UNIVERSIDAD DE LA HABANA INSTITUTO DE FARMACIA Y ALIMENTOS

MMEETTOODDOOSS DDEE AANNÁÁLLIISSIISS DDEE DDRROOGGAASS YY EEXXTTRRAACCTTOOSS..

Dra. Migdalia Miranda Martinez Profesora Titular.

Ciudad de la Habana, CUBA. 2002 MÉTODOS DE ANÁLISIS DE DROGAS. Introducción.

A nivel mundial, las drogas y los preparados fitoterapéuticos obtenidos a partir de ellas, ocupan un lugar importante dentro del comercio de medicamentos, y debido a ello, se ha enfatizado en la necesidad de garantizar su control de calidad con aplicación de técnicas modernas y el uso de patrones adecuados.

En diversas Farmacopeas se describen métodos de ensayos generales para evaluar o valorar las drogas oficiales. La Organización Mundial de la Salud ha recomendado la realización de monografías y la implantación de normas o especificaciones de calidad, basadas en la experiencia de cada país, para aquellas drogas no incluidas en las Farmacopeas y que son ampliamente utilizadas en Medicina Tradicional.

Evaluar o valorar las drogas vegetales significa, identificarlas y determinar su calidad y pureza, lo cual se traduce en su valor intrínseco, o lo que es lo mismo, en la cantidad de principios activos presentes en ella.

En este capítulo expondremos los aspectos teóricos de algunos de los métodos generales empleados en el análisis de droga. Selección de las muestras a evaluar.

La confiabilidad del resultado obtenido en el análisis de una muestra, depende de la selección que se haya realizado de la misma.

Debido a las características específicas de las drogas, en particular, su poca homogeneidad, se requiere de procedimientos especiales de manipulación relacionados con la toma de muestras.

La toma de la muestra para análisis puede realizarse de la siguiente forma: Si el lote de la droga, está integrado por 5 ó menos sacos o paquetes, se inspeccionan todos. Si éste está formado por más de 5 paquetes (entre 6 y 50), se inspeccionan al azar 5 de ellos. Si fuera mayor de 50 paquetes, se escogerán aleatoriamente el 10% de ellos.

Una vez determinado el número de sacos o paquetes a inspeccionar, se toman tres muestras de cada uno, (de la parte superior, media e inferior), mezclándose bien todas las muestras para lograr la mayor homogeneidad.

La muestra mezclada se divide en cuatro partes, formando un cuadrado y se seleccionan las de dos lados opuestos, las cuales se vuelven a mezclar bien, repitiendo el proceso cuantas veces sea necesario,

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hasta obtener la cantidad de muestra para los ensayos. A ésta se le denomina “Muestra Promedio”, y es representativa del lote a analizar.

Si durante la inspección y toma de muestras se detecta deterioro en algún saco o paquete, éste debe ser analizado independientemente.

Con la “Muestra Promedio” se llevan a cabo los ensayos de calidad, dentro de los cuales se encuentran: Métodos de percepción, físico-químicos y químicos, que pueden llegar hasta el aislamiento y purificación de los principios activos. Determinación de Materias extrañas.

Se entiende por materias extrañas, aquellas partes de la droga que no corresponden a las exigencias que señala la monografía en cuanto a color, tamaño, estado y grado de pulverización, mezclas de otras partes de la planta o de otras plantas, polvo, arena, piedra y otras sustancias minerales.

Las drogas deben estar libres de organismos patógenos y de microorganismos, insectos y cualquier otra contaminación animal, incluyendo excretas. No deben presentar olores anormales, decoloraciones o algún signo de deterioro.

Durante la cosecha de la droga, deben ser removidas las partículas de polvo, tierra, arena etc., y después de la recolección, las drogas pueden ser sometidas a lavado y desinfección.

El almacenamiento debe realizarse en lugares higiénicos para evitar la contaminación, tomándose especial cuidado ante la presencia de hongos, ya que ellos pueden ser productores de aflatoxinas.

Los límites para las materias extrañas, se establecen en la monografías o especificaciones de calidad de cada droga en particular.

La presencia de cualquier otro contaminante, en especial animal o microbiano, o el no cumplimiento de los parámetros establecidos para la droga, hace que la misma sea declarada NO APTA PARA EL CONSUMO. Parte experimental Materiales Equipos - Placas de Petri - Balanza técnica. - Lupa o microscopio estereoscópico. A. Peso de la muestra

Para este ensayo se utilizan según el tipo de droga las cantidades siguientes: -De semillas y frutos muy pequeños........10g. -De semillas y frutos normales ................20g. -De drogas pulverizadas ......................... 50g. -De flores, hojas, hierbas, cortezas, raíces, rizomas y bulbos .......................100g. B. Orden de ensayos - Determinación de partes de la droga que no corresponden con las exigencias que señala la monografía. - Determinación de partes de otras plantas. - Determinación de mezclas minerales (polvo, piedra, etc.) Procedimiento

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Teniendo en cuenta el peso de la droga señalado en el epígrafe A; proceda a la separación manual de las partes señaladas en el epígrafe B con la ayuda de una pinza o medio adecuado Una vez concluido pese cada una de las partes por separado. El resultado se expresa en por ciento y se calcula por la fórmula siguiente: X . 100 P= ------------ M Donde:

P= Porcentaje de materia extraña según su clasificación. X= Peso de la materia extraña. M= Peso inicial de la droga.

