principi pratici ed esempi di colture cellulari
TRANSCRIPT
PRINCIPI PRATICI ED ESEMPI
DI COLTURE CELLULARI
Dott.ssa Valeria Berton
Università di Verona
Applicazioni delle colture
cellulari
Studi di biologia e biochimica
Studi di interazione tra organismi patogeni e cellule
Studi degli effetti di farmaci sulle cellule
Studiare processi cellulari
Studi di tossicologia
Ricerca sui tumori
Colture
Colture cellulari: l’architettura del tessuto (o dell’organo) viene distrutta, fino ad arrivare alla sospensione di singole cellule.
Colture d’organo: L’organo (o parte di esso) viene asportato, conservando l’architettura. Usate principalmente per studi di fisiologia e sviluppo.
Colture di rene di ratto E13,5(Martovetsky et al. 2013)
Colture tissutali: o colture organotipiche. Fettine di tessuto vengono isolate dall’organointero. Spessore minore rispetto alle colture d’organo; mantenuti solo gliaspetti principali dell’architettura del tessuto.
Colture di ippocampo di ratto P7(Armentano et al. 2010; Guy et al. 2011)
Colture cellulari
Cellule isolate dal tessuto d’origine e mantenute in vita in un ambiente definito
Vantaggi
Sistemi semplici e riproducibili
Stretto controllo sulle condizioniambientali
Consentono analisi a livellomolecolare
Disponibilità di diversi tipi cellulari e reagenti per colture
Relativamente economiche
Ridotti problemi etici
Svantaggi
Sistema semplificato rispettoall’intero organismo
Difficile correlazione tra le condizioni di coltura e le condizioniin vivo
Possibili interazioni tra la molecoladi studio e le condizioni di coltura
Costi comunque abbastanza elevati
Expertise
Necessitano comunque di prelievoda animale o paziente
Vantaggi e Svantaggi
Tipi di colture
Colture primarie: derivate dall’isolamento di uno o più tipi cellulari da un campione di tessuto o organo
Colture secondarie: derivate dalla propagazione di colture primarie
neuroni cellule endoteliali cellule cervice uterina
Tipi di colture
Linee cellulari continue: derivate cellule tumorali o ottenute da trasformazione(spontanea o indotta) di colture primarieSono linee clonali
Colture clonali: colture derivate da una singola cellula (clone)
Colture cellulari: limite di Hayflick
Cellule trasformateImmortalizzate
Cellule non trasformate
Primo passaggio Secondo passaggio
Coltura primaria Coltura secondaria
Tempo
Log
n c
ellu
le
Cellule isolate da un tessuto e seminate in coltura
Proliferazione
Cellule della coltura primaria rimosse e seminate ad una minore densità
Cellule derivate da tumori o trasformate (trasformazionespontanea o con agenti chimici o biologici)
Acquisiscono la capacità diproliferare indefinitamente
Colture cellulari primarie
Colture primarie: colture cellulari derivate dalla dissociazione di un tessuto o un organo o isolate da fluidi biologici
Dissociazione: meccanica
enzimatica (tripsina, collagenasi, EDTA)
Distrugge la matrice cellulare che tiene unite le cellule; si ottiene unasospensione di materiale extracellulare e cellule.
