classe I, o II , o III è bona norma procedere

con la sterilizzazione delle parti interne della cappa, del piano di lavoro, delle pareti in vetro.

Tale sterilizzazione è necessaria ai fini di eliminare i residui biologici rimasti all’interno della

cappa; viene effettuata mediante l’utilizzo di lampade germicide a UV. Le radiazioni

ultraviolette sono radiazioni elettromagnetiche prodotte dal bombardamento, con elettroni

o con un fascio di raggi catodici, di un bersaglio di metallo pesante (lampade germicide).

Risultano poco penetranti ed agiscono per trasformazione fotochimica delle basi pirimidiniche

del DNA cellulare (danneggiamento del materiale genetico del microorganismo). La steriliz-

zazione con i raggi UV è adoperata soprattutto nei laboratori scientifici per trattare l’aria e

deve avvenire quando i locali trattati non sono utilizzati. Questo perché i raggi UV sono molto

irritanti per le mucose (occhi in particolare).

Uso delle cappe. Affinché le cappe di sicurezza biologica vengano a funzionare come dispositi-

vo di protezione collettiva, è necessario che il loro funzionamento per l’utilizzo nei limiti di

queste cappe vengano spiegati a tutti i potenziali utenti. La cappa non deve essere usata se

non è perfettamente funzionante, in quanto potrebbe non garantire la protezione collettiva.

Quando la cappa (classe II) è in uso, il pannello di chiusura in vetro non deve essere aperto

oltre alla posizione di sicurezza fissata dal costruttore (alterazione del flusso d’aria generato

dalla cappa). Per lavorare sotto cappa è necessario imparare a lavorare in modo da interferire

al minimo con il flusso d’aria e quindi le attrezzature e i materiali nella cappa devono essere

ridotti al minimo e posti in fondo all’area di lavoro. Nella cappa non si devono usare becchi

Bunsen. Il caldo prodotto causa scompensi nel flusso d’aria e può danneggiare i filtri. Tutte le

operazioni devono essere eseguite nel mezzo o in fondo alla superficie di lavoro ed essere

visibili dal pannello di vetro. Il passaggio di cose e persone alle spalle dell’operatore deve

39

essere ridotto al minimo. L’operatore non deve disturbare il flusso d’aria introducendo e

togliendo ripetutamente le braccia.

Buone prassi di lavoro. L’utilizzo di una cappa sterile prevede che vengano seguite alcune

semplici norme di lavoro:

a. Accendere la cappa almeno 10 minuti prima di iniziare a lavorare per essere sicuri che il

flusso possa andare a regime;

b. Posizionare il vetro frontale, se del tipo a scorrimento, all’altezza di sicurezza per

l’operatore (20-30 cm) – in realtà nelle cappe nuove la posizione del vetro frontale è fissa

quindi non necessita di regolazione.

c. Ridurre al minimo il materiale sul piano di lavoro per evitare di alterare il flusso all’interno

della cappa;

d. Operare nella parte media e posteriore del piano di lavoro, poiché nella parte anteriore

non è garantito in quanto questa è molto esterna, e l’operatore con i suoi movimenti

potrebbe alterare il flusso stesso.

e. Rimuovere immediatamente rovesciamenti di materiale biologico, utilizzando della carta

e pulire la cappa stessa per evitare che si formino delle contaminazioni.

f. A lavoro terminato, lasciare la cappa in funzione per 10 minuti, prima di chiuderla, per

consentire al flusso d’aria di “pulire” una eventuale aero-contaminazione dispersa che si

è creata all’interno;

g. Pulizia e disinfezione della cappa ogni volta che si termina il lavoro; si possono utilizzare

come disinfettanti la candeggina od altre soluzioni alcoliche che consentono l’elimi-

nazione degli agenti contaminanti.

h. Chiudere la cappa e accendere la lampada U.V. per effettuare un ciclo di decontami-

nazione; le cappe nuove hanno un sistema automatizzato settabile durante la notte o al

mattino presto in modo tale che all’arrivo dell’operatore la cappa decontaminata è

immediatamente pronta per l’utilizzo

BIOHAZARD. Le cappe di classe IIA sono denominate cappe biohazard dalla normativa del

national federal standard 49 (usa) e sono contraddistinte da dal simbolo in fig 5. Tali cappe

sono attualmente le più utilizzate e garantiscono un’efficace protezione dal rischio biologico.

.

Figura 5. Biohazard.

40

La scelta di una cappa piuttosto che di un’altra dipende dall’agente che deve essere mani-

polato al suo interno, poiché ogni cappa (come precedentemente visto) fornisce un livello di

protezione differente.

Classe Aria in

ricircolo

CARATTERISTICHE IMPIEGHI PROTEZIONE

% operatore Ambiente campione

I

Apertura frontale, il

contenimento è dato

dall’aria esterna

richiamata

dall’apertura frontale.

Filtro HEPA sull’aria in

uscita.

Basso rischio;

micro-

organismi di

gruppo 1-2.

buono

ottimo

Scarso

IIA

70

Apertura frontale che

permette l’ingresso

dell’aria, flusso

laminare verticale

nell’area di lavoro, filtro

HEPA sull’aria in

ingresso e in uscita se

oltre al campione

biologico sono presenti

sostanze mutagene,

cancerogene e

radioattive l’aria deve

essere convogliata

all’esterno.

Medio rischio;

microrganismi

di gruppo 2-3

buona

Ottima

Ottima

IIB 1

30

IIB 2

0

III

Chiusura ermetica,

funzionamento in

pressione negativa,

accesso consentito da

guanti, filtro HEPA

sull’aria in ingresso,

doppio filtro HEPA

sull’aria in uscita.

Elevato

rischio;

microrganismi

di gruppo 4.

ottima

ottima

buona

Livelli si contenimento fisico (PCL). Quando si utilizzano agenti biologici di classe II, non è

sufficiente utilizzare una cappa sterile di casse II o classe III, ma è necessario che vengano

utilizzate delle misure preventive aggiuntive anche sull’ambiente in cui si trova la cappa. In

particolar modo, si devono attuare delle strategie che garantiscano un buon livello di con-

tenimento fisico del materiale biologico all’interno della stanza; tale livello può essere diviso

in varie classi:

a. classe 2 (PCL-2) – prevede che la cappa e l’ambiente di lavoro siano a pressone negativa per

evitare la fuoriuscita di qualsiasi agente biologico;

41

b. classe 3 (PCL-3) – prevede la presenza di una pre-camera a pressione negativa che preceda

la camera in cui vengono effettuate le manipolazioni sul materiale biologico – solitamente,

questo ambiente aggiuntivo serve alla preparazione dell’operatore stesso.

c. classe 4 (PCL-4) - prevede la presenza di una serie di stanze a pressione negativa crescente

che precedono la camera in cui vengono effettuate le manipolazioni sul materiale bio-

logico. L’accesso a tali camere avviene in maniera unidirezionale.

2. INCUBATORI AD ATMOSFERA CONTROLLATA - E’ quello strumento che garantisce le

condizioni corrette di temperatura (28-37 °C), umidità (95%), pressione di anidride carbo-nica

(5-10%) indispensabili alla sopravvivenza della coltura stessa. Bisogna sempre tenere

presente che le colture cellulari necessitano di una fine regolazione su alcuni parametri come

il pH, l’osmolarità e la temperatura; questi, infatti vengono mantenuti dall’incubatore. Gli

incubatori contengono al loro interno una serie di ripiani sui quali possono essere esposti i

contenitori per colture cellulari (flasks, multiwell, dishes ecc), e solitamente sulla parte più

bassa sono provvisti di una bacinella in cui viene posta dell’acqua (con disinfettante) per

garantire la quantità di umidità necessaria all’interno dell’incubatore stesso. Ogni incubatore

prevede la presenza di un sistema a doppia porta, una interna in vetro e un’altra esterna di

materiale differente. La porta interna garantisce la tenuta stagna dell’umidità, della

temperatura e della CO2; mentre quella più interna in vetro permette all’operatore di osserva-

re all’interno dell’incubatore senza dover manomettere la porta esterna. Il sistema elettrico

di cui è dotato, consente all’incubatore di monitorare i parametri sopracitati.

Perché è importante regolare la temperatura? Le cellule sono in grado di crescere ad una

temperatura quanto più simile a quella fisiologica (37°C), talvolta possono sopportare situa-

zioni di ipotermia non inferiore a 28 °C. Difficilmente queste sopportano l’ipertermia, infatti

piccoli aumenti di temperatura per brevi periodi portano a notevoli alterazioni ed in alcuni

casi a morte.

A cosa serve l’umidità? L’acqua posta sulla parte bassa dell’incubatore è di fondamentale

importanza perché garantisce il corretto mantenimento dell’osmolarità della coltura cellu-

lare. Infatti, nel momento in cui vene il materiale viene mantenuto ad una temperatura di

37°C si assisterebbe ad un fenomeno di evaporazione in assenza di umidità. Ciò costituirebbe

una variazione drastica dell’osmolarità all’interno della soluzione.

Cosa accade se mettiamo una piastra contenente le cellule nel medium di coltura in un

incubatore privo di acqua? Durante la coltura cellulare deve essere rispettata la condizione di

isotonicità del terreno. Se il terreno che viene posto è ipertonico si assiste ad un rag-

grinzimento delle cellule; in condizioni di ipotonicità, le cellule catturano molta acqua e

rischierebbero di scoppiare.

Il pH. Il terzo parametro che viene ad essere regolato dall’incubatore è il pH. Precedentemen-

te abbiamo visto come i terreni di coltura sono generalmente addizionati di un sistema tam-

pone bicarbonato per consentire il mantenimento di tale parametro a seguito dell’intenso

metabolismo cellulare che ne acidificherebbe il terreno stesso. Però per poter funzionare, il

sistema tampone deve essere in presenza di determinato parametro pressorio di anidride

carbonica che viene fornita, in questo caso, dall’incubatore. Diminuendo la pressione della

CO2 l’efficacia del tampone si riduce del 75% in meno di 5 minuti.

42

All’interno dell’incubatore c’è una pressione pCO2 pari al 5% che corrisponde alla pCO2

cellulare misurata all’interno dei tessuti. Talvolta l’incubatore può essere anch’esso fonte di

contaminazione batterica, motivo per cui deve essere mantenuto pulito da agenti conta-

minanti attraverso l’utilizzo di soluzioni alcoliche e disinfettanti. Viene, di solito, ridotto il

rischio di contaminazione aggiungendo un agente anti-micotico all’acqua posta all’interno

dell’incubatore (infatti proprio l’acqua è una delle principali fonti di contaminazione). Alcuni

incubatori permettono la possibilità di effettuare un ciclo di sterilizzazione (per un tempo di

24 ore) in assenza del campione poiché ciclo di sterilizzazione, solitamente, è di tipo termico.

Altri tipi di incubatori hanno la parte interna fatta in rame, in quanto questo è un agente

antimicrobico naturale.

3. BAGNO TERMOSTATATO AD ACQUA (BAGNOMARIA) – consente di scaldare e portare ad

una temperatura di 37°C (temperatura pari a quella dell’incubatore) i terreni e tutto ciò che

deve essere messo a contatto con le cellule.

4. MICROSCOPI OTTICI – È un microscopio rovesciato a contrasto di fase che permette di

osservare la coltura cellulare e di valutarne:

a. Stato di proliferazione;

b. Stato di salute;

c. Parametri morfologici;

d. Parametri fisiologici delle colture;

e. Presenza di agenti contaminanti.

5. CENTRIFUGA – Le centrifughe sono molto utilizzate per le colture cellulari, per il

mantenimento, il congelamento/scongelamento ed il frazionamento subcellulare. Servono

principalmente a separare le cellule ad un mezzo fluido attraverso una blanda accelerazione

centrifuga di 300 giri per 5 minuti, che permette la sedimentazione delle cellule ma non il loro

danneggiamento. L’operazione di centrifugazione viene effettuata diverse volte durante la

coltivazione di una linea cellulare; basti pensare che nel momento in cui si effettua una

subcultura, il protocollo spesso prevede l’aggiunta di un agente di tipo enzimatico che con-

sente di staccare le cellule dal substrato. Una volta effettuata tale operazione è necessario

rimuovere l’agente enzimatico grazie all’utilizzo di una centrifuga. Un altro step in cui potreb-

be essere utile l’utilizzo di centrifuga per rimuovere il crioprotettore (durante lo scongela-

mento) o per concentrare le cellule per poterle in seguito congelare. Le centrifughe hanno il

grosso svantaggio di essere degli strumenti in cui possono venire a generarsi delle contamina-

zioni. Infatti, per loro natura le centrifughe producono aerosol, per minimizzare i rischi sono

spesso dotate di coperchi trasparenti per controllare l’interno senza aprire e vanno pulite

molto frequentemente da parte dell’operatore prima e dopo l’utilizzo. L’apparecchio deve

essere ben bilanciato prima di far partire il giro di centrifugazione per garantire un corretto

funzionamento della centrifuga stessa, al fine di impedire lo sversamento di liquido biologico

al suo interno.

6. PLASTICHERIA E VETRERIA – In un laboratorio di colture cellulari è indispensabile tutta una

serie di materiale in plastica o in vetro. Il vetro normale/pyrex (vetro borosilicato è un

materiale robusto resistente agli sbalzi termici e con un basso coefficiente di dilatazione). Gli

strumenti in vetro possono essere provvisti di scala graduata. Lo strumento principale che

43

possono essere utilizzate sono le pipette Pasteur (opportunamente sterilizzate prima

dell’utilizzo). Talvolta si predilige l’utilizzo di plastica consumabile (monouso)che viene

acquistata già sterile dal produttore, attraverso l’utilizzo di radiazioni ionizzanti. Tali radiazioni

sono fotoni ad elevata energia. Le radiazioni ionizzanti agiscono trasferendo la loro energia

all’interno della cellula colpita, la cui sensibilità è proporzionale alla quantità di DNA presente,

che viene alterato. In un laboratorio per colture cellulari, normalmente, vengono utilizzati dei

pipettatori che permettono di prelevare una certa quantità di liquido e dispensarlo all’interno

dei contenitori per colture cellulari. Molto utilizzate sono anche le micropipette.

3.4 Cura e mantenimento del laboratorio

Per operare in maniera corretta all’interno di un laboratorio per colture cellulari è necessario man-

tenere l’ambiente quanto più pulito possibile, per cercare di ridurre al minimo il rischio di contamina-

zione. Altro accorgimento importante è quello di controllare spesso il livello dell’acqua nell’incubato-

re per assicurarsi che venga mantenuto costante il livello di umidità all’interno dell’apparecchio. Per

mantenere l’ambiente di lavoro pulito, le superfici (banconi, pavimenti e pareti) presenti in

laboratorio devono essere lisce e facili da pulire. Devono essere resistenti all’acqua e resistenti a

diverse sostanze chimiche (acidi, alcalini, solventi e disinfettanti). Negli ambienti dove viene utilizzato

l’azoto liquido il pavimento deve essere resistente alla sostanza.

3.5 Aspetti di sicurezza delle colture cellulari

Sul sito www. Europe.osha.eu.int si possono leggere tutte le direttive europee per la salute e la sicu-

rezza sul lavoro (in cui sono indicate anche le direttive di lavoro in un laboratorio). La valutazione del

rischio deve essere intrapresa prima di iniziare un’attività. È importante identificare e valutare un

rischio associato ad un determinato agente biologico, in modo tale da poter definire quali sono le vie

efficaci volte a minimizzare tale rischio.

Rifiuti biologici. Un altro aspetto importante è il corretto smaltimento dei rifiuti biologici (rifiuti che

si sono generati per contatto con il materiale biologico. I rifiuti biologici devono essere smaltiti

secondo la normativa nazionale in appositi contenitori (ecobox). Il colore che indica il rischio infettivo

ed il pericolo biologico è il colore giallo.

3.6 Sterilizzazione del materiale per le colture cellulari

Le colture cellulari necessitano di condizioni di sterilità. E’ necessario che tutto il materiale utilizzato

(e che deve entrare a contatto con le colture cellulari) sia sterile.

Differenza tra sterilizzazione e disinfezione. Per sterilizzazione si intende la distruzione o

eliminazione di tutte le forme viventi; per disinfezione, invece, ci si riferisce all’eliminazione degli

agenti capaci di causare infezione o malattia.

Importanza della sterilizzazione. Tale pratica è molto importante perché gli agenti inqui-nanti

possono andare ad alterare la normale crescita di una coltura cellulare, perché questi sono in grado

di sottrarre nutrienti al terreno di crescita. Avendo un metabolismo molto più rapido rispetto alla

coltura cellulare di mammifero, solitamente, i batteri tendono ad acidificare il medium rapida-mente

44

e soprattutto producono metaboliti che possono essere tossici per le cellule. Se è presente una

contaminazione all’interno della coltura cellulare allora i risultati non saranno attendibili e quindi

bisognerà partire da zero.

Tecniche di sterilizzazione. Variano a seconda del materiale che deve essere sterilizzato.

Le soluzioni, generalmente, vengono sterilizzate mediante calore o filtrazione utilizzando appositi

filtri con pori del diametro di 0.2mm (capaci di trattenere tutte le particelle di diametro superiore).

La sterilizzazione del materiale solido è fatta mediante calore. La sterilità del materiale monouso è

stata fatta, all’atto della produzione, utilizzando radiazioni uv, raggi gamma o ossido d’etilene.

Sterilizzazione mediante calore (più utilizzata). Il calore è considerato il mezzo più sicuro, rapido ed

economico per qualsiasi materiale che non sia termolabile. Il tempo di sterilizzazione decresce con

l’aumentare della temperatura. Il calore può essere usato essenzialmente in due modi:

1. Secco (incenerimento, stufa);

a. Incenerimento. Si realizza attraverso la fiamma del Bunsen, che oggi ha impieghi limitati

perché il rischio fisico associato a tale metodologia è abbastanza elevato (infatti per la

ricurezza dell’operatore è consigliato di non utilizzare fiamme libere all’interno dell’am-

biente di laboratorio). Trova impiego nella sterilizzazione di strumenti di laboratorio

metallici (anse, aghi), pipette di vetro per aspirare il medium dalle piastre.

b. Stufa di calore. Trova impiego nella sterilizzazione della vetreria, di ferri chirurgici (per la

preparazione di colture primarie). Utile per materiale termoresistente, non corrode. La

sterilizzazione in stufa, richiede tempistiche più lunghe. Generalmente le stufe di calore

sono apparecchi con al loro interno una serie di ripiani sui quali viene alloggiato il materia-

le da sterilizzare; sono dotate di un sistema di regolazione della temperatura che consente

la regolare la temperatura per il riscaldamento iniziale e di impostare la fase di regime.

2. Umido (ebollizione, autoclave). Viene ottenuta principalmente all’interno i strumenti che

prendono il nome di autoclave.

a. Autoclave. Utilizza vapore ad una temperatura di 121 °C alla quale le più resistenti spore

batteriche vengono distrutte in 5-10 min. Un’autoclave può essere immaginato come una

sorta di pentola a pressione che può essere, in alcuni casi, molto semplice come realiz-

zazione e come utilizzo oppure prevedere un sistema di riciclo dell’aria molto più com-

plesso. Trova impiego nella sterilizzazione di materiale di vetro, materiale in gomma o

plastica (resistenti alla temperatura), ferri chirurgici (per la preparazione di colture pri-

marie), soluzioni acquose, terreni di coltura in brodo o agarizzati, purché privi di sostanze

deperibili alle alte temperature (es. Siero). Se le soluzioni sono sterilizzate in contenitori

sigillati, bisogna aspettare molto tempo prima di aprire l’autoclave per consentire un

sufficiente raffreddamento ed evitare esplosioni.

In entrambi i casi l’azione biocida del calore deriva dall’ossidazione dei costituenti cellulari con

denaturazione irreversibile degli enzimi e delle strutture proteiche. La sensibilità del calore varia in

rapporto al loro contenuto in acqua: più questa è alta, più sensibili sono i microrganismi al calore. Il

vapore è un migliore conduttore termico rispetto al calore secco, quindi a parità di temperatura, la

sterilizzazione è raggiunta in un tempo minore. Le sostanze volatili e i solventi (etanolo, isopropanolo,

acetone, fenolo, alcol isoamilico, formaldeide, formammide, guanidina isotiocianato) non devono mai

45

essere messe né in autoclave né in stufa. Le temperature e i tempi di sterilizzazione dipendono dal

metodo utilizzato.

TEMPERATURE E TEMPI DI STERILIZZAZIONE

Metodo di sterilizzazione Temperatura (°C) Tempo (min) Pressione (atm)

STUFA

140

150

160

170

180

150

120

60

AUTOCLAVE

112

121

134

30

15

10

+ 0,5

+ 1

+ 2

In qualunque processo di sterilizzazione effettuato col calore si possono individuare tre fasi distinte,

in cui la temperatura del sistema varia:

1. fase di riscaldamento (iniziale) - fase in cui si osserva l’aumento della temperatura ma che

non dà luogo alla sterilizzazione; infatti è importante che lo strumento arrivi alla temperatura

impostata e solo a quella temperatura si inizia a calcolare il tempo necessario;

2. fase di regime – fase in cui avviene effettivamente la sterilizzazione poiché tutto il materiale

è esposto ad una temperatura costante per un tempo definito;

3. fase di raffreddamento - tale fase è una fase di riassestamento, che consente al materiale di

tornate alla temperatura ambiente.

P

0 t

Riscaldamento Sterilizzazione Scarico Asciugatura

Figura 6. Processo di sterilizzazione.

46

Al termine del processo è possibile verificare se la sterilizzazione è avvenuta correttamente. Esistono

dei sistemi di rilevazione molto semplici che consistono in dei nastri adesivi contenenti al loro interno

delle parti termosensibili che cambiano colore al raggiungimento della temperatura desiderata. Ci

sono nastri per la sterilizzazione a secco e per quella in autoclave. Esistono anche dei sistemi più

tecnologici per determinare l’efficienza del processo di sterilizzazione; infatti questi non sono altro

che delle bande cangianti a seconda se il processo di sterilizzazione si avvenuto o meno.

3.7 Contaminazioni delle colture cellulari

Le principali cause di contaminazione delle colture cellulari sono rappresentate da batteri, lieviti,

muffe, micoplasma e cross-contaminazione da parte di altre cellule. Come si è detto in precedenza, i

problemi delle contaminazioni sono dati dalla:

1. competizione da parte delle cellule contaminanti per i nutrienti del terreno di crescita;

2. secrezione di sostanze acide/alcaline, o tossiche (es. perossido di idrogeno – H2O2) che

alterano la crescita;

3. degradazione di arginine e purine portando all’inibizione della sintesi degli istoni e degli acidi

nucleici;

Batteri. I batteri sono facilmente individuabili al microscopio a contrasto di fase, poiché questi

vanno a modificare una serie di parametri di crescita della coltura cellulare.

Lieviti. Possono avere forme svariate, di solito sono molto piccoli e di colore scuro. La loro forma “a

catenella” è il risultato di una crescita per colonie; tali catenelle risultano rifrangenti se osservate al

microscopio.

Micoplasma. È una delle contaminazioni più frequenti e subdole per le coltivazioni cellulari. Infatti, a

differenza degli altri due classi di microrganismi sopra citati, non può essere osservata al micro-scopio

ottico ma necessita di altri sistemi di rilevazione. I micoplasmi sono dei batteri molto piccoli (0.2 to

0.3 μm in diametro) le cui dimensioni risultano inferiori rispetto ai filtri per i terreni cellulari. Sono gli

organismi più piccoli del regno animale, privi di parete cellulare (questo costituisce una grossa

variabilità della morfologia cellulare) e con una capacità proliferativa accentuata e un genoma di solo

600-2200 kb. Secondo tali caratteristiche si rivelano essere gli organismi più pericolosi dei sistemi

cellulari di laboratorio, per via della loro difficoltà di eliminazione. Di solito quando si osserva una

contaminazione da micoplasma, l’unica strategia che si può attuare è quella di eliminare la coltura

cellulare contaminata e di ripartire da uno stock non contaminato.

COME RILEVARE LE CONTAMINAZIONI. I metodi che permettono di intuire la pre-senza di un

contaminante all’interno della coltura cellulare sono diversi, partendo dall’osservazione al

microscopio ottico. Questo permette all’operatore di identificare la presenza di un agente contami-

nante, anche quando questo è un micoplasma attraverso le variazioni della normale crescita delle

cellule che vengono osservate:

1. variazioni della curva di crescita;

2. cambiamenti di tipo morfologico delle cellule in coltura;

3. ridotta adesione (molto spesso a causa di micoplasma);

4. comparsa di cellule che presentano vacuoli;

5. sofferenza generale delle cellule contaminate.

47

I sistemi che consentono di individuare le contaminazioni (quando queste sono macroscopiche),

prevedono l’osservazione di alcuni parametri che sono sostanzialmente delle alterazioni nel terreno

di crescita:

1. comparsa di torbidità;

2. cambiamenti nella velocità di crescita;

3. viraggio improvvisto dell’indicatore del pH (utilizzando il rosso fenolo, se si assiste ad un cam-

bio di colore da rosso a giallo può determinare la presenza di un agente contaminante);

4. riotta adesione;

5. presenza di cellule multinucleate;

6. vacuolizzazione delle cellule;

7. corpi di inclusione;

8. lisi cellulare.

Lieviti, batteri e fungi mostrano effetti visibili sulla coltura (cambiamento torbidità e pH del medium) e possono essere visti al microscopio. Come rilevare una contaminazione da Micoplasma. Il Micoplasma può essere rilevato per staining

diretto del DNA con un intercalante fluorescente del DNA (Hoechst 33258). La colorazione che si

ottiene avrà un differente esito a seconda se le cellule siano contaminate o meno da micoplasma. Se

le cellule non sono contaminate, l’agente intercalante colorerà solamente i nuclei delle cellule;

mentre in presenza di una contaminazione da micoplasma, tale agente si intercala anche nel DNA del

micoplasma e si ottiene la tipica colorazione “a cielo stellato” in cui si osservano i nuclei delle cellule

di dimensioni maggiori e a fianco piccole macchie di fluorescenza che caratterizzano la presenza

dell’agente contaminante. Tuttavia, esiste una tecnica più efficace per osservare la presenza di mico-

plasma, ovvero la PCR. Per effettuare la PCR, l’operatore di avvale di specifici kit in cui vengono forni-

ti i reagenti (primer) specifici per il DNA del micoplasma. Si preleva una piccola aliquota del terreno

di crescita, e si scalda portando a bollore per circa 10 min in modo da denaturare il DNA cellulare e

successivamente si aggiungono i reagenti specifici all’interno del kit. Alla fine della PCR è necessario

eseguire l’elettroforesi su gel e osservare il risultato ottenuto. Se è presente il micoplasma si ottiene

una banda di amplificato, in caso contrario non apparirà alcuna banda. Il modo migliore per eliminare

una contaminazione è buttare via la linea cellulare, sterilizzando tutto e ripartendo da una linea

cellulare non contaminata.

48

4. Colture batteriche

La scelta di coltivare e studiare i batteri nasce dal fatto che queste cellule procariotiche sono molto

semplici, e si sono rivelate fondamentale importanza per lo studio di determinati aspetti della biologia

molecolare piuttosto che della biochimica. Tali cellule possono essere utilizzate per ingegnerizzare

colture di cellule di mammifero.

4.1 Utilizzo di colture di batteri in biologia molecolare

La maggior parte degli studi condotti e delle scoperte fatte in merito alla sintesi, alla replicazione e

su diverse vie metaboliche cellulari sono stati ottenuti su queste cellule proprio per la loro semplicità.

Le cellule procariote utilizzate per la produzione (librerie genomiche, cromosomiali, a DNA

complementare), esoprattutto l’amplificazione, di DNA geneticamente modificato, quindi subclonag-

gio di cDNA. Infine possono essere utilizzate per la produzione di proteine.

Vantaggi e svantaggi sull’uso di cellule procariotiche. I principali vantaggi dell’utiliz-zo di

cellule batteriche rispetto alle cellule eucariotiche sono:

1. Facilità di crescita su terreni di coltura sia solidi che liquidi in grosse quantità per via dei tempi

di replicazione molto più rapidi delle cellule eucariotiche;

2. Maggiore economicità;

3. Il genoma batterico è facilmente modificabile (con vettori contenenti DNA Ricombinante) e

tale modifica apportata può essere amplificata con estrema facilità e rapidità.

Gli svantaggi nell’utilizzo delle colture batteriche sono legati soprattutto al loro utilizzo nella produ-

zione di proteine; infatti i batteri sono in grado di effettuare le modiche post-traduzionali e di

conseguenza la proteina prodotta potrebbe risultare inattiva.

Batteri più utilizzati. Uno dei batteri più utilizzati sia per la produzione di proteine che di

materiale genetico è l’Escherichia Coli. La maggior parte deriva dal ceppo E.Coli K-12. È un micro-

organismo caratterizzato da un genoma che è costituito da cromosoma circolare di 4 milioni di bp

(paia di basi). L’E-coli, cresce rapidamente in medium minimale con glucosio (fonte di carbonio ed

energia), sali (fonte di azoto, fosforo, metalli pesanti). Inoltre, la sua crescita è estremamente favorita

in medium ricchi contenente tutti gli amminoacidi essenziali, precursori di nucleotidi, vitamine ecc.

ESEMPIO DI MEDIUM MINIMALE ESEMPIO DI MEDIUM RICCO

M9 medium (per litro) 6 g Na2HPO4 3 g KH2PO4 1 g NH4Cl 0.5 g NaCl 1 ml di 1M MgSO4 7H2O 10 ml 20% glucosio (o glicerolo)

Luria Bertani (LB) Broth per litro 10 g tryptone 5 g estratti di lievito 5 g NaCl 1 ml di 1N NaOH

49

E’ il terreno di crescita ricco è più utilizzato. I Sali disciolti hanno la stessa funzione del medium

minimale, ovvero servono a garantire che la soluzione in cui viene coltivato il microrganismo sia iso-

tonica. Il tryptone è un digerito pancreatico della caseina (proteina abbondante nel latte) e fornisce i

peptidi essenziali alla crescita dei batteri. Gli estratti di lievito sono ottenuti attraverso un processo

di digestione di particolari colture di lieviti, successivamente essiccati ed indotto un processo di

autolisi delle membrane (che porta alla liberazione di enzimi digestivi che vanno a degradare soprat-

tutto le componenti solubili presenti all’interno dei lieviti); tali estratti sono una fonte essenziale di

amminoacidi, proteine, zuccheri e acidi nucleici. Al fine di migliorare tale estrazione e far sì che i

componenti risultino solubili si procede alla separazione allontanando i residui delle membrane. È

possibile acquistare LB già pronto in polvere, da disciogliere in acqua distillata. Si raccomanda di

sterilizzare con calore umido (autoclave) la soluzione ottenuta.

4.2 Crescita dei batteri

I batteri possono crescere in modo ubiquitario sia in terreno solido che liquido; in entrambi i casi la

temperatura di coltura si aggira intorno ai 37°C. A differenza delle colture cellulari eucariotiche, non

è necessaria la regolazione degli scambi gassosi (CO2), ma è sufficiente disporre di una camera calda

(incubatore) per facilitarne la crescita.

Figura 7. Curva di crescita di batteri.

L’andamento della curva di crescita è perfettamente identico a quello delle cellule eucariotiche.

Quello che cambia sostanzialmente è il tempo necessario a raddoppiare il numero di cellule che, ne

caso dei batteri, è molto più rapido (infatti viene espresso in termini di minuti anziché giorni come

50

per le cellule di mammifero). Come per le cellule eucariotiche di mammifero, anche le colture

batteriche (soprattutto in coltura liquida) seguono un ciclo di crescita che prevede tre fasi:

1. Fase LAG (o di latenza) - è la fase iniziale in cui si osserva un primo adattamento al terreno in

cui le divisioni sono ridotte.

2. Fase LOG (o di crescita esponenziale) – si inizia ad entrare in fase log, quando si osserva una

replicazione ogni circa 20-30 min, fino al raggiungimento di un livello esponenziale di crescita

(early, middle, late log phase);

3. Fase stazionaria (o di saturazione) – si raggiunge quando avviene il consumo dei nutrienti

essenziali presenti nel terreno di coltura ed iniziano ad accumularsi le sostanze tossiche

prodotte.

4.3 Colture batteriche solide e liquide

COLTURE BATTERICHE LIQUIDE. Vengono seminati pochi batteri in un terreno molto ridotto

(2-3 mL di coltura liquida); tale sospensione viene incubata a 37°C per 24 ore. In questo primo

passaggio si realizza la fase di adattamento (Fase LAG). Nel momento in cui i batteri passano alla fase

logaritmica (FASE LOG) vengono amplificati diluendo la sospensione di partenza con più terreno,

rilanciando la crescita per un’altra notte. Durante questo primo step è molto importante controllare

la crescita batterica attraverso due diverse metodiche:

1. osservare la coltura attraverso un vetrino di conteggio al microscopio ottico.

2. attraverso uno spettrofotometro si va a leggere il valore di assorbanza della sospensione

batterica a 600 nanometri (OD600). La formula che permette di calcolare la densità cellulare a

partire dall’OD600 è la seguente: OD600 = 1 corrisponde a circa 8x108 cellule/ml.

I batteri che crescono in coltura liquida, di solito, vengono cresciuti all’interno di beute con terreno

di coltura di tipo LB (precedentemente sterilizzato in autoclave). Le beute solitamente, non vengono

sigillate ermeticamente ma vengono chiuse in maniera blanda per consentire l’ossigenazione delle

colture. Le beute con al loro interno le colture batteriche vengono poste su di un agitatore che

consente di mantenere la coltura in continua agitazione (anche riscaldata) per tutto il tempo della

crescita. Questo è importante, così come per tutte le colture cellulari liquide, per garantire una cor-

retta ossigenazione anche dei tessuti o delle cellule più interne alla coltura. Questo tipo di coltura ci

permette di ottenere un numero elevato di cellule batteriche in coltura.

COLTURE BATTERICHE SOLIDE. I batteri che vengono coltivati in coltura solida quando non è

necessario ottenerne grandi quantità, ma invece è di interesse quando si vuole andare a se- parare

una colonia dall’altra. Difatti viene molto utilizzata la coltura solida nel momento in cui un

determinato ceppo batterico viene geneticamente modificato e quindi si ha l’esigenza di separare

quei batteri di interesse rispetto a quelli non modificati. Le colture batteriche solide vengono genera-

te utilizzando dei terreni in partenza liquidi (LB) ai quali viene addizionato un agente gelificante (1.5%

di agar). L’agar è il più noto agente gelificante, un polisaccaride che deriva da un’alga marina, costitui-

to sostanzialmente da zuccheri. Nel momento in cui questo viene addizionato al LB e fatto solidificare

all’interno di un contenitore (es. dishes del Petri). Dopo che la gelificazione è avvenuta, si ottiene uno

strato di LB solido su cui poter seminare i batteri di interesse. Nel momento in cui si vuole andare a

selezionare un clone con specifiche caratteristiche piuttosto che un altro, il terreno viene addizionato

51

con dei marcatori selettivi (termolabili) che consentono all’operatore di individuare quale delle

colonie presenti è quella che esprime la mutazione di interesse. Una volta selezionato il ceppo mutato

è possibile passarlo in coltura liquida per poterlo amplificare.

4.4 Conservazione dei batteri

Anche i batteri, come le cellule di mammifero, possono essere conservate efficacemente attraverso

congelamento. Durante tale fase viene addizionato il crioprotettore. Rispetto alle cellule di mammi-

fero, quelle batteriche non vengono mantenute a temperature così basse, difatti non si utilizza l’azoto

liquido ma possono essere mantenuti ad una temperatura di -80°C. Di solito si predilige l’utilizzo di

glicerolo al 30% anziché DMSO al 7%. Come si è visto in precedenza il glicerolo e il DMSO sono sos-

tanze a diversa composizione chimica che hanno in comune elevata solubilità in acqua e tossicità

dipendente dalla concentrazione di utilizzo. La loro azione protettiva si esplica in vari modi:

1. con un’azione diretta sulla membrana cellulare;

2. si sostituiscono all’acqua e diminuiscono la formazione dei cristalli di ghiaccio;

3. abbassano il punto di congelamento della soluzione e permettono una maggiore disidra-

tazione delle cellule durante il congelamento lento.

4.5 Trasformazione dei batteri

Un batterio può essere modificato, attraverso l’inserimento di DNA esogeno all’interno di un pro-

cariote e, di conseguenza, sfruttato per amplificare tale modifica apportata. Per far avvenire tale

operazione è necessario rendere il batterio competente alla trasformazione; in sostanza, è necessario

apportare delle modifiche sia alla sua membrana, e se è provvisto di parete anche su quest’ultima, in

modo tale da renderle permeabili all’ingresso di molecole di DNA al suo interno. Ovviamente, in

condizioni normali, una membrana plasmatica non è assolutamente permeabile al DNA poiché

quest’ultimo è carico negativamente e lo strato esterno della membrana è idrofobico; quindi le due

strutture sono tra loro incompatibili. La tecnica più utilizzata per rendere il batterio competente alla

trasformazione è quella di andare a sottoporre quest’ultimo ad una soluzione di cloruro di calcio

(CaCl2) che modifica le caratteristiche della membrana. Purché la tecnica si dimostri efficace, è ne-

cessario che la coltura di E. coli si trovi all’inizio della fase logaritmica (fase che determina, in linea

generale, una maggiore riproducibilità degli esperimenti). Infatti, qualora vengono apportate modi-

fiche cellulari a livello genico (introduzione di DNA esogeno reso permeabile alla membrana) all’inizio

della fase logaritmica è possibile selezionare e amplificare, con maggiore successo, le colonie bat-

teriche che hanno integrato tale mutazione. Il processo di trasformazione dei batteri si divide in tre

fasi: 1) preparazione con CaCl2 e 2) trasformazione.

① PREPARAZIONE DELLE CELLULE COMPETENTI CON CALCIO CLORURO.

1. Si parte generalmente da una colonia singola di E. coli (TOP10 o DH5a), cresciuta in un volume

molto ridotto di LB (10 ml), procedendo con il “lancio della coltura” (si fa partire la coltura di

crescita batterica) in incubazione a 37°C per una notte.

2. Il giorno successivo viene presa una piccola aliquota (circa100m) e inoculata in 50 ml di LB e

si fa crescere a 37°C, seguendo l’assorbanza di crescita (OD600).

52

3. Quando l’assorbanza di crescita OD600 è uguale 0,5 sta a significare che la coltura cellulare si

trova in fase logaritmica precoce (early log phase), periodo ottimale per la preparazione delle

cellule competenti. Si fa raffreddare in ghiaccio per 5 min (allo scopo di rallentare o arrestare

la crescita) e successivamente recuperare i batteri della sospensione per centrifugazione.