Determinación de microorganismos.

Las drogas normalmente transportan bacterias y tierra del suelo. Un gran número de bacterias y hongos de la naturaleza aparecen en la microflora de las drogas, siendo predominantes las esporas aeróbicas. La práctica de cosechas, manipulación y producción son también causas adicionales de contaminación y crecimiento microbiano.

Adicionalmente la presencia de aflatoxinas provocadas por hongos se consideran contaminantes altamente peligrosos en una droga.

Los límites establecidos para la contaminación microbiana están de acuerdo al uso que se le va ha dar al material y al material en si mismo.

a) Contaminación de “drogas crudas” que se emplearán en procesos posteriores (incluyendo descontaminación adicional por un proceso físico o químico):

Los límites son dados para drogas no tratadas, cosechados bajo condiciones higiénicas aceptables. por gramo máximo 104 Escherichia coli máximo 105 Tierra vegetal

b) Drogas que serán pretratadas, (elaboración de infusiones y decocciones), o se usarán en forma tópica. por gramo máximo 107 bacterias aeróbicas máximo 103 Sacharomycetes e Hyphomycetes máximo 102 Escherichia coli máximo 104 otras enterobacterias NO SALMONELLA

c) drogas para uso interno por gramo máximo 105 bacterias aeróbicas máximo 103 Sacharomycetes e Hyphomycetes máximo 101 Escherichia coli máximo 103 otras enterobacterias NO SALMONELLA Examen visual e inspección microscópica.

Las drogas son categorizadas atendiendo a sus características sensoriales, macroscópicas y microscópicas. De ahí que la mayor información acerca de su identidad, pureza y calidad pueden darse de estas observaciones.

La inspección visual (Características sensoriales y macroscópicas), está basada en la forma, tamaño, color, características superficiales, texturas y fracturas. Este no puede considerarse como un ensayo definitorio, ya que en caso de adulteraciones con otras drogas de características similares suelen llegarse a resultados erróneos y es necesario la aplicación de los métodos microscópicos y físico-químicos para poder llegar a resultados concluyentes.

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La evaluación microscópica de las drogas es indispensable para su identificación pudiendo emplearse reactivos químicos para lograr una mayor información y visualización de los tejidos. Este ensayo aisladamente, no puede siempre llegar a una completa identificación, aunque utilizado en asociación con otros métodos analíticos ofrece un soporte incalculable.

La comparación con materiales de referencia puede revelar características no descritas en las especificaciones de las drogas. Evaluación macroscópica de las drogas.

Por conveniencia para su estudio, las drogas se agrupan de acuerdo a su clasificación morfológica en: órganos subterráneos; corteza y leños; flores; frutos; semillas y una categoría final que incluye las drogas que no pueden clasificarse bajo los anteriores acápites entre las cuales se encuentran resinas, -mucílagos, etc. Parte experimental. Como primer aspecto antes de comenzar las descripciones macromorfológicas, se debe conocer para las drogas a evaluar la siguiente información. -Nombre científico. -Uso tradicional o reconocido. -Nombre vulgar o vernáculo. -Planta endémica o aclimatada. -Familia botánica. Con la ayuda del microscopio esteroscópico, se realizará una monografía de las drogas crudas a evaluar, teniendo en cuenta para las mismas los siguientes acápites: A. Órganos subterráneos. Las estructuras subterráneas a estudiar de interés farmacognóstico se clasificarán en alguna de las siguientes categorías Raíz Rizoma, Bulbo y Tubérculo. Se observará prácticamente las características siguientes: 1. Tamaño. Dimensiones en largo y diámetro. 2. Color. 3. Olor. 4. Forma y consistencia. Algunos de los términos usados para describir la forma son: rectos, torcidos simples y ramificados también generalmente se habla de forma cilíndrica cónica fusiforme, ovoide, piriforme, napiforme, etc. 5. Condición. Fresca, seca, entera, cortada, privada de algún tejido. 6.Caracteres de la superficie. Lisa, arrugada, estriada, anillada, fisurada. Presencia o no de cicatrices y -yemas. 7. Sección transversal. Tamaño relativo de la corteza, del leño y de la médula. 8. Fractura. Describir como se rompe la pieza cuando se somete a presión; puede ser completa, incompleta, corta, fibrosa, dura, débil, flexible, córnea, etc. 9. Otras particularidades. B. Corteza y leños. La mayoría de los términos descriptivos aplicados a los órganos subterráneos también pueden utilizarse para cortezas y leños. Pueden destacarse además algunas peculiaridades como: 1. Forma de la pieza. Curvada, aplanada, acanalada, tubo simple, tubo doble, tubo compuesto. 2. Superficie externa. Cicatrices de hojas, presencia de lenticelas, mohos, líquenes, etc. 3. Superficie interna. Color, estriaciones, surcos, etc. C. Hojas. Para describir las hojas podemos guiarnos por las siguientes características.