Isolamento: Delle cellule dal materiale extracellulare (filtrazione)
Del tipo cellulare di interesse dalla popolazione mista di cellule; si sfruttanole proprietà fisiche (dimensioni), le capacità di adesione a substrati specifici, specificità di legame con anticorpi, terreni di coltura selettivi
Linee continue
Linee continue: cellule tumorali o cellule non tumorali trasformate
Dette anche linee cellulari immortalizzate
Il programma genetico della senescenza è stato annullato:
Mutazioni spontanee: cellule derivate da tumori o trasformazione in coltura di cellule da colture secondarie
Trasformazione indotta: cellule da colture primarie immortalizzate tramitemanipolazione genetica
Agenti fisici (radiazioni o mutageni chimici)Virus codificanti porzioni di genoma modificate
Colture primarie vs. immortalizzate
Limitato numero di cicli cellulari
Mantengono con maggioreprobabilità le caratteristiche dellecellule in vivo
Continui prelievi daanimali/pazienti
Condizioni di coltura più delicate
Maggiore variabilità (isolate dasoggetti diversi)
Proliferazione rapida e continua dipendente solo dalla presenza dimetaboliti
Possono acquisire caratteristiche diverse dalle cellule in vivo (morfologia, fisiologiae corredo cromosomico)
Disponibili commercialmente
Coltura più semplice (minori esigenzetrofiche, ridotta inibizione da contatto)
Variabilità ridotta
Colture primarie Colture immortalizzate
Tipi di colture cellulari
In sospensione: Cellule che crescono normalmente in mezzo fluido (es. cellule ematopoietiche)
Crescono in sospensione, senza aderire alla superficie di coltura
Aderenti: Cellule che fanno parte di tessuti solidi (es. cellule nervose, epiteliali, fibroblasti)
Crescono aderendo alla superficie di coltura
Spesso richiedono l’interazione tra recettori di adesione di membrana e proteine adesive adsorbite sulla superficie di coltura(es. fibronectina, lamimina, poly-L-lisina, matrigel)
L’adesione è necessaria per la proliferazione
Inibizione da contattodella proliferazione
Esaurimento dei fattori di crescita
Condizioni necessarie alla coltura cellulare
Adeguato apporto di sostanze nutritive• zuccheri• amminoacidi• ormoni• vitamine• ioni• fattori di crescita
Controllo e mantenimento di condizioni chimico-fisiche ottimali• sterilità• pH• concentrazione di anidride carbonica e ossigeno• temperatura• umidità• substrato
Terreni di coltura
Contengono i nutrienti essenziali al mantenimento e alla crescita delle cellule in coltura
Cellule diverse hanno requisiti nutrizionali diversi diversi terreni di coltura
Glycine
L-Alanine
L-Arginine hydrochloride
L-Asparagine-H2O
L-Cysteine
L-Histidine hydrochloride-H2O
L-Isoleucine
L-Leucine
L-Lysine hydrochloride
L-Methionine
L-Phenylalanine
L-Proline
L-Serine
L-Threonine
L-Tryptophan
L-Tyrosine
L-Valine
Amminoacidi
Choline chloride
D-Calcium pantothenate
Folic Acid
Niacinamide
Pyridoxine hydrochloride
Riboflavin
Thiamine hydrochloride
Vitamin B12
i-Inositol
Vitamine
Calcium Chloride (CaCl2) (anhyd.)
Ferric Nitrate (Fe(NO3)3"9H2O)
Magnesium Chloride (anhydrous)
Potassium Chloride (KCl)
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)
Sodium Chloride (NaCl)
Sodium Phosphate monobasic (NaH2PO4-H2O)
Zinc sulfate (ZnSO4-7H2O)
D-Glucose (Dextrose)
HEPES
Phenol Red
Sodium Pyruvate
Sali inorganici
Altri componenti
Esempio: componenti Neurobasal medium (Gibco)
Terreno in uso
In generale, al terreno di coltura vengono aggiunti:
Supplementi o siero
Glutammina
Antibiotici
Il terreno così composto può essere conservato a 4°C per un mese e mezzo al massimo(meglio un mese)
Eventuali fattori di crescita (per stimolare la proliferazione o il differenziamento) vanno addizionati al terreno già riscaldato appena prima dell’uso, in quanto sidegradano velocemente a 37°C
Il terreno di coltura deve essere riscaldato a 37°C prima di essere messo in contattocon le cellule.