4. Si va a risospendere il pellet di batteri in 10ml di CaCl2 freddo (60mM CaCl2, 15% di glicerolo)

e centrifugare. Il calcio cloruro ha la funzione di formare dei piccoli precipitati che si deposita-

no sulla membrana cellulare del batterio, e nel momento in cui si inserisce DNA esogeno, il

CaCl2 andrà a mascherare le cariche negative del DNA e favorire il suo ingresso all’interno

della cellula batterica.

5. La soluzione viene risospesa in 500µl di CaCl2 freddo.

6. Vengono fatte delle aliquote da 100ml e crioconservate a -80°C (le cellule rese competenti

restano tali per circa tre mesi).

② TRASFORMAZIONE DELLE CELLULE COMPETENTI. Le cellule competenti ottenute con la tecnica

del calcio cloruro possono essere utilizzate per l’inserimento del DNA esogeno di nostro interesse in

modo tale che poi, nel momento cui queste cellule vengono amplificate, è possibile ottenere una

quantità sufficiente di DNA che servirà successivamente a modificare le cellule eucariotiche.

1. A 100µl di cellule competenti in CaCl2 freddo aggiungere circa 10-20 ng di DNA plasmidico; 2. La sospensione viene incubata in ghiaccio per circa 30 minuti. 3. La sospensione viene incubata a 42°C per 2 minuti, temperatura utile non solo per la soprav-

vivenza del batterio, ma anche perché tale temperatura aumenta la permeabilità della

membrana (la rende più lassa) e favorisce l’ingresso del DNA che si è depositato sul suo

versante esterno. Trascorsi 2 minuti circa, si raffredda in ghiaccio in modo da provocare un

forte shock termico. Quest’ultima operazione serve a ripristinare la condizione della mem-

brana (dopo l’ingresso del DNA plasmidico), che rimanendo permeabile, potrebbe risultare

tossica per il batterio.

4. Si centrifuga e si risospende il pellet di batteri in 400µl di LB sterile e si fa crescere per 1 ora

sotto agitazione a 37°C (225 rpm) per garantire la massima ossigenazione di tutta la coltura

batterica).

5. Si centrifugare e si risospende nuovamente il pellet di batteri in 50µl di LB sterile e piastrare

su piastre di agar/LB (terreno solido) in modo da separare il più possibile un batterio dall’altro

per ottenere delle colonie singole. Al terreno di crescita viene aggiunto un antibiotico per la

crescita selettiva (amp, kana ecc) utile per l’ottenimento di una colonia singola da poter

amplificare. Normalmente, quando si vuole ottenere una trasformazione batterica con un

particolare gene di interesse è necessario verificare la presenza di un gene che codifichi per

una resistenza verso un antibiotico tra quelli addizionati al terreno. Solo così è possibile far

crescere selettivamente sul terreno di coltura solamente quei batteri che hanno acquisito le

caratteristiche genetiche di nostro interesse. In caso contrario, gli altri batteri non saranno in

grado di produrre resistenza ad un antibiotico e di conseguenza non sopravvivono.

6. Al momento in cui viene effettuata la semina, questa verrà incubata per una notte intera alla

temperatura di 37°C.

7. Il giorno successivo bisogna osservare la presenza d colonie di crescita dei batteri.

53

4.6 Amplificazione dei batteri

Alla trasformazione segue l’amplificazione delle specie batteriche che hanno mostrato le carat-

teristiche genetiche di interesse. Si selezionano una o più singole colonie e si trasferiscono, attraverso

uno strumento di plastica sterile, toccando una colonia batterica con la punta dello strumento

(picking) e, successivamente, questa viene immersa in LB liquido autoclavato. La coltura ottenuta

viene fatta crescere in agitazione tutta la notte a 37°C. Il passaggio successivo consiste nell’estrazione

del DNA esogeno di interesse.

4.7 Estrazione del DNA plasmidico dai batteri

L’estrazione si basa sul principio della lisi alcalina di una opportuna quantità di batteri trasformati

(cresciuti o/n a 37°C), la successiva separazione del DNA plasmidico su una resina e l’eliminazione

delle proteine, RNA, eventuali agenti contaminanti, ecc. Il DNA alla fine viene lavato, staccato dalla

resina e risospeso in H2O sterile. Attraverso dei kit commerciali (nei quali viene fornita una particolare

resina ad alta affinità per il DNA plasmidico) è possibile eseguire questa operazione isolando il

materiale genomico da tutto il resto. Il protocollo che regola la procedura di estrazione si divide in

diverse fasi:

1. Si parte da una colonia singola, ottenuta dalla trasformazione dei batteri, che viene inoculata

in 5 ml di LB e si fa crescere per 2 ore a 37°C. Si utilizza un volume abbondante del terreno di

crescita allo scopo di far permettere la crescita abbondante della colonia selezionata in modo

tale da ricavare una cospicua quantità di genoma in esame.

2. Trasferire i 5ml in 500ml di LB sterile contenente antibiotico di selezione e fare crescere per

una notte a 37°C. Una volta cresciuti, i batteri, devono essere pellettati per centrifugazione

(circa 3000 rpm per 30 minuti a 4°C).

3. Successivamente il pellet viene risospeso in un buffer di risospensione (contenete TrisCl, EDTA

ed RNAsi). L’RNAsi è importante durante il processo di lisi cellulare degrada selettivamente

l’RNA per far sì che si ottenga solo il filamento del DNA plasmidico.

4. Viene aggiunto un buffer di lisi (contenente NaOH e SDS) e incubare a RT per 5 minuti. La soda

(NaOH) e l’SDS vanno a degradare le membrane e la parete (qualora fosse presente) e

consentono la precipitazione del DNA genomico (completamente denaturato).

5. Attraverso l’aggiunta di un buffer di neutralizzazione (contenente potassio acetato) si assiste

alla precipitazione delle proteine e del DNA genomico. Si lascia in incubazione in ghiaccio per

20 minuti.

6. La sospensione viene centrifugata a 20000g a 4 °C per 30 minuti, allo scopo di eliminare il

pellet costituito principalmente dalle membrane e da altri detriti cellulari; mente in soluzione

restano le proteine e gli acidi nucleici.

7. Caricare il surnatante su una colonna contenente una resina a scambio ionico ad alta affinità

per gli acidi nucleici (nello specifico per il DNA plasmidico che essendo denaturato tende a

precipitare e ad addensarsi sulla colonna).

8. E’ necessario lavare la colonna per due volte con buffer a concentrazione salina media, in

modo tale da eliminare qualsiasi contaminante del DNA plasmidico.

54

9. Eluizione del DNA aggiungendo un buffer ad alti Sali che compete con la resina a scambio

ionico per il legame con il DNA plasmidico.

10. La soluzione che contiene il DNA viene addizionata ad isopropanolo che facilita la

precipitazione del DNA stesso. L’ispropanolo viene aggiunto lentamente, assistendo alla

formazione di una soluzione bifasica.

11. Far precipitare il DNA aggiungendo miscelare per inversione subito prima di centrifugare (a

15000g) a 4 °C per 30 minuti.

12. Il pellet di DNA ottenuto viene lavato con con 5ml di EtOH (etanolo) al 70% eliminando delica-

tamente il surnatante.

13. Centrifugare a 15000g a 4 °C per 10 minuti.

14. Eliminare con delicatezza il surnatante e asciugare il pellet ottenuto all’aria.

15. Risospendere il pellet in un opportuno volume di acqua.

4.8 Ceppi batterici: E.coli TOP 10

Le cellule competenti possono essere anche acquistate già pronte “One Shot” (che si possono

utilizzare una sola volta perché se replicate perdono la competenza). I ceppi batterici utilizzati in

laboratorio sono geneticamente modificati per ottimizzare le rese di produzione di plasmidi/proteine.

Uno dei ceppi più utilizzati è l’E. coli TOP 10. L’esigenza della modificazione genetica nasce dal fatto

che i batteri hanno sviluppato un sistema degradativo che permette loro di difendersi dall’ingresso

di DNA esogeno e quindi questo non viene amplificato. Sui ceppi batterici che vengono veduti viene

ne viene indicato il loro fenotipo e il genotipo di utilizzo. In questi genotipi sono indicati espres-

samente i singoli geni batterici deleti per far sì che il batterio non sia in grado degradare il DNA di

interesse. In particolar modo, vengono deleti tutti quei geni che attivano le metilasi, ovvero enzimi

che riconoscono e digeriscono il DNA metilato (con gruppi metilici in particolari siti); oppure ad

esempio quei geni che codificano per enzimi di restrizione, come EcoKI, che riconosce e degrada DNA

non metilato in particolari siti. Altre modifiche che vengono effettuate sono, ad esempio, sugli enzimi

che impediscono la ricombinazione del DNA e sulle endonucleasi, queste ultime due modifiche

sembrano ridurre al minimo la capacità del batterio di rigettare il DNA esogeno. Di solito, il genoma

del batterio viene modificato anche in altri geni per permettere di individuare facilmente quali batteri

hanno integrato il DNA di interesse. Ad esempio una delezione parziale del gene lacZ che codifica per

la beta-galattosidasi, oppure una delezione a carico del gene dell’operone del lattosio, permettono

di individuare facilmente quali batteri sono nuovamente in grado di crescere in un terreno in presenza

di lattosio.

55

5. Vettori batterici

I vettori di clonaggio sono particolari molecole di DNA, naturale o anche artificiale, impiegate nelle

tecnologie molecolari di clonaggio. Esistono differenti tipi di vettori di clonaggio. I più semplici, e

anche i più usati comunemente, sono di tre tipi:

1. Plasmidi, naturalmente presenti nei batteri;

2. Batteriofagi labda o correlati;

3. Cosmidi.

5.1 Vettori plasmidici per batteri (o plasmidi)

Sono delle strutture di DNA circolare extra-cromosomiale in grado di auto-replicare. Sono stati

identificati in molti ceppi di E. coli. Queste struttu-re vengono solitamente replicate insieme al DNA

cromosomiale. La replicazione può richiedere la produzione di proteine specifiche da parte del

plasmide o utilizzare quelle batteriche dell’ospite.

ELEMENTI ESSENZIALI DI UN PLASMIDE BATTERICO. Tutti i plasmidi utilizzati in biologia molecolare sono sintetici e devono possedere almeno tre proprietà in comune:

1. origine di replicazione batterica, che è quella regione che consente allo strumento di replica-

zione dei batteri di riconoscere il plasmide e di duplicarlo (parametro di amplificazione). E’

una sequenza di DNA che contiene il sito di inizio della replicazione (sito ori); comprende

anche i geni che codificano tutti gli mRNA e le proteine necessarie alla replicazione (possibili

fattori di trascrizione specifici).

2. un marker selettivo codificato da un determinato gene. Il marker selettivo deve essere

dominante, è un gene che codifica per alcuni enzimi in grado di degradare antibiotici specifici.

I marcatori selettivi più utilizzati sono quelli che conferiscono un certo grado di resistenza:

a. Resistenza all’ampicillina e alla penicillina. I batteri posseggono, oltre alla membrana

cellulare degli organismi pluricellulari, una parete cellulare esterna rigida che, oltre a

fornire supporto e protezione, previene la rottura osmotica nei medium ipotonici. La

parete cellulare batterica deve allargarsi e duplicarsi nel corso della crescita e divisione

cellulare, a tal proposito è necessaria una costante sintesi ex nuovo di tutto il materiale

della parete. I derivati della penicillina (ampicillina) agiscono inibendo la biosintesi ex

novo della parete batterica rendendo il batteriovulnerabile alla rottura osmotica.

Nello specifico, inibiscono l’enzima responsabile della transpeptidazione perché il loro

anello beta-lattamico simula la struttura della Dalanilalanina (sito di legame per gli

enzimi di transpeptidazione). Le transpeptidasi sono un complesso di proteine deno-

minate proteine leganti la penicillina (PBP). L’instaurarsi della resistenza avviene

quando i batteri producono specifici enzimi, le beta-lattamasi, che aprono l’anello

beta-lattamico inattivandolo. Le amidasi, invece, intervengono a livello del gruppo

ammidico. A seguito della resistenza, quello che si osserva è la crescita del batterio e

la sua replicazione anche in presenza di antibiotico.

56

b. Resistenza alla kanamicina e alla tetraciclina. Rappresenta il secondo tipo di marker

selettivo che viene utilizzato sui batteri. Questi due antibiotici vanno a bloccare la

sintesi proteica. Agiscono a livello ribosomiale, nello specifico la tetraciclina agisce

sulla subunità 30s andando ad inibire il legame dell’aminoacil-tRNA al sito A del ribo-

soma; mentre la kanamicina va a inibire legame del primo aminoacido al complesso di

iniziazione.

3. siti di clonaggio, è indispensabile perché permette l’inserimento del gene di interesse

all’interno del plasmide. E’ un sito di taglio per un enzima di restrizione specifico che può

essere utilizzato per inserire DNA esterno, senza interferire con le funzioni basali del plasmide.

Nei plasmidi è presente una regione chiamata Multiple Cloning Site (MCS) o Polylinker, cioè

una regione in cui sono presenti dei siti di taglio unici (non presenti in altre regioni del plas-

mide) per diversi enzimi di restrizione. Tale regione viene utilizzata per inserire il DNA

esogeno. Questo è vantaggioso perché consente di scegliere di scegliere la regione ottimale

per l’inserimento del DNA di interesse.

Figura 8. Mappa di un plasmide modello utilizzato come vettore di clonaggio composto di:

sequenza di origine di replicazione (ori), gene per la resistenza all’ampicillina (AmpR), gene per la

beta-galattosidasi (lacZ+) e regioni con siti di restrizione.

In fig.8 viene rappresentato un esempio di un polylinker dove sulla destra dell’immagine

vengono riportati diversi enzimi di restrizione. Ciascuno di questi enzimi è in grado di

riconoscere selettivamente e digerire una sequenza specifica di DNA rompendo la struttura

ciclica del plasmide e lasciando delle estremità che possono essere coesive o blunt. In fig. 9 è

rappresentato un esempio di Multiple Cloning Site, ingrandito nella porzione a destra dell’im-

magine. Viene indicata la sequenza di taglio specifica di ciascun enzima. Gli enzimi presenti

nell’MCS, tagliano una sola vota all’interno del plasmide; quindi messo a contatto il plasmide

con uno specifico enzima di restrizione, questo si aprirà unicamente in quel punto.

57

Figura 9. Multiple Cloning Site (MCS).

≡ ESEMPIO 1. In un esempio di modificazione viene riportato un plasmidio con tutte e tre le

caratteristiche necessarie già elencate. A titolo esemplificativo, per l’MCS sono indicati tre

enzimi BamHI, KpnI e ApaI. Supponiamo di voler digerire questo plasmide utilizzando due dei

tre enzimi citati (BamHI e ApaI), quello che si ottiene è l’apertura del DNA plasmidico e la

formazione di un plasmide che avrà un’estremità compatibile digerita da BamHI e

un’estremità caratteristica ottenuta per digestione dell’altro enzima. A questo punto sarà

necessario far digerire il DNA esogeno che si vuole inserire all’interno del plasmide con gli

stessi enzimi utilizzati precedentemente, in modo tale da avere estremità compatibili con il

plasmide stesso. Infatti, miscelando i due prodotti di digestione con l’addizione dell’enzima

ligasi (che consente il legame tra i filamenti di DNA), alla fine del processo si ottiene un nuovo

plasmide con DNA circolare che avrà inserito all’interno del MCS il gene di interesse. È

importante ricordare che nella fase di clonaggio viene perso il sito di clonaggio per l’enzima

che si trova in tutta la regione compresa tra BamHI e ApaI. Nel caso specifico viene perso

l’enzima KpnI. Questo vuol dire che se si va a digerire con KpnI il plasmide finale ottenuto, tale

plas-mide non può essere digerito; a meno che KpnI non abbia un sito di restrizione all’interno

del gene di interesse.

≡ ESEMPIO 2. Un altro esempio è quello in cui si possono osservare due marker selettivi

all’interno del plasmide, uno per resistenza all’ampicillina e quello per la resistenza alla

tetraciclina. Oltre a questi due maker è possibile osservare un sito di restrizione per l’enzima

BamHI che cade all’interno della sequenza che codifica per la resistenza alla tetraciclina.

Effettuando una digestione con BamHI, sia del plasmide che del nostro inserto, e successiva-

mente una ligazione si potrebbe assistere alla formazione di due diverse miscele plasmidiche

all’interno della sospensione. Questo perché la digestione con un unico enzima porta alla

formazione di estremità compatibili che per effetto dell’enzima ligasi può:

a. richiudersi su sé stesso tornando indietro al plasmide di partenza (in assenza del

frammento di DNA esogeno inserto);

58

b. legare il frammento di DNA esogeno attraverso le sue due estremità compatibili con quelle

del plasmide e – in questo caso – si assiste alla perdita della resistenza alla tetraciclina

(viene perso il gene che codifica per tale resistenza a seguito dell’inserimento del

frammento di DNA esogeno), ma non a quella verso l’ampicillina.

Quindi nella stessa provetta si otterrà una miscela composta in parte dalla situazione rap-

presentata nel punto (a) e una parte di quella rappresentata nel punto (b). Dato che la

situazione che interessa all’operatore è quella in (b), come si fa a discriminare tra i due vettori?

Viene sfruttata la diversa resistenza alla tetraciclina. Dunque, per poter selezionare il vettore

(b) di interesse basterà trasfor-mare un ceppo batterico competente, utilizzando la miscela

che contiene i due plasmidi. Dopo tale trasformazione si procede alla semina di tale ceppo su

un terreno solido contenente ampicillina. Si procede all’incubazione per una notte e il giorno

successivo si vanno ad osservare le colonie che sono cresciute in tale terreno. Queste colonie

potranno avere al loro interno il plasmide (a) oppure il plasmide (b) (perché entrambi hanno

mantenuto il gene che codifica per la resistenza all’ampicillina). Viene effettuata un’operazio-

ne definita Replica Plating che consiste nell’applicare una sorta di stampo ricoperto di velluto

sterile sulla coltura batterica toccando la superficie a contatto con le colonie; e, suc-

cessivamente tali colonie prelevate andranno trasferite su una piastra nuova. In questo caso,

si va ad effettuare una replica su piastre che contengono da una parte ampicillina e dall’altra

tetraciclina. Le colonie che vengono riseminate nel terreno che contiene ampicillina, saranno

in grado di crescere sia quelle che sono state trasformate con il vettore (a) sia quelle

trasformate con il vettore (b). Nella piastra che contiene tetraciclina, potranno crescere solo

le colonie che sono state trasformate con il vettore (a), mentre quelle trasformate con vettore

(b) saranno destinate a morte. Per differenza sarà possibile individuare sulla piastra che

contiene ampicillina quali sono le colonie trasformate con il vettore (b). Perché è necessario

effettuare una replica e non è sufficiente piastrare direttamente in un terreno contenente

tetraciclina? Il vettore di interesse è il (b), ovvero quello che ha perso la resistenza verso la

tetraciclina; quindi seminando e piastrando i batteri in un terreno contenente tetraciclina si

andrebbero a perdere tutti i batteri di interesse che contengono il plasmide (b). La prima

semina con ampicillina consente di andare a selezionare, tra tutti i batteri trasformati presenti

all’interno della sospensione, quali sono quelli effettivamente trasformati (o col vettore (a) o

col vettore (b)); infatti può succedere che durante la fase di trasformazione alcuni dei batteri

preseti non integrino alcun DNA plasmidico per cui non sono in grado di crescere nemmeno

in ampicillina. La seconda fase permette di selezionare anche quei batteri che sono in grado

di crescere anche in tetraciclina, quindi trasformati con il vettore (a). Per differenza si ricavano

i batteri ottenuti con (b).

≡ ESEMPIO 3. Un altro esempio si basa su un sistema naturale presente all’interno dei batteri

che è l’operone lattosio, che consente al batterio di sintetizzare gli enzimi necessari al

metabolismo del lattosio. Normalmente i batteri crescono in presenza di glucosio nel terreno

di coltura e, di conseguenza, la trascrizione dei geni codificanti per l’operone lac viene inibita

dal repressore lac. In presenza di lattosio (o componenti correlati) il repressore lac non può

più legare il promotore LAC e la trascrizione può iniziare, originando un singolo mRNA che

codifica per lacZ, lacY, lacA. Due di questi geni sono essenziali per la crescita in lattosio.

59

L’operone lattosio ha una regolazione negativa (feedback negativo), garantita dalla presenza

di tale repressore lac codificato dal gene I normalmente trascritto e tradotto in una proteina

che va a legarsi al promotore dell’operone lac creando un ingombro sterico che impedisce la

trascri-zione dei geni a valle (lacZ, lacY, lacA). Quando il lattosio è presente nel terreno, questo

va a legarsi all’inibitore provocando un cambiamento conformazionale nell’inibitore stesso

che si stacca dal promotore dell’operone lattosio rendendo questo accessibile per la

trascrizione (produzione delle proteine necessarie al metabolismo del lattosio).

Figura 10. Regolazione a Feedback negativo dell'operone lac.

In particolar modo vengono sintetizzate tre diverse proteine:

a. la permeasi, codificata dal gene lacY ed è necessaria per l’ingresso del lattosio nella cellula;

b. la beta-galattosidasi, codificata dal gene lacZ che scinde il lattosio in glucosio e galattosio

per poi essere facilmente metabolizzati dal batterio.

c. la tiogalattoside transacetilasi, codificata dal gene lacA indispensabile per il metabolismo.

Questo sistema può essere sfruttato a nostro vantaggio per andare a vedere quali batteri sono

stati trasformati con il plasmide contenente il gene di interesse. Questo è possibile utilizzando

il prodotto del gene lacZ, la beta-galattosidasi, sfruttando la caratteristica di questa proteina

di poter essere separata in due sub-unità alfa e omega che possono dare origine ad un feno-

meno detto alta com-plementazione. Grazie a tale fenomeno possono essere separate e

prodotte singolarmente; nel momento in cui si trovano entrambe nello stesso contenitore (o

60

nella stessa cellula), possono ricostituire l’enzima di partenza perfettamente funzionante. Il

sistema prevede che venga usato uno specifico ceppo batterico, E. Coli DH5α, geneticamente

modificato in modo da produrre solo la sub-unita omega della beta-galattosidasi (per elimi-

nazione dei geni lacA, lacZ e lacY); successivamente si inserisce il gene che codifica per la sub-

unità alfa all’interno del plasmide utilizzato per modificare tale battere. Il ceppo batterico di E.

Coli DH5α può essere trasformato con vettore pUC19 contenente il gene che codifica per il

frammento alfa. Come si possono discriminare i batteri che sono stati realmente trasformati

con questo vettore? Questo è possibile crescendo i batteri in un terreno che contiene due

particolari composti:

a. IPTG (isopropil-1-tio-b-D-galattoside) che inattiva il repressore lac e consente l’espressione del

frammento omega (codificato dal genoma del batterio DH5α);

b. Xgal (5-Bromo-4-cloro-3-indolil-b-D-galattoside), è un analogo del lattosio che viene meta-

bolizzato a composto blu dalla b-galattosidasi.

Nelle colonie in cui è avvenuta la complementazione, ovvero quelle che hanno prodotto il

frammento omega (prodotto da tutti i batteri trasformati con il vettore) e che possono produrre

anche il fram-mento alfa e quindi dar luogo ad una beta-galattosidasi funzionale che sarà in grado

di metabolizzare il composto Xgal (tale reazione è facilmente identificabile per via del composto

blu che si viene a formare sulla piastra). E’ possibile identificare i batteri che hanno inserito il gene

di interesse? Tale operazione è possibile in quanto il vettore pUC19 è strutturato in modo tale da

avere i tre parametri necessari (origine di replicazione, resistenza all’ampicillina e il Multiple

cloning site. In questo caso specifico, il Multiple cloning Site, è presente all’interno del gene che

codifica per il frammento alfa; nel momento in cui si inserisce il gene di interesse si andrà a

distruggere la sequenza che codifica per il frammento alfa della beta-galattosidasi. Da quanto

detto si deduce che i batteri che hanno integrato il gene di interesse all’interno della sequenza he

codifica per il frammento alfa non saranno in grado di dare alfa-complementazione e le colonie

assumeranno un colore bianco (non si può ottenere la conversione dell’Xgal e il substrato non

diviene blu).

( × ) Riassumendo. A partire da un frammento di pUC19 che normalmente codificherebbe

per la resistenza all’ampicillina e quello per il frammento alfa della beta-galattosidasi; all’interno

di tale frammento è posizionato il MCS. Dunque è possibile scegliere un enzima che tagli in tale

regione di clonaggio al fine di inserire il DNA di interesse. A questo punto viene digerito sia il

plasmide pUC19 che il DNA di interesse con lo stesso enzima. Successivamente vengono messi

entrambi a contatto con l’enzima ligasi per far avvenire la ligazione e si ottiene una sospensione

che può ottenere due diversi tipi di plasmide:

a. Il plasmide A, il quale è in grado di richiudersi su sé stesso tornando indietro al plasmide di

partenza (in assenza del frammento di DNA esogeno inserto); i batteri che contengono questo

plasmide produrranno un frammento alfa funzionale capace di dar luogo a complementa-

zione (colonie di colore blu).

b. Il plasmide B, il quale è capace di legare il frammento di DNA esogeno all’interno della

sequenza che codificava per il frammento alfa, per cui questi plasmidi hanno perso la capacità

di produrre un frammento alfa funzionale e i batteri che hanno integrato questo plasmide

daranno luogo a colonie di tipo bianco.

61

Entrambi i plasmidi portano la resistenza all’ampicillina, quindi come è possibile selezionare (per

poi successivamente amplificare) i batteri contenenti il plasmide di interesse? È utile un processo

di ligazione per trasformare un ceppo di DH5α che produce il frammento omega della β-

galattosidasi, se cresciuto in presenza di IPTG che rimuove il repressore. Una volta trasformati,

questi andranno seminati su una piastra di LB solido che conterrà al suo interno tre diverse

molecole (utili successiva-mente per lo screening):

a. l’ampicillina, che consente di selezionare tra tutti i batteri presenti, quelli che sono stati

trasformati (che hanno preso uno dei due plasmidi).

b. IPTG, che viene successivamente addizionato e consente a tutti i batteri in coltura di produrre

il frammento omega.

c. Xgal, che viene successivamente addizionato e consente di stabilire quali tra tutti i batteri si

sono trasformati con il vettore A (che darà origine a colonie di tipo blu), oppure con il vettore

B (che darà origine a colonie bianche).

Quelli appena visti sono i tre elementi fondamentali per un vettore plasmidico per i batteri. Nel

momento i cui si vuole utilizzare tale plasmide per modificare geneticamente una cellula eucariotica,

è necessario inserire all’interno di questo plasmide più sequenze, che possono essere:

1. una Sequenza promotrice. Il promotore è una serie di brevi sequenze che:

a. danno inizio alla trascrizione;

b. contengono al loro interno degli elementi di regolazione positiva che facilitano e pro-

muovono la trascrizione (Enhancer). Quasi tutti i promotori utilizzati per la produzione e

per l’espressione di proteine all’interno di cellule eucariotiche sono promotori derivati dai

virus come l’SV40 early gene enhancer (attivo su molti tipi cellulari), il LTR - long terminal

repeat (Raus Sarcoma Virus e CMV). La scelta dei promotori virali è dovuta al fatto che

questi sono forti e vengono trascritti molte volte con semplicità. Quindi porre un gene di

interesse sotto il controllo di un promotore virale garantisce una maggiore facilità di

espressione all’interno della cellula bersaglio. Esistono anche dei promotori minimali, o

cellulo-specifici; infatti scegliendo tale promotore si può scegliere quale gene deve essere

espresso. In alcuni casi è vantaggioso scegliere un promotore che possa essere regolato.

La sequenza promotrice contiene anche elementi di regolazione negativa (Silencer) che

inibiscono la trascrizione.

2. il DNA di interesse;

3. la sequenza di terminazione, è un’altra importante sequenza da inserire all’interno del plasmide

per garantire che questo venga espresso. Tale sequenza consiste nel sito di poliadenilazione.

Infatti, molto spesso quando si fa un clonaggio, quello che viene inserito è una sequenza di cDNA,

ovvero una sequenza complementare all’RNA messaggero. E’ necessario aggiungere

a. due sequenze ricche di GU o U poste a valle del sito di poliadenilazione;

b. sequenze di 6 nucleotidi AAUAAA localizzate 11-30 nucleotidi posti a monte del sito di

poliadenilazione.

Questo garantisce che il cDNA venga trascritto sull’RNA messaggero e che quest’ultimo venga

correttamente maturato.

4. dei fattori per la replicazione.

62

5.2 Batteriofagi

Struttura del Fago lambda. Un batteriofago è un virus capace di infettare i batteri. Il fago λ è

uno tra i batte-riofagi più utilizzati; ha una struttura che comprende una testa proteica icosaedrica

(capside), un collare, una coda non contrattile e un sistema di fibre poste nella sua porzione terminale

che gli permettono di aderire alla parete o alla membrana cellulare del batterio ospite.

Figura 11. Struttura del fago λ.

Il genoma del batteriofago. All’interno della capsula proteica che compone la testa si trova il

genoma che, per il fago λ, è un ds DNA di 48.5 kb. È una sequenza lineare che presenta, alle due

estremità, due siti terminali molto importanti definiti COS. In seguito all’infezione di un batterio

sensibile, il fago lambda inietta il suo DNA lineare che circolarizza grazie alle sequenze COS presenti

all’estremità (il DNA circolare è molto più stabile rispetto al DNA lineare). I siti COS sono costituiti da

12 paia di basi complementari, tra loro coesivi. Il genoma del fago λ, codifica principalmente per le

proteine strutturali del capside e della coda; altre sequenze, invece, possono essere di attacco alla

cellula ospite, di ricombinazione (che consentono al virus di ricombinare in suo genoma con quello

batterico) ed in fine sequenze di replicazione. Le sequenze COS sono responsabili del riconoscimento

del materiale genetico da inserire all’interno del capside; in assenza tali sequenze il DNA non viene

inserito.

63

Modalità di sopravvivenza nell’ospite. Nel momento in cui il fago infetta il batterio, può andare

incontro a due vie:

1. Via litica – quando il virus intraprende la via litica, questa porta il batterio a morte per permet-

tere la fuoriuscita dei nuovi batteriofagi prodotti dopo l’infezione della cellula ospite. Il ciclo

litico viene attuato per ottenere la replicazione del batteriofago (che senza la cellula ospite

non avrebbe modo per riprodursi). I batteriofagi generati vanno ad infettare altre cellule

batteriche. Nel momento in cui il fago si avvicina al batterio, inserisce il suo DNA all’interno

del batterio. Se le condizioni sono favorevoli, spesso il virus porta ad un’attivazione del

processo litico causato dalla digestione del DNA batterico in modo tale da sfruttare tutto il

sistema di replicazione della cellula ospite per riuscire a replicare il suo genoma, trascrivere e

opportunamente sintetizzare tutte le proteine necessarie per riprodurre i vari componenti

(capside, coda e fibre). Tale operazione gli consente di addensare all’interno dell’ambiente

cellulare nuovi batteriofagi formati che, non appena questi raggiungono quantità critiche per

la cellula, verranno liberati dopo aver indotto la lisi del batterio.

2. Via lisogena – in alcuni casi, il batterio viene mantenuto vitale e il batteriofago integra il suo

genoma con il comosoma dell’ospite, e questo gli permette di mantenere l’infezione per lungo

tempo (il virus diviene quiescente – profago non infettivo - e continua a vivere all’interno del

batterio). Tutte le volte che il batterio duplica il suo DNA contemporaneamente replica anche

Figura 12. Sequenze COS (Circolarizzazione genomica).

64

quello del fago. In alcuni casi però può succedere che, grazie alla presenza delle sequenze

COS, il profago si possa separare dal cromosoma (questo viene circolarizzato) e si innesca il

ciclo litico.

Figura 12. Via litica e via lisogena.

Integrazione del genoma fagico. L'integrazione del genoma circolare fagico lambda all'inter-no di

quello circolare batterico avviene in una speciale regione. La sequenza precisa sul genoma di E. coli è

chiamata attB (dall'inglese Bacterial attachment, sito di attacco batterico) ed è composta

essenzialmente di tre segmenti, detti B-O-B’. La sequenza omologa sul genoma del fago è attP

(dall'inglese Phagic attachment, sito di attacco fagico) ed è composta delle regioni P-O-P'. Nel mo-

mento in cui avviene l’integrazione si ha una ricombinazione dei siti dove la sequenza B si lega con la

sequenza P’ e, analogamente, la sequenza P con quella B’. Una volta avvenuta l’integrazione, si

formano due nuovi siti (non più attP e attB) che vengono chiamati attL e attR, che fiancheggiano il

DNA fagico (dove L e R stanno per Left and Right). La reazione operata dalla integrasi (INT, ricombinasi

di λ – enzima del fago lambda). Lo stesso enzima può catalizzare anche la reazione di excisione, nel

momento in cui dovesse riattivarsi un ciclo di tipo litico.

Clonaggio di un fago lambda. È possibile sfruttare il genoma del fago lambda e la sua mo-dalità

di inserimento all’interno del batterio, per poter inserire all’interno di quest’ultimo un fram-mento

di DNA esogeno di interesse. Questo perché il DNA del fago può essere modificabile, e l’integrazione

dell’inserto di DNA di interesse può avvenire eliminando tutti i geni che codificano per le proteine

strutturali (testa e coda), allo scopo di ottenere un fago incapace di replicare. Questa operazione è

importantissima perché permette un facile inserimento di DNA all’interno della cellula batterica

65

senza dover modificare la struttura della membrana ma semplicemente sfruttando le capacità

parassitarie del fago. L’unica limitazione è quella di rispettare le dimensioni massime (48 kb) del DNA

del fago contenuto nel capside proteico che ha una dimensione non espandibile; per cui, eliminando

le sequenze non necessarie (attraverso enzimi di restrizione) si riesce a creare dello spazio utile

all’inserimento di ulteriori informazioni (DNA ricombinante di interesse). L’operazione di clonag-gio

richiede l’inserimento del DNA ricombinante all’interno di una struttura fagica completa purché sia

possibile il trasferimento del materiale genetico. Vengono utilizzati ceppi batterici infettati con fagi

lamba mutati geneticamente che producono esclusivamente la componente strutturale: solo le teste

o solo le code (vengono mantenute solo le sequenze che codificano per le proteine strutturali del

virus). Si esegue il packaging in vitro aggiungendo il genoma del fago con il DNA di interesse, insieme

alle teste e le code precedentemente estratte dal batterio. In sostanza il packaging non è altro che

l’inserimento del DNA del fago all’interno del capside (ottenimento del fago maturo). Il batteriofago

modificato potrà successivamente infettare determinati ceppi batterici e trasferire loro il materiale

genetico di studio che, per la sua capacità di circolarizzare, può essere considerato come un plasmide.

La procedura di packaging si rivela particolarmente efficiente.

Crescita di un fago lambda. A seguito dell’ottenimento del fago geneticamente modifica-to, si

può andare a miscelare quest’ultimo con dei batteri su un terreno di coltura che mantiene in vita i

batteri. Viene dato il tempo al fago di interagire con i batteri infettandoli e, successivamente, si va a

seminare tali batteri (contenenti il genoma di interesse) su un terreno solido. Incubando la pia-stra

per qualche giorno si osserva che i batteri infettati con il fago verranno lisati, per cui si osservano

delle placche di lisi al cui interno si ritrova la nuova progenie di batteriofagi con il genoma di interesse.

Differenza tra la trasformazione batterica e trasfezione con fago λ. La formazione delle placche di lisi

caratterizza l’infezione da batteriofago. Si può osservare che il processo di infezione con fago è meno

efficiente rispetto a quello della trasformazione batterica, però il vantaggio che si può trarre dall’uti-

lizzo di un fago è dato dalla possibilità di inserimento di un DNA di dimensioni maggiori, proprio

perché viene sfruttata la capacità infettiva del fago piuttosto che la trasformazione utilizzando il calcio

cloruro.

5.3 Cosmidi

I cosmidi vengono utilizzati per il clonaggio di genomi di dimensioni medio-piccole (o singoli geni).

Non sono sufficienti per clonare l’intero genoma umano. Sono molecole di sintesi, non esistenti in

natura e che hanno la capacità di trasferire maggiore quantità di DNA di quanto possa fare un

plasmide o un fago. I cosmidi sono stati progettati per unire alcune proprietà dei plasmidi e dei fagi:

1. si replicano come i plasmidi poiché contengono la sequenza ori,

2. si impaccano nelle teste proteiche a formare le particelle virali come i fagi poiché conten-

gono le estremità COS. Grazie alla presenza di tali siti COS.

Elementi strutturali importanti. Gli elementi strutturali importanti dei cosmidi sono i seguenti:

1. inizio di replicazione ori, non vi sono geni per la replicazione fagica o lalisi, quindi non si

formeranno placche;

2. vengono assolutamente mantenuti i siti COS per poter effettuare il packaging in vitro;

66

3. di solito viene inserito un Polylinker (pUC) per poter effetuare il clonaggio;

4. l’importanza di marcatori genetici selezionabili (geni che codificano per la resistenza

all’Ampicillina), per la selezione delle colonie ricombinanti su agar solido.

Il meccanismo è molto simile a quello dei plasmidi; non placche di lisi ma colonie.

Figura 13. Struttura semplificata di un cosmide.

Nella struttura del cosmide, si possono chiaramente individuare:

1. l’origine di replicazione;

2. i due siti COS per la ricombinazione;

3. una sequenza che codifica per la resistenza ad un antibiotico, in questo caso alla tetra-

ciclina (TetR);

4. dei siti di restrizione.

Dimensioni del cosmide di solito sono di circa 5 kb, e l’inserto dovrà essere almeno di 32-45 Kb per

consentire il packaging in vitro (37-51 Kb totali).

Clonaggio in cosmidi. I due siti COS sono separati da un sito di restrizione per ScaI, la di-gestione

di questo punto permette la linearizzazione del cosmide (che simula quello dl fago). Inoltre è presente

un’altra regione, presente al di fuori delle due sequenze COS, che viene riconosciuta e tagliata da un

67

altro enzima di restrizione (BamHI). Quando di vuole effettuare un clonaggio viene digerito per primo

con ScaI, in modo da linearizzare il cosmide; successivamente una seconda di-gestione con BamHI

creando due estremità compatibili con tale enzima. In seguito si va ad idrolizzare il DNA di interesse

(in rosso) con BamHI. Prima di effettuare tale operazione è necessario che le estremità del DNA siano

defosforilate per evitare il legame tra i due frammenti terminali (previene la ciclizzazione); in questo

modo tali frammenti per poter essere inseriti necessitano di fosfato che viene a trovarsi a livello delle

sequenze BamHI recise del cosmide. Nel momento in cui si va a miscelare il DNA del cosmide e quello

di interesse, in presenza dell’enzima ligasi, si abbia una reazione di ligazione che porta alla formazione

del prodotto finale. Il cosmide linearizzato che è stato ottenuto può essere inserito all’interno di un

capside (solamente se è linearizzato e non diversamente) attraverso il meccanismo di packaging in

vitro. Successivamente all’infezione del batterio da parte del fago ottenuto, grazie alla presenza delle

sequenze COS, il DNA circolarizza a plasmide (come risultato si ottengono dei batteri trasformati con

plasmide). Per poter identificare quali batteri sono stati trasfor-mati con il cosmide, si va a sfruttare

il principio della resistenza alla tetraciclina riportata dalla se-quenza genica del cosmide.