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1. Forma. Puede clasificarse tomando en cuenta el peciolo, lámina, base, ápice, bordes y venación. (Ver Fig.1 a-f). 2 .Textura. Membranosa, coríacea, frágil, suculenta. 3. Superficie. Glabra o pubescente. 4. Color. 5. Olor. 6. Dimensiones Largo y ancho. 7. Condición. Fresca, seca, completa, rota. 8. Peculiaridades. Presencia de glándulas, puntuaciones, pelos, etc.

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D. Flores. Al describir las flores tendremos en cuenta las siguientes características: 1. Estado de desarrollo. 2. Condición Fresca, seca, completa o parte de ella. 3. Color. 4. Olor. 5. Peculiaridades. Aspectos morfológicos más sobresalientes como son: tipo de inflorescencia, tipo de cáliz, tipo de pétalos, número de éstos tipo de ovario, estambres, etc. E. Frutos. Al hacerse el estudio macroscópico del fruto deben definirse que tipo y/o que parte del mismo constituye la droga. Las características más importantes son:

1.Pericarpio. Color, textura, uniforme o modificado. 2.Dehiscencia. 3.Forma. 4.Dimensiones. 5.Color. 6.Olor. 7.Marcas externas o peculiares.

F. Semillas. Las características más relevantes a considerar son: 1. Caracteres físicos. Forma, dimensión, dureza y peso, etc. 2. Color. 3. Olor. 4. Peculiaridades.

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Determinación de las dimensiones de las hojas. En la descripción de las hojas, uno de los parámetros evaluados son sus dimensiones, (largo y ancho), los -cuales pueden variar en dependencia del grado de desarrollo de la planta en el momento de la recolección. El estudio estadístico de la homogeneidad o dispersión de estos valores resulta importante para reconocer si en un tamaño de muestra determinado, los valores encontrados se encuentran dentro de los informados en la monografía de referencia, si esta existe. En el estudio macromorfológico de las hojas se incluye por tanto la evaluación de sus dimensiones. Para ello se selecciona un tamaño de muestra n = 50 y con la ayuda de un pie de Rey o de una regla graduada se determina el largo y el ancho de las mismas. Aplicando conocimientos estadísticos se realizan los histogramas o representaciones gráficas de cada parámetro y se determinan los valores de la media X, desviación estándar y coeficiente de variabilidad, analizando la correspondencia entre los -valores calculados y los valores gráficos. Determinación de Cenizas. Se entiende por cenizas, el residuo que queda después de la ignición de una droga, y se determina por tres métodos diferentes: Cenizas totales, ácido-insolubles y solubles en agua. Las cenizas totales permiten determinar la cantidad de material remanente después de la ignición: “Cenizas fisiológicas”, Derivados de los tejidos de la planta y “Cenizas no fisiológicas”, que son el residuo después de la ignición de la materia extraña (Polvo, arena, tierra, etc.), adherida a la superficie de la droga. Parte experimental

Materiales y reactivos.

- Crisol de porcelana o platino. - Ácido clorhídrico al 10 % - Trípode. - Agua destilada. - Triángulo de porcelana. - Papel de filtro libre de cenizas - Mechero. - Ácido nítrico reactivo. - Mufla. - Solución de nitrato de amonio 10g/100 mL. - Desecadora. - Peróxido de hidrógeno conc. Se determina la masa de no menos de 2.0 g ni más de 3.0 g de la porción de ensayo pulverizada y tamizada con una desviación permisible de 0.5 mg en un crisol de porcelana o platino (en dependencia de la sustancia analizada) previamente tarado. Caliente suavemente la porción de ensayo aumentando la temperatura hasta carbonizar y posteriormente incinere en un horno mufla a una temperatura de 700 a 750 ºC, si no se señala otra temperatura en la norma específica, durante 2 h. Se enfría el crisol en una desecadora y se pesa, repitiéndose el proceso hasta que dos pesadas sucesivas no difieran en más de 0.5 mg por g (masa constante).

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Para obtener la masa constante los intervalos entre calentamiento y pesada son de 30 min. Si el residuo presenta trazas de carbón, se le añaden unas gotas de solución de peróxido de hidrógeno concentrado, ácido nítrico o solución de nitrato de amonio al 10 % m/v y se calienta hasta evaporar los solventes. Al enfriar el crisol el residuo es de color blanco o casi blanco.

M2-M Expresión de los resultados: C =--------- 100 (%)

M1-M

donde: C= porcentaje de cenizas totales en base hidratada. M= masa del crisol vacío (g) M1= masa del crisol con la porción de ensayo (g) M2= masa del crisol con la ceniza (g) 100= factor matemático para los cálculos.

Los valores se aproximan hasta las décimas.

Las cenizas ácido-insolubles son los residuos después de la ebullición de las cenizas totales con ácido clorhídrico diluido. Esta determinación mide la presencia de sílice, especialmente de arena y tierra silícea.

Procedimiento.