Non riscaldare l’intero contenitore di terreno, solo la quantità necessaria
Contaminazione
Ambientale: Stanze per colture cellulari a norma
Pulizia delle superfici
Non portare materiale fuori dalla stanza colture
Operatore: Le colture cellulari possono essere contaminate (virus) o trasformarsidurante l’uso
Procedure e tecniche che riducono il rischio per l’operatore (cappe a flussolaminare, dispositivi di protezione individuale)
Le colture cellulari di derivazione umana devono sempre essere considerate pericolose
Colture: Più frequenti da lieviti, funghi e micoplasmi; possono uccidere le colture (lieviti, funghi e batteri) o alterare le caratteristiche delle cellule (micoplasmi)
E’ necessario lavorare in condizioni di sterilità
Contaminazione della coltura
Terreno di coltura tendente al giallo e torbido
Batteri
Lieviti
Funghi
Virus
Micoplasmi
Hoechst: attraversa le membrana cellulare e si lega al DNA
Sterilità
Assenza di microrganismi inquinanti (batteri, funghi, micoplasmi, virus)
Trattamento dei materiali con autoclavi e stufe
Irraggiamento (UV) delle superfici
Ultrafiltrazione dei liquidi (membrane con pori Ø 0,4 – 0,2 µm)
Disinfettanti (prima di introdurre materiale sotto la cappa sterile)
Addizione di antibiotici nei terreni (preventiva)
Manipolazione in atmosfera sterile (cappe a flusso laminare)
Incubatori
Norme di comportamento in stanza delle colture
uso dei dispositivi di protezione individuale;
divieto di mangiare o bere all’interno della stanza;
non parlare mentre si lavora sotto la cappa sterile;
pulire la cappa prima e dopo l’utilizzo;
controllo periodico dei filtri della cappa;
uso di materiali monouso sterili, ad esempio pipette, fiasche e piastre petri etc,
pH
pH fisiologico: 6.8 – 7.8 (dipende dall’origine della coltura cellulare)
Ma il terreno di coltura tende ad acidificarsi a causa dei prodotti del metabolismocellulare
Nei terreni di coltura si trovano:
Sistemi tampone (comunementebicarbonato di sodio)
Rosso fenolo (indicatore di pH)
Giallo = pH acido
Rosso-arancio = pH neutro
Viola = ph basico
Se il terreno di coltura tende al viola, non deve essere usato!
Concentrazione CO2 e O2
Incubatori mantengono costante CO2
pCO2 (pressione parziale CO2) solitamente 5%
Corrisponde alla pressione parziale di CO2 media nei tessuti (4.6% - 5.9%)
Contrasta l’acidificazione del terreno dovuta al metabolismo cellulare
La pCO2 ottimale per la coltura cellulare dipende dal tipo di cellule coltivate
Nell’incubatore: 5% CO2 e 95% aria
Se all’interno dell’incubatore, il terreno di coltura tende al giallo, significa che ilmetabolismo cellulare (proliferazione) sta acidificando il terreno
Se invece il terreno tende al viola, la regolazione della pCO2 dell’incubatore non è bencalibrata o le cellule stanno morendo
TemperaturaIl mantenimento della temperatura ottimale è garantito dagli incubatori termostatati
La temperatura ottimale dipende dal tipo di cellule in coltura
Generalmente è 37°C, ma può essere inferiore
In generale, le cellule possono sopravvivere a lievi ipotermie rispetto allatemperatura ottimale, ma lievi ipertermie portano a morte o alterazioni
Umidità
Il mantenimento di un corretto grado di umidità impedisce al terreno di coltura dievaporare (la temperatura all’interno di un incubatore è superiore ai 30°C)
Il fondo degli incubatori termostatati viene riempito di acqua (sterile)
Il livello dell’acqua deve essere monitorato costantemente
I supporti di coltura maggiormente usati sono le piastre multiwell, le piastre Petri e le fiasche
La plastica per coltura è generalmente in polistirene, trasparente al microscopio.
Viene trattata per essere sterile e atossica nei confronti delle cellule.
La superficie è idrofila e carica negativamente, in modo da favorire il legame dei fattoridi adesione presenti nel siero o aggiunte dall’operatore in un secondo momento,
Nel caso di colture cellulari in sospensione è necessario usare plastica trattataappositamente allo scopo di inibire l’adesione delle cellule alla superficie.