5.4 Vettori e dimensioni degli inserti clonabili

A seconda delle dimensioni dell’inserto clonabile è possibile scegliere il vettore più adatto:

VETTORE

FORMA

OSPITE

CAPACITA’ TIPICA DI TRASPORTO

(dimensione dell’inserto che

accetta)

PLASMIDE DNA circolare DS E. coli Fino a 15 kb

BATTERIOFAGO λ Virus (DNA lineare DS) E. coli Fino a 25 kb

COSMIDE DNA circolare DS E. coli 30-45 kb

BAC Cromosoma Artificiale

Batterico

E. coli 100 – 500 kb

YAC Cromosoma Artificiale

di Lievito

Lievito 250 – 2000 kb

5.5 Laboratorio per i batteri

Solitamente i batteri possono essere facilmente manipolati a meno che non siano ceppi batterici

altamente patogeni per l’uomo e che non necessitino alti livelli di protezione. L’occorrente essenziale

per un laboratorio per batteri è: 1) Bancone, 2) Guanti, 3) Beute/piastre petri/ anse per batteri/

eppendorf/ etc…, 4) Centrifughe da banco/ centrifughe refrigerate/ super centrifughe, 5) Incubatore/

camera calda/ agitatori, 6)LB e agar, 7) Autoclave, 8) Smaltimento rifiuti biologici.

68

6. La trasfezione:

vettori virali e non virali

6.1 Sistemi di trasferimento genico (trasduzione)

Il processo che prevede il trasferimento di materiale genico prende generalmente il nome di trasdu-

zione; tuttavia può cambiare nome a seconda dell’organismo ricevente. Infatti, quando l’ospite è rap-

presentato dai microrganismi, il processo prende il nome di trasformazione; quando invece il riceven-

te è una cellula eucariotica (in particolare di mammifero), tale processo prende il nome di trasfezione;

quando il trasferimento genico è mediato da un virus questo prende il nome di infezione.

Perché trasferire nelle cellule frammenti di DNA/RNA esogeno? Le ragioni che motivano l’uso di questi

sistemi sono svariate. Nella ricerca, ad esempio, tale processo consente di ottenere delle cellule

ingegnerizzate (o geneticamente modificate) che sono in grado di produrre una determinata proteina

di interesse, consentendo l’espressione di un determinato gene e di studiarne la sua struttura;

permettono di tracciare il metabolismo di una specifica proteina all’interno della cellula qualora

questa venga resa fluorescente. In sostanza, le cellule in coltura sono utili:

1. all’identificazione di sequenze regolatorie;

2. all’identificazione della struttura e della funzione di un gene;

3. alla produzione di proteine come oggetto di studio oppure per sintetizzare nuovi farmaci.

Riguardo agli studi in vivo, questo processo riguarda la produzione di animali transgenici, ovvero una

serie di modelli per la comprensione delle basi molecolari di malattie umane. Nella pratica clinica,

invece, la modifica genica (terapia genica) viene utilizzata anche sull’uomo per consentire il ripristino

di funzioni metaboliche deficitarie (si tratta di un riespressione di un determinato gene che, mutato

o represso, e che portava ad una perdita di funzione), oppure l’aumento delle difese naturali. Nel momento in cui si inserisce del materiale genetico (RNA o DNA), quello che si può ottenere, con

differenti strategie, è:

1. una espressione o sovraespressione di un determinato gene (di solito attraverso l’utilizzo di

plasmidi - pDNA);

2. il silenziamento dell’espressione di un particolare gene (solitamente attraverso siRNA o

miRNA).

6.2 Ottimizzazione del processo

La trasfezione, come tutti i processi, può essere ottimizzata.

I parametri da tenere in considerazione sono:

1. DNA da trasfettare – il materiale genetico che da trasfettare deve essere privo di contaminanti (i

principali contaminanti sono le proteine e l’RNA che potrebbe interferire ad esempio con i metodi

chimici dove c’è la necessità di mascherare le cariche negative del DNA). Inoltre, la soluzione di

DNA deve essere necessariamente sterile e priva di contaminanti batterici.

69

2. Scelta del tipo cellulare.

3. Scelta del tipo di vettore – adatto per aumentare l’espressione in linee cellulari di mammifero.

4. Tempo di trasfezione – da un tempo minimo di 30 min ad un tempo massimo di 4 ore.

5. Scelta del terreno di coltura – scelta del siero o meno e degli antibiotici.

6.3 Fattori che influenzano la trasfezione

1. STATO DI SALUTE DELLE CELLULE – Le cellule devono essere mantenute nella fase log di

crescita; devono essere coltivate in un medium di crescita appropriato e in condizione di

temperatura e umidita corrette; e, devono essere prive di contaminazioni.

2. CONFLUENZA E FASE DI CRESCITA DELLA COLTURA - la densità media di crescita dipende dalla

linea cellulare, generalmente e compresa tra il 40 e 80%.

a. densità troppo bassa: i reagenti di trasfezione possono risultare troppo concentrati e tos-

sici, le cellule crescono troppo poco;

b. densità troppo alta: le cellule hanno inibizione da contatto, si riduce la superficie di

membrana disponibile all’ingresso del DNA.

Le cellule in attiva divisione si trasfettano meglio delle cellule quiescienti (la rottura della

membrana nucleare durante la mitosi, favorisce l’ingresso del DNA esogeno nel nucleo).Il

numero di passaggi della coltura deve essere il piu basso possibile, comunque inferiore a 50.

Le caratteristiche di una linea cellulare possono cambiare con l’aumentare dei passaggi,

queste cellule possono inserire nel loro genoma delle mutazioni e risultare significativamente

diverse rispetto alle cellule di partenza; questo potrebbe influenzare anche l’efficienza di

trasfezione e la riproducibilità di un esperimento. Solitamente le cellule dopo un elevato

numero di passaggi si trasfettano in maniera meno efficiente. Quindi è sempre meglio

standardizzare la procedura su cellule che hanno subito meno passaggi possibili.

3. QUALITA’ E QUANTITA’ DEL DNA – E’ un fattore molto importante per la trasfezione, infatti

e necessario utilizzare plasmidi di alta-qualità, privi di contaminanti proteiche, di RNA e di

sostanze chimiche usate per la purificazione. Non ci devono essere endotossine. Solitamente

il DNA e risospeso in acqua sterile o buffer TE, in una concentrazione compresa tra 0.2-1

mg/ml. La quantità ideale di DNA da trasfettare dipende dal tipo cellulare, dal metodo di tras-

fezione, etc e va quindi determinata sperimentalmente (NOTA: il DNA ad alte concentrazioni

e tossico per le cellule).

6.4 Metodi di Trasfezione

La trasfezione consiste nell’inserimento di DNA o RNA esogeno all’interno di cellule eucariotiche

bersaglio. A seguito della trascrizione, ottenere l’epressione/silenziamento del gene d’interesse ed

andarne a caratterizzare gli effetti di tale espressione genica (proteina). Le problematiche principale

legate al processo di trasfezione sono legate al fatto che il DNA e l’RNA sono molecole fortemente

polari (cariche negativamente) e la membrana cellulare è lipofila; dunque le due strutture risultano

poco compatibili, motivo per cui c’è la necessita di mascherare in qualche modo la carica negativa ed

aumentare la compatibilità degli acidi nucleici con la membrana in modo tale da consentire l’ingresso

70

all’interno della cellula. Il processo di trasfezione prevede l’utilizzo o la creazione di un vettore,

all’interno del quale viene posta la molecola da trasportare (cargo); il complesso formato dal vettore

e dal cargo facilità tale processo di trasfezione nell’ospite. Generalmente il processo di trasfezione

prevede che l’ingresso del materiale genico avvenga attraverso endocitosi ma non è proprio così. Di

solito, il vettore con all’interno il cargo viene internalizzato per endocitosi formando un ensosoma

precoce che maturerà per diventare un endosoma tardivo. Durante la trasfezione è molto importante

favorire il processo di escape, ovvero la fuoriuscite dell’endosoma tardivo prima che questo vada a

fondersi con il lisosoma (è necessario evitare che il contenenuto del endosoma tardivo vada a finire

nel lisosoma perché altrimenti questo verrebbe degradato) così che, ad esempio, il plasmide liberato

possa andare a svolgere la sua funzione all’interno della cellula.

6.5 Il cargo

Si distinguono diversi tipi di cargo genetici:

1. Plasmide (pDNA), DNA double-strand circolare (quello più utilizzato in assoluto). Il plasmide viene

prima amplificato nei batteri e poi successivamente utilizzato sulle cellule eucariotiche. Infatti uno

dei vantaggi è proprio questo, un plasmide è molto facile da amplificazione se si dispone di una

coltura di batteri, da ottenere e da manipolare. Lo svantaggio principale è legato alla sua minore

durata nel tempo (48-72 ore al massimo), infatti non riuscendosi ad integrare con il genoma della

cellula eucariotica, viene perso nel corso delle duplicazioni cellulari. Un altro svantaggio è dato

dall’impossibilità di caricare dimensioni eccessive di materiale genetico su un plasmide, infatti

diverrebbe difficoltoso l’attraversamento della membrana plasmatica.

Sono riportati alcuni esempi di modifiche apportate al plasmide in modo da ottimizzare la sua

durata di espressione del gene contenuto al suo interno.

≡ ESEMPIO 1. Tale sistema viene denominato Enhanced Episomal Vectors (EEV). La strategia

adottata è stata quella di inserire una sequenza virale all’interno del DNA double-strand circolare

che codifica per una proteina specifica, la Epstein-Barr Nuclear Antigen-1 (oriP-EBNA1), che nel

momento in cui viene trascritta e tradotta tale proteina accoppia la duplicazione del plasmide alla

duplicazione della cellula ospite. Quindi il plasmide continua ad essere presente anche per

l’apparato di trascrizione cellulare fin quando la cellula ospite duplica. Ciò significa che finché

viene mantenuta costante la coltura, il plasmide (non integra nel genoma ma rimane episomiale)

con questo sistema di abbinamento della duplicazione permane sempre all’interno della cellula.

≡ ESEMPIO 2. Il Minicircle è una strategia che è stata disegnata al fine di aumentare sia la durata

di espressione del transgene, ma soprattutto riesce ad ovviare al problema della dimensione del

plasmide stesso. Il minicircle ha la caratteristica di essere molto piccolo e di essere facilmente

trasfettabile all’interno della cellula ospite con una durata di espressione molto maggiore rispetto

ai plasmidi classici (72 ore – 3 settimane). Il funzionamento del sistema del minicircle parte da

una struttura definita plasmide parentale che possiede al suo interno le seguenti strutture:

a. un’origine di replicazione per i batteri;

b. un particolare gene che consente di selezionare quali batteri sono stati trasfettati col plasmi-

de grazie alla sua resistenza alla Kanamicina (KanR);

c. un gene promotore che controlla il gene di interesse;

71

d. tre sequenze particolari (attP e attB viste precedentemente nei cosmidi e che consentono di

effettuare un processo di ricombinazione una volta tagliate in modo opportuno; una terza

sequenza importante indicata con 32xSce-I sites, che manifesta la presenza di 32 siti di taglio

per l’enzima Sce-I, la presenza di così tanti siti aumenta la probabilità di un taglio efficace).

La struttura del plasmide parentale è molto grande e non è semplice veicolarlo all’interno di cellu-

le eucariotiche se non è stato precedentemente amplificato all’interno del batterio (che ha una

capacità di trasformazione maggiore rispetto a quella di trasfezione di una cellula eucariotica;

quindi è più facile introdurre materiale genetico all’interno di un batterio). Nel momento in cui il

costrutto viene generato, successivamente si procede con l’amplificazione batterica per produrre

dei minicircle; tale operazione è possibile grazie ad uno specifico ceppo batterico di E.coli, il

YCY10P3S2T, un ceppo ingegnerizzato per l’espressione in modo inducibile da Arabinosio. Viene

fatto amplificare il plasmide parentale nei batteri in incubazione per una notte, e al termine di

tale periodo (si presuppone che la coltura abbia prodotto una quantità sufficiente di plasmide) si

addiziona l’Arabinosio al terreno di crescita. Questo zucchero permette al batterio di esprime

sequenzialmente due diverse molecole enzimatiche:

a. PhiC31 integrasi, il quale agisce andando a tagliare le sequenze attP e attB separando in due

porzioni il plasmide parentale così queste due porzioni possono richiudersi su loro stesse in

modo tale da formare le sequenze attL e attR (come avveniva per i plasmidi nel momento in

cui andavano ad integrare). Alla fine di tale processo si ottengono due diversi plasmidi: uno è

il minicircle e l’altro è il backbone batterico (contiene tutte le sequenze necessarie a produrre

il plasmide all’interno dei batteri, per la replicazione e quelle relative alla resistenza alla

kanamicina. Il minicircle, in modo complementare, contiene tutte le sequenze necessarie

all’espressione del transgene di interesse nella cellula eucariotica e la coda di poly-A.

b. I-SceI endonucleasi (enzima di restrizione). Una volta ottenuti il minicircle e il backbone batte-

rico dovrebbe essere necessaria la lisi della cellula batterica per recuperare il minicircle. Il

problema sostanzialmente risiede nei sistemi di recupero di tale materiale genetico poiché i

sistemi di separazione del DNA batterico si basano (come precedentemente visto) su parti-

colari resine ad alta affinità per il DNA plasmidico. In questo caso, avendo ottenuto due plas-

midi (minicircle e il backbone batterico), attraverso tale operazione non risulterebbero distin-

guibili. L’endonucleasi, entra in gioco digerendo il backbone batterico nei suoi 32 siti di taglio

per Sce-I e linearizzando tale struttura che, solo a questo punto, potrà essere distinta dalla

colonna. Questo meccanismo permette il recupero selettivo del minicircle.

2. Antisense Oligo Nucleotide (AON). Queste molecole vengono utilizzate quando si vuole silenziare

l’espressione di un determinato gene. Gli AON sono polimeri sintetici. I monomeri possono essere

sia desossiribonuclotidi o ribonucleotidi. Sono denominati oligo perché hanno una lunghezza

compresa tra 15-20 nucleotidi (sequenze abbastanza corte); mentre vengono defiiti antisenso

perché la loro sequenza (3′ → 5′) è complementare alle sequenze del mRNA del gene da

silenziare. I meccanismi di silenziamento di un gene da parte degli AON sono essenzialmente due:

a. attraverso l’attivazione di un enzima denominato RNA-si H che è un enzima cellulare che viene

attivato qualora si formino delle molecole con RNA Duble Strand (DS), ovvero delle molecole

di RNA a doppio filamento, tale enzima ne promuove la degradazione;

72

b. determinazione di un ingombro sterico. L’AON solitamente va a posizionarsi sul messaggero

in una regione che precede o sta a cavallo del sito di inizio della traduzione, impedendo l’at-

tacco del ribosoma con conseguente mancata traduzione del mRNA e l’espressione della pro-

teina di interesse.

Caratteristiche funzionali e generazioni di AON. Gli AON per poter funzionare correttamente de-

vono soddisfare i seguenti punti:

a. devono essere capaci di entrare all’interno delle cellule bersaglio;

b. devono, ove possibile, evitare di essere digerite a loro volta dalle nucleasi;

c. non devono avere effetti dannosi per la cellula in cui vengono transfettati.

Per ottenere queste caratteristiche, solitamente gli AON, vengono modificati soprattutto al fine

di aumentarne la resistenza da parte delle nucleasi (queste molecole degradano con molta facilità

gli AON) e di aumentare l’affinità con il target. Le modifiche che possono essere fatte sul substrato

zuccherino, sulla base o sul backbone. Gli Oligo Nucleotidi Antisenso possono essere distinti in tre

generazioni a seconda delle modificazioni che sono state effettuate nel corso del tempo:

a. AON di prima generazione – ottenuti per modifiche del backbone. Le modificazioni più fre-

quente è quella che prevede la sostituzione di un ossigeno non a ponte con un atomo di zolfo.

Questo fa sì che venga aumentata la resistenza della molecola, che si abbia un maggiore

uptake e che aumenti la capacità di attivare l’RNA-si H. Gli svantaggi principali di questa prima

generazione sono quelli legati ad una maggiore citotossicità e ad una bassa permeabilità della

barriera ematoencefalica (BEE); questi due svantaggi potrebbero costituire una grossa

limitazione nel loro utilizzo.

b. AON di seconda generazione – ottenuti per modifiche a livello dello zucchero. In particolar

modo se ne distinguono di due tipologie:

• 2’-O-Me e 2’-O-MOE, che prevedono delle modifiche in pos 2’ del ribosio.

• locked nucleic acid (LNA), che prevedono delle modifiche al carbonio in 4’ legato

all’ossidrile in 2’.

In entrambi i casi si ha come vantaggio l’aumentata ibridazione con target e una maggiore

resistenza alle nucleasi. Lo svantaggio principale è dato dall’incapacità di entrambe le tipologie

di reclutare l’RNA-si H, e quindi possono solo funzionare per ingombro sterico. Altri AON di

seconda generazione sono stati ottenuti per modifiche a livello delle basi azotate. La terza

generazione ha come vantaggio quello di indurre un’aumentata ibridazione con il target; ma

come svantaggio una ridotta resistenza alle nucleasi.

c. AON di terza generazione - ottenuti per modifiche dell’anello furanico del nucleotide. Quelli

più utilizzati di solito sono di due tipi:

• Il Peptide nucleic acid (PNA), è costituito dagli analoghi peptidici dei nucleotidi. Questi

peptidi hanno il vantaggio di non attivare l’RNA-si H, e quindi possono funzionare per

ingombro sterico e hanno un’elevata affinità e specificità di ibridazione con il target

(producono un silenziamento molto efficiente). Il vantaggio di interagire per ingombro

sterico garantisce una maggiore attività dell’AON che dura nel tempo perché questi

non vengono degradati.

• Il Phosphorodiamidate morpholino oligomer (PMO), gli AON appartenenti a questa

tipologia vengono più comunemente chiamati “morfolino” dal nome dell’anello della

73

struttura che li caratterizza. La loro funzione è data per ingombro sterico. Vengono

spesso utilizzati nei modelli in vivo animali, in quanto si sono dimostrati parecchio

efficaci nel silenziamento genico da un punto di vista della durata, e una ridotta cito-

tossicità rispetto agli AON visti in precedenza.

3. RNA interference (RNAi). Queste molecole vengono utilizzate quando si vuole silenziare

l’espressione di un determinato gene. Quello dell’RNAi è un processo fisiologico che avviene

all’interno delle cellule (a seguito della trascrizione) per regolare la vita di un determi-nato mRNA

e si basa sulla generazione di sequenze di Double Strand RNA (DS) che vengono processati al fine

di ottenere molecole di micro RNA che verranno poi utilizzate (da un complesso multiproteico)

come stampo per L’RNA che deve essere degradato. Esistono due diverse moleco-le che possono

originare dall’RNA interference:

a. Il Small interfering RNAs (siRNAs) - I componenti cellulari necessari per generare i siRNA sono

quattro:

• Dicer (RNAse di tipo III ribonucleasi RNA dipendente) è l’enzima iniziatore dell’RNAi per la

prodizione dei siRNA. Questo enzima processa il dsRNA (a doppio filamento) in sRNA (fila-

mento singolo).

• Small interfering RNA, ovvero il siRNA vero e proprio, dato da sequenze di 21-23 nucleotidi

di dsRNA, prodotti dalla cellula a partire dal taglio di un dsRNA di partenza. Vengono

incorpora-ti allinterno dell’enzima RISC e fungono da guida per la degradazione di

specifiche sequenze dell’mRNA (proprio per la complementarietà del siRNA rispetto al

mRNA).

• RNA-Induced Silencing Complex (RISC), ovvero un complesso enzimatico che lega l’mRNA

messaggero endogeno complementare al siRNA presente al suo interno. È un complesso

nucleasico costituito sia da proteine che da RNA.

• RNA-Dependent RNA Polymerase (RdRP), amplifica l’effetto di silenziamento.

Partendo da una molecola di dsRNA che viene tagliato dal Dicer per ottenere coppie più corte

di RNA non complementari alle estremità (leggermente sfalsate). Queste coppie sono i siRNA,

i quali vengono riconosciuti e legati al complesso RISC in modo da legare solo un singolo strand

(ovvero solo quello complementare al mRNA da degradare) e degrada la sequenza che

corrisponde al messaggero stesso (per complementarietà) in modo da silenziare l’espressione

genica di quel segmento di mRNA. I vantaggi nell’utilizzo del siRNA rispetto agli AON sono

dovuti ad una maggiore efficacia e sensibilità. Il siRNA che viene sintetizzato può essere fornito

e introdotto all’interno della cellula la quale può farlo funzionare in maniera fisiologica.

Mentre gli AON vengono degradati a seguito dell’attivazione dellRNA-si H, invece il siRNA

viene mantenuto all’interno del complesso RISC (portando alla degradazione del messaggero).

Modificare un AON richiede costi elevati, a differenza dei siRNA che sono particolarmente

semplici da produrre e da trasfettare all’interno di un vettore.

b. Il Micro RNAs (miRNAs). Prevede componenti aggiuntivi oltre quelli del siRNA che sono il

Drosha e l’Argonauta. Il funzionamento del micro RNA prevede la formazione di strutture

dette stem loop, che vengono processate dall’enzima Drosha e successivamente trasportate

dal nucleo al citoplasma dove successivamente vengono digerite ad opera del Dicer e caricate

sul complesso RISC. A questo punto, il processo è uguale a quello del siRNA.

74

6.6 I vettori

Sono i veicoli per l’introduzione e l’espressione di DNA/RNA esogeni in cellule bersaglio. I vettori si distinguono in due grosse categorie: virali e non virali.

1. Vettori non virali (attraverso metodi fisici e chimici): a. Plasmidi nudi b. Elettroporazione in vivo c. Liposomi d. Amine, proteine cariche positivamente

2. Vettori virali (attraverso metodi virali): a. Adenovirus b. Retrovirus c. Virus adeno-associati d. Lentivirus (derivati da HIV) e. Herpesvirus

Vettore ideale. i requisiti per un vettore ideale sono i seguenti:

1. Ampio Tropismo di espressione, per garantire la localizzazione del transgene sia a livello trasduzionale (il vettore infetta cellule specifiche), che a livello trascrizionale (il gene viene espresso solo in alcune cellule).

2. Durata di espressione, per far sì che l’effetto duri nel tempo. 3. Livello di espressione, possibilmente regolabile, soprattutto se il vettore trasporta una pro-

teina mutata e che può essere tossica per la cellula. 4. Scarsa tossicità.

Metodi di trasfezione. La scelta del metodo di trasfezione più appropriato dipende da diversi fattori: 1. tipo cellulare (linea immortalizzata, linea primaria – le linee primarie sono difficilissime da

trafettare, mentre le cellule immortalizzate più facilmente accettano DNA esogeno che viene mantenuto ed espresso per più tempo a causa delle loro frequenti replicazioni che rendono il macchinario cellulare sempre attivo alla traduzione e trascrizione del DNA esogeno);

2. dimensione del transgene, più questo è grande più bisognerà passare ad un metodo fisico piuttosto che un altro;

3. sicurezza (virus implicano un livello di sicurezza maggiore rispetto alle tecniche non virali); 4. efficienza desiderata; 5. costo; 6. tempo etc.

Non tutti i metodi di trasfezione possono essere utilizzati in maniera standard con tutti i tipi cellulari

o in tutti gli esperimenti. Esiste una notevole variabilità in termini di efficienza, vitalità, espressione

genica ottenuta, etc. E’ necessario settare le condizioni di trasfezione ottimale per ciascuna linea

cellulare e per ciascun gene di interesse.

① METODI FISICI E CHIMICI PER VETTORI NON VIRALI.

1. Metodi chimici. I metodi chimici sono tecniche che prevedono l’utilizzo di molecole ‘carrier’

per poter superare la barriera costituita dalla membrana cellulare. Non si hanno reazioni

chimiche con formazione di legami, il principio consiste nell’interazione tra gli acidi nucleici

carichi negativamente con molecole cariche positivamente (mascheramento delle cariche

negative), come polimeri o lipidi, che permettano agli acidi nucleici di entrare in contatto con

75

le componenti della membrana cariche negativamente e quindi di poter essere incorporati

nella cellula mediante endocitosi, e quindi rilasciati nel citoplasma.

a. DEAE (Diethylaminoethyl)-dextran. E’ stato il primo metodo non virale, messo a punto da

Vaheri and Pagano in 1965. Il destrano è un polisaccaride costituito da unita di D-glucosio

legate mediante legami di tipo alfa1/4 o alfa1/6. Quando viene associato a gruppi carichi

positivamente DEAE (dietilamminoetile) e in grado di legare il DNA (attraverso legami non

covalenti) e di mediarne l’ingresso attraverso le membrane, schermando le sue cariche

negative. Il principio sul quale si basa il DEAE è, per l’appunto, la formazione di un

complesso tra il DEAE-destrano e il DNA caratterizzato dall’avere un eccesso di carica

positiva (fornito dal DEAE- destrano) che facilita l’avvicinamento del DNA alla membrana

(avente il suo foglietto extracellulare leggermente carico negativamente e per questa

ragione è incompatibile col DNA). Grazie ad un pre-trattamento con glicerolo o DMSO che

sono in grado di modificare temporaneamente la permeabilità della membrana al DNA e

il su uptake avviene per endocitosi. Il vantaggio dell’utilizzo di questa tecnica è dovuto

alla sua semplicità, seppur poco costosa risulta poco efficiente per via dell’alta tossicità

scaturita dall’uso di glicerolo e DMSO che possono essere dannosi per la cellula (shock

osmotico). Un’altra strategia utile per aumentare l’efficienza di trasfezione consiste

nell’utilizzo di questi due composti in abbinamento ad un altro composto, la clorochna,

che si lega al DNA e inibisce la sua degradazione lisosomiale (excape).

76

b. Calcio fosfato. È un metodo simile a quello del DEAE-Dextran, testato e sviluppato da

Graham e van der Ebb nel 1973. Il principio si basa sul mascheramento della carica

negativa del DNA grazie ad un eccesso di carica positiva. Il metodo prevede che il DNA del

plasmide venga mischiato direttamente con una soluzione concentrata di CaCl2, e

successivamente viene aggiunto goccia a goccia a un buffer fosfato per formare un fine

precipitato caratterizzato da un eccesso di carica positiva che ingloba il DNA plasmidico.

In questo caso, probabilmente, l’uptake del DNA avviene per endocitosi. Nel momento in

cui il precipitato entra all’interno della cellula, la situazione di pH all’interno del citosol

viene a mutare, questo fa sì che il precipitato di disgreghi e venga rilasciato il DNA plasmi-

dico che è libero di entrare nel nucleo. I vantaggi dell’utilizzo del calcio fosfato sono molto

simili a quelli del DEAE-Dextran e prevedono l’economicità e la versatilità. Gli svantaggi

riguardanti tale metodo sono determinati:

• da una bassa efficienza;

• da una elevata tossicità per le cellule;

• non è funzionante verso alcuni tipi di cellule;

ESEMPIO DI PROTOCOLLO STANDARD (utilizzando la tecnica del DEAE- Destrano)

1. Piastrare le cellule per l’esperimento: a. piastrare il giorno prima della trasfezione - è importante che le cellule si trovino in fase

logaritmica al momento della trasfezione, poiché queste sono in fase di replicazione esponenziale, se si effettua una trasfezione con plasmide bisogna tener presente che questo deve entrare all’interno del nucleo una volta entrato nel citosol, questa operazione viene facilitata durante la replicazione cellulare perché il nucleo viene disassemblato e sarà più facile per il plasmide interagire con il DNA della cellula. Un’altra motivazione per cui vengono scelte le cellule in fase log, soprattutto in quei DEAE-Dextran casi in cui si vuole sovraesprimere una determinata proteina è importante che le cellule abbiano un assetto metabolico attivo e un sistema di trascri-zione e traduzione attivo.

b. il giorno della trasfezione le cellule devono avere una confluenza del 30-60%, perché l’esperimento di trascrizione prevede che il DNA venga internalizzato dando alla cellula il tempo necessario (circa 48 ore) per poter trascrivere e tradurre il DNA; se le cellule sono già in confluenza si andrebbe incontro alla fase stazionaria entro le 48 ore e si rischierebbe di avere cellule più attive.

2. Preparare il MIX di trasfezione: diluire il DNA in un tampone opportuno (ad es. tampone fosfato – PBS), aggiungere il DEAE-Dextran e mischiare delicatamente in modo da favorire la formazione del complesso di DEAE-destrano e DNA;

3. Aspirare il medium dalle cellule. Lavarle due volte con un tampone fosfato (PBS) che deve avere una caratteristica isotonicità rispetto alle cellule stesse.

4. Aggiungere il mix DNA/DEAE-dextran alle cellule. 5. Incubare le piastre a 37 °C per 30 minuti. 6. Aggiungere delicatamente il medium (perché le cellule non possono stare a contatto con il

tampone fosfato per un tempo molto lungo), il terreno di coltura deve essere comprensivo di nutrienti e del siero. Incubare fino a 2.5 ore a 37 °C poi cambiare il medium (e con esso vengono sottratti tutti i reagenti di trasfezione) e fare shock con DMSO, per favorire la permeabilità della membrana cellulare e per permettere al DNA (depositato sulle membrane) di penetrare all’interno della cellula.

77

• a differenza del precedente metodo risulta più delicato dal punto di vista tecnico

poiché l’efficienza dipende dal tipo di precipitato che si ottiene (forma e

dimensione) che dipendono dalla soluzione di calcio fosfato e quindi le variazioni

di pH possono influenzare l’efficienza di trasfezione.

c. Lipofezione. È uno dei metodi chimici più utilizzati in quanto meno tossico e più efficiente.

Tra i metodi di trasfezione appartenenti a questa categoria, distinguiamo:

A) Lipidi cationici;

B) Reagenti liposomiali a multicomponente: combinazioni di lipidi e polimeri

C) Reagenti liposomiali a multicomponente coniugati con anticorpi o ligandi che aiuta-

no il targeting specifico.

Generalmente vengono utilizzati lipidi cationici che mimano la struttura di un fosfolipide,

infatti sono composti da:

• una testa carica positivamente (ammina) che costituisce il dominio cationico;

• un gruppo linker come unestere o un etere (spaziatore);

• due o più code idrofobiche (ancore idrofobiche);

Nel momento in cui questi lipidi cationici vengono introdotti in acqua formano delle

strutture a micella cava, i liposomi, che ha affinità chimica con la struttura della membrana

cellulare. La disposizione dei lipidi all’interno del liposoma sarà tale che le teste polari si

disporranno sul esterno e lungo il lume interno a contatto con i liquidi acquosi, mentre le

code idrofobiche sul versante interno vicine le une con le altre (allontanandosi

dall’ambiente acquoso). Se questi lipidi vengono messi a contatto con il DNA plasmidico,

questo verrà attratto e complessato dalle teste polari cariche positivamente. Grazie a

questo principio il DNA può stratificarsi o sulla superficie esterna o all’interno della

particella liposomica. In questo modi di andranno a mascherare efficacemente le cariche

negative del DNA plasmidico. Per di più, essendo la membrana del liposoma altamente

ESEMPIO DI PROTOCOLLO STANDARD (utilizzando la tecnica del calcio fosfato)

1. Piastrare le cellule per l’esperimento: a. piastrare il giorno prima della trasfezione; b. il giorno della trasfezione le cellule devono avere una confluenza del 30-60%

2. La mattina della trasfezione è necessario cambiare il medium (per lavorare quanto più possibile in condizioni iso-osmotiche e isotoniche).

3. Dopo almeno 2 ore, trasfettare le cellule:

• mettere buffer fosfato in tubi sterili;

• aggiungere il DNA e mischiare,

• aggiungere goccia a goccia il CaCl2;

• incubare 20 minuti (per consentire la formazione dei precipitati di DNA e calcio).

• aggiungere la soluzione di precipitati goccia a goccia sulle cellule e mettere nell’incubatore.

• cambiare il medium il giorno successivo (a differenza di come di faceva per il DEAE-Dextran.

78

compatibile con la membrana cellulare, dunque verrà facilmente favorita l’interna-

lizzazione di tale struttura all’interno della cellula bersaglio senza la necessità di utilizzare

dei composti (come glicerolo e DMSO) che alterano la permeabilità della membrana.

Questi lipidi cationici sono un misto di lipidi policationici e neutri, permette la formazione

di vescicole liposomiali unilamellari (proprio per l’aggiunta dei lipidi neutri) che portano

una carica netta positiva; questo meccanismo gli permette di sfuggire facilmente

(excaping del DNA) dall’endosoma. La testa cationica del composto lipidico si associa ai

gruppi P negativi dell’acido nucleico. Si suppone che complessi lipidi-DNA si fondano con

le membrane cellulari rilasciando spontaneamente il loro contenuto nelle cellule; oppure

quello che pensa nella maggior parte dei casi è che la vescicola stessa venga internalizzata

nel citosol per endocitosi.

Figura 14. Trasfezione ed endocitosi mediata da Lipoplex. Lipidi cationici che formano strutture micellari

chiamate i liposomi sono complessati con il DNA per creare lipoplessi. Le strutture si fondono con la

membrana cellulare, almeno a volte dopo interazioni con proteoglicani di superficie. I complessi sono

interiorizzati dall'endocitosi, con conseguente formazione di una vescicola micellare invertita a doppio strato.

Durante la maturazione del endosoma in un lisosoma, la parete endosomiale potrebbe rompersi, rilasciando

il DNA contenuto nel citoplasma e potenzialmente verso il nucleo. Il DNA importato nel nucleo potrebbe

risultare in un gene espressione. In alternativa, il DNA potrebbe essere degradato all'interno del lisosoma.

Come precedentemente riportato, il principale problema di questi composti è la loro

degradazione liposomiale. Per ovviare alla degradazione lisosomiale, i lipidi cationici

vengono mischiati con lipidi neutri (lipidi Helper; es DOPE), che permettono la formazione

di vescicole unilammellari a netta carica positiva. Gli acidi nucleici si assorbono in questa

struttura impacchettata. L’Uptake avviene presumibilmente mediante endocitosi. Il lipide

helper permette al DNA di uscire dall’endosoma. Questa tecnica ha il vantaggio di avere

una bassissima tossicità per la cellula ed un’alta efficienza di trasfezione, che seppur

proprietà al quanto soddisfacenti rimangono inferiori rispetto agli svantaggi che sono

legati alla loro difficoltà di produzione (infatti i liposomi devono essere per forza acqui-

stati) e per tale ragione presentano un costo poco economico.

LIPOFECTAMINA: Reagenti e metodo. La lipofectamina fu uno dei primi reagenti sviluppati

nel campo della lipofezione. Si tratta di un mix 3:1 di lipidi cationici e lipidi neutri.

Generalmente la lipofectamina può essere addizionata a degli agenti che vengono detti

79

direzionanti. Un esempio di agente direzionante è la transferrina, un ligando che viene

addizionato al mix di liposoma e DNA perché presenta numerosi recettori di membrana

specifici per la transferina (normalmente espressi in molti tipi cellulari diversi) che facilita

l’avvicinamento della vescicola del liposoma con il DNA alla membrana plasmatica, e

l’interazione proteina-proteina fa sì che la vescicola si fonda con essa e successivamente

indotta a rilasciare il suo contenuto nel citosol.

Quando le cellule vengono coltivate in assenza di siero, però, si attivano tutta una serie

di meccanismi catabolici che ad esempio portano alla produzione di metaboliti di

rapido utilizzo che possono essere utilizzati al posto dei componenti del siero. Tali

risposte potrebbero influenzare i risultati dell’esperimento. A tal proposito sono stati

formulati dei terreni specifici per la lipofezione che consentono di lavorare a basse

concentrazioni di siero.

Altri formulati di lipofectamina. Nel corso del tempo si sono susseguite varie

formulazioni di lipofectamina. La Lipofectamina 3000 è quella che viene utilizzata di

più in assoluto che, rispetto alla lipo-fectamina descritta in precedenza, ha come

vantaggio una durata minore in termini di tempo (5 min) di complessazione del DNA.

Infatti per la lipofectamina vista pre-cedentemente occorrono circa 30 min affinché

questa riesca a complessare il DNA plasmidico. La lipofectamina 3000 non necessita di

un cambio di terreno, né prima e né dopo la transfezione (questo è un punto molto

importante perché il cambio del terreno può divenire un’operazione al quanto

ESEMPIO DI PROTOCOLLO STANDARD (utilizzando lipofectamina)

1. Le cellule vengono seminate il giorno prima e devono arrivare a una confluenza del

50-80% (ottimizzazione della densità cellulare);

2. Si effettua la trasfezione vera e propria:

a. Si va a diluire il DNA in medium privo di siero e antibiotici perché è stato

dimostrato che questi inibiscono, o riducono l’efficacia, dei liposomi in fase di

transfezione. La rimozione degli antibiotici può essere mantenuta per tutta la

notte dall’inizio della transfezione in poi; mentre il siero viene riaggiunto di solito

3 ore dopo la transfezione (operazione consigliabile).

b. Viene addizioanata la Transferrina e viene lasciato reagire per circa 15 min in

incubazione in modo che si formi il complesso DNA-transferrina.

c. Si addiziona la Lipofectamina in D-MEM privo di siero e si lascia reagire per 15 min

sempre in incubazione.

d. Si effettua l’eliminazione del medium di crescita dalle piastre; e si riag-giunge un

medium privo di siero e Antibiotici (a metà del volume).

3. Dopo 30 min dall’inizio della transfezione le cellule possono essere incuba per circa 3

ore.

4. Si aggiunge il siero (in proporzione doppia) e gli antibiotici in modo da rimet-tere le

cellule in una condizione per loro ottimale.

5. Il giorno successivo si esegue il cambio del medium e relativi trattamenti.

80

stressogena per le cellule, le quali necessariamente devono re-instaurare nuove

connessioni e riadattarsi al nuovo terreno di crescita); quindi il fatto di non dover

intervenire sulle condizioni di crescita durante la lipofezione rappresenta un grosso

vantaggio di questa tecnica. Tutte le altre formulazioni successive hanno certamente

lo scopo di ridurre i tempi di complessazione e soprattutto vantano una minore

tossicità e una migliore efficienza di trasfezione. La lipofectamina RNAimax è stata

formulata in modo specifico per la trasfezione dei siRNA e dei miRNA; tiene conto del

fatto che il cargo non è ds-DNA ma è RNA. Un’altra formulazione, il LipofectamineR

MessengerMAX™ mRNA Transfection Reagent, è una nuova tecnologia che permette

di trasfettare direttamente un mRNA partendo dalla formazione di un complesso che

coinvolge direttamente l’RNA messaggero. Il vantaggio è legato ai tempi ridotti che

intercorrono nell’espressione del transgene di interesse. Infatti, fornendo un RNA

messaggero già pronto, questo nel momento in cui viene liberato all’interno del

citoplasma è già disponibile per il macchinario cellulare e per la traduzione a proteina.