A las cenizas totales obtenidas según la técnica descrita, se le añaden de 2-3mL de ácido clorhídrico al 10%. El crisol se tapa con un vidrio reloj y se calienta sobre un baño de agua hirviente durante 10 min. Se lava el vidrio reloj con 5mL de agua caliente y se une al contenido del crisol. La solución se filtra a través de un papel de filtro libre de cenizas; se lava el residuo con agua caliente hasta que el filtrado acidulado con ácido nítrico p.a; al cual se le añade una o dos gotas de solución de nitrato de plata 0.1 mol/L, no muestre presencia de cloruros. El filtrado con el residuo se deseca de 100 a 105 ºC, se transfiere al crisol inicial y se incinera en un horno mufla a una temperatura de 700-750 ºC durante 2h (sino se señala otra temperatura en la norma específica). Posteriormente se coloca en una desecadora y cuando alcance la temperatura ambiente se pesa. Se repite el procedimiento hasta obtener masa constante. M2-M Expresión de los resultados: B=--------- 100 (%) M1-M donde: B= porcentaje de cenizas insolubles en ácido clorhídrico en base hidratada. M= masa del crisol vacío (g) M1= masa del crisol con la porción de ensayos (g) M2= masa del crisol con la ceniza (g) 100= factor matemático. Los valores se aproximan hasta las décimas.

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Las cenizas insolubles en agua son calculadas por diferencia en peso entre las cenizas totales y el residuo remanente después del tratamiento de las cenizas totales con agua. Cuando los valores obtenidos para las cenizas totales son elevados (>5%), es necesario conocer si las mismas están compuestas por metales pesados, lo cual se determina mediante los ensayos de cenizas insolubles, y si este resultado es elevado hay que someter la droga a otros análisis antes de aprobar su uso. Procedimiento.

A las cenizas totales obtenidas en (A), se le añaden de 15 a 20 mL de agua. El crisol se tapa y se hierve suavemente a la llama del mechero durante 5 min. La solución se filtra a través del papel de filtro libre de cenizas. El filtro con el residuo se transfiere al crisol inicial, se carboniza en un mechero y luego se incinera en un horno mufla de 700-750 ºC, durante 2 h. Posteriormente se coloca en una desecadora y cuando alcance la temperatura ambiente se pesa. Se repite el procedimiento hasta alcanzar peso constante. M2-Ma Expresión de los resultados: Ca= --------- x 100 M1-M. Ca= Porcentaje de cenizas solubles en agua en base hidratada. M2= masa del crisol con las cenizas totales (g). Ma= masa del crisol con las cenizas insolubles en agua (g) M1= masa del crisol con la muestra de ensayo. M= masa del crisol vacío. 100= factor matemático. Los valores se aproximan las décimas. Determinación de arsénico y metales pesados. La presencia en las drogas de arsénico y metales pesados, puede ser atribuida a muchas causas, entre las cuales se citan la contaminación ambiental y los residuos de pesticidas. Las contaminación con trazas de arsénico se debe fundamentalmente, al tratamiento de las plantas con ciertos pesticidas, estando los límites permisibles en términos de μg de arsénico por gramo de droga. Para cadmio y plomo, cuya presencia se atribuye fundamentalmente a contaminación de los suelos por desechos industriales, las cantidades máximas permitidas están en el orden de 10 ppm y 0,3 ppm, respectivamente. Determinación de agua (Humedad residual). Un exceso de agua en una droga puede provocar el crecimiento microbiano, la presencia de hongos o insectos y el deterioro, seguido de la hidrólisis de los principios activos. Este ensayo es especialmente importante para drogas que absorben humedad fácilmente o se deterioran rápidamente en presencia de agua. Los límites de agua establecidos en la Farmacopea para las drogas, oscila entre un 8 y un 14 % con pocas excepciones, correspondiendo los valores más altos con la humedad de cortezas, tallos y raíces.

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La humedad residual o límite para la cantidad de agua, puede ser establecida mediante el estudio de secado de la droga. Para esta determinación puede ser empleados dos métodos: Método azeotrópico: Mediante el cual debe obtenerse de forma directa la cantidad de agua presente en la droga cuando ésta es destilada junto con un solvente inmiscible tal como tolueno o xileno. Si el solvente es anhidro, el agua puede ser absorbida por el solvente y el resultado sería falso, por lo que se recomienda saturar el solvente con agua, antes de usarlo. Parte experimental. Materiales y reactivos. - Plancha eléctrica o fuente de calor. - Tolueno. - Equipo esquema (Fig. 2).

Fig. 2 Equipo de determinación de humedad. Método azeotrópico.

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Procedimiento. A un balón de 500mL se transfiere 200 mL de tolueno, se le añaden 2 mL de agua, se monta el equipo, se le añade tolueno al tubo colector hasta el cuello. Se coloca en la fuente de calor y se destila hasta que el volumen de agua en el tubo colector permanezca constante y se mide el volumen inicial de agua (V1). Se deja enfriar el tolueno (tolueno saturado). De la muestra de ensayo pulverizada y tamizada, se pesan 10g, con un error máximo de 0.5 mg y se transfiere al balón que contiene el tolueno saturado de agua; se pone el equipo a la fuente de calor nuevamente y se destila hasta que el volumen de agua en el tubo colector permanezca constante, midiéndose el volumen final de agua (Vt). Vt-V1 Expresión de los resultados: H= ------- 100 M donde: H= Humedad residual (%) V1= Volumen de agua inicial (mL) Vt= Volumen de agua final (mL) 100= Factor matemático. Los resultados se aproximan hasta las décimas. Pérdida por desecación: El cual determina el agua y las sustancias volátiles ya que el método plantea el calentamiento de la droga a 100 - 105ºC ó, en una desecadora sobre pentóxido de fósforo a presión atmosférica o reducida a temperatura ambiente por un período de tiempo específico para cada droga. Este método no es recomendable cuando la planta contiene aceites esenciales u otras sustancias volátiles, para evitar el error que introducirían éstas, en el resultado final. Parte experimental.