Supporto di coltura
Substrato
Tipi diversi di cellule richiedono la presenza (o l’assenza) di un substrato proteico che favorisca l’adesione delle cellule stesse alla superficie
Esempi: cellule endoteliali e cellule neuronali richiedono un substrato più comuni: laminina, fibronectina, collagene, poli-L-lisina, gelatina, Matrigel (mix di proteine)
cellule ematopoietiche (linfociti), alcuni tipi di cellule staminali vengono coltivate in sospensione
Vitalità
Una densità di cellule in coltura troppo alta provoca sofferenza, e spesso alterazioni, delle cellule
Cellule in adesione crescono fino ad occupare l’intera superficie a disposizione: sonoconfluenti.
Regola generale: non superare l’80% della confluenza
Cellule in sospensione, non aderendo alla superficie di coltura, non offrono un segnalecosì chiaro del raggiungimento della densità massima
E’ necessario contare le cellule
Conta delle cellule
Camera di Burker
Contare le cellule vitali nei 4 quadranti
Il numero di cellule/ml è:
Numero di cellule contate4
x Fattore di diluizione x 104
Coloranti vitali
Trypan Blue: internalizzato solo dalle cellule morte, che quindi diventano blu opaco; le cellule vive sono bianche e “luminose” (rifrangono la luce emessa dal microscopio)
Un’aliquota di sospensione cellulare viene mescolata con Trypan Blue al rapporto desiderato (1:10, 1:2, a seconda della densità delle cellule in coltura) e lasciata riposare a T. amb. per 5-10 minuti.
Coloranti vitali
Ioduro di Propidio: intercalante del DNA, diventa fluorescente solo quando va ad inserirsitra I filamenti di DNA.
Le cellule sane non sono permeabili al PI solo le cellule non vitalidiventano fluorescenti
Diacetil fluoresceina: tutte le cellule incorporano la forma esterificata (non fluorescente), ma solo le cellule vitali sono in grado di produrre la forma idrolizzatafluorescente (verde).
Le cellule non vitali possono essere evidenziate con PI (rosse)
Coloranti vitali
VitalitàCambiamenti (RNA, proteine, studi funzionali)
Applicazioni delle colture cellulari:studio di farmaci
Farmaco
Applicazioni delle colture cellulari:organi su chip
Applicazioni delle colture cellulari:polmoni su chip
Huh, D. et al., Reconstituting organ-level lung functions on a chip, Science, 2010
http://www.elveflow.com/microfluidic-
tutorials/cell-biology-imaging-reviews-and-
tutorials/microfluidic-for-cell-biology/a-review-
about-organs-on-chip/
Applicazioni delle colture cellulari:fegato su chip
https://ncats.nih.gov/tissuechip/chip/liver
https://ncats.nih.gov/tissuechip/chip/liver
Applicazioni delle colture cellulari:uomo su chip
http://youngzine.org/news/technology/organs-chip
Oligodendrociti
Gli oligodendrociti sono cellule formanti mielina, la quale ricopre gli assoni
migliorando efficienza e velocità di trasmissione dei potenziali d’azione.
La guaina mielinica ha il principale compito di isolare gli assoni, è ricca di
lipidi che le conferiscono caratteristiche di isolante ed è costituita da
particolari proteine che la caratterizzano.