Di contro, nella trasfettazione del DNA, questo deve prima riuscire ad effettuare

l’excape dall’endosoma, successivamente dal citoplasma trasportato al nucleo,

trascritto, maturato, esportato e solo a questo punto è reso disponibile per l’apparato

di traduzione. Il kit che viene fornito per effettuare questa operazione di trascrizione

consiste in un vettore di espressione (plasmide a DNA) che consente di clonare

all’interno del plasmide oppure di amplificare mediante un sistema PCR, così da ge-

nerare l’RNA messaggero e di poterlo successivamente isolare. Una volta ottenuto

l’RNA messaggero può essere messo a contatto con i liposomi contenuti nel kit e

avviare il processo di trasfezione.

2. Metodi fisici. I metodi fisici permettono di trasferire direttamente nel citosol o nel nucleo

acidi nucleici, senza l’uso di sostanze chimiche. I metodi fisici più utilizzati sono i seguenti:

a. Microiniezione – Metodo fisico per elezione, usato principalmente per la manipolazione

di singole cellule (es. oociti, poiché sono sufficientemente grandi per essere iniettati). Si

basa sull’inserimento di DNA o RNA nella cellula (nel citoplasma o nel nucleo) attraverso

un capillare di vetro, con un sistema ad alta pressione senza danneggiare la cellula stessa.

Date le ridotte dimensioni delle cellule (alcune decine di mm di diametro) la microinie-

zione richiede una sofisticata apparecchiatura che comprende:

• un microscopio;

• un micromanipolatore (per regolare l’inserimento del fluido);

• un iniettore;

come vantaggio di questa tecnica si ha il 100% di efficienza, poiché inserendo diret-

tamente il DNA all’interno del citoplasma del nucleo oltrepassando l’ostacolo fisico della

membrana. Lo svantaggio principale è che si può trasfettare solo un numero limitato di

cellule e quindi la tecnica è molto costosa ed applicabile solo a particolari tipi cellulari ed

è operatore dipendente. È una tecnica molto utilizzata oggi per la fecondazione assistita

e in questo caso il DNA viene inserito nel pro-nucleo.

b. Metodi balistici. Il principio al base di queste metodologie è quello che il DNA viene coat-

tato (adsorbito) su particelle di oro o tungsteno. Le particelle sono accelarate da un forza

81

esterna, applicando un alto voltaggio o attraverso una pressione esercitata da un gas. Nel

momento in cui tali particelle impattano con la membrana plasmatica (o con la parete

cellulare vegetale) vanno a formare dei pori attraverso i quali il DNA viene fisicamente

inserito all’interno della cellula bersaglio. Di solito si utilizza un sistema a pressione

regolabile ad elio per sparare microcarriers d’oro rivestiti di DNA dalla parete interna di

una cartuccia di plastica direttamente sul bersaglio; oppure un sistema per accelerare

microproiettili d’oro o di tungsteno rivestiti di DNA su un bersaglio posto in una camera

sottovuoto. Per l’utilizzo di questa tecnica è bene tenere in considerazione una serie di

parametri fisici molto importanti:

• Velocità con cui la particella colpisce il target – tale velocità è dipendente dal tipo di

proiettile (materiale che li costituisce), dalla forza che gli viene applicata per poter

accelerare o decelerare e in fine dalla distanza del target.

• Rivestimento dei proiettili – influenza fortemente l’efficienza;

• Numero di particelle che entrano nel tessuto – il numero delle particelle che si vuole

“sparare” all’interno delle cellule deve essere determinato poiché esiste un equilibrio

tra efficienza e vitalità cellulare; infatti maggiori saranno le particelle e maggiori sarà

l’efficienza ma di contro saranno maggiori i pori che vengono generati sulla membrana

e questo potrebbe contribuire ad abbassare la vitalità cellulare. Quindi è necessario

trovare un buon compromesso che va determinato sperimentalmente.

I principali strumenti che possono essere utilizzati per la trasfezione con metodi balistici

sono due:

• Sistema della camera a vuoto – è un sistema che accelera microproiettili d’oro o

di tungsteno rivestiti di DNA su un bersaglio posto in una camera sottovuoto sfrut-

tando la pressione dell’elio. • Gene-gun – i proiettili vengono caricati all’interno della “pistola”, lo sparo è otte-

nuto con un’onda supersonica di elio, che passando all’interno della cartuccia, pro-

ietta fuori il contenuto.

Figura 15. Gene-gun.

I vantaggi di questa tecnica si basano principalmente sulle cellule vegetali perché consentono di

lavorare in Situ dato che le cellule vegetali sono difficili da trasfettare per via del fatto che

queste sono provviste di parete cellulare, oltre alla membrana. È una tecnica applicabile

a quei sistemi cellulari poco responsivi ad altri carrier per il trasferimento genico anche in

vivo; dà la possibilità di fare studi di espressione genica in condizioni fisiologiche (espres-

82

sione tessuto specifiche o studi sullo sviluppo). Inoltre, consente di usare meno DNA e

meno cellule di partenza. Gli svantaggi correlati a questa tecnica sono relativi alla sua

maggiore invasività, alla correlazione dipendente della sua efficienza per il tipo cellulare,

occorrono molti parametri da stabilire e controllare, e inoltre per tali ragioni e per il

materiale di cui sono fatti i proiettili si rivela una tecnica molto costosa.

c. Elettroporazione. Se le cellule vengono poste in una soluzione contenente DNA, e

vengono esposte ad un breve impulso elettrico che produce transitoriamente dei pori

nelle loro membrane e il DNA viene veicolato senza necessità di altri reagenti nelle cellule.

Prima dell’impulso elettrico la cellula è completamente integra e impermeabile all’in-

gresso di molecole di DNA; nel momento in cui viene applicato il campo elettrico si osserva

la comparsa di pori temporanei che possono essere sfruttati dal materiale genetico per

entrare all’interno dell’ambiente cellulare. La comparsa dei pori si pensi sia dovuta ad una

temporanea perturbazione dovuta al campo elettrico che interagisce con le cariche della

membrana, che da neutra viene polarizzata. Cessata tale perturbazione, la membrana

torna allo stato originario e il DNA che è entrato viene intrappolato all’in-terno. La tecnica

dell’elettroporazione necessita di uno strumento che è l’elettroporatore, il quale consente

di generare e di regolare un determinato campo elettrico all’interno di una provetta.

L’unica limitazione di questa tecnica è che le cellule si devono trovare in sospensione,

ovvero devono essere staccate dal terreno di coltura e poste temporanea-mente

all’interno di una provetta sterile a contatto con il DNA; al termine devono essere semi-

nate nuovamente. Il vantaggio di questa tecnica risiede principalmente sulla sua efficienza

nel trasfettare anche tipi cellulari difficilmente trasfettabili con metodi chimici. Un altro

vantaggio è che il DNA entra all’interno senza passare per il compartimento endosomiale

e si riduece il rischio di degradazione dello stesso. Gli svantaggi, invece, sono legati

principalmente ad una elevata tossicità (50%) per cui vi è la necessità di ottimizzare le

condizioni del campo elettrico in intensità e durata.

d. Nucleofezione. Vantaggi e svantaggi dei vettori non virali.

Vantaggi. Tra i vantaggi legati dei vettori non virali abbiamo i seguenti:

• dai vettori non virali è impossibile la generazione di nuovi virus patogeni;

• riduzione del rischio di reazione immunitaria (porterebbe ad una alterazione della

normale crescita della coltura cellulare e in alcuni casi anche a tossicità della linea

stessa;

• possono trasferire molti tipi diversi di molecole, e permettono di trasdurre mole-

cole di DNA anche molto grandi;

• offrono la possibilità di produzione in grandi quantità a basso costo (in alcuni casi).

Svantaggi. Tra gli svantaggi invece abbiamo i seguenti:

• scarsa efficienza sia di trasduzione che di integrazione (effetti non duraturi) e spes-

so hanno una ridotta capacità di dare origine a delle linee cellulari che vengono

modificate in modo stabile – poiché la strategia che spesso si utilizza prevede che

il transgene (nel caso del plasmide) resti in forma episomiale al di fuori del genoma;

83

• Se integrati possono a loro volta possono dare mutagenesi inserzionale e la mo-

difica viene mantenuta nel tempo.

② VETTORI VIRALI (VIRUS).

Un virus (dal latino vīrus, -i, "veleno") è un'entità biologica con caratteristiche di parassita endocel-

lulare obbligato, in quanto si replica esclusivamente all'interno delle cellule degli organismi. Infatti,

questo parassita sfrutta l’assetto metabolico della cellula ospite per produrre le sue proteine strut-

turali. I virus possono infettare tutte le forme di vita, dagli animali, alle piante, ai microrganismi

(compresi altri agenti infettanti come i batteri) e anche altri virus. Quando non si trovano all'interno

di una cellula infetta o nella fase di infettarne una, i virus esistono in forma di particelle indipendenti

e inattive. Queste particelle virali, note anche come virioni, sono costituite da due o tre parti:

1. il materiale genetico costituito da DNA o RNA, lunghe molecole che trasportano le informa-

zioni genetiche;

2. un rivestimento proteico, chiamato capside, che circonda e protegge il materiale genetico;

3. e in alcuni casi una sacca di lipidi che circonda il rivestimento proteico quando sono fuori dalla

cellula (enveloped viruses).

I virioni possono avere forme semplici, elicoidali e icosaedriche, ma anche architetture più complesse.

La maggior parte dei virus possiede virioni che sono troppo piccoli (10-100nm) per essere visti con

un microscopio ottico. In media il virione ha una dimensione di circa un centesimo della dimensione

media di un batterio. I virus si sono evoluti per trasferire il loro materiale genetico nelle cellule in

maniera efficiente e selettiva e per questo vengono utilizzati come vettore per infettare cellule di

mammifero.

Meccanismo di infezione. Quando un virus aderisce alla cellula bersaglio è a partire da questo

momento che inizia il processo di infezione. Il virus inietta il suo materiale genetico all’interno

dell’ospite, il quale viene replicato sfruttando il macchinario cellulare. Dalla moltitudine di copie del

genoma virale duplicato, alcune vengono trascritte in modo da poter avviare tutti quei processi

metabolici che portano all’assemblaggio della componente strutturale di un nuovo virione. Una volta

sintetizzato il capside, il materiale genetico viene inserito al suo interno. Nel momento in cui questi

virioni raggiungono una concentrazione critica, portano la cellula a lisi e la liberazione di nuove

particelle infettive nell’ambiente esterno pronte a dare origine ad una nuova infezione. I virus

vengono definiti come delle vere e proprie “macchine da infezione” ed è il principale motivo per quale

vengono sfruttati come vettori al fine di veicolare il materiale genetico.

Virus come vettore. I vettori virali si ottengono:

1. inserendo il gene di interesse nel genoma del virus, sotto il controllo di un promotore forte

(promotore virale che promuove la trascrizione del gene posto a valle – questo garantisce,

nel momento in cui il gene viene inserito nella cellula bersaglio e viene trascritto rapidamente,

di avere un maggior numero di copie e la massima espressione del nostro transgene.

2. modificando il genoma virale in modo da rendere il virus incapace di riprodursi in maniera

autonoma (virus difettivo). Questo è importante per evitare la diffusione di virus ricombinanti;

3. il genoma virale ingegnerizzato con le tecniche del DNA ricombinante (il genoma del virus

viene di solito digerito in provetta utilizzando degli enzimi di restrizione adatti e di una ligasi),

e trasfettato in particolari linee cellulari capaci di produrre le componenti strutturali del virus

84

(capside e coda) per generare nuove particelle virali ricombinanti, all’interno delle quali, viene

inserito successivamente il genoma modificato.

4. Le linee cellulari che vengono utilizzate sono dette linee di packaging, e sono in grado di

complementare i difetti introdotti nel genoma.

Vantaggi e svantaggi dei vettori virali. Il principale vantaggio dell’utilizzo di vettori virali consiste

nell’elevata efficienza di trasduzione del transgene (che può raggiungere il 100%). Gli svantaggi sono

dati dai seguenti punti:

1. Possibilità di generare nuovi virus patogeni per ricombinazione con eventuali virus presenti

nell’ospite (svantaggio principale) – per cui questi necessitano di maggiori condizioni di

sicurezza per essere manipolati (è necessario evitare nella maniera più assoluta che i virioni

fuoriescano dal laboratorio);

2. Mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera casuale nel genoma);

3. Molecole di DNA di dimensioni limitate;

4. Reazioni immunitarie;

5. Costi elevati (poiché questi sono difficili da produrre in grandi quantità).

Come si costruisce un vettore virale (virus difettivi). I vettori virali vengono definiti come virus difettivi,

ovvero dei virus che sono stati privati di alcuni geni fondamentali alla sintesi della struttura del virione

(geni che codificano per il capside). Quindi, tali virus difettivi possono essere prodotti solo in parti-

colari linee cellulari capaci di complementare i difetti del virus (cellule di packaging). La loro pre-

parazione deve seguire queste fasi obbligate:

1. Costruzione del genoma ricombinante, che successivamente viene inserito all’interno del

genoma del virus privato di alcuni geni strutturali;

2. Trasfezione del DNA (o RNA) nella linea cellulare capace di produrre le particelle virali (cellule

di packaging) – vengono prodotte solo le componenti strutturali – nel momento in cui tali

strutture (capside) vengono riempite con il genoma ricombinante, si formano dei virioni

completi capaci di infettare delle cellule bersaglio.

3. Vengono raccolte le cellule, e i virioni secreti nel terreno (liberati dalle cellule di packaging),

si procede con la titolazione dei virioni per millilitro e analisi del virus (costatate l’effettiva

capacità di infezione del virus e che questa non sia possibile una seconda volta dopo la prima

infezione di interesse - in sostanza, bisogna assicurarsi che i virus prodotti non diano origine

a virioni maturi anche se questi sono stati privati dei geni codificanti per il capside).

Linee cellulari di Packaging. Sono linee cellulari trasfettate (transientemente o stabilmente) con geni

virali codificanti per proteine strutturali del virus, necessarie per l’assemblaggio dei virioni. La loro

trasfezione transiente con il DNA-vettore determina l’impacchettamento del costrutto nel virione

maturo. In questo modo si ottiene un vettore virale completo e pronto per la trasfezione.

85

Figura 16. Funzionamento delle Packaging cell.

Nella figura 16, viene riassunto il funzionamento delle packaging cells. Le cellule di “impacchetta-

mento” sono cellule che vengono munite di costrutti che codificano per le proteine strutturali del

virus. Sono sprovviste di DNA al loro interno finché non gli viene fornito il vettore di trasfezione con

il gene di interesse. A seguito della trasfezione la cellula di packaging produce e rilascia nel terreno di

coltura i virioni maturi, che successivamente possono essere raccolti e usati per infettare le cellule di

interesse. Quindi le packaging cell possono essere considerate come delle “fabbriche” per i virioni.

Se introdotto del DNA all’interno delle packaging cells, tale DNA può essere introdotto all’interno del

capside virale e generare delle particelle infettive che possono infettare delle cellule target. I tali

cellule bersaglio, tutto ciò che era contenuto nel genoma virale viene espresso e successivamente

duplicato. Il materiale genetico non può essere utilizzato per l’assemblamento di nuovi virioni in

quanto il genoma virale è stato precedentemente privato dei geni codificanti per il capside.

L’impossibilità di generare nuovi virioni infettivi a seguito della prima infezione è di fondamentale

importanza al fine di garantire la sicurezza del sistema, dell’operatore e dell’ambiente.

Virus utilizzati per i vettori. I principali virus che vengono utilizzati per generare dei vettori virali sono:

1. Retrovirus. Possono infettare solo cellule in divisione e si integrano stabilmente (attraverso il

loro genoma) in maniera casuale – questo potrebbe essere un problema perché il gene di

interesse potrebbe andare ad inserirsi in una sequenza e andare a silenziare l’espressione

genica di un determinato gene cellulare, o viceversa andare ad integrarsi in una regione che

non viene espressa nonostante l’infezione sia avvenuta in modo efficiente. Di questa

categoria fanno parte:

a. Retrovirus murini (Moloney murine leukemia virus) – Non sono noti membri capaci di

provocare malattie nell’uomo. Vengono inattivati dal complemento umano. Possiedono

un envelope (rivestimento) lipidico e non resistono al disseccamento. Hanno un genoma

abbastanza piccolo (10 Kb) costituito da una molecola di RNAss; dopo l’infezione il

genoma è retrotrascritto a DNAds che viene integrato nel genoma dell’ospite (possibile

mutagenesi). È opportuno ricordare che i retrovirus infettano solo cellule in divisione.

Questa può essere una limitazione qualora si voglia utilizzare questa tipologia di virus per

generare per andare ad infettare delle cellule post-mitotiche.

86

ciclo vitale di un retrovirus. Il ciclo vitale parte con il riconoscimento di una proteina sulla

superficie della particella virale da parte di una proteina presente sulla superficie della

cellula ospite. Il riconoscimento proteina-proteina fa sì che il virus venga ancora-to sulla

superficie della cellula bersaglio così che questo possa rilasciarvi il suo contenuto all’in-

terno. Nel momento in cui avviene la fusione, si ha quello che viene definito uncutting,

ovvero l’eliminazione delle parti strutturali del virus. Il genoma che si libera all’interno

dell’ospite viene retrotrascitto e, una volta giunto nl nucleo, può integrare il DNA cellulare

formando il pro-virus. Il genoma virale verrà contemporaneamente duplicato insieme a

quello dell’ospite, poi trascritto e tradotto per dare origine a nuove particelle virali

potenzialmente infettive che, in seguito, verranno espulse all’esterno della cella cellula.

Figura 17. Ciclo vitale di un retrovirus.

Genoma retrovirale. Il genoma retrovirale, in modo molto semplificato, è costituito da tre

geni principali che sono:

• gag: codifica per le proteine del core

• pol: codifica per la trascrittasi inversa necessaria per poter trascrivere il genoma da DNA a RNA (che verrà integrato nella cellula bersagli)

• env: codifica per la sostanza lipidica e proteica dell’envelope.

Molto importanti sono anche le sequenze terminali di questo genoma, denominate LTR

(Long Terminal Repeat), che comprendono promotore/enhancers e sequenze necessarie

per l’integrazione del genoma all’interno dell’ospite. Un’altra sequenza importantissima

è la sequenza Ψ che prende il nome di sequenza di packaging, la quale viene riconosciuta

dalle proteine strutturali e stabilisce quale è il tipo di genoma che dovrà essere inserito

all’interno del capside.

87

Vettori retrovirali e replicazione deficitaria. La rimozione dei geni che codificano per le

proteine strutturali permette l’inserimento del genoma di interesse. Tale delezione è

importante perché ci assicura che il virus non dia luogo ad una seconda infezione. Il

vettore che si ottiene non è in grado di produrre le proteine virali necessarie per un altro

ciclo di infezione (vettore difettivo nella replicazione). I geni virali gag, pol ed env sono

sostituiti con il cDNA del gene di interesse. Le sequenze LTR devono essere mantenute

(necessarie per l’integrazione e la trascrizione), così come va mantenuta la sequenza di

packaging (Ψ) che è indispensabile per l’introduzione del DNA ricombinante all’interno del

capside. Infatti il genoma ottenuto deve essere trasfettato in una linea cellulare di

packaging che è in grado di produrre le proteine strutturali, di riconoscere il genoma

ricombinante come endogeno da inserire all’interno del capside (perché tale genoma

possiede la sequenza Ψ). Le sequenze LTR e Ψ rimarranno in cis, mentre le sequenze GAG,

POL ed ENV verranno complementate in trans, quando vengono prodotti dalle cellule di

packaging.

Dopo aver introdotto il genoma ricombinato è necessario che questo sia posto sotto il

controllo di un gene promotore (virale o eucariotico) che ne consente l’espressione; e

spesso anche un gene che codifica per la resistenza (marker di selezione per neomicina o

beta-galattosidasi) e che permette di capire quali cellule sono state infettate. Il transgene

non può superare una dimensione massima di 9kb. Lo step successivo sarà quello di

inserire il genoma ricombinante all’interno di una linea cellulare di packaging che

consentirà l’assemblaggio di virioni maturi infettivi. Le cellule di packaging sono cellule

che vengono trasfettate stabilemnte con dei geni che codificano per i geni GAG, POL ed

ENV. Questo fa sì che all’interno della stessa cellula si avrà la produzione dei capsidi e

dell’envelope all’interno del quale verrà inserito il vettore geneticamente modificato

(perché viene mantenuta la sequenza Ψ). Alla fine verranno rilasciate delleparticelle virali

complete che potranno generare un solo ciclo di infezione.

Figura 18. Genoma retrovirale.

LTR Ψ GAG POL ENV LTR

LTR Ψ GAG POL ENV LTR

LTR Ψ cDNA LTR

LTR Ψ neo prom. cDNA LTR

Figura 19. Formazione di un virus difettivo.

88

Vantaggi e svantaggi. I vantaggi dell’utilizzo di retrovirus murini è principalmente quello

di non provocare malattie nell’uomo, di indurre una risposta immunitaria molto debole

nell’ospite. I transgeni possono essere espressi per tutta la vita dell’ospite. Possono dar

luogo ad integrazione stabile del materiale genetico recato dal vettore nel genoma delle

cellule bersaglio. Sfruttando lo pseudotyping sono in grado di infettare efficientemente

una vasta gamma di tipi cellulari. Presentano un’alta efficienza di trasduzione. Lo svantag-

gio principale è dato dal fatto che sono in grado di infettare solo cellule in attiva

divisione.Presentano un potenziale oncogeno perché si integrano nel genoma dell’ospite

in molteplici siti. Sono difficili da coltivare e vengono solitamente recuperate con un basso

titolo (basso numero di virioni per ml, 106-107 particelle virali per ml). Possono subire inat-

tivazione trascrizionale in vivo.

b. Lentivirus. Come i retrovirus, i lentivirus possono essere usati come vettori virali. Sono derivati del virus dell'HIV. Questi possono infettare cellule quiescenti e si integrano stabilmente in maniera casuale. Le proteine virali necessarie per l’infezione iniziale vengono fornite in trans da:

I. CELLULE DI PACKAGING.Lo sviluppo dei vettori lentivirali ha previsto uno sviluppo sequenziale che va dai lentivirus di prima generazione fino a quelli di terza generazione. Lentivirus di prima generazione. Prevedevano l’utilizzo di cellule di packaging

trasfettate stabilmente con il genoma di un retrovirus MLV privato di Ψ. La linea

cellulare ottenuta complementava costrutti privi di gag, pol e env, ma i titoli

ottenuti sono bassi e la frequenza di ricombinazione con produzione di revertanti

replicazione competenti (RCR) è troppo elevata. In pratica, si aveva un evento di

ricombinazione tra il genoma ricombinante che conteneva la sequenza di

packaging e il plasmide che conteneva i costrutti GAG, POL ed ENV e le sequenze

LTR, facilmente riacquistava la sequenza Ψ. Alla fine si aveva la produzione di

revertanti replicazione competenti (RCR) che riacquistavano la capacità di

replicare in modo autonomo. Ovviamente questo era molto pericoloso.

Lentivirus di seconda generazione. Per ridurre il rischio di ottenere RCR per i

lentivirus di seconda generazione si è deciso di utilizzare cellule di packaging

trasfettate stabilmente con un plasmide che codifica per i geni gag, pol e env senza

la sequenza di packaging e nemmeno il LTR.

Lentivirus di terza generazione. Per ridurre ulteriormente il rischio di ricom-

binazione, la tecnica utilizzata consiste nel separare su plasmidi differenti i geni

che codificano per le proteine strutturali che verranno poi complementate dalle

cellule di packaging. In particolar modo i geni gag e pol vengono espressi su un

plasmide diverso da quello esprimente env, e non più sotto il controllo di LTR..

Questa tecnica prende il nome di “split genome”. Questi plasmidi, insieme al gene

di interesse, vengono co-trasfettati all’interno delle cellule di packaging per la

produzione di vettori virali. Splittando il genoma di un virus si riduce la probabilità

che grazie ad un evento di ricombinazione, questo riacquisisca tutti i geni strut-

turali di cui era stato privato, andando incontro alla formazione di RCR.

89

II. VIRUS HELPER. Un altro modo per ottenere un vettore lentivirale è quello di

inserire i geni strutturali all’interno di un virus helper, privato della sequenza di

packaging. Quello che generalmente viene fatto è trasfettare le cellule con vettore

geneticamente modificato e contemporaneamente infettarle con il virus helper,

in modo da complementare in trans le particelle virali mancanti, ottenendo così,

un vettore virale perfettamente infettivo. Ogni retrovirus è in grado di infettare un

particolare tipo cellulare grazie all’ espressione di specifiche proteine codificate

dai geni env. Spesso, quando si costruiscono dei vettori retrovirali, si sfrutta lo

speudotyping, ovvero la caratteristica di incorporare le proteine env di un altro

retrovirus - modificando i geni env è possibile modificare il tropismo virale (viene

modificato il bersaglio di un determinato retrovirus scegliendo di aumentare

l’efficienza di infezione verso un tipo cellulare di interesse) e/o aumentare il titolo.

del vettore. Le proteine env endogene o eterologhe vengono fornite in trans ad

un retrovirus difettivo per la replicazione.

Vantaggi e svantaggi. Il vantaggio principale è dato dalla loro capacità infettiva

verso cellule in divisione e cellule quiescenti. I transgeni possono essere espressi

per tutta la vita dell’ospite. Un altro vantaggio è dato dall’integrazione del mate-

riale genetico recato dal vettore nel genoma delle cellule bersaglio. Solitamente

non sono inattivati dal complemento. Possono essere somministrati in vivo. Gli

svantaggi sono legati principalmente alla loro virulenza in quanto sono in grado di

provocare malattia nell’uomo. Sono difficili da coltivare. Inoltre hanno un elevato

potenziale oncogeno perché si integrano nel genoma dell’ospite in molteplici siti,

e talvolta vengono ad alterare l’espressione di alcuni geni coinvolti nella regola-

zione del ciclo cellulare.

2. Adenovirus. sono quelli più utilizzati perché sono in grado di esprimere ad alti livelli il trans-

gene inserito al loro interno, non si integrano stabilmente e come svantaggio danno grosse

reazioni immunitarie nelle cellule bersaglio. Sono virus a DNA con un genoma molto più gran-

de di quello di un retrovirus e ai lentivirus costituito da 36kb. Sono virus privi di envelope

esterno e presentano solamente il capside che ha una struttura icosaedrica regolare. Il ge-

noma è fiancheggiato da sequenze ITR (inverted terminal repeats) che servono come origine

di replicazione. Dopo l’infezione il virus entra nel nucleo della cellula ospite e viene replicato

rimanendo in forma episomiale (ovvero non viene integrato nel genoma dell’ospite). Il loro

vantaggio principale è dato dalla capacità di infettare cellule in replicazione e cellule

quiescenti. Come i retrovirus possono essere dotati di ampio trofismo.

Processo di internalizzazione. Gli Adenovirus sono internalizzati dalle cellule attraverso un

processo di endocitosi mediata da recettore. Nel caso dell’Adenovirus i recettori coinvolti nel

riconoscimento (a livello della membrana cellulare dell’ospite) sono CAR e un’integrina.

Questi recettori sono espressi in molti tipi cellulari, ma a livelli diversi di espressione.

L’efficienza di infezione dipende quindi dal numero di recettori che si trovano sulle cellule da

infettare; maggiore sarà tale numero, altrettanto maggiore sarà il grado di infezione.

90

Figura 21. ciclo di infezione di un adenovirus.

Nell’immagine 21, viene raffigurato il ciclo di infezione dell’adenovirus. In primo luogo

si ha il riconoscimento tra una proteina presente sulla superficie virale ed un recettore

proteico presente sulla superficie cellulare. Nel momento in cui avviene il ricono-

scimento si ha il processo di endocitosi mediata da recettore e la particella virale viene

successivamente inegrata all’interno di un endosoma. Quest’ultimo andrà incontro a

Figura 20. Internalizzazione dell'adenovirus.

91

modificazioni che portano la sua forma precoce a quella tardiva (endosoma tardivo –

fino al lisosoma). Il ciclo replicativo dell’adenovirus può essere suddiviso in due fasi:

fase precoce (early-phase) o fase tardiva (late-phase). La trasformazione dell’endo-

soma porta ad una progressiva acidificazione del lume endosomiale, al quale il virione

riesce a sfuggire liberando il suo contenuto (genoma) all’interno del nucleo della

cellula bersaglio. A questo punto ha inizio la fase precoce, in cui si osserva la

trascrizione di geni precoci che hanno il compito di attivare il macchinario replicativo

della cellula e bloccare tutti i punti di controllo del ciclo cellulare in modo che la cellula

non vada incontro ad apoptosi. Una volta attivato il suo ciclo di replicazione, la cellula

duplica con esso anche il genoma virale. Alla fase precoce segue quella tardiva in cui

vengono prodotti e attivati dei geni tardivi (late-genes) che codificano per le proteine

strutturali. Alla fine del ciclo si ha l’assemblaggio di nuovi virioni che possono essere

rilasciati dalla cellula in seguito a lisi indotta della sua membrana plasmatica.

Nel genoma di un adenovirus sono presenti diversi geni: i geni early (E) e i geni late (L).

dei geni early quelli di maggiore importanza sono i geni E1A e E1B.

a. E1A: coinvolto nell’attivazione della trascrizione e nella promozione dell’entrata della

cellula ospite in fase S (lega Rb inducendo il rilascio del fattore di trascrizione E2F). E1A

funziona come l’antigene T di SV40 visto in precedenza per l’immortalizzazione cellulare.

b. E1B: blocca azione di p53 (sempre come l’antigene T di SV40), evitando entrata della

cellula in apoptosi.

c. E2: codifica per 3 proteine coinvolte nella replicazione del DNA e nella modulazione della

trascrizione (DNA-pol; proteina terminale e DNA-binding protein;

d. E3: è responsabile della risposta immunitaria da parte della cellula bersaglio e nel mediare

la lisi cellulare dopo l’assemblaggio delle particelle adenovirali.;

e. E4: regola la trascrizione, la transizione dell’espressione da early a late gene, la

replicazione virale e l’assemblaggio dei virioni;

f. L1-5: coinvolti nella produzione e nell’assemblaggio delle proteine del capside;

Nel normale ciclo vitale degli adenovirus, i geni E1 (immediate early) sono trascritti per primi.

Questi hanno funzioni regolatorie e stimolano la trascrizione dei geni E2, E3 e E4 (early).

Quando si vuole utilizzare un adenovirus come vettore virale è necessario andare a modificare

il genoma dell’adenovirus per eliminare i geni strutturali in modo tale da creare spazio per

l’inserimento del genoma di interesse e soprattutto evitare che il vettore virale sia in grado di

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 %

E1A E1B E3

E2B E2A E4

Figura 22. Genoma di un adenovirus.

L1 L2 L3 L4 L5

92

cominciare nuovamente a replicare in maniera autonoma. Oggi sono stati messi a punto

sistemi ricombinanti di adenovirus per l’impiego di laboratorio, più semplici da utilizzare e

meno pericolosi. Sono molto usati anche per il silenziamento genico.

Generazioni di vettori adenovirali.

Prima generazione. I vettori adenovirali di prima generazione furono ottenuti sostituendo

i geni E1a e E1b con il transgene di interesse, posto sotto il controllo di un elemento

enhancer e di un promotore. Il vettore così ottenuto è replicazione-difettivo e le funzioni

replicative vengono fornite in trans dalle cellule di packaging (proprio come avviene nei

vettori retrovirali). Il problema principale di questa strategia fu quello di ottenere un

elevato grado di tossicità e l’attivazione della risposta immunitaria poiché, nonostante

l’eliminazione dei geni E1, il virus si esprime a bassi livelli nelle cellule infettate.

Seconda generazione. I vettori di seconda generazione furono ottenuti eliminando anche

gli altri livelli, dando come vantaggio un aumento della grandezza del transgene, una

ridotta attivazione della risposta immunitaria e un’aumentata persistenza di espressione

del vettore.

Helper dipendenti (o Gutless). Sono vettori adenovirali di nuova generazione caratterizzati

da un’alta capacità. Questi vettori sfruttano il fatto che tutte le proteine adenovirali

possono essere complementate in trans, quindi quasi tutta la sequenza codificante può

essere sostituita dal transgene che può avere dimensioni comprese tra 100b e i 36 Kb. Le

uniche sequenze essenziali in cis sono le ITRs e la sequenza Ψ. I vettori gutless vengono

ottenuti da un vettore virale (plasmide) che contiene solo sequenze ITRs e Ψ e il transgene

di interesse (finacheggiato dalle sequenze ITRs e preceduto dalla sequenza di packaging).

Si utilizzano delle cellule di packaging (293) che esprimono solamente il gene E1, che poi

vengono trasfettateutilizzando un metodo di trasfezione non virale (ad esempio lipo-

fezione) e contemporaneamente tali cellule vengono infettate con un virus helper che

contiene e fornisce gli elementi strutturali nel suo genoma ma privato delle sequenze E1

ed E3 (tecnica dello split genomico – perché le cellule di packaging esprimono il gene E1

mentre tutti gli altri geni sono veicolati dal virus helper). L’unico costrutto che contiene la

sequenza di packaging è quello fornito mediante metodo di trasfezione non virale e che

contiene il gene ricombinante.

Vantaggi e svantaggi dei vettori adenovirali. Il vantaggio principale è quello di essere

sicuri, in quanto non integrano il genoma; sono facili da ottenere in alti titoli e altrettanto

facili da manipolare; infettano anche cellule quiescenti e il genoma che può essere

introdotto all’interno del capside di un adenovirus è abbastanza grande (fino a 36kb). Lo

svantaggio è quello che non integrando il genoma, l’espressione del gene che si ottiene è

transiente; inoltre si può avere un’attivazione significativa della risposta immunitaria.

3. Virus adeno-associati (AAV). Sono virus ad integrazione sito-specifica e per tale ragione è

possibile ottenere un’espressione stabile nel tempo. Sono difficili da produrre ad alto titolo.

Sono virus privi di envelope e il loro capside è di forma icosaedrica. All’interno del capside è

contenuto il genoma a DNA single strand con polarità positiva o negativa. Tale genoma è

molto semplice ed è fiancheggiato da sequenze ITRs, che contengono la sequenza di

packaging; è composto unicamente da due tipi di geni:

93

a. Geni cap (che codificano per le proteine del capside);

b. Gene rep (che codificano per le proteine necessarie per la replicazione e l’integrazione).

Ciclo virale di replicazione e di infezione degli adeno-asociati. Anche in questo caso, l’in-

ternalizzazione di tali molecole prevede il riconoscimento proteina-recettore, la forma-zione

dell’endosoma, l’escape del virus dall’endosoma e l’inserimento di questo all’interno del

nucleo. Il virus, essendo a (ss)DNA viene duplicato e trascritto per l’ottenimento delle proteine

virali. Vengono definiti adeno-associati perché per replicare necessita della presenza in

contemporanea di un adenovirus (AV) o di un Herpes simplex virus (HSV). In assenza di uno di

questi due virus, l’adeno-associato non duplica il duo DNA, ma lo integra in modo stabile

all’interno della cellula ospite in una regione ben precisa del cromosoma 19 (19q 13,3q-te).

Una successiva superinfezione con AV o HSV attiva la replicazione del virus integrato e dà

origine a nuovi virioni potenzialmente infettivi. Formazione di vettori adeno-associati. Prevede, come per la formazione degli altri vettori

virali visti in precedenza, la delezione dei geni strutturali che codificano per le proteine del

capside (cap e rep) e sostituiti con il gene di interesse. Viene lasciato invariato tutto il resto,

in quanto le sequenze ITRs contengono tutte le informazioni necessarie per l’integrazione e

per il packaging. I geni eliminati vengono poi complementati in trans dalle cellule di packaging.

La linea cellulare 293 viene trasfettata con un plasmide (sistema non virale) contenente i geni

cap e rep e successivamente infettata con il vettore contenente il gene di interesse fiancheg-

giato dalle sequenze ITRs e dalle sequenze di packaging. Per ottenere dei vettori adeno-

associati è necessario che le cellule di packaging contenga-no anche i geni dell’adenovirus, in

particolare è sufficiente l’espressione del gene E1. Per tale ragione le cellule di packaging

vengono trasfettate con un plasmide che contiene i geni cap e rep e successivamente con un

adenovirus helper difettivo per E1. Recentemente è stato sviluppato un nuovo sistema di

produzione in cui il virus helper è sostituito con un plasmide mini-Ad (contiene parte del

genoma di adenovirus).

Figura 23. Trasfezione di adeno-associati.

94

Vantaggi e svantaggi. Il vantaggio principale nell’utilizzo di adeno-associati è dato dalla

mancata patogenicità verso l’uomo. Vengono ottenuti facilmente con alti titoli. Manifestano

un’alta efficienza di trasferimento genico e un ampio trofismo. Sono in grado di infettare sia

cellule in divisione che quiescenti. Possono integrare il transgene all’interno della cellula

bersaglio e di conseguenza è possibile ottenere delle trasfezioni stabili. Gli svantaggi sono

principalmente due: 1) Dovuto alle dimensioni ridotte del transgene da inserire (4.7 Kb). Re-

centemente la capacità di questi vettori è stata aumentata sfruttando concatamerizzazione

del genoma dei AAV dopo il trasferimento. Si usano due vettori, ciascuno codificante metà

della proteina di interesse. 2) Dovuto al vettore ricombinante non ha integrazione sito

specifica e, una volta tolti i geni rep e cap, talvolta resta in forma episomiale.

4. Herpes simplex virus. Sono cellule ad infezione selettiva dei neuroni ma, al contempo, sono

noti per i loro importanti effetti citotossici. Sono virus molto grandi con un genoma costituito

da circa 80 geni (di cui almeno metà di questi non sono essenziali, quindi il vantaggio

principale è dato dalla capacità di trasportate un genoma ricombinante decisamente grande).

Il genoma è costituito da (ds)DNA racchiuso in capside icosaedrico ricoperto da envelope di

natura lipidica.

Figura 24. Struttura di un HSV.

95

Figura 25. Meccanismo di infezione.