Materiales y Equipos

- Balanza analítica Vd. 0.1 mg. - Cápsula de porcelana. - Estufa u horno de calentamiento. - Desecadora.

Procedimiento.

De la muestra de laboratorio, con el grado de trituración que determine la norma específica, se pesan 2 g con desviación permisible de 0.5 mg y se transfieren a una cápsula de porcelana previamente tarada y secada, se calienta y se deseca a 105 ºC durante 3 h. La cápsula se coloca en la

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desecadora, donde se enfría a temperatura ambiente y se pesa, colocándose nuevamente en la estufa durante 1h, volviéndose a pesar, hasta obtener una masa constante.

M2-M1 Expresión de los resultados : Hg= ---------- 100 M2-M donde:

Hg= Pérdida en peso por desecación (%). M2= masa de la cápsula con la muestra de ensayos(g) M1= masa de la cápsula con la muestra de ensayo desecada (g) M= masa de la cápsula vacía. 100= factor matemático. Los resultados se aproximan a las décimas. Determinación de sustancias extraíbles. Se basa en la extracción de las sustancias solubles en agua, alcohol o mezclas hidroalcohólicas mediante maceración y evaporación hasta sequedad de una alícuota del extracto. Este método determina la cantidad de principios activos en una cantidad dada de droga, extraíble con un solvente. Se emplea para aquellas drogas en las cuales no se dispone de un método de ensayo químico o biológico aprobado, para determinar su composición química cuantitativa. Parte experimental. Materiales y reactivos. - Balanza analítica. - Disolvente indicado (agua, alcohol mezclas hidroalcohólicas) - Erlenmeyer de boca esmerilada c/tapa 250 mL. - Zaranda. - Embudo. - Pipetas de 20 mL. - Papel de filtro. - Cápsula de porcelana. - Baño de agua. - Estufa. Procedimiento. De la muestra de ensayo previamente pulverizada y tamizada, se pesan exactamente 5 g y se transfieren a un erlenmeyer de 250 mL; se añaden 100 mL del disolvente, se tapa y se agita durante 6h, dejándose en reposo hasta el día siguiente; se agita 30 min., se deja reposar alrededor de media hora más y se filtra por papel. Se toma una alícuota de 20 mL que se transfiere a una cápsula previamente tarada. Se evapora sobre baño de agua, se deseca en estufa a 105 ºC durante 3 h, se enfría y se pesa. R . 500.100

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Expresión de los resultados: S= -------------- M. (100-H) donde: S= Sustancias solubles (%). H= Humedad de la muestra (%) 500 y 100= factores matemáticos para los cálculos. R= Residuo de la muestra (g) M= Masa de la muestra (g). Los resultados se aproximan hasta las décimas. Determinación del índice de amargor. Muchas drogas empleadas como medicinales presentan un fuerte sabor amargo; aspecto éste utilizado en terapéutica como estimulante del apetito. Los principios amargos estimulan las secreciones del tracto gastrointestinal y en particular del jugo gástrico. Las sustancias amargas pueden ser determinadas químicamente, pero al estar compuestas por dos o más constituyentes con diferentes grados de amargor, es necesario primeramente medir el total de amargor empleando un método biológico. Las propiedades amargas de una droga son determinadas por comparación del extracto de la droga a diferentes concentraciones con una solución diluida de hidrocloruro de quinina. El valor de amargor es expresado en términos de unidades equivalentes a la solución diluida de quinina que contiene 1 g en 2000 mL. Como vehículo para la extracción de la droga se emplean generalmente agua potable, la cual se utiliza también en el lavado bucal después de cada ensayo; no siendo necesario el uso de agua destilada ya que su dureza no tiene una influencia marcada sobre el amargor. La sensibilidad del amargor varía de persona a persona y en una misma persona puede variar en diferentes momentos (después de fumar, ingerir alimentos de sabor fuerte, etc.). Para llevar a cabo el ensayo, el catador, (persona que está entrenada en ensayos de este tipo), debe comenzar probando la concentración menor de la muestra de ensayo, y transcurrido un período corto de tiempo (15 min.), después de haberse enjuagado la boca con agua potable, debe comparar el amargor contra la concentración menor de la sustancia de referencia (hidrocloruro de quinina). La sensación de amargor debe ensayarse en la parte superior de la lengua, en las partes laterales de la boca y en la parte inferior o base de la lengua. Si la persona no es capaz de apreciar la sensación amarga de la concentración menor, 10,058 mg de la solución de quinina, no se considera apta para esta determinación. Determinación del índice de espuma.