Demielinizzazione da parte degli oligodendrociti
perdita della funzionalità degli assoni
Danno agli oligodendrociti
oligodendrocytes from meningeal stem cells
can be used regenerative medicine
Danno agli oligodendrociti
1st: obtain stem cells from meninges
Isolation of
meningesIn vitro culture
Oligodendrociti dalle meningi
Cells in culture
Add PDGF and T3
Oligodendrocytes from
meningeal stem cells
2nd: obtain oligodendrocytes from meningeal cells
Oligodendrociti dalle meningi
NS: A small spinal cord meningeal biopsy is isolated and
cultured in neurosphere expansion medium
OliGo1 : Neurosphere dissociation and culture in oligodendrocyte
induction medium in floating conditions
OliGo2 : Oligosphere dissociation and cell culture in oligodendrocyte differentiation
medium in adherent condition
OliGo3 : Final differentiation with oligodendrocyte maturation
medium
Oligodendrociti dalle meningi: protocollo
Oligodendrociti dalle meningi: protocollo
Nestin, Vimentin and other stemness and neural progenitor markers
are expressed at low levels by the end of the protocol
Expression of stemness-related genes
Nanog, Oct4, Sox2 and Pax6 was
detected only at very low levels at every
step of the protocol
Neural Progenitor-related genes
Vimentin Nestin
Rela
tiv
e G
en
e E
xp
ressio
n
NS
OliGo1
OliGo2
OliGo3
One-way ANOVA and Bonferroni post-test. *p<0.05
n=5
Diffused Nestin protein expression
Cellular morphology increased in complexity
Oligodendrociti dalle meningi: davvero?
Oligodendrocyte Progenitors
Olig1 Olig2 Nkx2.2 Cspg4
Rela
tiv
e G
en
e E
xp
ressio
n NS
OliGo1
OliGo2
OliGo3
One-way ANOVA and Bonferroni post-test. *p<0.05
n=5
Pre-oligodendrocyte and immature oligodendrocyte markers
are expressed in the intermediate stages of the differentiation protocol
TOPRO3NG2
NG2 maximal expression was
observed at the OliGo1 stage.
NS OliGo1 OliGo2 OliGo3
Scale bar: 50 um
Maximal expression of O4 at the OliGo2 stage confirmed progression to immature oligodendrocytes
Oligodendrociti dalle meningi: davvero?
Mature Oligodendrocyte - High Increase
Mag Mbp Mog Plp1
Rela
tiv
e G
en
e E
xp
ressio
nNS
OliGo1
OliGo2
OliGo3
One-way ANOVA and Bonferroni post-test. *p<0.05; **p<0.01
n=5
MBP immunofluorescence to show oligodendrocyte morphological changes
Expression of myelin-specific genes:
1- high increase by the end of the protocol
Oligodendrociti dalle meningi: davvero?
Mature Oligodendrocyte - Low Increase
GalC Sox10 CaII Cnp
Rela
tiv
e G
en
e E
xp
ressio
n
NS
OliGo1
OliGo2
OliGo3
One-way ANOVA and Bonferroni post-test. *p<0.05; **p<0.01
n=5
Expression of myelin-specific genes:
2- Cnp increases by the end of the protocol
GalC protein expression: growing morphological complexity
Cnp, Mag, Mbp, Mog and Plp1 are
considered the signature of mature
oligodendrocytes in vivo and in vitro
Oligodendrociti dalle meningi: davvero?
Neurons
Dcx Tub3 Syt1
Rela
tiv
e G
en
e E
xp
ressio
n
NS
OliGo1
OliGo2
OliGo3
One-way ANOVA and Bonferroni post-test.
n=5
Under our culture conditions, LeSCs do not differentiate into neurons or
astrocytes
Gene expression of the mature marker Mtap2 and the astrocytic markers Gfap and Aqp4 were
detectable only at low levels
Immunofluorescence analysis detected rare expression of the neuronal markers Tuj1 and MAP2,
while the astrocytic marker GFAP was never observed
Oligodendrociti dalle meningi: davvero?