Meccanismo di infezione. Anche tale infezione da HSV, sfrutta il riconoscimento da parte di

proteine di membrana della cellula bersaglio e la superficie del virale. Infatti, il virus inserisca

su tale superficie delle proteine che mimano il più possibile il legame con la proteina di

membrana e sfruttando tale legame per introdursi all’interno della cellula. Il meccanismo di

infezione dell’HSV è molto particolare. Infatti, nel momento in cui infetta la cellula,

solitamente di tipo epiteliale (infezione primaria), si ha un ciclo di replicazione classico che

porta alla formazione di nuovi virioni infettivi che vengono rilasciati dalla cellula epiteliale

attraverso lisi indotta (ciclo litico). I nuovi virioni prodotti risalgono lungo le terminazioni dei

neuroni sensoriali fino ai gangli dorsali. Qui stabilisce un’infezione latente (che non necessita

di espressione genica) integrandosi nel genoma della cellula bersaglio e rimangono quiescenti

finché Il ciclo litico non viene riattivato periodicamente in condizioni favorevoli (stress). Una

volta riattivato il ciclo litico, le nuove particelle virali vengono rilasciate dalla cellula che li

contiene (senza lisi indotta) e trasportate con trasporto anterogrado fino alle cellule epiteliali

dove, una volta infettate (infezione secondaria) ne inducono il danneggiamento del tessuto

per lisi delle cellule costituenti. La sua latenza a livello dei gangli dorsali fa sì che il virus sia

difficilmente debellabile.

Vettori HSV-1. Grazie alla loro naturale capacità di stabilire infezioni latenti nei neuroni,

vengono utilizzati per il trasporto di geni nel CNS. L’espressione a lungo termine del transgene

viene ottenuta utilizzando dei promotori neurone-specifici, attivati durante il periodo di la-

tenza. Possono trasportare geni di grosse dimensioni (152Kb).

Esistono due tipi di vettori HSV-1:

a. Disabled HSV vectors – virus ricombinanti ottenuti eliminando uno o più geni precoci

immediati (strutturali). Vengono prodotti in cellule di packaging che complementano i

geni mancanti. Sono vettori di ultima generazione prodotti eliminando il gene che codifica

96

per la glicoproteina-H disuperficie di HSV-1 e cresciuti in una linea cellulare che com-

plementa questa proteina. I virus ottenuti sono infettivi, ma possono effettuare un solo

ciclo di infezione.

b. Amplicon HSV vectors – si basano sull’utilizzo di un amplicone, un plasmide contenente:

• un’origine di replicazione batterica (generalmente da Escherichia coli – perché ne

consente una maggiore amplificazione);

• un’origine di replicazione di HSV-1 (OriS) che ne permette il riconoscimento in fase

successiva di trascrizione;

• la sequenza di packaging di HSV-1;

• il transgene.

Tale plasmide viene inserito (mediante un sistema non virale) in una linea cellulare di

packaging infettata da un virus helper difettivo contenente in trans i geni regolatori e

strutturali (per capside ed envelope) mancanti. Tale meccanismo consiste nel separare

quanto più possibile il genoma virale dalle sequenze di packaging con splitting delle se-

quenze virali che codificano per una successiva replicazione.

Produzione di vettori virali. Nel momento in cui si vanno a generare vettori virali bisogna

considerare che è necessario aumentare l’efficienza di produzione, in quanto tali vettori virali prodotti

devono essere particolarmente efficienti da riuscire ad infettare delle cellule bersaglio, o per essere

utilizzati in vivo per generare degli animali transgenici. Tre fattori determinano l’efficienza di

produzione di un vettore virale:

1. la natura del vettore – a seconda della natura del vettore utilizzato è possibile ottenere un

titolo più o meno elevato.

2. la linea cellulare di packaging – attraverso modificazioni del ciclo cellulare di tali cellule al fine

di favorire le fasi di replicazione virale e inibizione dell’apoptosi (es. alcuni virus, quali SV40 e

Epstein-Barr hanno evoluto sistemi anti-apoptotici). Questo garantisce una maggiore prdut-

tività da parte di queste cellule.

3. le condizioni di coltura – è possibile ottenere una maggiore efficienza andando a modificare

le condizioni di coltura cellulare, ad esempio temperatura di crescita, concentrazione del

siero, tempo di infezione, confluenza cellulare al tempo dell’infezione (Es. retrovirus ha

emivita aumentata di 4 volte e titolo virale aumentato di 5-10 volte portando la temperatura

di crescita da 37°C a 32°C).

Nella produzione dei vettori virali è molto importante considerare il grado di purezza richiesta (resa

di produzione). Di solito per facilitare la purificazione dei vettori virali dalla coltura cellulare di

packaging si tende a ridurre la concentrazione del siero, o addirittura coltivare le cellule in assenza di

siero nel momento finale in cui queste iniziano a produrre i virus e liberare i nuovi virioni durante il

ciclo litico. Il siero infatti interferisce con la purificazione, o meglio, è stato dimostrato che in assenza

di siero è più facile purificare i virioni. Le tecniche di purificazione dipendono dalla scala di produzione,

in particolar modo, nel momento in cui vengono prodotti dei vettori virali tali tecniche di purificazione

che si basano su:

1. centrifugazione su gradiente di CsCl (usato nei laboratori);

2. cromatografia d’affinità (produzione su larga scala).

97

Le tecniche di purificazione, che esse siano di laboratorio o su larga scala, prevedono una fase iniziale

di amplificazione del vettore. Successivamente il vettore subisce un processo di espansione da parte

delle cellule di packaging dalle quali viene fatto produrre per ottenerne un certo titolo. A seguito

vengono recuperati i virioni prodotti dalle colture di packaging e, successivamente, utilizzati per

infettare altre cellule di packaging e consentire un’ulteriore espansione. Una volta che si è prodotto

un notevole numero di virioni questi devono andare incontro ad un processo di purificazione. Succes-

sivamente se ne determina il titolo finale.

≡ ESEMPIO 1. Produzione di vettori adeno-virali.

1) Inserzione del transgene nel vettore.

Si parte dal vettore adenovirale (Plasmide) che contiene:

a. vettore commerciale (in questo caso adenovirus) deleto in E1 e E3;

b. origine di replicazione batterica (amplificazione);

c. marker specifico che codifica per la resistenza contro l’ampicillina;

d. Multiple Cloning Site che permette l’inserimento del gene di interesse posto sotto il

controllo di un promotore forte (es. CMV);

e. sequenze necessarie per il packaging (ITRs, sequenza ψ, late gene).

Il plasmide modificato con le tecniche del DNA ricombinante all’interno di una provetta

per l’inserimento del gene di interesse.

Il clonaggio del DNA di interesse avviene mediante taglio enzimatico del vettore,

dell’inserto (estremità coesive) e successiva ligazione (ligasi). In seguito il plasmide

modificato verrà amplificato mediante l’utilizzo di colture batteriche, e selezionati grazie

al gene che codifica per la resistenza all’ampicillina (solo i batteri con il gene che codifica

per tale resistenza potranno crescere).

2) Trasfezione della linea 293A con il vettore. Il vettore commerciale viene venduto assieme

alla sua linea cellulare di packaging. La linea cellulare 293A (cellule embrionali renali

umane), che contiene una copia dei geni E1 integrata stabilmente (complementazione

in trans) che erano stati deleti in partenza.

Il plasmide ottenuto nel punto (1) viene trasfettato nelle cellule di packaging con un

metodo di trasfezione non virale (perché questo è un plasmide). A questo punto la coltura

di packaging viene seguita nel tempo e osservare la produzione.

3) Preparazione del lisato virale. Se con il passare del tempo queste iniziano a produrre i

vettori virali di interesse, vengono a formarsi delle evidenti placche di lisi. Se circa il 60-

70% delle cellule sono andate incontro a lisi si procede andando a recuperare il terreno

e le cellule presenti nella piastra di coltura, separando i virioni dai detriti cellulari e dal

citoplasma che si è liberato. Tale separazione che prevede di avere una sospensione

contenete i virioni isolati, generalmente, viene ottenuta per centrifugazione. Succes-

sivamente dei virioni prodotti è necessario calcolare il titolo per millilitro. Congelare tale

stock di virioni titolati a -80°C, questo consente all’operatore di avere a disposizione una

scorta consistente dei virioni infettivi contenenti il gene di interesse. il prossimo step

sarà quello di amplificare questi virioni poiché il numero che si ottiene dalla prima

trasfezione è molto basso; l’amplificazione consiste nel mettere a contatto i virioni

ottenuti con delle cellule di packaging (non è necessario effettuare una trasfezione ma

98

si sfrutta la capacità infettiva dei virioni). Dopo l’infezione verranno prodotti molti più

virioni rispetto a quelli utilizzati in partenza (prima dell’infezione).

Titolazione dello Stock. Per poter utilizzare i vettori virali prodotti è necessario determinare il

titolo della sospensione ottenuta dalle cellule di packaging. Il titolo viene solitamente indicato come

PFU (unità formanti placca). Per la determinazione del titolo si possono utilizzare tre diversi saggi:

1. Test di placca (plaque assay). È quello più semplice, il primo ad essere stato utilizzato e dal

quale derivò la definizione di PFU. Viene fatto su cellule di packaging, ma ugualmente utiliz-

zabile per virus che hanno ciclo litico. Viene eseguito secondo diversi step:

a. Effettuare diluizioni seriali della sospensione contenente i virioni;

b. Preparare delle piastre contenenti cellule di packaging per determinare il titolo della

sospensione di virioni;

c. Utilizzare le varie diluizioni di sospensione di virus per infettare le cellule in terreno liquido

– le diluizioni vengono messe a contatto ciascuna con una piastra diversa di coltre di

packaging;

d. Coprire con agar (agente gelificante) per evitare la diffusione dei virioni che si liberano a

seguito del ciclo litico, e incubare – i virioni liberati potrebbero andare ad infettare la

cellula vicina e amplificarne la lisi (quello che si vuole fare è contare tutte le unità che

formano placca).

e. Contare il numero di placche (PFU=unità formanti placca) osservabili in quei pozzetti dove

la conta è possibile (da 10-5 in poi) e successivamente si calcola il valore medio.

Questo test è cruciale anche nel giudicare l’efficacia del sistema vettore/linea di packaging è

la valutazione della frequenza con la quale si verifica la comparsa di revertanti replicazione

competenti (RCR) nella popolazione di virus prodotto. I RCR sono quegli agenti virali che

hanno riacquistato la capacità di replicare in modo autonomo, per re-inserimento a livello del

loro genoma dei geni strutturali. Se questo accade, non solo si ottengono agenti virali capaci

di infetta e trasferire il materiale genetico al loro interno ma, sono in grado di formare nuovi

virioni che divengono potenzialmente pericolosi per l’operatore e per l’ambiente. A tal

proposito viene effettuato un test di placca su cellule non di packaging in quanto queste sono

cellule che non esprimono le proteine strutturali del virus e quindi non sono in grado di

complementare in trans i geni che mancano dal vettore virale. Il test di placca eseguito a tale

scopo deve avere come risultato la comparsa di nessuna placca di lisi (test negativo); qualora

si formassero delle placche di lisi si va ad eliminare tutto lo stock prodotto dai virioni crio-

conservati a quelli presenti in provetta per la titolazione. Per eliminare qualsiasi residuo o

forma di vita potenzialmente infettivo si utilizza il sodio ipoclorito (candeggina); è necessario

Esempio.

10-4 diluizione: confluenti; indeterminabile. 10-5 diluizione: 59 10-6 diluizione: 4.5

Quindi il titolo di questo stock virale è 5,2 x 106 PFU/ml (i.e. media di 59 x 105 e 4.5 x 106).

99

assicurarsi che nessun agente ricombinante infettivo capace di replicare in maniera autonoma

fuoriesca dalla stanza.

2. Test ELISA. Si utilizza una coppia di anticorpo contro una proteina del capside (es p24

codificata dal gene cap del lentivirus). Si utilizzano, al solito, delle piastre multi-pozzetto che

sono state ricoperto con uno specifico anticorpo selettivo per la proteina di interesse. Si

preleva un’aliquota della sospensione di virioni, si lisa in modo tale che vengano rilasciate le

particelle virali, e si incuba con l’anticorpo per far avvenire il legame (reazione di ricono-

scimento antigene-anticorpo). Successivamente si lava per eliminare l’eccesso di proteina non

legata e sulla piastra resteranno intrappolate solo le proteine che sono state correttamente

riconosciute dall’anticorpo. A questo punto si introduce un secondo anticorpo legato ad una

proteina fluorescente che riconosce la stessa proteina virale ma in un’altra regione. Dunque,

la particella virale riconosciuta dai due anticorpi forma un pozzetto che rimane bloccato sul

fondo del pozzetto. Dato che il secondo anticorpo è fluorescente è possibile leggere la

quantità di fluorescenza presente all’interno del pozzetto che è direttamente proporzionale

alla quantità di proteina virale presente. Da questa analisi si può risalire alla quantità di virioni

presenti nella sospensione.

3. qPCR (PCR quantitativa). Analisi PCR quantitativa effettuata utilizzando una coppia di primers

specifici per una sequenza presente nel genoma del virus (modulo di metodologie biochi-

miche).

6.7 Lavorare con i virus

Il problema di lavorare con i virus è legato alla loro patogenicità nei confronti dell’uomo. Dunque è

necessario che questi vengano manipolati in condizioni opportune tali da garantire la sicurezza

dell’operatore e dell’ambiente. Di solito il livello di sicurezza che si deve utilizzare per l’utilizzo dei

virus è maggiore rispetto a quello che si utilizza ad esempio per una coltura cellulare. Le linee guida

federali che riguardano l’utilizzo di agenti virali o con tutto che e viene a contatto, come pipette usate,

i puntali delle pipette e altre colture di tessuti devono essere candeggiati per garantire la sicurezza

da rischio biologico, e successivamente sterilizzati in autoclave (materiale biohazard). Tutte le

manipolazioni devono essere eseguite all'interno di una cabina di biosicurezza certificata. L’operatore

deve indossare guanti, camice da laboratorio e occhiali o occhiali protettivi quando si maneggiano

scorte virali e supporti contenenti virus; e, in funzione del rischio legato al tipo di manipolazione è

importante utilizzare dei dispositivi atti a garantire la sicurezza collettiva. I virus vengono classificati

con livelli di sicurezza crescenti che vanno da 2 a 4. Se si lavora con micro-organismi di classe 2, è

necessario utilizzare tutte le misure richieste per la classe 1 con delle aggiunte. A seconda del rischio

crescente dovranno essere adoperate misure di sicurezza ben precise e correlate ad esso. Per la

classe 2 si utilizzano delle cappe con filtro HEPA; per i microrganismi di classe 3 e 4, oltre all’utilizzo

di cappe biohazard bisogna aumentare anche il livello di protezione individuale (per i virus di classe 3

è necessario evitare l’esposizione agli aerosol degli ambienti e per i virus di classe 4 l’operatore deve

essere completamente isolato in ogni sua parte del corpo all’esposizione con tali agenti). L’ambiente

deve costantemente garantire una pressione negativa per far sì che il materiale biologico che si sta

manipolando non fuoriesca dalla stanza (aumentare il contenimento).

100

6.8 Tipo di trasfezione: transiente o stabile?

Nel momento in cui si disegna un esperimento di trasfezione la domanda che bisogna porsi, sia se si

utilizza un vettore virale o non virale, riguarda il grado di espressione del transgene di interesse

all’interno della cellula bersaglio:

“si vuole effettuare una trasfezione transiente (di breve durata) o stabile?”.

Trasfezione transiente. È solitamente immediata. Non prevede l’integrazione del ma-teriale

genetico all’interno del genoma della cellula ospite. La trasfezione transiente viene scelta per

esperimenti a breve termine (analisi ICC, studio del promotore, ecc.) in cui le cellule sono nor-

malmente raccolte 48-72 h dopo la trasfezione. Di solito è un esperimento in cui si lavora in condizioni

di sovra-espressione genica (o di silenziamento) ad altissimi livelli (più di una copia per cellula).

Un’altra caratteristica di questo tipo di trasfezione è che la popolazione cellulare è fortemente dis-

omogenea, ovvero poche cellule con più copie dello stesso plasmide, in quanto il numero di copie del

plasmide inserito all’interno di ciascuna cellula non è facilmente prevedibile; si ha una conseguente

sovra-espressione del plasmide in proteina rispetto magari alla cellula vicina che ha ricevuto un

plasmide soltanto.

Trasfezione stabile. Di solito la trasfezione stabile viene scelta per esperimenti a lungo termine

in cui si ha possibilità di isolare e propagare singoli cloni contenenti il DNA trasfettato. Prevede

l’integrazione (molto spesso casuale) del materiale genetico all’interno del genoma della cellula

ospite con conseguente modificazione permanente di tale cellula. Tale procedura prevede un

processo lungo e laborioso che prevede la selezione di tutte le cellule (un po' come succedeva per i

batteri) che hanno preso il gene di interesse e quante lo hanno perfettamente integrato. Per rendere

possibile questa selezione, molto spesso, il gene di interesse viene abbinato ad un marcatore selettivo

come ad esempio un gene che codifica per una resistenza ad un antibiotico che funziona nelle cellule

eucariotiche. Una volta avvenuta la selezione di tipo clonale, si ottiene una popolazione cellulare

omogenea (integrazione in singola copia) composta da molte cellule e poco plasmide (tutte le cellule

esprimeranno lo stesso quantitativo della proteina di interesse); perché si presuppone che la linea

cellulare selezionata si sia originata da un’unica cellula che ha subito l’integrazione del DNA esogeno

all’interno del suo genoma. Per poter effettuare una trasfezione stabile è necessario partire da una

trasfezione transiente; si parte dalla modificazione di una linea cellulare attraverso l’inserimento di

DNA esogeno all’interno delle cellule bersaglio e si aspetta che il DNA venga espresso. Durante le

prime 48 ore dalla trasfezione (sia stabile che transiente), fino al 50% delle cellule contengono DNA

esogeno (normalmente in forma episomale). In seguito, a causa della degradazione e della diluizione,

le cellule che non hanno integrato tale DNA nel loro genoma lo perdono. Se si vuole fare una

trasfezione stabile è necessario selezionare quali cellule (cloni) hanno integrato il transgene; per far

questo si accoppia l’espressione del transgene a quella di un gene che codifica per una resistenza

generalmente ad un antibiotico (marker selettivo). Una volta aggiunto l’antibiotico al terreno di coltu-

ra, solo le cellule che sono in grado di mantenere l’espressione dei geni esogeni saranno in grado di

produrre la resistenza all’antibiotico; quindi solo quelle cellule sopravviveranno. Mantenendo la

pressione selettiva per almeno 21 giorni si riesce pian piano ad eliminare le cellule che non hanno

integrato il gene di interesse dalla coltura cellulare, mantenendo solo quelle cellule che hanno

101

integrato in modo corretto e che duplicando daranno origine a delle vere e proprie colonie che

prendono il nome di cloni. Il marker può essere presente sullo stesso plasmide del gene di nostro

interesse oppure co-trasfettato con un secondo plasmide. Come prima cosa è necessario scegliere

quale marcatore selettivo utilizzare per selezionare le cellule che hanno integrato stabilmente il

nostro gene di interesse.

Geni per markers selettivi. Uno dei markers selettivi più utilizzati è aminoglicoside fosfotransferasi

(Neo), un enzima che è in grado di conferire resistenza agli antibiotici aminoglicosidici (kanamicina,

neomicina, geneticina ecc.). Questi antibiotici tendono a non essere tossici a piccole dosi, per selezio-

nare le cellule sono necessarie dosi elevate che però possono danneggiare anche le cellule trasfet-

tate; dunque è necessario determinare la dose appropriata (attraverso una curva dose-risposta). Un

altro enzima che si può utilizzare è l’igromicina B fosfotransferasi che conferisce resistenza all’igro-

micina (Hyg)

102

6.9 Sistemi inducibili

La trasfezione stabile, rispetto a quella transiente, ha il grosso vantaggio di creare una popolazione

più possibile omogenea e di esprimere il gene di interesse ad un livello basso molto simile a quello

fisiologico; questo consente di generare un modello di studio in grado di avvicinarsi maggiormente

alla realtà. Spesso questo sistema viene utilizzato per creare modelli-malattia, attraverso i quali si può

studiare, ad esempio, l’espressione di determinate proteine coinvolte in alcune patologie. Di solito

vengono prodotte due diverse linee; una linea che esprime la proteina di studio non mutata e,

un’altra linea in parallelo che esprime la proteina mutata. Molto spesso, si può incorrere in un proble-

ma legato alla proteina o al gene mutato, che risiede proprio nella modifica presa come oggetto di

studio che potrebbe generare tossicità per la cellula. Tale problema non si riscontra facilmente

quando si effettua una trasfezione transiente poiché questa richiede tempistiche ridotte; però

qualora si decida di effettuare una trasfezione stabile allora il problema della tossicità potrebbe

essere piuttosto evidente (per accumulo) e di conseguenza potrebbe causare la perdita dell’intera

PROTOCOLLO PER UNA TRASFEZIONE STABILE.

1. Inizialmente le cellule devono essere trasfettate (attraverso trasfezione transiente) con il plasmide

contenente il nostro gene di interesse e il gene che codifica per il marker selettivo (con uno dei me-

todi precedentemente descritti).

2. Dopo due giorni aggiungere alte dosi dell’antibiotico scelto per la selezione per consentire la morta-

lità di tutte quelle cellule che non hanno integrato e che non mantengono il plasmide al loro interno.

Questa operazione viene fatta nelle prime ore perché quasi la metà della popolazione cellulare sarà

in grado di produrre un certo grado di resistenza all’antibiotico addizionato perché il plasmide

rimane in forma episomiale.

3. Queste condizioni vengono mantenute per circa 14 giorni, cambiare il medium e aspettare che

muoiano le cellule non trasfettate (non resistenti) o che non hanno integrato stabilmente il

plasmide (che altrimenti viene perso dopo un certo numero di divisioni). Per tale ragione all’interno

di una dish o di un pozzetto si osserva che le cellule non raggiungeranno mai la confluenza. In questi

14 è sconsigliato di effettuare una subcultura (che ovviamente prevede un distaccamento delle

cellule dal terreno e un successivo re-impianto) perché l’obbiettivo è quello di andare a selezionare

tutte quelle cellule che si sono generate da un’unica cellula e continuano a crescere le une accanto

alle altre formando delle vere e proprie isole (colonie) resistenti che rappresentano una maggiore

omogeneità dell’espressione del transgene esogeno trasfettato.

4. Quando si iniziano a vedere “isole” di cellule resistenti, trasferire i singoli cloni (colonie)

ciascuna in un contenitore differente; di solito di passa da una dish di 10cm di diametro

adoperata all’inizio, ad una multi-well da 96 pozzetti. Nel momento in cui si raggiunge la

confluenza della multi-well da 96 pozzetti, allora le cellule vengono trasferite in superfici

più grandi (multi-well da 48 pozzetti, poi 24, 12,6) fino ad ottenere una dish per ciascuna

colonia. Tale operazione prende il nome di “picking”.

5. A questo punto si ottiene una nuova linea cellulare geneticamente modificata che andrà

crio-conservata.

103

linea cellulare. Questo problema ha portato allo sviluppo di una strategia che consente di generare

una linea stabile che esprime una proteina tossica in modo inducibile. Questo significa che il gene di

interesse viene espresso solamente in presenza di un particolare stimolo. Tale strategia è vantaggiosa

perché permette di regolare l’espressione di un gene e consente di ottenere una linea stabile pur

contenendo un gene tossico che non viene sempre espresso. Solo nel momento in cui si effettua

l’esperimento si andrà ad aggiungere un particolare reagente al terreno di crescita che attiva l’espres-

sione del transgene di interesse in modo da poter seguire l’effetto dell’espressione del gene tossico

all’interno della linea cellulare. Ovviamente una parte delle cellule dovrà mantenere il gene tossico

silenziato in modo che la linea stabile si possa mantenere nel tempo. Uno dei sistemi più utilizzati per

effettuare una espressione inducibile di un gene di interesse all’interno di cellule eucariotiche è il

sistema dell’operone lattosio (vedi pagina 56). Un altro sistema analogo è quello delle tetracicline e

dei suoi analoghi. Quello della tetraciclina è un sistema di repressione che, in assenza di tetraciclina

(Tc) o doxyciclina (Dox), costituisce un blocco del promotore che è regolato dalla tetraciclina stessa.

Infatti in presenza di tale molecola, il repressore si stacca dall’operatore e si ottiene la trascrizione

dei geni. Questo sistema è stato modificato in due modi differenti per poter regolare l’espressione

del gene di interesse:

1. Sistema Tet-On, l’aggiunta di tetraciclina o Doxyciclina “accende” il gene di interesse;

2. Sistema Tet-Off: l’aggiunta di tetraciclina o Doxyciclina mantiene “spento” il gene di interesse.

Figura 26. Sistema Tet-ON e TET-Off presente in E.coli..

Questo sistema è il più utilizzato per ottenere una trascrizione di tipo inducibile. È un sistema che

sfrutta le proteine di E.coli coinvolte nella resistenza alle tetracicline. Il repressore Tet R (tet repressor

protein) regola negativamente l’espressione dei geni coinvolti nella resistenza a valle (trasposone

Tn10). In assenza di tetraciclina, Tet R si lega alla sequenza Tet O (tet operator, sequenza dell’opera-

tore) e blocca la trascrizione. L’aggiunta di tetraciclina o dell’analogo fa sì che abbia un cambio con-

formazionale nel repressore che si stacca dall’operatore e da l’input alla trascrizione. Per gli esperi-

menti in cellule di mammifero Tet R e stata modificata per ottenere due diversi tipi di proteine:

1. tTA (Tc-controlled trans activator), proteina ibrida (37 kDa) ottenuta dalla fusione dei primi

207 aa di Tet R con 127 aa del C-terminale del dominio attivante del VP16 di herpes simplex

104

virus. Questa proteina ottenuta non è più un repressore ma bensì diventa attivatore

trascrizionale in assenza di Doxyciclina.

2. rtTA (reverse tTA), proteina ottenuta modificando 4 aa di Tet R e ha comportamento opposto

a tTA in risposta a Doxyciclina. viene modificata in modo da diventare attivatore trascrizionale

in presenza di Doxyciclina.

Per repressore trascrizionale si intende che nel momento in cui la proteina si lega al promotore crea

un ingombro sterico e ne blocca la trascrizione. Un attivatore trascrizionale, invece, nel momento in

cui si lega al promotore ne promuove la trascrizione.

Nel sistema TET-Off, la proteina coinvolta è la tTA che funziona in assenza di doxyciclina. infatti, in

assenza del substrato, tale proteina può legarsi al substrato e promuovere la trascrizione dei geni a

valle del promotore. In presenza del substrato (doxyciclina o tetraciclina), diversamente, l’attivatore

trascrizionale si stacca dal promotore e l’attivazione trascrizionale viene “spenta”.

Per quanto riguarda il sistema TET-On la proteina coinvolta è la rtTA e, in questo caso, necessita della

presenza di doxyciclina per poter essere affine per il legame con il promotore e promuove la trascri-

zione dei geni a valle. In assenza di Doxyciclina, tale proteina, ha una struttura non affine con il

promotore quindi la trascrizione è mantenuta “spenta”.

105

Figura 27. Sistema TET-off e TET-on nei mammiferi.

Il gene che si vuole regolare deve essere inserito a valle di una sequenza TRE (Tc responsive

elements), sequenze di 42 bp che contengono sequenza Tet O. L’espressione basale del promotore

e molto bassa in assenza di Tc. La differenza tra i due sistemi è data dal tempo e dal consumo di

doxyciclina. Se si utilizza un sistema TET-on bisogna lavorare sempre in presenza di doxyciclina per

manenere il gene “spento”, tranne quando si vuole promuovere la sua espressione. Però a lungo

andare, la doxyciclina potrebbe essere citotossica; ed è appunto un sistema più costoso. Nel sistema

TET-off, basterà aggiungere la doxyclina nel momento in cui si vuole effettuare l’esperimento. Per

questo, tale sistema risulta più economico e più versatile rispetto al TET-on. I due sistemi sono

complementari. Nel sistema Tet-Off è necessario aggiungere Tc o Dox nel medium per mantenere lo

stato inattivo. Le due molecole però hanno emivita breve ed è quindi necessario aggiungerle ogni

circa 48 ore per reprimere l’espressione del gene X. Il sistema Tet-On è responsivo solo alla Dox,

mentre Tet-Off è sensibile a entrambi. Le concentrazioni di Tc o Dox necessarie sono molto basse,

inferiori a dosi citotossiche (sia per colture cellulari che per animali transgenici).

106

Al fine di ottenere una trasfezione stabile utilizzando il sistema TET-on o il sistema TET-off è neces-

sario, in realtà, effettuare due trasfezioni consecutive.

Figura 28. Ottenimento di una trasfezione stabile.

Nella figura 28 in A, rappresenta un sistema TET-off in cui si osserva un plasmide sul quale è possibile

identificare il marcatore per la resistenza all’ampicillina nei batteri (serve per la crescita e

l’amplificazione), un marcatore per la neomicina (per effettuare la selezione delle cellule che sono

state trasfettate in modo stabile negli eucarioti), un gene che codifica per la proteina tTA (attivatore

trascrizionale) posto sotto il controllo di un promotore virale per garantire un’espressione ad alti li-

velli, ed in fine le sequenze di terminazione (poly-A) sempre di origine virale. Il plasmide A una volta

inserito in una coltura cellulare produe la proteina tTA che consentirà il funzionamento del plasmide

rappresentato in B. In quest’ultimo, diversamente da A, si osserva il marcatore di resistenza per

l’ampicillina, un altro marcatore di resistenza (non riportato in figura) diverso dalla neomicina (ad

esempio l’igromicina) che consente di selezionare quali cellule eucariotiche avranno preso il plasmide

in B, non più un promotore del citomegalovirus ma il promotore TRE (pTRE) responsivo alle tetracicli-

ne, ed in fine le sequenze di terminazione (code di poly-A) e un MCS (Multiple Cloning Site) che

permette di clonare la sequenza che codifica per il gene di interesse. Questo processo di trasfezione

stabile prevede l’utilizzo sia del plasmide A che del plasmide B (in cui si inserisce il gene di interesse

sotto il controllo del promotore responsivo alle tetracicline). A questo punto è necesario effettuare

due trasfezioni stabili. La prima trasfezione esprime stabilmente il plasmide A e si selezionano delle

cellule che esprimono in modo stabile e non inducibile la proteina tTA. Successivamente si andrà a

trasfettare in queste cellule il plasmide B che contiene il gene di interesse la cui espressione è regolata

dalle tetracicline. Operativamente la doppia trasfezione (o consecutiva) viene operata scegliendo

prima di tutto il sistema TET-on o TET-off, e successivamente viene selezionato il primo plasmide che

codificherà per la proteina regolatoria.

PRIMA TRASFEZIONE STABILE.

1. Piastrare le cellule e lasciarle crescere fino a circa l’80% di confluenza;

2. Si effettua una trasfezione con vettore pTet On/Off, il plasmide può essere linearizzato

per aumentare l’efficienza di integrazione e per permettere alle cellule di duplicarsi

(per circa 24-48 h) e successivamente aggiungere un agente selezionante (geneticina,

G418, 400-500 ug/ml – concentrazioni elevate). La geneticina è una neomicina la cui

resistenza è codificata dal plasmide trasfettato.

107

3. Si effettua un cambio medium solitamente ogni 48 ore o quando necessario. Dopo

circa 5 gg le cellule che non hanno preso la resistenza iniziano a morire.

4. Mantenere le cellule sotto pressione selettiva in presenza dell’antibiotico per circa 2-

4 settimane, fino a quando inizieranno a morire tutte le cellule e iniziano a comparire

le colonie singole (isole), che hanno mantenuto o integrato l’espressione del plasmide

trasfettato; le colonie devono essere isolate e trasferite ognuna in una well (picking),

dopo di che verranno amplificate.

5. Assicurarsi che il sistema TET-on/TET-off venga espresso correttamente, attraverso

una trasfezione transiente con un plasmide in cui un gene reporter (es. pTRE-luc che

contiene gene per la luciferasi di lucciola regolato dasequenza TRE) posto sotto il

controllo di un promotore responsivo alle tetracicline. Questo metodo consente di

evidenziare quali sono le cellule che esprimono il sistema di regolazione TET.

6. Si selezionano le colonie migliori (maggior differenza indotto-non indotto) e congelare

l’intero stock dei cloni positivi.

I cloni stabili positivi ottenuti nella prima trasfezione vengono trasfettati con il plasmide pTRE-gene X per verificare l’effettiva regolazione genica sul costrutto che si vuole trasfettare stabilmente. SECONDA TRASFEZIONE STABILE.

1. Piastrare le cellule stabili per pTet On/Off e lasciarle crescere fino a circa 80% di

confluenza e in seguito si effettua la trasfezione con il plasmide che codifica per il gene

X sotto il controllo del promotore pTRE responsivo alle tetracicline. In questo plasmide

è presente anche il gene che codifica per la resistenza alla igromicina, oltre a quella

per la geneticina. La presenza di un secondo antibiotico diverso serve a mantenere

stabili le cellule ottenute dalla prima trasfezione e devono essere cresciute sempre in

presenza di neomicina (geneticina) per mantenere l’espressione del primo plasmide.

Il secondo antibiotico (igromicina) serve a selezionare quelle cellule che sono state

trasfettate in modo stabile, quindi a mantenere l’espressione del secondo plasmide.

Se si usasse lo stesso antibiotico non saremmo in grado di discriminare tra le linee

cellulari si dovrebbe fare una seconda selezione perché le cellule non morirebbero.

2. I plasmidi possono essere linearizzati per aumentare efficienza di integrazione.

3. Favorire la replicazione cellulare (24-48 ore) e quindi aggiungere agente selezionante

(igromicina B, 200-400 ug/ml) e Dox nel caso del sistema Tet-Off.

4. Si esegue un cambio del medium ogni 48 ore o quando è necessario. Dopo circa 5

giorni le cellule che non hanno preso la resistenza iniziano a morire.

5. Dopo circa 2-4 settimane iniziano a comparire le colonie singole. Isolare le singole

colonie e trasferire ognuna in una well (amplificazione).

6. Eseguire lo screening per verificare espressione del gene X (in assenza o in presenza

di Doxyciclina a seconda del sistema TET on/off scelto) con la stessa tecnica usata nel

controllo della trasfezione transiente.

7. Si selezionano le colonie migliori (maggior differenza indotto-non indotto).

8. Congelare lo stock dei cloni positivi

108

Un vantaggio delle linee stabili inducibili è che in poco tempo è possibile attivare l’espressione del

gene di interesse a livelli molto alti; in quanto, sarà sufficiente addizionare o sottrarre la doxyciclina

dal sistema TET-on o TET-off per attivare la trascrizione del promotore forte pTRE. È importante

ricordare che per poter effettuare la doppia trasfezione deve essere presente un secondo marker di

selezione che solitamente può essere presente sul costrutto pTRE con il gene X; oppure per una

questione di spazio (nel caso in cui si abbia un gene molto grande da trasfettare) per ridurre le

dimensioni del plasmide viene deletato il marcatore di selezione e si utilizza un terzo plasmide. I due

plasmidi, pTRE con il gene X e plasmide che porta la resistenza all’igromicina, vengono co-trasfettati.

Per essere sicuri che tutte le cellule sono in grado di codificare per la resistenza all’antibiotico abbiano

anche il gene di interesse, quando viene fatto il mix di co-trasfezione è opportuno miscelare i due

plasmidi in rapporto 10-20:1 in modo tale che questo rapporto sia estremamente favorevole per il

pTRE per aumentare probabilità che vengano acquisiti entrambi i vettori dalla cellula e non solo

quello della resistenza.

Un esempio di trasfezione stabile inducibile ottenuta sono le cellule NSC34-TET off. Queste cellule

sono degli ibridomi, motoneuroni murini immortalizzati, trasfettati in maniera stabile e inducibile con

un plasmide che codifica per una proteina responsabile di una malattia moto-neuronale. In questo

caso la proteina è stata fusa con una proteina fluorescente; dunque le cellule che risaltano in verde

sono quelle che esprimono la proteina di interesse. Come si può osservare, l’espressione si ha in

assenza di doxyciclina, mentre in presenza si ottengono dei livelli di espressione molto più bassi. I

numeri che compaiono a fianco di ciascuna linea cellulare indicano i diversi cloni, tra i quali è ne-

cessario selezionare quelli che hanno le caratteristiche migliori.

6.10 Scopo della trasfezione

Finora si è parlato di trasfezione di un DNA di nostro interesse al fine di andare ad esprimere (o

silenziare) una determinata proteina. In questo caso si ha la possibilità di scegliere tra diversi promo-

tori allo scopo di ottenere l’espressione del gene di studio. I promotori più utilizzati sono quelli virali

(solitamente quelli del citomegalovirus o del virus SV40) perché consentono di ottenere un elevato

grado di espressione del transgene (sovraespressione). È possibile scegliere dei promotori che

possono essere regolabili (inducibili) che consentono, di conseguenza, di regolare l’espressione del

transgene. Possono essere scelti dei promotori che si esprimono solo in particolari cellule specifiche

e questo consente di direzionare l’espressione del transgene verso una linea cellulare piuttosto che

un’altra. In tutti questi casi lo scopo della trasfezione è quello di sovra-esprimere un gene di interesse

e quindi poter studiare la proteina di interesse all’interno di un determinato contesto. Spesso, però,

potrebbe capitare che l’oggetto di studio non è la proteina stessa ma semplicemente la regolazione

del suo promotore che definisce le modalità per la sua espressione. Nel caso specifico, quello che

bisogna fare è costruire un plasmide in cui viene inserita la sequenza che codifica per il promotore

del gene di interesse che regola un altro gene detto reporter. Per poter effettuare gli studi di attività

trascrizionale di un promotore si utilizza un vettore denominato promoterless (un vettore privato del

promotore). Un esempio di vettore promoterless è quello in cui è presente l’origine di replicazione

(come in tutti i plasmidi e permette l’amplificazione nei batteri), il marker di resistenza all’ampicillina

la coda di poly-A e il MCS (Multiple Cloning Site, per effettuare un clonaggio con il gene di interesse).

109

Il MCS si trova posizionato dove normalmente di ritrova il promotore che in questo caso è assente;

generalmente viene a trovarsi prima di una sequenza che codifica per una gene reporter (es Luc che

codifica per l’enzima luciferasi).

Figura 29. Vettore Promoterless.

Se non viene apportata alcuna modifica al promoterless e successivamente lo si trasfetta in cellule

bersaglio non si ottiene alcuna espressione dell’enzima luciferasi proprio perché il promotore è

assente. Se invece, attraverso processi digestivi, si inserisce la sequenza che corrisponde al promo-

tore che si vuole studiare all’interno di questo plasmide, possibile regolare l’espressione del gene che

codifica per la l’enzima luciferasi (in questo caso) attraverso il promotore di interesse. L’espressione

di tale gene dipende da quanto è forte il promotore utilizzato. Questi sistemi, molto spesso, vengono

utilizzati per fare degli studi di attività trascrizionale in cui si vuole osservare quanto un determinato

promotore è in grado di promuovere la trascrizione di un gene. Di solito, questi studi, permettono di

capire quali regioni presenti all’interno del promotore sono essenziali per ottenere una buona

trascrizione e quindi una buona espressione del gene reporter. Generalmente quello che si fa è creare

un costrutto con il promotore intero e successivamente si apportano delezioni seriali (o inserzioni in

alcune regioni) per poter paragonare l’effetto di tale modifica rispetto al promotore intero.