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Esta determinación se realiza con vista a establecer la capacidad que presentan algunas drogas de formar espuma persistente cuando una decocción o solución acuosa se agita vigorosamente en un corto período de tiempo. Este ensayo es característico de compuestos de tipo saponina o de otros que debido a sus características estructurales son capaces de disminuir la tensión superficial del agua. Determinación de la actividad hemolítica. Muchas drogas en especial aquellas derivadas de Caryophyllaceae, Araliaceae, Sapindaceae, Primulaceae, y Dioscoreaceae, contienen saponinas. La propiedad más característica de éstos compuestos es la de causar, la ruptura o lisis de los glóbulos rojos. La actividad hemolítica de una droga, o de un preparado que contiene saponinas, se determina por comparación con un material de referencia o saponina R, la cual tiene una actividad hemolítica de 1000 unidades por gramos. Una suspensión de glóbulos rojos se mezcla con igual volumen de una dilución seriada de la droga y se determina la menor concentración que produce un efecto completo de hemólisis. Este ensayo se lleva a cabo simultáneamente con el patrón de referencia. Todos los procedimientos propuestos para determinar la actividad hemolítica están basados en el mismo principio, pero presentan algunas variaciones referidas a: la procedencia de los glóbulos rojos; los métodos de preparación de la suspensión de los glóbulos rojos y del extracto de la droga, la actividad hemolítica definida del material de referencia y el método experimental. Con vista a obtener valores confiables, es esencial estandarizar las condiciones experimentales y especialmente determinar la actividad hemolítica por comparación con la saponina de referencia. Cromatografía en capas delgadas. La cromatografia en capa delgada es particularmente útil para la determinación cualitativa de pequeñas cantidades de impureza. La técnica es fácil de realizar, efectiva y emplea aparatos no costosos. Se usa con frecuencia para evaluar drogas y sus preparaciones. Deben establecerse las siguientes especificaciones para cada determinación: a) Tipo de absorbente y método de activación; sí éste último no se menciona calentar a 110ºC por 30 min. b) El método de preparación y la concentración de la muestra y la solución de referencia. c) El volumen de la solución a aplicarse en la placa. d) La fase móvil, la temperatura de desarrollo y la distancia de migración del solvente (fase móvil). e) El método de secado, la temperatura y el método de detección. f) Para el resultado obtenido observar las manchas. - Número y posición aproximada. (o el valor Rf si es necesario). - Fluorescencia y/o color. Determinaciones cualitativas. Antes de realizar la extracción completa de la muestra a ser analizada, es necesario llevar a cabo pruebas preliminares sencillas y rápidas que permitan detectar cualitativamente la presencia de determinados grupos de compuestos. Esto se logra mediante las técnicas de "screening" (tamizaje), que

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se ayudan de la microquímica para evidenciar estos grupos de constituyentes mediante formación de precipitados, coloraciones, etc. Estas reacciones se caracterizan porque son selectivas para las clases o grupos de compuestos que se investigan, son simples y rápidas, detectan la mínima cantidad posible y utilizan un mínimo de equipo de laboratorio. No debe olvidarse que cuando se obtiene un resultado negativo, este puede deberse a la ausencia de la clase de compuestos buscada, a la selección errónea del solvente para extraer, a la presencia de sustancias extrañas que interfieran ó a una concentración en el orden de trazas del compuesto ensayado. Con relación a la selección del disolvente, este da lugar a diferentes métodos o esquemas de trabajo para el tamizaje fitoquímico. En el desarrollo de esta actividad se persigue el aprendizaje y aplicación de técnicas de tamizaje al material vegetal fresco, seco o en forma de extracto blando o seco. Parte experimental. Materiales y reactivos. - Gradillas - Éter etílico. - Tubos de ensayo - Etanol. - Agua destilada. - Reactivos del tamizaje. Procedimiento. La planta fresca, seca o el residuo de una extracción; es sometida a tres extracciones sucesivas según el esquema de la Fig.3. A cada extracto I, II y III, se le mide el volumen obtenido y se le calcula su concentración, esto es, gramos de sustancias extraídas por mL de extracto. Para ello tome una alícuota de 5 mL y páselo a una cápsula previamente tarada, evapore a sequedad en baño de agua y pese nuevamente. Se procede de igual forma que la técnica descrita para le determinación de sustancias solubles.

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30 - 50 g MATERIAL VEGETAL

EXTRAER CON 90 -150 mL DE ÉTER ETÍLICO POR MACERACIONDURANTE 48 HORAS A TEMPERATURA AMBIENTE

FILTRAR

EXTRACTO ETÉREOMedir volumen y calcular concentración

RESIDUO SÓLIDOSecar y pesar

EXTRAER CON 3 VECES EL PESO DEL RESIDUOEN VOLUMEN CON ETANOL POR MACERACIÓNDURANTE 48 HORAS.

FILTRAR

EXTRACTO ALCOHÓLICOMedir volumen y calcular concentración

RESIDUO SÓLIDOSecar y pesar

EXTRAER CON 3 VECES EL PESO DEL RESIDUOEN VOLUMEN CON AGUA DESTILADA POR MACERACIÓNDURANTE 48 HORAS.