Cellule Nestina+ nelle corteccia di ratto
Immunofluorescenza sucampioni di cervello diratto in diverse fasidello sviluppo
Nestina: filamentointermedio tipico dellecellule progenitricineurali
SVZ: nicchiariconosciuta di cellule staminali/progenitricineurali
Isolamento delle cellule da tessuto
Cervello di ratto Sprague-Dawley al 15°giorno dopo la nascita (P15)
Prelievo delle leptomeningi
Dissociazione delle meningi:
Enzimatica: Collagenasi (10 minuti 37°C)Tripsina e DNAsi (5 minuti 37°C)
Meccanica: pipetta 10mlpipetta 5mlpasteur di vetro
Azione degli enzimi bloccata dall’aggiunta di terreno contenente siero
Centrifugazione
Filtrazione (per eliminare i frammenti di tessuto rimasti)
Caratterizzazione delle cellule
FACS: Fluorescence-Activated Cell Sorting
Cellule in sospensione in PBS
Incubazione con anticorpo anti-Nestina coniugato con un fluoroforo
Valutazione della percentuale di cellule Nestina+ nella popolazionecellulare
Neurosfere: Aggregati cellulari sferici derivati dalla proliferazione di singole cellule in colture in sospensione
La capacità di formare neurosfere è una delle caratteristiche principali delle cellule staminali/progenitrici neurali
Le cellule isolate dalle meningi sono state coltivate nelterreno di coltura solitamente usato per indurre la generazione di neurosfere da cellule dell’SVZ
NeurobasalGlutamminaPen/StrepB27N2
bFGFEGF
Le cellule isolate dalle leptomeningi formano neurosfere
Colony-Forming Unit
Colony-Forming Unit (CFU): Cellula in grado di dare generare una colonia di cellule derivate dalla replicazione della cellula di origine
Molte cellule dell’organismo sono in grado di proliferarein vitro, ma solo per un numero limitato di volte (piccolecolonie).
Le cellule staminali/progenitrici sono invece in grado di formare colonie molto numerose.
Importante:
• Una coltura di cellule staminali/progenitrici mantiene un alto numero di CFU anche dopo diversi passaggi
• Se le cellule sono staminali/progenitrici, una cellula isolata da una colonia forma a sua volta una colonia
Una coltura di cellule staminali/progenitrici comprende un alto numero di CFU
Analisi dell’immunofenotipo dellacoltura
La coltura in vitro può modificare le proprietà delle cellule stesse.
Nestin MAP2 GFAP
CD34CD31CD106
CD45 CD90
marker
isotype control
L’analisi con FACS consente di verificare illivello di espressione di un marker diinteresse
CD106: marker cellule staminalimesenchimali
CD31: marker cellule endoteliali
CD34: marker cellule staminaliematopoietiche
CD45: marker leucociti
CD90: marker non specifico cellule staminali
Analisi dell’espressione proteica
Le neurosfere sono formate da una popolazione cellulare eterogenea, composta dacellule staminali/progenitrici (nel core della neurosfera) e cellule in via didifferenziamento negli strati più superficiali.
Nestina: marker cellule staminali/progenitrici
MAP2: Microtubule-Associated Protein 2marker neuronale
GFAP: marker astrociti
Differenziamento in vitro
Coltura in terreno di differenziamento in senso neuronale
Diminuisce l’espressione di Nestina
Aumenta l’espressione di MAP2
Immunofluorescenza per studiare la morfologia delle cellule MAP2+
BrdU: analogo della Timidinaviene incorporata dalle cellule in replicazione, sostituendosi allaTimidina
Le cellule MAP2+ derivano da cellule proliferanti nella coltura, non sono neuronipre-esistenti
Spine dendritiche, tipiche dei neuroni
Analisi dell’espressione genica
RT-PCR: Reverse Transcriptase PCR
Consente di retrotrascrivere cDNA a partire dall’RNA
In questo modo si può valutare l’espressione dei geni effettivamenteespressi dalla cellula
Si preleva una quantità di cellule (minimo 105) dalla popolazione in coltura
Le cellule vengono sospese in TRIzol (soluzione chimica che favorisce la rottura dellemembrane e delle componenti cellulari mantenendo al contempo l’integrità degli acidinucleici)
Conservate a -80°C
Misurata la quantità di RNA contenuta nei campioni
PCR e quantificazione (relativa)
Osservazione delle colonie derivate da cellule delle meningi a diversi time-points:
Durante le diverse fasi, le cellule Nestina+ continuano a proliferare formando colonieomogenee. Non ci sono cellule NG2+ o GFAP+
Anche in condizioni di aderenza, le cellule isolate dalle leptomeningi mantengono la capacità proliferativa e l’espressione di Nestina
Nelle prime fasi della coltura sono visibili cellule Nestina+ e qualche cellula NG2+
Time course in coltura aderente
Sinaptofisina: proteina pre-sinaptica
GAD67: enzima coinvolto nelmetabolismo del glutammato; marker neuroni GABAergici
GluR2: recettore per il glutammatoil recettore più comune nel CNS
Differenziamento in vitro
Differenziamento in vitro
Calcium Imaging: misurazione dei livelli cellulari di ioni Calcio tramite uso di indicatori
Gli ioni Calcio fungono da segnali intracellulari in tutti i tipi cellulari. Nei neuroni regolano l’esocitosi deineurotrasmettitori, la plasticità sinaptica e la trascrizione genica.