Gene Reporter. È un gene che codifica per una proteina con una caratteristica unica e che non

sia presente nelle cellule in cui viene effettuata l’analisi e che sia facilmente misurabile. L’attività

proteica del Reporter non deve interferire con quelle fisiologiche della cellula, ovvero le vie di

segnalazione e il metabolismo cellulare devono rimanere integri. Il saggio sull’attività del reporter

deve essere specifico, riproducibile e immediato. Di solito un gene reporter permette l’immediata

110

identificazione delle cellule positivamente trasfettate (che lo esprimono) e vengono molto utilizzati

per studiare la funzionalità di un promotore (reporter posto sotto il controllo di quel promotore);

oppure molto spesso vengono utilizzati per studiare funzionalità e la localizzazione di un gene di

interesse (es. nella linea cellulare NSC34-TET off, la proteina fluorescente è un buon reporter –

attraverso un microscopio a fluorescenza è possibile osservare la localizzazione della proteina di

interesse all’interno della cellula). Uno de primi geni reporter ad essere stato utilizzato è il

Cloramfenicolo acetil-transferasi; un enzima batterico in grado di conferire resistenza all’antibiotico

cloramfenicolo (inattivazione attraverso acetilazione). Il suo utilizzo come gene reporter al fatto che

veniva abbinato ad un saggio (autoradiografia) in cui le cellule venivano trattate con un antibiotico

marcato con C14; l’antibiotico veniva acetilato solo nelle cellule trasfettate e dove il promotore che

controlla l’enzima attivo e, successivamente, prodotta una miscela proteica di queste cellule e

sottoposta ad autoradiografia era possibile identificare facilmente quali erano i cloni che erano in

grado di effettuare l’acetilazione (nei cloni incapaci di acetilare l’antibiotico si riscontrava assenza di

tale enzima che non era stato integrato). Oggi questo sistema non è più adoperato poiché utilizza

fonti di radiazioni pericolose per l’operatore. Uno degli enzimi maggiormente utilizzati è la luciferasi.

Questo enzima è in grado di convertire attivamente un substrato noto come luciferina nella sua forma

ossidata (ossiluciferina) liberando luce. Attraverso un luminometro è possibile quantificare il conte-

nuto luminoso prodotto da questo enzima all’interno delle cellule; la sua attività è direttamente

proporzionale alla quantità di luce emessa.

Figura 30. Sistema reporter della luciferasi.

Il promoterless codifica per l’enzima luciferasi. Il sistema descritto non presenta il promotore. La

presenza dell’enhancer fa in modo che vengano aumentati i livelli di espressione dell’enzima. Quando

si effettua il clonaggio del gene di interesse e si trasfettano le cellule con questo plasmide si può

andare a dosare la quantità di luciferasi presente all’interno delle cellule. Tale operazione può essere

eseguita effettuando una trasfezione e aspettano che le cellule esprimano il gene; in seguito è possi-

bile addizionare al medium di coltura il substrato per la luciferasi. L’analisi della luce prodotta viene

effettuata sia in cellule vive (attraverso un luminometro), oppure su cellule morte (attraverso un

saggio che prevede la lisi delle membrane cellulari, si recupera il contenuto citoplasmatico conte-

nente l’enzima luciferasi, si incuba con il substrato e si effettua la lettura).

Un gene reporter maggiormente utilizzato in biologia è la proteina GFP (Green Fluorescente Protein),

identificata per la prima volta nella medusa Aequorea Victoria. È una proteina che in natura produce

111

bioluminescenza dovuta al trasferimento di energia (processo Calcio-dipendente associato alla

proteina Aeqorina). La sua esposizione della proteina a raggi ultravioletti produce autofluorescenza

di colore verde in assenza di calcio, Aequorina o qualunque cofattore o substrato. Sono presenti delle

mutazioni puntiformi nel cromoforo che producono varianti di emissioni di luce a differente

lunghezza d’onda; in particolar modo la CFP (Cyan Fluorescent Protein) produce una luce di colore

blu, mentre la YFP (Yellow Fluorescent Protein) di colore giallo. Questa proteina può essere utilizzata

allo stesso modo della luciferasi per produrre un vettore promoterless, in cui l’emissione della luce

verde si ha solo per attivazione del promotore; oppure, molto spesso, viene utilizzata per ottenere

delle proteine di fusione dove la sequenza che codifica per questa proteina viene fusa in frame (in

modo da mantenere il frame di lettura) o all’N-terminale o al C-terminale di un gene che codifica per

la proteina di interesse.

112

7. Tecnologie di editing del genoma

7.1 Modifiche genomiche

Negli anni si sono sviluppate delle tecnologie di modifica molto più avanzate e sofisticate del genoma

di una cellula bersaglio e che consentono di mantenere il background genetico e i livelli di regolazione

di un determinato gene il più possibile a livello fisiologico. Nello specifico sono tecnologie che permet-

tono l’inserimento, ad esempio, di una mutazione di nostro interesse all’interno di un determinato

gene in modo tale da produrre una proteina mutata. Questa operazione viene compiuta all’interno

della cellula bersaglio senza dover andare a sovra-esprimere la proteina mutata e mantenendola

sotto il controllo del suo promotore endogeno. Tramite queste tecnologie è possibile ottenere dei

modelli di studio più simili possibile al reale. Le tecnologie che si sono evolute per andare a modificare

il genoma di una cellula bersaglio prevedono l’utilizzo di quattro classi di proteine che vengono

sfruttate per andare ad apportare modificazioni permanenti nel genoma della cellula bersaglio

(secondo quelle più recenti):

1. clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9);

2. transcription activator-like effector nucleases (TALENs); 3. zinc-finger nucleases (ZFNs); 4. homing endonucleases or meganucleases.

Tutte le tecnologie di “genome editing” si basano su dei sistemi enzimatici presenti in natura e

sfruttano la capacità delle cellule di attivare dei sistemi di riparazione del DNA quando questo viene

danneggiato, o in particolar modo, tagliato su entrambi i suoi filamenti (ds break). Nel momento in

cui si verificano queste situazioni, le cellule sono in grado di attivare due diversi tipi di sistemi di riparo

che differiscono a seconda che sia presente o meno un sistema guida che possa indirizzare tale

meccanismo di riparo:

1. In assenza di uno stampo per effettuare la riparazione viene attivato un meccanismo che

prende il nome di nonhomologous-end-joining (NHEJ), dove l’azione riparativa consiste nel

riassemblare i filamenti i filamenti colpiti da ds-break; durante questa fase può succedere che

la riparazione avvenga correttamente con successo, oppure che nel momento della ripara-

zione vengano inserite erroneamente alcune basi in più che portano a mutazione (puntiforme

in cui può cambiare il frame di lettura, può prevedere l’inserimento di uno stop-codon pre-

maturo) e all’ottenimento di una proteina non funzionante.

2. In presenza di uno stampo che può essere utilizzato dal macchinario di riparazione, in questo

caso si ha un meccanismo denominato homology-directed-repair (HDR), che può essere utiliz-

zato per effettuare un editing molto sofisticato che consente di guidare la riparazione cellu-

lare in modo tale che venga inserita la modifica di interesse.

Tutti i meccanismi di editing genomico di basano sul meccanismo riparatorio attivato dalla cellula nel

caso in cui incorre in un ds-break del DNA in assenza o in presenza di uno stampo (template); in

particolar modo, in assenza di un template il meccanismo di riparo può incorrere all’inserimento di

errori sequenziali. Per tale ragione le tecniche utilizzate consentono di silenziare l’espressione di un

113

determinato gene. Quando invece il template che viene fornito al meccanismo di riparazione ge-

nomica non è endogeno ma ricombinato si può andare an inserire una specifica mutazione oppure

semplicemente correggere una determinata mutazione endogena.

① HOMING ENDONUCLEASES – Enzimi codificati da sequenze di introni che ricono-scono,

legano e tagliano lunghe sequenze di DNA (14–40 bps). Questi enzimi indirizzano verso una specifica

regione del genoma introducendo una rottura del doppio filamento (DSB). Questo DBS viene riparato

utilizzando come stampo la sequenza che contiene il gene che codifica per le homing endonucleases

(questo meccanismo serve in natura a duplicare il gene che codifica per questo enzima e aumentarne

la frequenza allilica). Quindi si è pensato di poter sfruttare il fatto che questo enzima inducesse un

DSB per sfruttare l’apertura nel DNA e inserire la modifica di interesse. La grossa limitazione di questo

sistema sta nel fatto che le sequenze che vengono riconosciute dalle HE sono poche all’interno del

genoma e sono molto lunghe e difficili da modificare. Quindi in realtà non è possibile decidere in

modo specifico il sito sul quale apportare la modifica di interesse (o meglio la modifica verrà inserita

solo in prossimità della sequenza riconosciuta da questi enzimi). Ovviamente questo sistema non può

essere utilizzato per effettuare una correzione di tipo genico.

② ZINC-FINGER (ZFN) SYSTEM - è un altro sistema identificato in natura ed è un sistema più

versatile rispetto al precedente che consente di effettuare il DSB. Il sistema consiste nell’utilizzo di

una coppia di enzimi, detti appunto zinc-finger, che sono in grado di riconoscere sequenze di

lunghezza variabile dalle 8-20 pb. Il monomero superiore riconosce la sequenza complementare da

5’ a 3’, mentre quello inferiore da 3’ a 5’. Solo nel momento in cui ciascun monomero riconosce la

sua sequenza può avvenire il taglio e la formazione del DSB. La versatilità di questo sistema rispetto

al precedente è dovuta al fatto che la sequenza riconosciuta è più corta e poi perché ogni monomero

è costituito da diverse sub-unità ciascuna delle quali è in grado di riconoscere tre nucleotidi. Quindi

Figura 31. Meccanismi di riparazione del DNA cellulare.

114

è possibile comporre un monomero utilizzando le diverse sub-unità in modo tale che sia possibile

riconoscere tutte le eventuali triplette di nucleotidi. Nella pratica non è facile ideare proteine di

questo tipo che riescano a riconoscere effettivamente ogni tripletta però, almeno idealmente, il

sistema permette di riconoscere qualsiasi sequenza al livello del genoma e quindi andare a

direzionare il taglio (a differenza delle HE dove il taglio doveva essere effettuato in maniera obbliga-

toria laddove questi enzimi riconoscevano la regione di taglio). Il riconoscimento è di tipo proteina-

nucleotide.

③ TRANSCRIPTION ACTIVATOR-LIKE EFFECTOR (TALE) NUCLEASES

(TALENs). Sono delle vere e proprie proteine modulari composte da unità multiple (di solito

12-20). Tali moduli permettono il riconoscimento non di una tripletta ma bensì di un singolo nucleo-

tide. Difatti questo sistema manifesta una versatilità ancora maggiore rispetto ai due precedenti;

permette di effettuare un DSB utilizzando sempre il sito catalitico che era presente nelle zinc-finger

riconoscendo e tagliando qualsiasi sequenza presente all’interno del genoma di interesse. Anche in

questo caso il riconoscimento è di tipo proteina-nucleotide. Il vantaggio di questo sistema rispetto ai

precedenti sta nel fatto che è più semplice da ingegnerizzare, presenta una maggiore specificità oltre

alla sua versatilità atta a ridurre il fenomeno di taglio a sequenze simili a quella di interesse all’interno

del genoma (che possono dare un effetto di tipo tossico).

④ CLUSTERED REGULARLY INTERSPACED SHORT PALINDROME REPEATS

(CRISPR/CAS 9). La rivoluzione si ebbe nel 2005 quando fu scoperto che nei batteri, all’interno

del loro genoma, erano presenti delle corte sequenze palindromiche ripetute spaziate in modo

regolare. Si è scoperto che in mezzo a queste sequenze erano presenti degli spaziatori di origine non

batterica, che successivamente venero definite CRISPR. Fu presto scoperto che tali se-quenze erano

spesso associate all’enzima nucleasi (CAS). Questo sistema era alla base dei processi immunitari dei

batteri e degli Archea, che ha permesso soprattutto ai batteri di sopravvivere e fron-teggiare le

infezioni di tipo virale (fagi). È un sistema molto semplice che ha consentito e che tuttora consente ai

batteri di proteggersi nei confronti di un DNA esogeno di origine virale. Quando un virus inserisce il

suo DNA all’interno di un batterio, questo è in grado di riconoscere alcune sequenze presenti

all’interno di questo genoma (in particolare riconosce una sequenza di tre nucleotidi nota come

PAM), una volta riconosciute, va a tagliare in una regione immediatamente adiacente a questa

sequenza del genoma del virus o del plasmide nella quale va ad inserire il suo materiale genetico

ponendolo vicino a queste sequenze CRISPR (che fungono da spaziatori). In questo modo il batterio

riesce ad inserire nel proprio genoma una parte del genoma virale. Nel momento in cui trascriverà il

proprio genoma, verrà al contempo trascritta anche questa piccola sequenza; e il fatto che sia posta

vicino a queste sequenze palindromiche ripetute fa sì che si formeranno delle strutture particolari

che si chiameranno pre-cr -RNA successivamente processate dal sistema batterico per formare le cr-

RNA. Queste ultime hanno una struttura “a loop” che è costante ed è data dalle sequenze

palindromiche ripetute del batterio. Ogni cr-RNA avrà una piccola coda variabile che corrisponde alla

sequenza complementare alla sequenza del genoma del virus (o del DNA esogeno). Il cr-RNA viene

caricato all’interno di un complesso proteico (CAS 9) (che funziona similmente come il dicer) e

funziona da stampo-guida per la degradazione del DNA da parte del CAS 9. Infatti, a seguito di una

nuova infezione da parte dello stesso virus, il batterio riconosce e degrada la sequenza di DNA del

virus infettante (o del DNA plasmidico che verrà completamente inattivato).

115

I componenti essenziali di questo sistema sono:

1. Le componenti CRISPR

2. La proteina CAS 9 (nucleasi in grado di tagliare in modo specifico il DNA) associata alle CRISPR.

Di queste proteine ne esistono di tre tipi.

3. La sequenza PAM (Protospacer adjacent motif) che si trova a fianco di quella sequenza

(costituita da un nucleotide qualsiasi e da due guanine) che viene inserita all’interno del

batterio, oppure nell’uomo quando viene sfruttato questo sistema per modificare il genoma

umano.

4. gRNA (guide-RNA) sono costrutti formati dal cr-RNA e da quello che viene chiamato trans-

activator-cr-RNA.

Figura 32. Funzionamento del CRISPR/CAS 9.

Il funzionamento del CRISPR/CAS 9 avviene secondo diversi step:

1. Fase di acquisizione. È la fase in cui il DNA esogeno viene incorporato all’interno del DNA

batterico a livello dei CRISPR loci. Come è possibile osservare in fig.32, la sequenza più

prossima (di solito a monte) alla sequenza PAM può essere incorporata all’interno del genoma

batterico in uno dei suddetti locus CRISPR che consiste in una serie sequenze palindromiche

di cr-RNA inframezzate da DNA esogeno.

2. Fase di trascrizione del genoma batterico e la formazione del cr-RNA. All’interno del genoma

batterico si ha la regione dei cr-loci che darà origine ad un trascritto primario; immediatamen-

116

te a monte è presente una sequenza che codifica per una struttura nota come tracr-RNA e le

sequenze che codificano per la proteina CAS 9. Ottenuto il trascritto primario, in corrispon-

denza del sito primario, verranno trascritti anche i tracr-RNA necessari per la formazione del

cr-RNA. Si forma, sostanzialmente, una struttura composta dai tracr-RNA e dai singoli cr-RNA.

Tutta questa struttura verrà successivamente riconosciuta e inserita all’interno dell’enzima

CAS 9 con la funzione di guidare la degradazione di un frammento specifico di DNA. Di solito

la CAS 9 effettua un taglio di una sequenza di DNA (pari a 20 nucleotidi) complementare alla

sequenza che si trova adiacente alla PAM sul DNA bersaglio. Quello che viene inserito all’inter-

no del batterio è costituito dal target senza la PAM poiché questa viene unicamente sfruttata

per avere la specificità di taglio (DSB) sulla sequenza target. Se non vi è la sequenza PAM, il

taglio non avviene. Questo sistema è importante perché protegge il batterio dall’auto-

digestione del proprio DNA. Infatti grazie a questa sequenza, la CAS 9 riconosce anche il

proprio materiale genetico che non viene digerito proprio perché non riconosce alcuna

sequenza PAM legata ad esso. Una volta che la CAS 9 viene associata al cr-RNA, e utilizza

questa sequenza per poter scansionare il DNA esogeno al fine di ritrovare il suo target; nel

momento in cui avviene la complementarietà perfetta o quasi perfetta, un sistema di

ricontrollo verifica la presenza della sequenza PAM.

Figura 33. Funzionamento della CAS 9.

117

In una visione ancor più dettagliata, la guida che permette al CAS 9 di effettuare il taglio è fornita da

una struttura composta dal tracr-RNA (una sequenza sempre uguale trascritta dal genoma batterico)

che, a sua volta, si associa con un cr-RNA (costituito da una sequenza complementare al tracr-RNA)

e ad una sequenza target di 20 nucleotidi che è complementare al DNA esogeno sul quale effettuare

il DSB. Nel momento in cui tutta questa struttura viene caricata dalla CAS 9, qualora si ripresenti una

seconda infezione dello stesso virus, attraverso questo sistema la CAS 9 è in grado di legare il DNA

target, di aprirlo, scorrere i suoi filamenti in modo tale da verificare la presenza di questo target. Se

la CAS 9 riscontra una certa complementarietà con le sequenze del DNA esogeno, allora questa

verifica la presenza della sequenza PAM. Ad esito positivo, si verifica una mutazione conformazionale

che permette l’attivazione della CAS 9 per effettuare DSB.

La proteina CAS 9 è composta da due siti attivi:

1. Il sito HNH, quello in cui avviene il riconoscimento e l’alloggiamento della sequenza (strand)

complementare al cr-RNA. In questo sito viene effettuato il taglio tra i nucleotidi adiacenti alla

sequenza PAM.

2. Il sito RuvC, che taglia il secondo filamento non complementare nello stesso punto individuato

dal primo sito.

Tecnologia CRISPR/CAS 9. Rispetto alle altre tecnologie, quello dei CRISPR è di sicuro quello più

versatile di tutti perché il riconoscimento avviene nucleotide-nucleotide e questo assicura una

maggiore specificità, rapidità di utilizzo ed economicità.

Per poter utilizzare questo sistema sono state compiute delle modifiche in particolare:

1. Il cr-RNA e il trasc-RNA sono state fuse in un’unica struttura, il guide-RNA (ovvero un’unica

molecola di RNA che è molto più semplice da produrre);

2. La seconda modica importante è quella a livello della CAS 9, la quale è stata convertita da

endonucleasi a due domini catalitici differenti ad una coppia di nickasi attraverso una muta-

zione del domino RuvC. Il vantaggio di questa modifica è che ciascuna nickasi può essere

associata con uno specifico guide-RNA che riconosce e taglia uno solo dei due filamenti. Viene

sfruttato il fatto che il sistema di riparo riconosce anche un taglio sfalsato come DSB purché il

taglio sui due singoli filamenti sia sufficientemente vicino –si può pensare di disegnare le due

guide-RNA in modo che una sia complementare ad un filamento e l’altra con uno shift di 20-

30 basi, questo permette di aumentare ulteriormente la specificità in quanto è impossibile

trovare due regioni all’interno del genoma che possano essere riconosciute da due guide-RNA

sfalsate (quindi permette di ridurre le mutazioni off-target).

Questo sistema può essere utilizzato per effettuare modificazioni genomiche molto sofisticate. Per

funzionare necessità di un enzima come la CAS 9, di guide-RNA disegnate (attraverso particolari

software) allo scopo di indirizzare il taglio presso la regione di interesse. Affinché la CAS 9 effettui il

taglio, è necessario che sia presente la sequenza PAM e che la sequenza di taglio si trovi in prossimità

a adiacente ad essa. Per l’inserimento di questi elementi all’interno delle cellule per effettuare il

genome editing si utilizza uno dei sistemi di trasfezione descritti precedentemente. Generalmente

viene sfruttato un plasmide commerciale che contiene tutti gli elementi classici di espressione

batterica. Tale plasmide sarà in grado di codificare per la CAS 9 (sotto il controllo di un promotore

forte) e al suo interno, in siti specifici, è possibile inserire e clonare le guide-RNA disegnate per il gene

118

di interesse. In seguito si utilizza il plasmide batterico per trasfettare le cellule bersaglio. La strategia

è quella di disegnare due oligonucleotidi di circa 20pb (paia di basi) che rappresentano il senso (5’-

3’) e l’antisenso (3’-5’) della sequenza target (bisogna tener presente che la sequenza complementare

deve essere disposta vicina ad una sequenza PAM). Si procede con l’annilazione dei due oligonucleo-

tidi al fine di formare un duplex e poterlo inserire all’interno del vettore (ottenuto attraverso cellule

rese competenti e che presentano resistenza alla kanamicina) dopo aver digerito eventualmente

alcuni siti specifici di taglio (attraverso enzimi di restrizione). Si esegue il clonaggio del gene che

codifica per la CAS 9 e si trasfetta in una cellula di mammifero. Importante potrebbe essere (nel

momento della trasfezione) l’aggiunta di un secondo plasmide che prende il nome di donor template.

Difatti, come si era detto precedentemente, nel momento in cui si va ad effettuare un DSB del DNA,

il macchinario cellulare si attiva al riparo del danno; in assenza dello stampo la riparazione avviene o

perfettamente attraverso mutazioni che vedono l’inserimento di nucleotidi in più. A tal proposito

potrebbe essere interessante guidare il riparo del genoma, sfruttando la capacità delle cellule di

ricorrere ad uno stampo di riparazione. Se viene fornito uno stampo esogeno al sistema di ripara-

zione, questo inserisce la modifica di interesse. Sostanzialmente, viene fornita alla cellula un template

che consiste in una sequenza complementare alla regione che fiancheggia il taglio eseguito ad opera

della CAS 9 (up-stream e down-stream) che contiene al centro la modifica di interesse. A seguito del

taglio, infatti, le sequenze fiancheggianti note come braccia omologhe (homology arms) si inseriscono

all’interno del break e forniscono il nuovo stampo per il macchinario di riparazione (la DNA polimerasi

che duplicherà il filamento stampo inserendo la modifica di interesse).

Come si fa a disegnare un donor template per avere un genome editing più accurato possibile? – è

necessario considerare 5 parametri:

1. la distanza dal sito di taglio della CAS 9. Il filamento omologo contenente la modifica che si

va ad inserire ha la maggiore efficienza quanto più questo è vicino al DSB (può discostarsi da

esso per un massimo 10 nucleotidi).

2. identificcare le cr-RNA compatibili. Quando viene effettuato il taglio (DSB) all’interno del ge-

noma, il sistema di riparo delle cellule di mammifero tenderà a riparare tale danno nel minor

tempo possibile. Solitamente viene utilizzato un meccanismo di tipo nonhomologous-end-

joining (NHEJ) (vedi pag. 106) perché è più rapido e semplice. Quindi difficilmente verrà

utilizzato il donor template esogeno fornito. L’obbiettivo è quello di andare ad aumentare la

probabilità dell’utilizzo del donor template funzioni. Questo è possibile rendendo il sistema di

taglio (CAS 9) con le guide-RNA il più efficiente possibile. Vengono scelte accuratamente le

guide-RNA e posizionarle in prossimità di due PAM diverse; e possibilmente la CAS 9 modi-

ficata a double-nickasi. Nel momento in cui questo costrutto verrà trasfettato alla cellula

bersaglio fornendo il donor template; la CAS 9 caricherà le guide-RNA e in maniera piuttosto

efficiente eseguirà il taglio del DNA. Successivamente il macchinario cellulare procederà con

il riparo e a causa della frequenza dei tagli si aumenta la probabilità che almeno una volta il

donor template fornito. Infatti è sufficiente che venga utilizzato il template una volta soltanto

che si è sicuri di aver inserito la modifica genetica di interesse.

3. scegliere il tipo di modifica da effettuare. Al momento in cui il template viene ideato, bisogna

tenendo conto dell’obbiettivo che si propone la modifica da effettuare (inserzione di un gene,

mutagenesi sito-specifica, inserzione/correzione di una mutazione puntiforme).

119

4. lunghezza dei bracci omologi (homology arms). Le sequenze che fiancheggiano la regione che

si vuole modificare e che ne permettono l’inserzione del donor template all’interno del DSB

devono essere di dimensione pari a 30-40 nucleotidi e simmetrici rispetto alla regione in cui

viene effettuata la modifica.

5. modifica del donor template e la sua resistenza alla CAS 9. Vengono apportate delle modifica-

zioni alla sequenza che potrebbe consentire alla CAS 9 di digerire il donor template (poiché

complementare alla sequenza di taglio – contiene le PAM e la sequenza complementare alle

guide-RNA). Le strategie che si possono effettuare a tal proposito sono due:

a. split in due della sequenza target di 20 nucleotidi (riconosciuta dalle guide-RNA) - qualora

questa sia presente nel template – ponendo l’inserto all’interno della sequenza ricono-

sciuta in modo tale questa sequenza sia spezzata in due parti dall’inserto stesso e non sia

riconosciuta dalla CAS 9.

b. modificare la sequenza contenuta all’interno del donor template andando a mutageniz-

zare la PAM, inserendo un nucleotide differente da una guanina in modo tale che la PAM

non venga più riconosciuta come tale; oppure può essere mantenuta intatta la PAM e

modificata quella sequenza riconosciuta dalle guide-RNA – attraverso l’inserimento di

mutazioni puntiformi.

Esistono dei software in commercio che consentono di disegnare in maniera opportuna sia le guide-

RNA che il donor template, o di identificare le sequenze PAM; basta inserire la regione di interesse

che si vuole modificare. Questi software con-sentono di identificare la strategia migliore da adottare

per effettuare il genoma editing e avere la maggiore probabilità possibile che questa avvenga con

successo. Bisogna tenere in considerazione che il genome-editing effettuato utilizzando questo sis-

tema è poco frequente e di difficile realizzazione; per cui, una volta trasfettate le cellule di mammi-

fero con il costrutto che codifica per la CAS 9 e contenente anche le guide-RNA e il donor template,

sarà necessario effettuare uno screening di una moltitudine di cloni cellulari per identificare quello

che ha subito la modifica genica di interesse. Lo screening verrà effettuato con un meccanismo analo-

go a quello visto per le trasfezioni stabili. Molto spesso quando si fa una modifica che prevede

l’utilizzo di un donor template, all’interno di quest’ultimo viene inserito (oltre al gene di interesse) un

gene che codifica per una resistenza ad un determinato antibiotico per selezionare quali cellule saran-

no geneticamente modificate.

120

8. Tecniche di microscopia a

fluorescenza

8.1 Luminescenza

Per luminescenza si intende l’emissione di luce da atomi, molecole o cristalli eccitati elettronicamen-

te. Si può dividere in:

1. luminescenza di tipo luminoso – si parla di fotoluminescenza;

2. luminescenza di tipo chimico – è nota anche come chemioluminescenza.

La fotoluminescenza può essere divisa in due sottogruppi: fluorescenza e fosforescenza. La differenza

principale è che la fluorescenza si ferma appena finisce l’illuminazione. La fosforescenza può durare

anche ore dopo il termine dell’eccitazione. Quindi differiscono per il tempo che impiega la molecola

ad emettere radiazione luminosa.

8.2 Fluorescenza

Introduzione alla fluorescenza. Normalmente quando gli oggetti assorbono energia lumino-sa,

quello che succede quasi sempre è che questi dissipano tale energia assorbita sotto forma di calore;

alcune sostanze però, sono in grado di liberare parte dell’energia assorbita sotto forma di luce con

lunghezza d’onda differente rispetto a quella assorbita. Queste molecole sono note come

fluorescenti. La fluorescenza è il risultato di un processo a tre step che accade in molecole chiamati

fluorofori. Una sonda fluorescente viene disegnata per rispondere a specifici stimoli o per localizzarsi

in una specifica regione di una specie biologica. La fluorescenza prende il suo nome da un minerale

di calcio e fluoro, la fluorite, in cui questa re-emissione luminosa fu osservata per la prima volta.

Quali sono le molecole fluorescenti? Sono molecole contenenti dei sistemi aromatici π ad alta coniu-

gazione. Le molecole più note in biologia cellulare sono la fluoresceina (più utilizzata), le flavine, le

rodamine e le porfirine. Il meccanismo di fluorescenza avviene attraverso tre step:

S

S’

ην EX ην EMI

S0

ENER

GIA

①

②

③

Figura 34. Meccanimo della fluorescenza.

121

① ECCITAZIONE. Un fotone di energia hνex viene fornito da una fonte esterna come una lampada

incadescente od un laser, e viene assorbita dal fluoroforo. L’energia fornita fa in modo che la mole-

cola passi dallo stato fondamentale a quello eccitato.

② ASSORBIMENTO. Il fluoroforo va incontro a cambiamenti conformazionali ed è soggetto ad una

serie di interazioni con l’ambiente molecolare. L’energia S1’ viene parzialmente dissipata portando ad

uno stato eccitato S1.

③ STATO DI EMISSIONE. Un fotone di energia hνem viene emesso ed il fluoroforo torna nello stato

S0. A causa dell’energia di dissipazione, l’energia del fotone è minore, e la sua lunghezza d’onda

maggiore di quelle di eccitazione. La differenza di energia o lunghezza d’onda (hνEX – hνEM) è chiamato

spostamento di Stoke (Stokes shift).

Purché si abbia questo fenomeno è importante che nella molecola vi siano degli elettroni mobili in

grado di passare facilmente da uno stato all’altro.

Figura 35. Stokes Shift. L’energia emessa sarà più grande rispetto a quella di assorbimento, poiché queste sono inversamente proporzionali.

La fluorescenza si ha solo quando il fluorocromo viene illuminato alla corretta lunghezza d’onda. La

lunghezza d’onda dipende dallo spettro di assorbimento del fluoroforo. A tale lunghezza d’onda

infatti corrisponde l’energia necessaria per eccitare gli elettroni dello stato fondamentale e passare

allo stato eccitato.

E= hν ν=c/λ

122

Lunghezza d’onda ed energia sono grandezze inversamente proporzionali. Per ogni molecola esiste

uno spettro di assorbimento ed uno di emissione.

8.3 Proteine fluorescenti

Le molecole fluorescenti più utilizzate in biologia cellulare sono le proteine.

La GFP (Green Fluorescent Protein) è una proteina di 238 aa (27 KDa) isolata dalla medusa Aequorea

victoria. Il suo gene è stato clonato ed è disponibile commercialmente in diversi vettori plasmidici.

Inducendo mutazioni nel gene della GFP sono state prodotte varianti di questa proteina con

caratteristici spettri di assorbimento ed emissione (BFP, CFP, YFP). Il suo ruolo fisiologico è di

trasdurre la chemio-luminescenza blu della proteina aequorina in luce fluorescente verde. Molto

usata per produrre proteine chimeriche fluorescenti, con GFP fusa all’estremità N o C terminale.

Questa tecnica serve per studiare la localizzazione o il livello di espressione di una proteina di

interesse. Le modificazioni di questa proteina hanno permesso l’ottenimento di varianti (blu, giallo

e ciano). Spesso nei plasmidi si trova indicato anche eGFP, dove “e” sta per “enhanced”, questo sta

ad indicare che questa proteina è stata mutagenizzata al fine di aumentarne maggiormente la fluore-

scenza (per renderla più brillante). Molto spesso si utilizzano anche delle proteine di colore rosso che

hanno avuto origine da questa proteina isolata dall’anemone di mare, le quali vengono chiamate

DsRed.Anche in questo caso sono state effettuate delle varianti andando a modificare alcuni

amminoacidi presenti nel fluocromo della proteina. Le varianti sono date da fluorescenza giallo

banana, arancione e rosso.

Ogni proteina fluorescente ha uno spettro che la contraddistingue, quindi è necessario che conoscere

il suo spettro di eccitazione e di emissione. Questo permetterà di sapere a che lunghezza d'onda

potrà essere eccitata tale proteina affinché questa emetta un segnale luminoso. È importante anche

conoscere la lunghezza di emissione perché consentirà di settare il detector su quella lunghezza

d'onda e quindi essere in grado di vedere il segnale qualora sia presente.

Figura 36. Rappresentazione di alcuni spettri di assorbimento (A) e di emissione (B) dei principali fluorofori

usati in ricerca biomedica. Caratteristica tipica della fluorescenza è che, coinvolgendo stati energetici

vibrazionali non radiativi che fanno perdere energia al fluoroforo eccitato, gli spettri di assorbimento in

eccitazione hanno λ minori rispetto a quelli in emissione, come visibile confrontando i due grafici. Questo

permette di rilevare l’emissione fluorescente su una λ differente da quella con cui il fluoroforo è stato eccitato.

123

E’ possibile utilizzare diversi fluorocromi all’interno dello stesso campione e analizzarli in contempo-

ranea se gli spettri dei due fluorocromi non si sovrappongono (ovvero se è possibile eccitare i due

fluorocromi singolarmente). Infatti, più questi sono lontani in lunghezza d’onda più sarà la probabilità

di poterli utilizzare in contemporanea.

8.4 Microscopio a fluorescenza.

Per poter effettuare esperimenti su delle molecole fluorescenti è necessario disporre di un particola-

re microscopio in grado di rilevare la fluorescenza di queste molecole. Tale strumento è anche in

grado di eccitare la molecola fluorescente di interesse ad un’opportuna lunghezza d’onda. Il micro-

scopio a fluorescenza permette di andare a determinare la localizzazione di una proteina o di diverse

proteine, determinare la forma di organi, cellule, strutture intracellulari, valutare la dinamica delle

proteine (in termini di spostamento), studiare le interazioni tra proteine o la loro struttura, valutare

la concentrazione ionica ecc.

Figura 37. Microscopio a fluorescenza.

DESCRIZIONE DI UN MICROSCOPIO A FLUORESCENZA. Un microscopio a fluorescenza è

sostanzialmente composto da:

1. una lampada che consente di generare la radiazione luminosa che eccita il campione. Le

lampade più utilizzato sono lampade a vapori di mercurio e le lampade allo xeno perché sono

lampade ad alta energia e che sono in grado di produrre ed emettere luce a tutte le lunghezze

d’onda dello spettro visibile.

a. lampada a vapori di mercurio - è quella più utilizzata ed è in grado di emettere delle

radiazioni luminose con picchi di emissione a particolare lunghezza d'onda molto

intense.

b. lampada allo xeno - emette con radiazione luminosa con energia minore ma più

costante (senza grossi picchi, ma viene emessa allo stesso modo per tutte le lunghezze

d’onda).

124

2. un sistema di filtri e di obbiettivi che permettono all’operatore di osservare il campione e di

selezione e indirizzare la lunghezza d’onda della radiazione che colpisce il campione. La

radiazione che viene emessa dalle lampade può essere di diverse lunghezze d’onda, quindi è

necessario avere dei sistemi che filtrino, in modo da selezionare tra tutte le lunghezze d’onda

prodotte, soltanto quelle di interesse. Di filtri ce ne sono di diversi tipi all’interno del micro-

scopio a fluorescenza, sostanzialmente divisibili in due categorie:

a. filtri di eccitazione (o filtro barriera) – sono quelli posti subito dopo la lampada, e per-

mettono di selezionare solitamente una sola di queste o un range molto ristretto.

b. filtri di emissione – tra tutte le radiazioni emesse dal campione, selezionano solo quelle

che corrispondono alla lunghezza d’onda del fluorocromo in esame. Tali filtri sono

neces-sari per eliminare eventuali interferenze. Un filtro di emissione è posto poco

prima del detector.

I filtri che si trovano all’interno di un microscopio a fluorescenza sono di tre tipi:

a. Band Pass filter (filtro passabanda) – permette il passaggio solamente delle lunghezze

d’onda che sono comprese all’interno di un range.

b. Short Pass filter - è un filtro passabanda ancor più ristretto e molto spesso utilizzati in

un filtro multibanda in cui sullo stesso filtro vengono selezionate più di una lunghezza

d’onda , o meglio, più di un range ristretto di lunghezze d’onda.

c. Long Pass Filter - lascia passare tutte le lunghezze d’onda al di sopra di una determi-

nata lunghezza d’onda.

3. uno specchio, detto dicroico, che riflette la luce filtrata in emissione e la indirizza sul campione,

e qualora il fluorocromo venga colpito dalla radiazione luminosa alla corretta lunghezza

d’onda di eccitazione, questo successivamente sarà in grado di emettere una lunghezza

d’onda maggiore rispetto a quella di eccitazione. Quindi lo specchio riflette le lunghezze

d’onda inferiori a quella necessaria e lascia passare quelle al di sopra di questa (solo quelle

che vengono emesse).

4. un detector che permette di osservare la luminescenza emessa attraverso:

a. un obiettivo che permette di osservare in maniera oculare le radiazioni luminose e-

messe dal campione in esame;

b. Tubo fotomoltiplicatore (confocale)

c. una CCD camera che converte il segnale luminoso in digitale.

La parte sottostante è identica a quella di un normale microscopio ottico.

Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) – MICROSCOPIA CONFOCALE. E’ una tecnica

basata su un microscopio ottico convenzionale dove al posto di una lampada vi è un raggio laser che

colpisce il campione e viene costruita un’immagine pixel per pixel raccogliendo i fotoni, spesso

attraverso un fotomoltiplicatore. Vengono acquisite immagini per ogni piano del campione. Il

microscopio confocale focalizza la luce su una zona molto piccola del campione, alla profondità desi-

derata, ovvero solo quella zona riceve l’illuminazione (questo riduce la luce diffusa dalle altre zone

del campione) e sarà quella che emetterà fluorescenza. Questa operazione è importante perché,

illuminando una zona più ampia del campione, si potrebbe ottenere un segnale poco nitido dato

dall’interferenze di emissione di un fluorocromo e di quello adiacente. Dunque, l’idea che ha dato

125

origine a questo tipo di microscopio nasce dalla possibilità di illuminare una piccola porzione del

campione come se questo venga sezionato in vari piani; e successivamente, attraverso l’acquisizione

di più piani illuminati è possibile ricostruire l’immagine al computer. La luce viene comunque riflessa

anche dagli strati del campione sopra e sotto il fuoco dell’illuminazione.

Funzionamento. La differenza rispetto ad un microscopio in campo chiaro è data dall’inserimento di

un diaframma (apertura confocale) prima del detector.

Figura 38. a) Microscopio in campo chiaro (wide field); b) microscopio confocale.