FILTRAR

EXTRACTO ACUOSOMedir volumen y calcular concentración

RESIDUO SÓLIDOSecar, pesar y desechar

Fig. 3 Extracción sucesiva del material vegetal para la aplicación de técnicass de Tamizaje Fitoquímico.

Posteriormente en cada extracto por separado se procede de acuerdo a los esquemas representados en las Figuras 4, 5 y 6. En cada caso para realizar los ensayos se procede de la siguiente forma: Ensayo de Sudan: Permite reconocer en un extracto la presencia de compuestos grasos, para ello, a la alícuota de la fracción en el solvente de extracción, se le añade 1 mL de una solución diluida en agua del colorante Sudan III o Sudan IV. Se calienta en baño de agua hasta evaporación del solvente.

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EXTRACTO ETÉREO

DIVIDIR EN FRACCIONES

5 mLENSAYO DE SUDAN

(ACEITES Y GRASAS)

15 mL (dividir en 3 porciones)ENSAYOS DE DRAGENDORFF

MAYER Y WAGNER(ALCALOIDES)

5 mLENSAYO DE BALJET

(LACTONAS Y COUMARINAS)

5 mLENSAYO DE LIEBERMAN-BUCHARD

(TRITERPENOS-ESTEROIDES)

Fig. 4 Esquema de las reacciones a realizar en el extracto de éter etílico. La presencia de compuestos grasos se considera positiva si aparecen gotas o una película coloreada de rojo en el seno del líquido o en las paredes del tubo de ensayos respectivamente.

EXTRACTO ALCOHÓLICO

DIVIDIR EN FRACCIONES

1mLENSAYO DECATEQUINAS

2 mLENSAYO DE

RESINAS

2 mLENSAYO DE

FEHLING(AZ. REDUCTORES)

2 mLENSAYO DE BALJET

(LACTONAS)

2 mLENSAYO DE

LIEBERMAN-BUCHARD(TRITERPENOS-ESTEROIDES)

2 mLENSAYO ESPUMA

(SAPONINAS)

2 mLENSAYO DE

Cl3Fe

(FENOLES Y TANINOS)

2 mLENSAYO DENINHIDRINA

(AMINOÁCIDOS)

2 mLENSAYO DEBORNTRAGER

(QUINONAS)

2 mLENSAYO DE

SHINODA(FLAVONOIDES)

2 mLENSAYO DE

KEDDE(CARDENÓLIDOS)

2 mLENSAYO DE

ANTOCIANIDINA

(ALCALOIDES)MAYER Y WAGNER

ENSAYOS DE DRAGENDORFF6 ML en 3 porciones

Fig. 5 Esquema de las reacciones a realizar en el extracto alcohólico. Ensayo de Dragendorff: Permite reconocer en un extracto la presencia de alcaloides, para ello, si la alícuota del extracto está disuelta en un solvente orgánico, este debe evaporarse en baño de agua y el residuo redisolverse en 1 mL de ácido clorhídrico al 1 % en agua. Si el extracto es acuoso, a la alícuota se le añade 1 gota de ácido clorhídrico concentrado, (calentar suavemente y dejar enfriar hasta acidez). Con la solución acuosa ácida se realiza el ensayo, añadiendo 3gotas del reactivo de Dragendorff, si hay opalescencia se considera (+), turbidez definida (++),precipitado (+++). Ensayo de Mayer: Proceda de la forma descrita anteriormente, hasta obtener la solución ácida. Añada una pizca de cloruro de sodio en polvo, agite y filtre. Añada 2 o 3 gotas de la solución reactiva de Mayer, si se observa opalescencia (+), Turbidez definida (++), precipitado coposo (+++). Observación: En el caso de alcaloides cuaternarios y/o amino-óxidos libres, éstos solo se encontrarán en el extracto acuoso y para considerar su presencia la reacción debe ser (++) ó (+++), en todos los casos, ya que un resultado (+), puede provenir de una extracción incompleta de bases primarias, secundarias o terciarias.

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EXTRACTO ACUOSO

6 ML en 3 porcionesENSAYOS DE DRAGENDORFF

MAYER Y WAGNER(ALCALOIDES)

2 mLENSAYO DE CLORURO

FÉRRICO(TANINOS)

2 mLENSAYO DE SHINODA

(FLAVONOIDES)

2 mLENSAYO DE FEHLING

(AZ. REDUCTORES)

2 mLENSAYO DE ESPUMA

(SAPONINAS)