Fura-2: indicatore fluorescente; eccitato a 350/380 nm emette fluorescenza proporzionale al livello di ioni Calcio. Consente valutazione quantitativa.
La depolarizzazione (KCl) attiva i canali del Calcio voltaggio-dipendenti che si aprono e fanno entrare ioni Calcio.
I neuroni derivati dalle cellule delle leptomeningi mostrano livelli di Calcio simili a quellimisurati da colture primarie di neuroni Possono essere differenziate in
neuroni funzionali
Potenziale differenziativo in
vivo
Riconoscimento delle cellule trapiantate Espressione di EGFP
Cellule isolate dalle leptomeningi di ratti transgenici EGFP
Trapiantate nell’ippocampo di ratti adulti
Cheung and Cardinal BMC Neuroscience 2005
McCaffery P, Zhang J, Crandall JE J Neurobiol.
2006
Real time PCR: espressione di EGFP solo nei ratti trapiantati
Cellule EGFP+ nella
zona di iniezione
Astrociti (GFAP) circondano
le cellule EGFP+ nella zona
dell’iniezione
Analizzate tramite immunofluorescenza
Doppia immunofluorescenza: anticorpo anti-EGFP (verde) e anticorpo anti-GFAP,
-MAP2 o -NG2 (rosso)
Potenziale differenziativo in
vivo4 settimane
Potenziale differenziativo in
vivo 4 settimane
Molte cellule
EGFP+ sono
anche Nestina+
Rare cellule
EGFP+/GFAP+
Rare cellule
EGFP+/NG2+
Potenziale differenziativo in
vivo 8 settimane
La maggior parte delle cellule EGFP+ (49,8%)
sono MAP2+
La maggior parte delle cellule EGFP+/MAP2+ si
trovano nella regione CA1 dell’ippocampo
Alcune cellule EGFP+ mostrano
morfologia complessa e simile a quella dei
neuroni piramidali dell’ippocampo
Neuronal Dynamics
Laboratory
University of Utah
Potenziale differenziativo in
vivo 8 settimane
Cellule EGFP+/MAP2+ nello strato
piramidale e nello stratum oriens
dell’ippocampo
Alcune cellule EGFP+/MAP2+ sono
migrate nella sub-granular zone (SGZ) del
giro dentato
Conclusioni
Le cellule isolate dalle leptomeningi sono Nestina+ e possono esserecoltivate in vitro sottoforma di neurosfere
Le cellule delle leptomeningi (in colture aderenti e di neurosfere) esprimono alti livelli di geni correlati alla staminalità
Le cellule possono proliferare in coltura per diversi mesi e possonoessere indotte a differenziare con alta efficienza in cellule della lineaneuronale
Una volta trapiantate nell’ippocampo del ratto adulto, le cellule delleleptomeningi si integrano nel tessuto e acquisiscono caratteristichesimili a quelle dei neuroni maturi (espressione di MAP2 e morfologia)
Presenti nell’adulto
Proliferazione in vitro
Differenziamento in
neuroni in vitro e in
vivo
Leptomeningeal Stem/progenitor
Cells (LeSCs)