Osservando la figura 38, si può distinguere una sorgente luminosa che genera una radiazione

luminosa, che una volta filtrata colpisce lo specchio dicroico e successivamente colpisce il campion in

esame. Nel sistema in campo chiaro (a), una volta selezionato un piano focale, questo non verrà

unicamente investito dal fascio luminoso, ma anche le molecole vicine, e quindi l’emissione del

segnale sarà generato anche da parte di queste, oltre che dal piano. Differentemente, nel sistema

confocale (b), per eliminare queste riflessioni spurie (ovvero tutte le riflessioni che non provengono

dal piano focale), basta inserire un diaframma (uno schermo con un forellino/pinhole) nel punto in

cui la luce riflessa viene focalizzata, lontano dal campione (prima del detector), dallo stesso obiettivo

che si usa per illuminarlo. Con il diaframma è possibile focalizzare la radiazione di interesse. Solo la

126

luce riflessa dal punto desiderato passa per il forellino, mentre quella riflessa dagli altri piani focali

non viene messa a fuoco sul pinhole e non passa. La luce che passa il pinhole raggiunge poi un

rivelatore. Nella microscopia a fluorescenza convenzionale l’immagine è disturbata da tutte le parti

che non sono a fuoco. Nella microscopia confocale i piani non a fuoco sono esclusi dalla formazione

dell’immagine che risulta molto più nitida.

8.5 Applicazioni della fluorescenza in biologia cellulare

IMMUNOFLUORESCENZA. Un’applicazione importante è l’immunofluorescenza. Questa

tecnica riguarda l’utilizzo di molecole fluorescenti (fluorocromi) abbinate ad una reazione di tipo im-

munitario (che prevede l’utilizzo di anticorpi). L’antigene è rappresentato dalla proteina di interesse.

attraverso questa tecnica è possibile andare a rendere fluorescente (mediante l’utilizzo di un fluoro-

cromo) una proteina di studio (riguardo il suo metabolismo, la sua localizzazione, il suo com-

portamento ecc.) in ambiente intracellulare. Di immunofluorescenza ne esistono di due tipi:

1. diretta - si utilizza un anticorpo primario direttamente coniugato al fluorocromo. L’antigene

si deve trovare sulla molecola oggetto di studio e l’anticorpo deve essere in grado di rico-

noscere questo antigene specifico. Nel memento in cui avviene la reazione che coinvolge

antigene e anticorpo, quello che può essere osservato mediante microcopio a fluorescenza è

la presenza della proteina di studio nel punto di fluorescenza.

2. indiretta – si utilizzano due anticorpi differenti; ovvero un anticorpo primario che riconosce

la proteina di interesse, e un anticorpo secondario fluorescente (coniugato al fluorocromo)

che riconosce l’anticorpo primario nella sua regione costante.

L’immunofluorescenza viene eseguita attraverso un protocollo specifico.

Figura 39. Uovo fecondato di riccio di mare in mitosi, analisi per tubulina.

a) Microscopia a fluorescenza convenzionale; b) Microscopia a fluorescenza confocale

127

PROTOCOLLO PER IMMUNOFLUORESCENZA.

Prevede diversi step:

1. FISSAZIONE - è quel processo che consente di portare a morte le cellule del preparato di

interesse in modo tale che queste mantengano la citoarchitettura. Il processo di fissazione

può avvenire utilizzando due tipi di sostanze:

a. Aldeidi – agenti cross-linkanti (paraformaldeide al 4%in PBS, 15-20mins a RT).

La p-foraldeide che è la più utilizzata. Formano ponti di legame tra aa liberi, creando

un network di antigeni liberi. Preservano meglio la citoarchitettura della cellula; certe

volte però mascherano l’antigene e necessitano di ulteriori steps di permeabilizazio-

ne prima dell’incubazione con l’anticorpo.

b. Sostanze organiche – metanolo, acetone, miscele MeOH-acetone (MeOH assoluto -

20°C è quello più utilizzato) Rimuovono i lipidi e fanno precipitare le proteine sull’archi-

tettura. Oltre all’azione fissativa permeabilizzano la cellula all’ingresso dell’anticorpo

ma preservano meno citoarchitettura.

Il metodo scelto si basa sul tipo di antigene.

Dopo la fissazione è possibile effettuare un lavaggio con glicina allo 0,1% in PBS, per

eliminare l’eccesso di reagente che si è visto essere un forte interferente (soprattutto le

aldeidi) con la fluorescenza (riducono l’emissione luminosa).

2. PERMEABILIZZAZIONE – avviene soprattutto se la fissazione è stata effettuata attraverso

l’utilizzo di aldeidi (in particolar modo con p-formaldeide) e prevede l’uso di detergenti

(possibilmente non ionici) che, a seguito di un processo di incubazione, facilita l’ingresso

dell’anticorpo nella cellula. Il processo di permeabilizzazione è necessario se l’antigene si

trova all’interno della cellula; diversamente, se questo si trova esposto sul foglietto es-

terno della membrana plasmatica allora tale processo non è necessario. I detergenti non

ionici più utilizzati sono (di solito) il Triton (X100: 0.02% - 0.2% in PBS), il Tween 20, il

NonidetTM P-40 (NP40) e il Saponin.

Eseguire un lavaggio in PBS.

3. SATURAZIONE DEI SITI ASPECIFICI – esistono delle regioni in cui si addensano determinate

cariche elettriche, regioni che possono essere presenti sulle superfici di ancoraggio delle

cellule. Può essere effettuato un cutting per aumentare l’elettrofilicità del substrato, ma

potrebbero essere presenti ancora dei siti di legame liberi che in qualche modo potrebbe-

ro fare avvenire delle reazioni di legame aspecifici dell’anticorpo. Quello che può essere

fatto per ridurre la presenza di questi siti di legame aspecifici è aggiungere delle proteine

che solitamente sono molto abbondanti nel siero come:

a. BSA (sieroalbumina bovina) al 3% in PBS che satura i siti di legame aspecifici deter-

minati da interazioni di carica elettrica in modo tale che l’anticorpo non si leghi a questi

siti e così facendo venga favorita l’interazione con l’antigene.

b. Siero non immune proveniente dalla stessa specie animale che ha prodotto l'anticorpo

secondario: NGS (normal goat serum) /NRS (normal rabbit serum). Viene saturata una

eventualie aspecificità specie-specifica.

4. INCUBAZIONE CON ANTICORPO PRIMARIO LAVAGGI IN PBS 5. INCUBAZIONE CON ANTICORPO SECONDARIO LAVAGGI IN PBS

128

c. Latte in polvere al 5% in PBS, è molto ricco di proteine che possono svolgere un’azione

saturante nei confronti di questi siti aspecifici.

Eseguire un lavaggio in PBS.

4. INCUBAZIONE CON ANTICORPO PRIMARIO – gli anticorpi primari, solitamente, vengono

diluiti in PBS con la proteina utilizzata per la saturazione dei siti aspecifici, che può essere

BSA 3% oppure latte in polvere al 5%. Tale operazione può avvenire per una o due ore a

temperatura ambiente, oppure per una notte intera a 4°C. La differenza tra le due tempe-

rature di incubazione è dovuta principalmente al tempo; infatti per tempi di incubazione

brevi allora l’anticorpo può essere incubato a temperatura ambiente (o circa 37°C), per

favorire il corretto funzionamento fisiologico dell’anticorpo, mentre per un tempo pro-

lungato la riduzione della temperatura riduce il rischio di avere interazioni aspecifiche

dell’anticorpo che interferirebbero con il legame per l’antigene. In questo step è impor-

tante stabilire quanto anticorpo aggiungere per effettuare la marcatura del campione. Tale

quantità dipende dall’anticorpo stesso, dall’antigene e dal tipo cellulare; ma in ogni caso

va determinata sperimentalmente. Di solito non si lavora mai in eccesso di anticorpo per

due motivi: 1) lavando in eccesso di anticorpo si possono avere reazioni di tipo aspecifico;

e 2) gli anticorpi primari costano veramente tanto (soprattutto se essi sono combinati con

dei fluorocromi).

Figura 40. Struttura di un anticorpo. La regione variabile è quella che riconosce in

maniera specifica l’antigene (diversa da un anticorpo all’altro; la regione costante è

quella che varia a seconda della specie (quella che riconosce l’anticorpo secondario).

Eseguire un lavaggio in PBS.

5. INCUBAZIONE CON ANTICORPO SECONDARIO -

LAVAGGI IN PBS 6. COLORAZIONE DEI NUCLEI LAVAGGI IN PBS

129

Controlli per immunofluorescenza. Quando si effettua un’analisi di immunofluorescenza è molto

importante aggiungere dei controlli per assicurarsi che la fluorescenza osservata sia specifica della

proteina di interesse (o meglio per escludere che ci siano delle interazioni aspecifiche). A tal proposito

viene eseguito un controllo dell’anticorpo secondario (in quanto è quello che può dare maggiore

aspecificità), di solito andando ad omettere l’anticorpo primario dalla reazione di immunofluore-

scenza. Quello che ci sia aspetta è che ne pozzetto di controllo non vi sia alcuna marcatura. Il controllo

di specificità, solitamente, viene effettuato da chi produce l’anticorpo primario. Questo, prima di es-

Gli anticorpi primari possono essere non coniugati oppure direttamente coniugati. Se si

utilizza un anticorpo primario non coniugato allora è necessario utilizzare un anticorpo

secondario coniugato al fluorocromo.

Eseguire un lavaggio in PBS.

5. INCUBAZIONE CON ANTICORPO SECONDARIO - anche l’anticorpo secondario deve essere

aggiunto in buffer che contiene l’agente utilizzato per la saturazione dei siti aspecifici (PBS

con 3% BSA o 5% latte in polvere) per un tempo più corto (1-2 ore perché gli anticorpi

secondari si legano con più facilità rispetto a quelli primari) a temperatura ambiente al

buio (perché nel momento in cui è presente il fluorocromo è necessario impedire che

questo venga eccitato durante l’incubazione – qualora anche l’anticorpo primario fosse

stato coniugato con un fluorocromo, anche in questo caso bisognerebbe effettuare

l’incubazione in assenza di luce). Può essere utilizzato un anticorpo secondario nella sua

integrità legato al fluorocromo, o solamente la parte della molecola che è implicata nel

riconoscimento dell’anticorpo primario.

Eseguire un lavaggio in PBS.

6. COLORAZIONE DEI NUCLEI – molto spesso, terminata l’incubazione con l’anticorpo secon-

dario, viene effettuata la colorazione dei nuclei utilizzando delle molecole fluorescenti che

sono degli intercalanti del DNA. Quelli più utilizzati in gran parte per colorare nuclei e/o

cromosomi sono:

a. DAPI (4',6-Diamidino-2-fenilindolo cloridrato); b. HOECHST (Bis-benzimide); c. PI (ioduro di propidio). I primi due emettono il blu, mentre il PI il rosso. DAPI e PI non sono un grado di permeare le cellule integre, ma necessitano di uno step di permeabilizzazione per essere integrati all’interno della cellula e poi nel nucleo (in questo caso lo step di permeabilizzazione che viene effettuato all’inizio del protocollo di immunofluorescenza – punto 2 – e rimane valido per tutta la sua durata). Eseguire un lavaggio in PBS.

7. MONTAGGIO.

Nota. il PBS è un buffer che abbia un pH più fisiologico possibile. I lavaggi con PBS sono molto importanti perché

consentono di eliminare l’eccesso di qualsiasi reagente introdotto nello step precedente. Molto importanti sono i

lavaggi effettuati dopo l’incubazione con anticorpi, per eliminare l’eventuale presenza di anticorpi non legati. Questo

serve per evitare di ottenere segnali aspecifici.

130

sere messo a contatto con il campione, viene preincubato con l’antigene usato per generarlo con

concentrazione di cento volte maggiore di quella dell’anticorpo. Una volta preincubato, e succes-

sivamente messo a contatto col campione, non deve dare alcuna marcatura. E’ cruciale per capire se

l’anticorpo primario riconosce l’antigene in modo specifico. Spesso si unisce ad un controllo in

Western Blot.

Marcature multiple. Spesso è possibile andare a colorare, all’interno dello stesso campione, più di un

antigene; qualora i fluorocromi utilizzati per la rilevazione (abbinati agli anticorpi) abbiano degli spet-

tri sufficientemente separati (non si devono sovrapporre) per garantire le singole rilevabilità alle

lunghezze d’onda fornite. Le combinazioni più comuni sono quelli che vedono l’utilizzo di coloranti

che si trovano più lontani possibili sullo spettro. Tra questi il DAPI e il PI che, come detto in prece-

denza, emettono rispettivamente il primo nel blu e il secondo nel rosso. Molto spesso è possibile

utilizzare la proteina fluorescente verde con alcune proteine rosse.

40

X

3

2X

B-III tubulin SMI312 DAPI MERGE

Figura 41. Esempio si fluorescenza di motoneuroni ottenuti da cellule IPs differenziate in laboratorio, sul citoscheletro

delle quali sono state colorate due proteine di interesse, la B-III tubulina e la SMI312 (che marca gli assoni).

131

8.6 Applicazioni della fluorescenza

Una delle proteine fluorescenti più utilizzate è la GFP e delle sue varianti. Questa proteina può essere

utilizzata per marcare un’altra proteina e identificarne la localizzazione; il questo il gene che codifica

per la proteina fluorescente verde può essere fuso all’N- o al C-terminale del cDNA che codifica per

la proteina di interesse. E’ possibile utilizzare il GFP per studiare l’attività di un promotore di nostro

interesse, sotto al quale si pone l’espressione della GFP. I livelli di tale proteina fluorescente saranno

indice di quanto il promotore può essere più o meno attivo. Un’altra applicazione può essere quella

di aggiungere alla proteina GFP una sequenza che ne indirizza la localizzazione in un comparti-mento

particolare (nucleo, membrana, mitocondri, ecc.). in questo modo si può colorare in modo selettivo

quel compartimento e, seguendo la fluorescenza, sarà possibile visualizzare la sua localizzazione.

Figura 42. Esempio di espressione condizionale della proteina GFP. A) embrione transgenico, vivo, di drosophila: l’es-

pressione di GFP è stata messa sotto il controllo di un promotore attivo solo in una serie specializzata di neuroni po-

sizionati appena sotto la superficie dell’animale, che consentono di percepire l’ambiente circostante e che fanno contatti

con altri neuroni non fluorescenti e quindi invisibili. B) La fusione di GFP con un promotore che ne induce l’espressione in

modo ubiquitario ha consentito di ottenere una drosophila, transgenica, viva e fluorescente in tutte le sue parti.

Un altro esempio è quello in cui è stata realizzata una proteina di fusione tra la beta-tubulina e la

GFP. Nel momento in cui si fa esprimere questa proteina chimerica all’interno delle cellule si osserva

la fluorescenza a livello dei microtubuli. Quindi è possibile andare a seguire in vivo la dinamica di

assemblaggio dei microtubuli e la successiva suddivisione delle due cellule, semplicemente andando

ad osservare la fluorescenza emessa di colore verse.

Figura 43. La sintesi di beta-tubulina-GFP porta alla formazione di microtubuli fluorescenti che consentono di osservare in diretta e nella cellula vivente la formazione del fuso mitotico.

Inizio dell’osservazione, tempo 00:00. Tempo 3’.40” dall’inizio dell’osservazione Tempo 5’:08” dall’inizio dell’osservazione

132

Esistono una serie di esempi di fluorescenza legati alla biologia cellulare che si sono sviluppati negli

ultimi anni e che sfruttano la presenza di proteine fluorescenti e la possibilità del loro utilizzo per

seguire delle dinamiche in vivo (in cellule non fissate). Una di queste tecniche è il FRET.

FLUORESCENCE (FORSTER) RESONANCE ENERGY TRANSFER (FRET). E’ un processo in cui

viene trasferita dell’energia da una proteina donatrice ad una accettrice. Il FRET avviene solo se vi è

un’interazione fisica tra donatore ed accettore e se la distanza tra le due molecole è inferiore a 10nm

(sufficientemente vicini). Viene utilizzato per studiare l’interazione molecolare proteina – proteina

oppure proteina – substrato. Affinché si possa effettuare un esperimento di FRET all’interno delle

cellule è necessario avere una coppia di fluorocromi in grado di essere eccitati ad una determinata

lunghezza d’onda e capaci di emettere ad un’altra lunghezza d’onda. Uno dei due fluoro-cromi viene

posto sulla molecola di studio, mentre l’altro fluorocromo sulla molecola di cui si vuole capire se

interagisce o meno con la prima. I due fluorocromi, come già detto, devono:

1. essere sufficientemente vicini (b) in maniera tale che avvenga il trasferimento di energia tra

il primo e il secondo.

2. avere delle caratteristiche tali da garantire che l’energia emessa dal primo fluorocromo

corrisponda all’energia necessaria per eccitare il secondo fluorocromo (con una lunghezza

d’onda maggiore del primo). Nella FRET si utilizza un’unica lunghezza d’onda di eccitazione

(quella del primo fluorocromo) e successivamente si va a rilevare solo il segnale emesso dal

secondo fluoro-cromo. La scelta opportuna della coppia accettore-donatore, in modo tale che

lo spettro di emissione della molecola accettore deve essere sovrapposto a quella della

molecola donatore (a). Nel momento in cui viene eccitato il donatore non deve essere

accettato l’accettore (le due lunghezze d’onda devono essere diverse).

3. avere il corretto orientamento (c) che garantisca il passaggio dell’energia da un fluorocromo

all’altro.

C

B

A

Figura 44. Caratteristiche del FRET.

133

Una delle copie accettore-donatore più utilizzate è la coppia FITC (520nm) – TRICH (550 nm), in cui

le due lunghezze d’onda sono molto vicine (spettro in overlap - intersezione).

Applicazioni della FRET. La FRET consente di studiare:

1. Struttura e conformazione delle proteine;

2. Distribuzione spaziale e assemblaggio di proteine;

3. Interazioni recettore / ligando – utilizzado una coppia di fluorocromi posti ciascuno sulle due

molecole che devono interagire, nel momento in cui le due molecole si trovano vicine tra loro

possono frettare.

4. Test immunologici;

5. Struttura e conformazione degli acidi nucleici;

6. Distribuzione e trasporto dei lipidi;

7. Saggi di fusione di membrana;

8. Rilevamento del potenziale di membrana;

9. Saggi fluorogenici della proteasi;

10. Indicatori per AMP ciclico;

11. Attività proteolitica di un determinato enzima – entrambi i fluorocromi vengono posizionati

vicini sulla stessa molecola che deve essere digerita dall’attività proteolitica. All’inizio si ha il

FRET, nel momento in cui agisce la proteasi i fluorocromi verranno separati e si ha una perdita

di FRET.

12. Cambio conformazionale di determinate molecole – i due fluorocromi vengono aggiunti alla

stessa molecola su due domini differenti, che in condizioni (ad esempio) di assenza di sub-

strato, questi si trovano distanti; qualora si abbia un cambiamento conformazionale, i due

fluorocromi vengono a trovarsi vicini e danno origine a FRET.

Tutte queste applicazioni devono essere tali da permettere l’utilizzo di proteine fluorescenti in vivo

(live-cells) attraverso l’utilizzo di un microscopio confocale. Molto spesso per agevolare lo studio di

proteine in vivo, questi microscopi sono equipaggiati con dei sistemi che garantiscono il mantenimen-

to costante della temperatura (37°C) e dei microincubatori che garantiscono la corretta pressione

della CO2 e la corretta umidità del campione (maggiori condizioni fisiologiche possibili).

FLUORESCENCE RECOVERY AFTER PHOTOBLEACHING (FRAP). Per photo-bleaching si intende

la diminuzione della fluorescenza di un campione dovuta alla degradazione del suo fluoroforo

attraverso un processo irreversibile. La FRAP è una tecnica utilizzata per studiare la mobilità proteica

intracellulare:

1. movimento e la diffusione di molecole e proteine (velocità di diffusione)

2. compartimentalizzazione e lo spostamento da un compartimento intracellulare all’altro;

3. velocità di scambio di molecole e proteine tra un compartimento e l’altro;

4. caratteristiche di legame tra due proteine e l’eventuale effetto di mutazioni o molecole sul

legame stesso.

Il fenomeno alla base di questa tecnica è il photobleaching, in cui a seguito di un’intensa illuminazione

di un determinato fluorocromo si assiste ad un danneggiamento irreversibile del fluorocromo (che

non sarà più in grado di ricevere ed emettere energia luminosa – al microscopio tale regione risulta

nera). Viene registrato nel tempo cosa accade in quella specifica regione da un punto di vista di inten-

134

sità di fluorescenza. Proteine dotate di fluorescenza capaci di muoversi all’interno della cellula sono

in grado di veicolare i loro fluorocromi associati anche nelle zone disattivate irreversibilmente a

seguito del photobleachng. Quindi al microscopio, in talune zone che prima si presentavano nere, è

possibile osservare nuovamente fluorescenza dovuta alle proteine di una zona non colpita da photo-

bleaching che sono in grado di muoversi. È possibile determinare la velocità di diffusione attraverso

la quale una proteina è in grado di ricoprire la zona disattivata. Tale velocità è variabile; infatti a

proteina può raggiungere la zona disattivata in poco tempo così come potrebbe raggiungerla in un

tempo molto più lungo, o talvolta può verificarsi che la fluorescenza non venga più ristabilita per via

della sua mobilità che diviene scarsissima o nulla.

Esiste anche una tecnica complementare alla FRAP nota come iFRAP (i, inverted). In questa tecnica si

fa esattamente l’opposto rispetto al FRAP, ovvero viene mantenuta fluorescente la zona di interesse

e, attraverso bleaching, si disattiva tutto il resto. In questo caso quello che si va a fare è misurare la

perdita di fluorescenza in quella regione per diffusione della proteina verso le zone disattivate.

Passaggi per effettuare il FRAP. Sono i seguenti:

1. selezionare la regione in cui deve essere eseguito il bleaching;

2. ottenere delle immagini che misurino l’intensità di fluorescenza prima del bleaching;

3. effettuare una breve illuminazione della zona esposta ad intensità molto elevata, in modo da

distruggere il fluorocromo in quella regione.

4. registrare il recupero di fluorescenza nella regione disattivata.

FLUORESCENCE LOSS IN PHOTOBLEACHING (FLIP). Un’altra tecnica complemen-tare alla FRAP

che viene utilizzata per studiare il movimento di una determinata proteina da un compartimento ad

un altro e le connessioni tra i vari compartimenti. La tecnica FLIP si differenzia da FRAP e iFRAP perché

è caratterizzata da continui photobleaching della stessa regione, prevenendo cosi il recupero di

fluorescenza. Sostanzialmente vengono selezionate due regioni: la prima regione (quella che in fig 46

B viene indicata con il cerchio) è quella sottoposta a bleaching, e la seconda (indicata con il

rettangolo) adiacente alla prima che non è sottoposta a bleaching ma nella quale si registra. La

A B C

Figura 45. Diversa velocità di diffusione della proteina fluorescente. A seguito del fenomeno di bleaching si può avere: A) una proteina

altamente mobile quando l’intensità di fluorescenza va a zero e successivamente in modo rapido l’intensità di fluorescenza recupera e

ritorna ai livelli iniziali; B) proteina mediamente mobile in cui il recupero di fluorescenza è parziale; C) proteina immobile, quindi dopo il

bleaching non si recupera alcuna fluorescenza.

Inte

nsi

tà d

i flu

ore

scen

za

Tempo di recupero

Inte

nsi

tà d

i flu

ore

scen

za

Inte

nsi

tà d

i flu

ore

scen

za

Tempo di recupero Tempo di recupero

135

regione che viene sottoposta a bleaching, viene mantenuta in illuminazione costante ad alta intensità

in modo tale da disattivare eventuali proteine fluorescenti che transitano in quella regione da un’altra

zona fluorescente. Tale operazione riduce drasticamente l’emissione di fluore-scenza nella seconda

regione (rettangolo).

Figura 46. Differenza fra FRAP (A) e FLIP (B).

Passaggi per effettuare il FLIP. Sono i seguenti:

1. selezionare la regione in cui deve essere eseguito il bleaching;

2. ottenere delle immagini che misurino l’intensità di fluorescenza prima del bleaching;

3. effettuare una serie di cicli ripetuti di illuminazione della regione esposta ad intensità molto

elevata, in modo da distruggere il fluorocromo in quella regione.

4. registrare il calo di fluorescenza in una regione diversa da quella disattivata.

FLUORESCENCE LOCALIZATION AFTER PHOTOBLEACHING (FLAP). Questa tecnica, permette la

localizzazione e la tracciatura di sub-popolazioni che si muovono rapidamente ed anche un periodo

di residenza molto breve. Le biomolecole di interesse sono legate a due marcatori fluorescenti, uno

viene localmente “bleachato”, mentre il secondo rimane intatto e viene usato come riferimento.

136

9. SAGGI SULLE COLTURE CELLULARI

Sono diversi i saggi che possono essere applicati alle colture cellulari, in particolar modo, per determi-

narne la vitalità o la mortalità. Questi saggi possono essere molto utili per studiare la tossicità di un

determinato composto. Altri studi possono riguardare le colture tumorali al fine di andare a monito-

rare dei parametri molto importanti (migrazione, invasione, adesione e la proliferazione cellulare)

per la crescita e lo sviluppo di un tumore, e soprattutto per osservare come un determinato composto

riesce a contrastare tali parametri.

9.1 Saggi di vitalità cellulare

Una serie di test molto importanti sono quelli che consentono di andare a valutare la vitalità di una

coltura cellulare. Questi test sfruttano sostanzialmente tre caratteristiche delle cellule:

1. integrità della membrana;

2. potenziale REDOX;

3. funzionalità mitocondriale.

① INTEGRITA’ DELLA MEMBRANA. I saggi più utilizzati per valutare la vitalità cellulare sono

quelli che sfruttano l‘integrità della membrana, poiché questa è una delle prime strutture che va

incontro a modificazioni nel momento in cui la cellula va incontro a morte necrotica o apoptotica.

Infatti, durante il processo apopotico la membrana cambia la sua permeabilità e la sua composizione

(uno dei primi segnali è rappresentato dall’esposizione della fosfatidilserina sul versante esterno –

che normalmente si trova sul foglietto interno della membrana plasmatica). Uno dei coloranti più

utilizzati in questi saggi è il (1) trypan blue, il quale è in grado di colorare selettivamente le cellule

morte per via della sua scarsa permeabilità all’interno di cellule vive con membrana integra; nel

momento in cui le cellule vanno incontro a morte, cambiando la permeabilità cellulare, ciò rende più

facile anche la permeazione di tale colorante all’interno della cellula (osservabili al microscopio

ottico). Se, attraverso questo colorante, si vanno a contare le cellule vive (rifrangenti) quello che si

esegue è il metodo di esclusione (test di vitalità); mentre la conta delle cellule colorate in blu

determinerà un test sulla mortalità. Prima del test però è necessario fare una conta del numero totale

di cellule e, successiva-mente, bisogna fare il rapporto tra le cellule vive (quelle non colorate sul

totale) e quelle morte (quelle colorate sul totale). Un altro saggio atto a determinare la vitalità

cellulare è quello che utilizza la (2) calceina acetossimetile, un derivato della calceina modificato al

fine di andare ad aumenta-re la sua idrofobicità. La calceina normalmente è molto idrofilica e non è

in grado di attraversare la membrana plasmatica; inoltre in presenza di ioni calcio, questa è in grado

di emettere fluorescenza verde. L’aggiunta del gruppo acetossimetile maschera i siti di legame per il

calcio e quindi, a differenza della calceina, questo composto non è fluorescente. L’aggiunta del com-

posto alla coltura cellulare permette di osservare un comportamento in cui, solamente nelle cellule

vive, saranno presenti degli enzimi (esterasi) in grado di rimuovere il gruppo acetossimetile e portare

la calceina ottenuta a fluorescenza per contatto con gli ioni calcio fisiologicamente presenti in am-

biente cellulare. Per la proprietà sopra elencata, la calceina rimarrà contenuta all’interno della cellula

viva con membrana integra (per via della sua idrofilicità). Un altro test effettuabile sulla permeabilità

137

della membrana riguarda l’uso di una sostanza nota come (3) ioduro di propidio (IP). È un agente

fluorescente e intercalante, in grado di permeare la membrana delle cellule morte (che si presenta

lassa). Dopo aver trattato la coltura con un agente tossico come il perossido di idrogeno che ne causa

la morte delle cellule, lo ioduro di propidio permea all’interno e va a legarsi agli acidi nucleici. Attra-

verso un citofluorimetro è possibile andare ad osservare la fluorescenza (di colore rosso) delle cellule

morte (test di mortalità rapido). I saggi (2) e (3) possono essere eseguiti in combinazione così che da

osservare all’interno dello stesso campione le cellule vive e le cellule morte. Esistono altri coloranti

specifici che servono per colorare le cellule morte e che funzionano come l’IP, con la differenza che

questi non risultano tossici (l’IP è tossico e necessita l’utilizzo di guanti e va maneggiato sotto cappa

chimica). Un altro saggio che può essere utilizzato è quello che prevede il rilascio dell’enzima

citosolico (4) glucosio-6-fosfato deidrogenasi. È l’enzima responsabile della conversione del glucosio

6-fosfato in 6-fosfo-gluconalappone con produzione di NADPH nella via dei pentosi fosfati. Il saggio è

un test di mortalità perché normalmente l’enzima si trova all’interno del citosol però, quando la

cellula muore l’enzima viene rilasciato nel terreno di crescita. Il test prevede l’accoppiamento di due

reazioni diverse: una è quella normalmente sfruttata dall’enzima glucosio-6-fosfato deidrogenasi, e

la seconda reazione sfrutta il NADPH prodotto dalla prima reazione per convertire un composto noto

come risazzurrina in resorufina, la quale diviene fluorescente a contatto con un enzima specifico (dia-

forasi). Lo svolgimento del test prevede che venga prelevata un’aliquota del terreno di crescita delle

cellule e lo si mette a contatto con i reagenti necessari per fare avvenire la reazione. In particolare il

terreno di crescita verrà messo a contatto con una soluzione contenente glucosio-6-fosfato, NADP+,

resazurina e l’enzima diaforasi. Qualora sia presente la glucosio-6-fosfato deidrogenasi si ottiene la

reazione descritta in precedenza. Alla fine della reazione sarà possibile misurare la fluorescenza del

campione analizzato, direttamente proporzionale alla quantità di resorufina prodotta, a sua volta

direttamente proporzionale alla quantità di NADPH prodotto e dalla presenza di glucosio-6-fosfato

deidrogenasi che era presente nel terreno e che corrisponde alla quantità di cellule morte presenti

nel campione. Un saggio simile a questo è quello che si basa sul rilascio della (5) lattato deidrogenasi,

anch’esso un enzima citosolico. Le cellule danneggiate o morte rilasciano la lattato deidrogenasi nel

medium di coltura; questo utilizza una reazione che prevede l’utilizzo del cofattore NAD+, il quale

viene convertito in NADH in presenza del substrato (lattato). La reazione viene nuovamente accoppia-

ta con quella ottenuta dalla diaforasi utilizzando questa volta un reagente diverso, un sale di tetra-

zolio, si ottiene la formazione di un prodotto noto come formanzano, che a differenza della resorfina

non è fluorescente ma dà una colorazione blu-violetto. In questo caso non verrà misurata la fluore-

scenza, ma bensì l’assorbanza che è direttamente proporzionale alla quantità di NADH liberata, e

quindi alla quantità di lattato deidrogenasi presente nel medium a cui è attribuita la quantità di cellule

morte (test di mortalità).

② POTENZIALE REDOX. Un test che si basa sul potenziale REDOX, ovvero sull’attività

metabolica della cellula è un test che prende il nome di (1) alamaro blu, è un test sulla vitalità cellulare

che utilizza i composti visti in precedenza, ovvero risazzurrina e resorufina utilizzati non in fluorescenza

ma in assorbanza (perché la risazzurrina oltre ad essere poco fluorescente è un composto blu, mentre

la resorufina oltre che ad essere un composto fluorescente è di colore rosa). Questo saggio sfrutta il

fatto che mettendo a contatto la risazzurrina con le cellule vive in coltura, questa verrà veicolata

all’interno delle cellule dove verrà convertita in resorufina. La conversione è tanto maggiore quanto

138

più le cellule saranno metabolicamente attive. Un altro test molto simile e maggiormente utilizzato,

basato sull’attività metabolica delle cellule è un (2) saggio di tipo colorimetrico con MTT che sfrutta

la capacità degli enzimi mitocondriali (deidrogenasi) di rompere l’anello tetrazolico di una molecola

di MTT (sale tetrazolico solubile di colore giallo che è capace di permeare all’interno delle cellule). Le

cellule vengono incubate a 37°C per un tempo pari a 30 min. Nel momento in cui questo sale viene

convertito dalle deidrogenasi forma un sale (formanzano) che precipita in forma non più solubile e

dona un colorito blu-violetto alle cellule (si tratta di osservare l’assorbanza a 490-500 nm). Per poter

calcolare l’assorbanza le cellule devono essere lisate per aggiunta di isopropanolo e il formanzano

deve essere solubilizzato per avere una colorazione uniforme al fine di consentire una corretta let-

tura. La quantità di formanzano prodotta dipende dal numero di cellule vive in coltura. Esistono diver-

si Sali di tetrazolio che possono essere ridotti da deidrogenasi e da reduttasi a diversi a diversi

formanzani che possono adsorbire a diverse lunghezze d’onda (ad esempio MTS ha una colorazione

che vira di più sull’arancio).

③ FUNZIONALITA’ MITOCONDRIALE. Questi test sfruttano la quantità indiretta di ATP

prodotta dai mitocondri. Un saggio che può essere utilizzato è quello che si basa sulla luminescenza

emessa dal campione, sfruttando l’enzima (1) luciferasi. Tale enzima è in grado di ossidare in presenza

di ATP un composto noto come luciferina ad ossiluciferina, attraverso l’emissione di una radiazione

luminosa misurabile. Maggiore sarà il contenuto di ATP, altrettanto maggiore sarà la quantità di luce

emessa.

9.2 Tecniche per lo studio della genesi tumorale.

Le tecniche per lo studio della tumoregnesi si basano sul comprendere parametri importanti come

migrazione, invasione, adesione e proliferazione cellulare.

Con cancro, si definisce la crescita anormale di un tessuto in cui le cellule tendono a dividersi in

maniera incontrollata e autonoma. Queste divisioni incontrollate portano all’aumento della massa

cellulare in quel determinato punto. Alla massa risultante viene attribuita la definizione di tumore. La

tumoregenesi è un processo che può avvenire spontaneamente e di solito è un processo multi-step,

caratterizzato dall’avvenimento di più di una mutazione a livello di geni che solitamente codificano

per proteine regolatorie del ciclo cellulare. Difficilmente una singola mutazione è sufficiente ad indur-

re a tumoregenesi, ma conferisce un vantaggio qualora vengano ad instaurarsi processi che portano

a mutazioni secondarie all’interno delle stesse cellule.

Genesi del tumore. In laboratorio è possibile andare a studiare tutte le fasi di progressione di

un tumore a partire dallo sviluppo iniziale. Le fasi successive sono importanti invece, perché

permettono di capire gli stadi di metastatizzazione che permettono di trasformare un tumore

primario ad uno secondario. Il processo prevede diversi step tra cui l’invasione da parte delle cellule

tumorali dello stroma, e quindi, il contatto con i vasi sanguigni porta inizialmente alla formazione di

neo-vascolarizzazioni nella zona di sviluppo del tumore (perché gli ammassi di cellule sovrapposti

necessitano di nutrienti). Con il passare del tempo, le cellule tumorali sono in grado di infiltrarsi anche

all’interno del vaso e migrare da un sito primario ad uno secondario. Una volta raggiunto il nuovo

sito, a seconda che abbiano o meno capacità di adesione, possono aderire al vaso e nuovamente

attraversarlo per andare a generare un’altra massa tumorale secondaria. Il processo di metastatizza-

139

zione prevede che la cellula tumorale inizi a staccarsi da quelle vicine con perdita delle giunzioni

cellula-cellula. Successivamente la cellula che si è staccata va ad aderire il più possibile alla matrice

extracellulare allo scopo di degradarla per poterla attraversare per raggiungere il vaso. Il processo di

degradazione della matrice avviene grazie al rilascio di enzimi proteolitici che ne degradano le pro-

teine (in particolar le metallo-proteasi). Una volta liberatasi della matrice, la cellula tumorale è libera

di migrare, obbligata però da un cambio morfologico che fa assumere a questa una maggiore motilità

e una maggiore polarità. Successivamente si assiste ad un completo riarrangiamento del suo cito-

scheletro. La migrazione è un processo che necessita della degradazione della matrice, della polariz-

zazione della cellula e della presenza di segnali che guidano l’iniziale polarizzazione e il suo sposta-

mento. In particolar modo la polarizzazione può essere guidata da segnali di “via” e di “stop”. La

migrazione può avvenire di solito seguendo degli stimoli fisici o chimici; nello specifico si possono

avere due tipi di movimento guidati da un gradiente di concentrazione:

1. chemotassi, che è un movimento che si osserva in direzioni di un gradiente di concentrazione

di un mezzo chimico o fisico che può diffondere;

2. aptotassi, che è un movimento che si osserva in direzioni di un gradiente di concentrazione

di un mezzo (proteina della matrice extracellulare, oppure un recettore che viene espresso

sulla superficie di altre cellule) che non è in grado diffondere.

Entrambi questi fenomeni possono essere studiati e riprodotti in laboratorio. In laboratorio può

essere riprodotta la cosiddetta metastasi sperimentale, in modo tale da poter suddividere tale pro-

cesso nelle varie fasi che lo compongono (migrazione, adesione e infiltrazione) in modo tale da poter

studiare tutti i diversi momenti dell’invasione metastatica, modificare anche uno solo di questi

momenti per poter studiare un composto anti-metastatico.

Saggi di metastasi sperimentale. Possono essere adoperati diversi saggi. Ad esempio la

migrazione può essere studiata attraverso un saggio che prende il nome di (1) camera di Boyden, che

a livello sperimentale consente di studiare i passaggi di adesione, il rilascio delle metallo-proteasi e il

processo di invasione. Permette di valutare il potere metastatico di una linea tumorale. L’utilizzo della

camera di Boyden prevede diversi step:

1. partire da una coltura cellulare trattata con la molecola di interesse della quale si vuole studia-

re la capacità di andare ad interferire o meno con il processo di migrazione;

2. incubare per il tempo necessario;

3. raccogliere le cellule (sospensione cellulare) dopo avere effettuato il trattamento;

4. andare a seminare le cellule all’interno della camera di Boyden;

5. dopo il test contare le cellule che sono state in grado di migrare.

La camera di Boyden è una cameretta molto piccola che ha una dimensione di circa 10 cm. E’

composta da una parte superiore in cui sono presenti dei pozzetti che con-sentono di seminare le

cellule; una parte inferiore in cui sono presenti altri pozzetti per aggiungere eventuale terreno di

crescita (anche con l’aggiunta ad esempio di agenti che favoriscono /sfavoriscono la migrazione) per

poter testare composti diversi creando un gradiente chemotattico per la migrazione. L’incubazione

della camera di Boyden a 37°C per un tempo necessario a far avvenire la migrazione cellulare. La

membrana di policarbonato può essere attraversata qualora queste cellule abbiano un potere

migratorio (si ritrovano sulla faccia inferiore della membrana). Terminato il tempo di incubazione si

utilizza una spatola per poter rimuovere tutte le cellule presenti nella parte superiore, suc-

140

cessivamente si andrà a colorare la membrana di policarbonato utilizzando un colorante capace di

permeare all’interno delle cellule e si procede alla conta (attraverso il microscopio) delle cellule

presenti sulla faccia inferiore della membrana. La conta rappresenterà il numero delle cellule che

hanno migrato. Attraverso il composto che si addiziona al terreno di coltura è possibile testare in

parallelo la capacità migratoria cellulare che questo composto ha di indurre o inibire la migrazione

stessa, sarà paragonata con delle condizioni attese. Un altro test che può essere effettuato per

studiare la capacità invasiva è il (2) test della camera invasione in matrigel, che prevede un trat-

tamento della coltura cellulare con la molecola di interesse per vedere se blocca o favorisce la

migrazione; al seguito del quale si raccolgono le cellule per seminarle all’interno del matrigel. Si

procede con la conta delle cellule che sono in grado di degradare tale matrice e che sono in grado di

fuoriuscire. La camera di invasione è molto semplice e, anche in questo caso, la coltura cellulare viene

trattata con il composto di interesse. Nel momento in cui si deve fare l’esperimento le cellule vanno

staccate e seminate all’interno della camera di invasione. Si può distinguere un sistema a doppia

camera in cui nella parte inferiore viene depositato il matrigel, mentre la parte superiore accoglie la

semina delle cellule in apposito terreno (nel quale è possibile addizionare un agente capace di

attrarre le cellule). Si lascia incubare per il tempo necessario e dopo di che si effettua una colorazione.

Quello che si può osservare, attraverso la conta, sono quelle cellule che sono state in grado di

degradare il matrigel e spostarsi nella parte inferiore. Un altro test che è utile per studiare l’invasione

è il (3) test degli aggregati di matrigel. Si prepara una sospensione di matrigel al quale vengono

direttamente addizionate le cellule. Successivamente si seminano delle gocce di cellule su un vetrino.

È necessario incubare per il tempo necessario; al termine del quale, l’osservazione al microscopio

permette di rilevare diverse situazioni. Una di queste è la formazione di un aggregato compatto di

cellule (che sono rimaste tutte all’interno della goccia e quindi questo le caratterizza per una ridotta

capacità migratoria), oppure un insieme di cellule disseminate (che sono uscite dalla goccia e quindi

presuppone un’elevata capacità migratoria). (4) Il test di elisione cellulare consente invece di stabilire

la capacità di una determinata cultura cellulare tumorale di aderire su un determinato substrato. Si

utilizza una piastra non opportunamente trattata per colture cellulari (sulla quale, normalmente, le

cellule hanno poca capacità adesiva). Sui pozzetti è possibile effettuare un pre-trattamento con vari

composti capaci di aumentare o meno la capacità adesiva delle cellule. Dopo aver effettuato la

semina è necessario mantenere il paragone tra le cellule seminate su un pozzetto trattato con siero,

quelle non trattate (senza il composto X), altre cellule seminate su siero (a parità di rivestimento della

piastra). Le cellule trattate con il composto X sono quelle da tenere in considerazione, che però

devono essere paragonate alle altre due semine per avere risultati attendibili. Al termine dell’incu-

bazione si aspirano le cellule che non sono aderite e si colorano con ematossilina ed eosina quelle

adese al pozzetto. Una volta effettuata la colorazione viene letta l’assorbanza che sarà tanto mag-

giore quanto più cellule adese sono presenti sulla superficie del pozzetto. Il paragone darà un’idea

della capacità del composto X di favorire o sfavorire l’adesione cellulare, al fine di comprendere se

tale composto può essere oggetto di studio come antitumorale.

141

10. La Citofluorimetria

La citofluorimetria (CFM) è una tecnica che consente la misurazione e la caratterizzazione di cellule

sospese in un mezzo fluido. Questa tecnica permette l’analisi di proprietà fisiche o biochimiche

multiple di una singola cellula. Le cellule devono essere trasportate in un flusso laminare fino ad un

punto di in-tersezione in cui verranno eccitate da una sorgente luminosa (laser). L’aspetto

interessante di questa tecnica è quello che la citofluorimetria permette di misurare e di analizzare

un’elevata quantità di eventi (cellule) in tempi brevi; più la velocità di analisi è elevata più è possibile

ottenere dati sulla sospensione cellulare in esame. La citometria a flusso è una tecnologia che misura

simultaneamente e quindi analizza più caratteristiche fisiche di singole particelle, di solito le cellule,

poiché scorrono in un flusso fluido attraverso un raggio di luce. Le proprietà misurate includono la

dimensione relativa di una particella, granularità relativa o complessità interna e relativa intensità di

fluorescenza. Queste caratteristiche sono determinate utilizzando un sistema di accoppiamento

ottico-elettronico che registra come il la cellula o la particella disperde la luce laser incidente ed

emette fluorescenza. La comparsa della citofluorimetria a flusso (CFM) avviene intorno agli anni ‘70,

determinando un veloce ed intenso sviluppo delle tecniche istologiche e citochimiche. Inizialmente

era limitata alla misura di 1-2 parametri: uno per le misure fisiche e l’altro per la fluorescenza. La CFM

portò grande impulso allo studio del sistema immunitario, grazie all’utilizzo di anticorpi monoclonali

marcati con fluore-sceina (FITC). La grande complessità del sistema immunitario e la presenza di

diverse sub-popolazioni stimolarono:

• lo sviluppo di anticorpo monoclonali (MoAb) sempre più specifici;

• la ricerca di nuovi coloranti fluorescenti da coniugare agli anticorpi;

• la creazione di citofluorimetri a flusso multiparametrici.

Anche gli strumenti hanno subito un enorme sviluppo nel corso del tempo avvicinandosi sempre di

più alle varie esigenze di laboratorio e dell’operatore, tant’è che oggi questi non vengono utilizzati

solamente nel campo dell’immunologia ma anche per altre metodiche.

10.1 Citofluorimetro

I citofluorimetri sono costituiti da tre componenti principali.

1. la fluidica:

Il sistema della fluidica trasporta le particelle in un flusso fino al punto in cui queste vengono

colpite ed eccitate con il raggio laser;

2. l’ottica:

Il sistema ottico è costituito da laser per illuminare le particelle nel flusso del campione e tutto

il sistema di filtri ottici per dirigere i segnali luminosi di risultato ai rilevatori appropriati (tale

sistema è in grado di selezionare le lunghezze d’onda dei fluorofori utilizzati per marcare le

cellule in analisi per poi successivamente indirizzarle ai detectors);

3. e l’elettronca:

Il sistema elettronico converte la luce rilevata in segnali elettronici che possono essere

elaborati dal computer. Un parametro che non sempre è presente nei citofluorimetri corri-

142

sponde a quello che è l’equipaggiamento di un sistema di selezione (sorting) degli eventi che

si stanno analizzando che permette di collezionare le cellule, alla fine di tutti i passaggi, in

contenitori appositi e successivamente recuperarle per una futura analisi. In questo caso

l’elettronica svolge un grosso ruolo poiché necessaria per deviare il flusso di ogni singola

particella e indirizzarlo verso il sistema di collezionamento.

Il sistema della fluidica è un sistema centrale del citofluorimetro ed è quello che permette di tras-

portare il campione sino al punto di interrogazione in cui verrà colpito dal laser. Questo sistema è

costituito dal liquido, che è tipico per ogni macchina, ma che di fatto costituisce un tampone salino.

All’interno di questo flusso viene inserito il campione di interesse e attraverso l’effetto di Bernoulli

(fig 47) il campione viene centrato. Questo consente il generarsi di un flusso in cui le particelle

vengono a disporsi in “fila indiana”. Il processo prende il nome di focalizzazione idrodinamica. In

condizioni ottimali viene a formarsi un flusso laminare in cui il mescolamento tra il fluido centrale

(campione) e il fluido presente nel citofluorimetro è assente

Figura 47. La focalizzazione idrodinamica produce un unico flusso di particelle.

Per quanto riguarda l’ottica e i sistemi di detection, la sorgente luminosa è quasi sempre un laser; ma

di fatto per la detection viene utilizzata a fluorescenza emessa in seguito all’eccitazione (con il laser

ad una specifica lunghezza d’onda) di fluorofori presenti all’interno delle cellule. Il citofluorimetro è

in grado di misurare la fluorescenza emessa. I parametri che vengono comunemente utilizzati per

definire la popolazione cellulare in analisi sono due:

1. il forward scatter (FSC) channel, rappresentato dalla luce rilevata da un detector presente sul

lato opposto rispetto alla sorgente laser che è in grado di eccitare le cellule; questo parametro

fornisce informazioni in merito alle dimensioni dell’oggetto che si sta osservando.

2. Il side scattering (SSC) channel, è la misura della luce che diffonde e che viene deviata dall’og-

getto che colpito dal laser, rilevata da un detector posto con un angolo di 90° risetto al laser.

Tutte le fluorescenze che si andranno ad esaminare verranno analizzate con un angolo di

incidenza di 90°C. L’SSC indica quanto la cellula è complessa al suo interno; ogni ostacolo

143

(organello) incontrato al suo interno dal laser determina una deviazione della luce rispetto

alla luce incidente e questa verrà poi captata su un angolo di 90°.

Figura 48. Parametri di detection.

La fluorescenza è quello che ci permette di misurare e di analizzare il campione. È possibile utilizzare

degli anticorpi coniugati con molecole fluorescenti che vanno ad attaccarsi a specifiche proteine

all’interno delle cellule in indagine. Già la misura di parametri di fluorescenza a diverse lunghezze

d’onda in un campione senza marcatura con anticorpi fluorescenti permette di definire una certa

popolazione cellulare. Infatti, alcuni recettori di membrana piuttosto che molecole presenti all’in-

terno delle nostre cellule sono di per sé fluorescenti; quindi è possibile osservare le cellule anche in

assenza si anticorpi fluorescenti e vedere come queste si distribuiscono per capacità di eccitarsi.

Dunque, è possibile definire una sottopopolazione del campione cellulare anche senza nessun tipo di

marcatura. La specificità della misura della fluorescenza di eccitazione è controllata da filtri ottici che,

messi in sequenza, determinano quale lunghezza d’onda si sta osservando. La figura 49 descrive lo

schema di un citofluorimetro moderno. Si può osservare la sorgente luminosa di eccitazione, il FSC

(Forwad Scatter Channel), una serie di lenti, un pinhole e un detector. Andando sul percorso ottico

del SCC (Side Scatter Channel) è possibile osservare una serie di lenti che focalizzano la fluorescenza

che viene emessa a 90°, un pinhole che elimina quelle frequenze luminose non di interesse; e dopo

di che, grazie ai filtri e ad un percorso ottico preciso è possibile far giungere le lunghezze d’onda a

differenti detectors (es. la luce blu viene deviata verso un detector come la luce gialla piuttosto che

un altro). L’utilizzo di filtri che permettono il passaggio di alcune lunghezze d’onda, esattamente come

avviene nella microscopia a fluorescenza ci permette di separare la luce emessa e analizzare i singoli

parametri della cellula di interesse.

Incident Light Source

144

Figura 49. Schema di un citofluorimetro moderno. A sinistra in basso è possibile osservare tre sorgenti laser diretti verso un singolo

punto rappresentato dalla zona dove si allineano le cellule all’interno del flusso con focalizzazione idrodinamica, e il gruppo ottico di

filtri che permettono la detection e la conversione nel sistema elettronico dei segnali emessi.

145

Figura 50. Laser a diverse lunghezze d'onda.

I laser utilizzati sono quelli a diverse lunghezze d’onda (come quelli descritti in fig.50). I laser va ad

eccitare tutto ciò che ha un’emissione con una lunghezza d’onda maggiore. Per cui, se si va ad eccita-

re il campione ad esempio con un laser giallo, tutto ciò che viene eccitato dal laser blu e ultravioletto

non può essere di conseguenza eccitato.

Laser (nm) Filtro di collezione Nome parametro Fluorocromi

488

530/30 BL1 FITC, Alexa Fluor 488, GFP, CFSE

585/40 BL2 PE, PI

615/24 BL3 PI, PE-Texas-Red, PE-Alexa Fluor 610

675/30 BL4 PerCP, PerCP-Cy 5.5, PE-Cy 5, 7-ADD

780/60 BL5 PE-Cy 7

640 670/30 RL1 APC, Alexa Fluor 647

680/60 RL2 APC-Cy 7, Alexa Fluor 700

405

445/45 VL1 Pacific blue, Brillant Violet 421, DAPI

530/30 VL2 AmCyan, Brilliant Violet 510

585/40 VL3 Pacific orange, Brilliant Violet 570

615/24 VL4 Qdot 605, Brilliant Violet 605

675/30 VL5 Qdot 655, Brilliant Violet 650

780/60 VL6 Qdot 800, Brilliant Violet 785

146

Ogni cellula, o particella, che arriva al punto di interrogazione viene eccitata con uno dei tre laser in

successione ed emette della fluorescenza. Tale fluorescenza, lungo tutto il percorso ottico, viene col-

lezionata dai fotomoltiplicatori dei detector e determina un evento, caratterizzato dai seguenti

parametri quali l’altezza del segnale, la larghezza del segnale (ovvero la sua presenza nel tempo) e

l’area. L’evento viene successivamente analizzato attraverso software specifici che permettono di

interpretare i dati del citofluorimetro. Nel nostro campione, però, non sono presenti solo cellule ma

bensì anche detriti cellulari, oppure altre particelle molto piccole che possono falsificare il risultato

dell’analisi. Per cui, a tale scopo, il software imposta un threshold, ovvero una soglia variabile stabilita

dall’operatore e che permette di selezionare soltanto gli eventi che superano tale soglia. Per cui alcuni

eventi verranno ignorati ed altri processati.

Quando gli impulsi vengono generati, la loro quantificazione è necessaria per i segnali di fluorescenza

essere visualizzati su grafici, analizzati e interpretati. La corrente analogica dal PMT è prima digita-

lizzata o suddiviso in fette molto piccole dal convertitore analogico-digitale (ADC). Questo processo

è chiamato "campionamento", e permette di capire quali eventi verranno collezionati e quali ignorati.

Durante tutto il processo di campionamento, le cellule (o le particelle) passano al setaccio davanti al

punto di interrogazione, dove vengono generati dei segnali che verranno collezionati o rigettati. Pr

ogni evento che viene collezionati, i dati vengono visualizzati su una serie di istogrammi e quello che

verrà visualizzato saranno i parametri singoli (area, altezza e larghezza) per ogni singolo evento. A

seconda di come si decide di visualizzare le diverse grandezze (fluorescenze) si ottiene una distribu-

zione di tali eventi su un grafico.

Larghezza

altezza

tempo

Foto

corr

ente

Area soglia

IGNORATO

PROCESSATO

Figura 51. Processamento degli eventi citofluorimetrici.

147

Figura 52. Grafici in cui il SSC si trova sull'asse delle y e il FSC sull'asse delle x. I

software sono in grado di presentare i dati in modo molto differente. Il grafico A

è ti tipo lineare e si può notale che gli eventi sono concentrati sull’estremo

margine sinistro in basso del grafico e questo non permette di distinguere bene

le popolazioni. Allo stesso modo è possibile utilizzare l’intensità di fluorescenza

del SSC e del FSC su scala logaritmica, attraverso cui è possibile distinguere ben

quattro popolazioni differenti per dimensione e per complessità (D).

I dati possono essere rappresentati come dot-plot neri oppure attraverso linee in cui gli eventi sono

rappresentati dall’infittimento di tali linee. Altri esempi sono quelli forniti dai density-plot colorati

dove varia il colore dell’evento in funzione di quanti eventi ci sono in quel singolo punto (che hanno

le stesse caratteristiche). Ovviamente più gli eventi si concentrano in quella regione più questi

assumono il colore rosso. Una considerazione importante quando si eseguono studi sulla fluore-

scenza multicolore è la possibilità di sovrapposizione spettrale tra fluorofori. Perché i fluorofori

utilizzati nella citometria a flusso emettono fotoni di più energie e lunghezze d'onda, un metodo

matematico chiamato la compensazione è stata sviluppata per affrontare la misurazione dei fotoni di

uno fluoroforo in più rivelatori. A causa della natura delle misurazioni mediante citometria a flusso,

l'emissione di particelle viene misurata non in un singolo rivelatore, ma in tutti i rivelatori utilizzati

nell'esperimento. Questo è utile perché il segnale del verde, ad esempio (fig.53), non è solamente

collezionato dal filtro 525/50 ma può essere anche raccolto dal filtro 585/40 che è un filtro che

normalmente viene utilizzato nel rosso, per cui quando viene emessa la frequenza sul verde verrà

emessa anche una piccola quota che riflette sul rosso.

A B

C D

148

Figura 53. Studi multicolore.

Altri esempi in fig.54, rappresentano il modo i dati correlati alle popolazioni potrebbero essere mal

interpretati per via di un segnale rosso che non esiste e come questo può essere corretto con delle

compensazioni. È possibile visualizzare una “scodata” del segnale, in cui queste cellule aumentano di

segnale rosso anche in assenza di segnale verde; nella distribuzione compensata viene sottratta la

quota di segnale verde che viene visualizzato come segnale rosso.

Figura 54. Come si può applicare la compensazione a un campione colorato con anticorpi coniugati a FITC.

A B C

D E F

149

Per fare questo, si utilizzano delle tabelle di compensazione (fig. 55).

10.2 Analisi dei dati

L’analisi dei dati viene fatta analizzando delle popolazioni e andando a contare le cellule che pre-

sentano determinate caratteristiche. Questo viene effettuato rappresentando i dati ottenuti in

istogrammi che rappresentano delle conte e dei valori di intensità. Attraverso l’utilizzo di campioni

negativi e degli opportuni controlli è possibile discriminare le cellule positive o negative. Quindi, è

possibile raggruppare tutte le cellule con una comune caratteristica. Nell’isto-gramma (a parametro

singolo) rappresentato in figura 56 è possibile valutare quante sono le cellule positive alla marcatura

con l’anticorpo CD3 attraverso un gate di riconoscimento (A). L’utilizzo di un controllo di cellule che

non sono state marcate con l’anticorpo CD3, rappresenta il controllo negativo (B) in cui viene

impostato un gate dato dall’intervallo di fluorescenza da 0 fino a 102. Si osserva che nella popolazione

di cellule in studio, il 6!% di queste esprime il recettore CD3 (cellule CD3 positive).

Figura 56. Istogrammi a parametro singolo. A. Cellule all'interno del gate linfocitario sono rappresentati in

un istogramma per valutare l'espressione relativa di CD3. B. La sovrapposizione di una popolazione di

controllo sulla popolazione colorata consente una facile identificazione delle cellule positive.

FITC PE PeCP-Cy5-5

FITC 100 22 1

PE 0,5 100 0,6

PeCP-Cy5-5 0 0 100

Figura 55. Tabelle di compensazione.

Quanto gli altri si riversano

nel FITC (verde)

Quanto il FITC (verde) si

riversa sugli altri.

A B

150

Il caso appena descritto rappresenta un parametro singolo in analisi. Come detto in precedenza, la citoflu-

orimetria è in grado di analizzare più parametri, quindi più fluorescenze nello stesso tempo (ci sono

citofluorimetri che arrivano ad analizzare anche 19 fluorescenze contemporaneamente). Nel caso di fluore-

scenze multiple l’analisi può essere davvero complessa, per cui si ricorre a grafici che sono in grado di analiz-

zare non più di due parametri per volta. Nel caso in figura 57, viene selezionata una popolazione di cellule

(A) i cui successivamente si è valutata la presenza del recettore per il CD19 o per il CD3 (B). E’ possibile

impostare un nuovo sistema di assi cartesiani o gate (C) per distinguere tutte quelle cellule che esprimono

solo il CD19, o solo il CD3, quelle cellule che li esprimo entrambi e quelle che non esprimono nessuno dei

due. Attraverso questi grafici è possibile determinare in che percentuale di cellule esprimono contempo-

raneamente questi due marcatori.

Figura 57. Grafico della densità a due parametri (fluorescenza a due colori). Il sangue intero lisato di globuli

rossi è stato colorato con CD3 A647 e CD19 PE. Le popolazioni relative sono state determinate utilizzando diversi

metodi di gating.

Ovviamente l’analisi può essere fatta a step successivi attraverso l’utilizzo di insiemi (ovvero un raggrup-

pamento di eventi) che hanno caratteristiche comuni di dimensioni, complessità o fluorescenza. Quindi è

possibile andare ad effettuare analisi successive su sottocategorie cellulari. Molto spesso questo è quello che

viene fatto nell’analisi delle cellule del sistema immunitario (fig.58), per cui quello che si osserva è la presenza

di diverse popolazioni che si caratterizzano per dimensione e complessità; ma allo stesso modo è possibile

andare a fare un’analisi della stessa popolazione cellulare introducendo un marcatore per il CD45 che serve

a visualizzare le popolazioni di monociti, granulociti e linfociti. Attraverso un gating su una di queste popola-

zioni è possibile andare a vedere ulteriori sottopopolazioni all’interno di queste cellule che, all’apparenza

sono tutte CD45 positive. L’analisi dei dati permette, attraverso gate o regioni, di andare ad identificare

determinate sotto-popolazioni e quindi, ad esempio, identificare cellule CD3 positive e stabilire quali

sono le CD4 o le CD8 positive all’interno della stessa popolazione cellulare. Questa analisi è valida

anche per i marcatori CD46 e CD28. È possibile identificare, successivamente, quali sono le cellule

effettrici della memoria e quelle T-naive (fig. 59). Queste tecniche sono molto importanti per le

cellule del sistema immunitario; anche se, oggi vengono utilizzate anche per altre applicazioni.

A B C

151

Figura 58. Analisi del sangue intero lisato. A. Grafico densità SSC vs FSC. B. Grafico di fluorescenza SSC vs. CD45 PB.

Figura 59. Gating sequenziale per identificare sottoinsiemi T specifici. Il sangue intero

lyzato di globuli rossi è stato colorato con CD3, CD4, CD8, CD45RA e CD28 in presenza

di ioduro di propidio per rimuovere le cellule morte. La strategia è indicata dalle frecce.

152

10.3 Controlli

Una cosa molto importante quando ci si approccia alla citofluorimetria sono i controlli, che rendono

più facile l’analisi. Una delle prime cose che ci devono essere sempre in citofluorimetria è il controllo

di una popolazione di cellule che non viene marcata con anticorpi fluorescenti. Un altro aspetto che

bisogna tener presente è che gli eventi che si stanno analizzando devono essere necessariamente

singoli; perché può capitare che durante la focalizzazione idrodinamica le cellule non si dispongano

in single cells (fila indiana) ma si raggruppano dando luogo ad eventi che non sono il contributo di

una singola cella ma bensì di due cellule. Questo è quello che viene denominato discriminazione dei

doppietti (eventi doppi) (fig.61). La discriminazione dei doppietti è importante quando si va a sele-

zionare una popolazione di cellule (sorting), oppure quando si fanno le analisi sul DNA perché questo

potrebbe compromettere l’analisi stessa.

Figura 60. Controlli senza macchie. I linfociti non colorati (A) vengono utilizzati per deter-

minare l'autofluorescenza e settare la popolazione negativa che consente la visualizzazione

delle cellule colorate (B).

È molto facile escludere gli eventi che non sono singoli perché basta andare a controllare la po-

polazione di cellule in esame e selezionare un parametro e analizzare la sua altezza per la sua area.

L’altezza e l’area devono essere proporzionali per ottenere una relazione lineare; ovvero un segnale

tanto più ha un’area grande, tanto più è grande la sua altezza. Se si verifica il contrario, vuol dire che

questo ha aumentato la sua area, non tanto perché è aumentata l’intensità del suo picco, ma perché

si è dilatato il tempo (lunghezza del picco). Questa situazione appena descritta caratterizza un evento

doppio.

A B

153

Figura 61. Discriminazione dei doppietti. I doppietti (rosso)

possono essere distinti dalle singole cellule (verde) tracciando

l'altezza FSC rispetto all'area FCS. I doppietti hanno area

aumentata mentre altezza simile al singolo cellule.

10.4 Applicazioni

La prima applicazione per cui è stata sviluppata la citofluorimetria è (1) la determinazione del fenotipo

delle cellule del sistema immunitario, le quali non crescono in adesione ma in sospensione e sono

cellule con la tendenza a non complessare con altre cellule (scarsa interazione cellula-cellula). Queste

cellule sono riccamente provviste di marcatori sulla loro superficie cellulare che servono alle cellule

per le loro funzioni, ma soprattutto che possono essere sfruttati in citofluorimetria per marcare le

sottopopolazioni cellulari, in quanto l’espressione di specifici marker determinano la tipologia cellu-

lare. Ecco che la determinazione dell’immuno-fenotipo per le cellule del sangue vengono utilizzate in

diagnostica per la diagnosi, o per valutare lo sviluppo e la progressione delle patologie. Allo stesso

modo la citofluorimetria viene utilizzate per lo studio di quelli che possono essere degli alterati

pattern di produzione del sistema immunitario e che possono portare all’insorgenza di patologie.

Sono stati sviluppati numerosi anticorpi monoclonali, o anche policlonali, che sono in grado di ricono-

scere queste proteine presenti membrane di queste cellule e, attraverso la successiva definizione di

popolazioni cellulari si può andare ad identificare quelle che sono le possibili componenti del sistema

immunitario in un preparato biologico. La figura 62, rappresenta la distribuzione delle cellule per di-

mensione (FSC) e per complessità (SSC) (A); vengono selezionate delle popolazioni (B) sempre più

ristrette, per cui attraverso marcatori CD3 e CD19 si ha la possibilità di marcare quelle che sono le

cellule B e le cellule, oppure con una marcatura CD10 e CD14 possono essere identificati i granulociti

e i monociti (C). Questo è estremamente importante perché ogni popolazione cellulare ha i propri

marker e le proprie proteine espresse, per cui quello che si può fare è evidenziare una sotto-popola-

zione, dove quello che cambia è semplicemente il parametro della proteina di superficie (di tali

cellule) che si va a valutare.

154

Figura 62. Immunofenotipizzazione del sangue intero. Semplice pannello di immunofenotipizzazione a 4 colori utilizzando CD3, CD19,

CD66b e CD14 a identificare rispettivamente T, B, granulociti e monociti.

Una seconda applicazione nello sviluppo della ricerca è (2) il Cell Sorting, ovvero andare a separare

una popolazione cellulare da un’altra all’interno di una popolazione che vedeva diverse sottopopo-

lazioni al suo interno. La particolarità di questa tecnica è che prevede la separazione fisica di queste

cellule e il loro recupero in opportuni contenitori (provette) in modo tale che queste cellule possano

essere poi utilizzate per applicazioni successive (diagnostico, come l’analisi del trascittoma in una

sottopopolazione; oppure l’amplificazione delle stesse a seguito di una re-coltura).

Ovviamente l’applicazione di questa tecnica è notevolmente sensibile perché non è facile da attuare.

Intanto, se può essere facile identificare e isolare una popolazione, il passaggio tra l’analisi di una

A B C

Figura 63. Cell-Sorting.

155

singola cellula (quindi, il fatto che un laser colpisce una singola cellula in un punto di interrogazione)

a questa deve seguire un sistema che segue e controlla la separazione di queste cellule in due o più

contenitori di recupero (poiché tutto quello che normalmente viene osservato dal citofluorimetro

viene poi buttato via). Subito dopo il punto di interrogazione, vi è un piccolo augello che vibrando ad

una frequenza specifica è in grado di formare delle micro-goccioline, all’interno delle quali si verrà a

trovare non più di un evento (ovvero goccioline in cui non ci saranno cellule, ed altre in cui ci sarà una

sola cellula). Questo però non è sempre vero, nel senso che se non abbiamo una sospensione

unicellulare può capitare che in una gocciolina si ritrovino due cellule attaccate, e non è detto che

due cellule attaccate siano due cellule uguali; per tanto vi è un sistema di rielaborazione del segnale

collezionato dal laser che permette di discriminare se l’evento è singolo o doppio. Allo stesso tempo

se la goccia non si è formata o non ha inglobato un solo evento ma più di uno, questo è altresì un

problema perché non è possibile avere delle gocce con più di un evento al loro interno. Per tanto c’è

tutto un controllo visi-vo che permette di selezionare non solo quelle gocce che contengono l’evento

che si vuole recupera-re (separando dagli scarti), ma è possibile identificare se all’interno della goccia

ci sarà uno, due o tre eventi. In questa maniera è possibile escludere tutte le gocce che non con-

tengono eventi e quelle che contengono più di un evento.

+ -

Cavo di ricarica nell’augello

Le piastre di deflessione

generano un campo elettrico

Traiettoria deflessa

Flusso di sarto

① Punto di interrogazione

ottica e collezione della luce

② partizione del flusso

in goccioline

③ Deviazione delle goccioline

attraverso il campo elettrico

④ le goccioline che non hanno deviato la

loro traiettoria vengono eliminate

Figura 64. Meccanismo di recupero.

156

Il passaggio successivo è quello che prevede la separazione delle cellule e l’indirizzamento verso i

contenitori di raccolta. Il fluido in cui gli eventi vengono trasportati e che successivamente viene rotto

in goccioline, può essere caricato elettricamente attraverso un sistema di piastre. Questo, attraverso

l’applicazione di cariche positive e negative, sono in grado di deflettere la traiettoria della gocciolina

che contiene la cellula e di indirizzarla verso i contenitori di recupero (modificandone la carica),

oppure farla procedere dritto in direzione del contenitore di scarto (senza modificazione di carica).

Questo è un processo molto delicato perché deve essere condotto da un software che più è preciso

più il cell-sorting avviene in modo corretto. Secondo quanto detto, un’applicazione del cell-sorting

può essere quella che riguarda l’isolamento di una popolazione omogenea come cellule staminali e

primarie in neuroni. Si può partire da diversi campioni che potrebbero essere cellule in coltura, cellule

staminali umane, tessuti.

Figura 65. Cloni derivati dalla linea cellulare di controllo.

157

Tutti questi campioni che logicamente contengono tipologie cellulari differenti vengono distrutti in

modo tale che le cellule passino in una soluzione unicellulare che può essere trasfettata, marcata con

anticorpi e analizzata al citofluorimetro. A questo punto, si osserva che queste cellule possono essere

positivi all’es-pressione di una proteina fluorescente, oppure l’espressione di un anticorpo di

selezione. È possibile isolare nuovamente questa popolazione e rimetterla in piastra e utilizzare

applicazioni successive. Una cosa che viene spesso fatta è quella di marcare le cellule in analisi al

citofluorimetro con la proteina fluorescente verde per analizzare ad esempio tutte quelle cellule che

esprimono di più tale proteina fluorescente verde piuttosto che quelle che ne esprimono di meno,

oppure semplicemente per discriminare le cellule positive da quelle negative all’espressione della

proteina. In questo modo è possibile identificare una sottopopolazione e poi applicare tutte quelle

che sono le procedure di analisi genomica, coltura, trapianti, immortalizzazione cellulare, e tutte le

metodiche normalmente utilizzate. Una recente applicazione è quella di utilizzare la citofluorimetria

per selezionare delle cellule staminali pluripotenti indotte che erano state trasfettate e

ingegnerizzate attraverso la tecnica CRISPR-CAS 9 con la proteina fluorescente Dendra-2, una

proteina fotoattivabile che viene convertita dal verde al rosso. La proteina Dendra-2 viene spesso

utilizzata per esaminate il turnover delle proteine dal vivo. Vengono inserite cellule di controllo

(negative, che non erano state trasfettate con i costrutti del Dendra-2) nel citofluorimetro, e

successivamente si osservano le linee cellulari otte-nute, che nel caso della linea cellulare W81 (in

figura 65) presenta due picchi distinti. Il primo picco cade esattamente nella condizione negativa, e il

secondo picco invece è dato dalle cellule Dendra-2 positive. Allo stesso modo sono stati analizzati

altri due cloni, uno esclusivamente negativo (A7) e il secondo totalmente positivo (A19). Nel clone

W81, come visto, vi è la presenza in contemporanea di due popolazioni cellulari differenti, per cui

attraverso il cell-sorting, è possibile isolare la popolazione positiva, fino ad ottenere un risultato simile

a quello del clone A19.

La terza importante applicazione della citofluorimetria è (3) l’analisi del ciclo cellulare soprattutto

nell’ambito della ricerca. L’analisi del ciclo cellulare permette di separare le cellule che sono ferme in

G1, quelle che sono in fase S e quelle in G2. Tutto ciò è possibile grazie all’utilizzo di intercalanti (che

sono basi azotate) come lo ioduro di propidio, oppure bromodeossiuridina BrdU. Rispettivamente

questi due intercalanti vanno a marcare la quantità di DNA (per quanto riguarda lo ioduro di propidio)

oppure incorporati durante la fase S (nel caso della BrdU, in quanto nulceotide). Poco prima di effet-

tuare l’analisi in citofluorimetria, che secondo i protocolli può essere circa 30 min – 1 ora prima, le

cellule vengono fatte crescere in terreno di coltura arricchito con BrdU. Al termine dell’incubazione

le cellule vengono staccate dal medium, processate al fine di marcare con anticorpi fluorescenti la

BrdU e successivamente incubate con ioduro di propidio (allo scopo di valutare la quantità di DNA).

L’analisi del ciclo viene fatta andando a valutare eventualmente due aspetti:

1. la quantità di DNA per la positività allo ioduro di propidio

2. l’internalizzazione della BrdU;

chiaramente le cellule che si trovano in G1 hanno una quantità di DNA inferiore a quelle che si trovano

in G2 (il doppio). Le cellule in fase G1 e G2 sono cellule che durante l’incubazione con BrdU non

proliferavano; di conseguenza la BrdU non si è potuta intercalare all’interno del DNA. Quindi è pos-

sibile andare a vedere, in fase di incubazione, fotografando quante e quali sono le cellule che non

158

hanno incorporato la BrdU, ma che hanno il doppio del DNA quindi in fase di esperimento si tro-

vavano in G2, quelle in fase G1 (con metà del DNA), e quelle in fase S che in fase di duplicazione

stanno incorporando la BrdU. Il segnale dello ioduro di propidio è variabile nelle cellule in fase S,

poiché è legato all’aumento della quantità di DNA, e per tale ragione il segnale è maggiore.

Un’altra applicazione è (4) l’apoptosi, in cui la cictofluorimetria sfrutta il cambiamento della struttura

della membrana cellulare legato a due aspetti in particolare:

1. durante l’apoptosi viene esposta sulla membrana la fosfatidilserina;

2. la membrana cellulare, con la progressione dell’apoptosi, diviene permeabile.

A causa della aumentata permeabilità si sfruttano due possibilità: l’utilizzo dello ioduro di propidio

(marcatore del DNA) che è in grado di permeare all’interno della cellula solo quando lo stato apop-

totico è avanzato; l’altra possibilità sfrutta la capacità dell’annesina V di legare la fosfatidilserina.

L’annessina V viene marcata con un gruppo FITC, lo ioduro di propidio è esso stesso riconosciuto nel

rosso. Quello che si osserva sono tre condizioni diverse:

1. cellule normali, che non hanno nessun tipo di interazione (nessun segnale) né con lo ioduro

di propidio, né con l’annesina V;

2. una fase iniziale di apoptosi, in cui si osserva il segnale dell’annesina V ma non il segnale dello

ioduro di propidio;

3. una fase di apoptosi terminale in cui si osserva sia il segnale dello ioduro di propidio che quello

dell’annesina V.

Figura 66. Test per l'apoptosi cellulare.

Nella figura 67, possiamo osservare come si presenta un esperimento di ioduro di propidio e di

annesina V in un preparato di cellule sane, dove la grande maggioranza delle cellule si trova nel

riquadro in basso, negative sia per lo ioduro di propidio e per l’annesina V. Mentre invece nel riquadro

accanto è una condizione di un dotplot dove le cellule sono andate incontro ad apoptosi, una parte

in fase iniziale ed altre in fase terminale. Lo ioduro di propidio però può essere utilizzato in maniera

più semplice per valutare il livello di mortalità delle cellule.

159

Figura 67. Confronto tra cellule normali e apoptotiche.

A tal proposito è stato fatto un esperimento per valutare la quantità di cellule morte in una coltura

cellulare dopo che le cellule sono state staccate meccanicamente dalla piastra con uno scraper e

attraverso l’utilizzo di tripsina e pbs senza o con calcio e magnesio; dopo aver utilizzato accutase per

facilitare il distacco delle cellule. Allo stesso tempo è stata confrontata la confluenza delle cellule al

60% e al 100%. Da questo esperimento è possibile notare come a seconda del metodo utilizzato per

staccare le cellule dal terreno di crescita queste diventano più o meno positive allo ioduro di propidio.

Man mano che queste muoiono la positività aumenta. Allo stesso modo, lo ioduro d propidio potreb-

be essere utilizzato per valutare la percentuale di mortalità di una linea cellulare che esprime

determinate proteine che potrebbero essere responsabili o meno di una patologia.

Figura 68. Reattività allo ioduro di propidio a seguito del distacco dal terreno di coltura.

La figura 69 raffigura una linea cellulare, la 6HSY5Y, che sono state trasfettate in modo stabile con un

plasmide che esprime una sequenza di poliglutammina. Tale sequenza è responsabile di alcune

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Confluenza 60% Confluenza 100%

Scrper

Spipetta

trips - trips

pbs w/o Ca Mg - trips

accutase

160

patologie neurodegenerative come l’Huntington, atassie spino-cerebellari, o l’atrofia muscolare e

spinale-bubare. Quello che si vuole osservare è che se l’over-espressione del polyQ è in grado di

aumentare la tossicità nella linea cellulare. La popolazione cellulare viene mantenuta uguale nei due

esperimenti. Nelle cellule normali (A) si osservano già due picchi, un picco è dato da cellule che sono

negative (in buono stato) e l’altro picco rappresenta le cellule morte in seguito al metodo utilizzato

per il distacco dalla piastra. Durante l’espressione del polyQ (B) cambia in modo significativo il profilo

di incorporazione dello ioduro di propidio, dove appunto la positività delle cellule passa da 37% a

62%. Dunque l’espressione del polyQ induce la mortalità cellulare.

A

B

Figura 69. Tossicità cellulare da poliglutammina. A cellule normali; B espressione del PolyQ.

Altre applicazioni della citofluorimetria possono essere utilizzate per lo studio di:

1. pathway di segnale come le fosforilazioni;

2. piccole particelle, piuttosto che di cellule;

3. espressione genica (esistono dei kit che sono in grado di riconoscere le molecole di RNA e

attraverso le sonde fluorescenti è possibile dosare e quantificare l’espressione di un trascritto

in una singola cellula);

4. quantificazioni assolute;

5. internalizzazione di particelle.