10 mLENSAYO DEMUCÍLAGOS

1 Ó 2 GOTASENSAYO DE

PRINCIPIOS AMARGOS

DIVIDIR EN FRACCIONES

Fig. 6 Esquema de las reacciones a realizar en el extracto acuoso. Ensayo de Wagner: Se parte al igual que en los casos anteriores de la solución ácida, añadiendo 2 ó 3 gotas del reactivo, clasificando los resultados de la misma forma. Ensayo de Baljet: Permite reconocer en un extracto la presencia de compuestos con agrupamiento lactónico, en particular Coumarinas, aunque otros compuestos lactónicos pueden dar positivo al ensayo. Para ello, si la alícuota del extracto no se encuentra en alcohol, debe evaporarse el solvente en baño de agua y redisolverse en la menor cantidad de alcohol (1 mL). En estas condiciones se adiciona 1mL del reactivo, considerándose un ensayo positivo la aparición de coloración o precipitado rojo (++ y +++) respectivamente. Ensayo de Hidroxamato férrico para coumarinas: Una gota del extracto se coloca en una placa de porcelana y se añade una gota de clorhidrato de hidroxilamina disuelto en etanol al 10 %. Se añaden unas gotas de hidróxido de potasio al 10% en etanol y se calienta a la llama hasta burbujeo, se añaden unas gotas de ácido clorhídrico 0.5 mol/L y una gota de cloruro férrico al 1% en agua. El desarrollo de una coloración violeta (+), claro (++), intenso (+++). El reactivo de Baljet se prepara de la siguiente forma: Solución 1: Hidróxido de sodio al 10 % en agua. Solución 2: Ácido pícrico al 1 % en etanol. Las soluciones se tienen preparadas de forma independiente y se mezcla igual cantidad en volumen de cada una de ellas justo en el momento de realizar el ensayo. Dicha mezcla es la que se adiciona a la alícuota a evaluar. Ensayo de Borntrager: Permite reconocer en un extracto la presencia de quinonas. Para ello si la alícuota del extracto no se encuentra en cloroformo, debe evaporarse el solvente en baño de agua y el residuo redisolverse en 1 mL de cloroformo. Se adiciona 1 mL de hidróxido de sodio, hidróxido de potasio ó amonio al 5 % en agua. Se agita mezclando las fases y se deja en reposo hasta su

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ulterior separación. Si la fase acuosa alcalina (superior) se colorea de rosado o rojo, el ensayo se considera positivo. Coloración rosada (++), coloración roja (+++). Ensayo de Lieberman-Burchard: Permite reconocer en un extracto la presencia de triterpenos y/o esteroides, por ambos tipos de productos poseer un núcleo del androstano, generalmente insaturado en el anillo B y la posición 5-6. Para ello, si la alícuota del extracto no se encuentra en cloroformo, debe evaporarse el solvente en baño de agua y el residuo redisolverse en 1 mL de cloroformo. Se adiciona 1 mL de anhídrido acético y se mezcla bien. Por la pared del tubo de ensayos se dejan resbalar 2-3 gotas de ácido sulfúrico concentrado sin agitar. Un ensayo positivo se tiene por un cambio rápido de coloración: 1- Rosado-azul muy rápido. 2- Verde intenso-visible aunque rápido. 3- Verde oscuro-negro-final de la reacción. A veces el ensayo queda en dos fases o desarrollo de color. Muy pocas veces puede observarse el primer cambio. El tercer cambio generalmente ocurre cuando el material evaluado tiene cantidades importantes de estos compuestos. IMPORTANTE : Para realizar este ensayo no puede haber agua en el medio de reacción pues ésta con el ácido sulfúrico reacciona de forma violenta y puede ocurrir un accidente. La reacción de Lieberman-Burchard se emplea también para diferenciar las estructuras esteroidales de los triterpenoides, las primeras producen coloraciones azul o azul verdoso, mientras que para las segundas se observa rojo, rosado o púrpura. Estas coloraciones pueden variar por interferencias producidas por carotenos, xantofilas y esteroides saturados que puedan estar presentes. Ensayo de catequinas: Para ello, tome de la solución alcohólica obtenida una gota, con la ayuda de un capilar y aplique la solución sobre papel de filtro. Sobre la mancha aplique solución de carbonato de sodio. La aparición de una mancha verde carmelita a la luz UV, indica un ensayo positivo. Ensayo de resinas: Para detectar este tipo de compuesto, adicione a 2 mL de la solución alcohólica, 10 mL de agua destilada. La aparición de un precipitado, indica un ensayo positivo. Ensayo de Fehling: Permite reconocer en un extracto la presencia de azúcares reductores. Para ello , si la alícuota del extracto no se encuentra en agua, debe evaporarse el solvente en baño de agua y el residuo redisolverse en 1-2 mL de agua. Se adicionan 2 mL del reactivo y se calienta en baño de agua 5-10 minutos la mezcla. El ensayo se considera positivo si la solución se colorea de rojo o aparece precipitado rojo. El reactivo se prepara de la siguiente forma: Solución A: Se pesan 35 g de sulfato cúprico hidratado cristalizado y se disuelven con agua hasta un volumen total de 1000 mL. Solución B: Se pesan 150 g de tartrato de sodio y potasio y 40 g de hidróxido de sodio y se disuelven con agua hasta un volumen total de 1000 mL. Las soluciones se tienen preparadas de forma independiente y se mezcla igual cantidad en volumen de cada una de ellas justo en el momento de realizar el ensayo. Dicha mezcla es la que se adiciona a la alícuota a evaluar.

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Ensayo de la espuma: Permite reconocer en un extracto la presencia de saponinas, tanto del tipo esteroidal como triterpénica. De modo que si la alícuota se encuentra en alcohol, se diluye con 5 veces su volumen en agua y se agita la mezcla fuertemente durante 5-10 minutos. El ensayo se considera positivo si aparece espuma en la superficie del líquido de más de 2 mm de altura y persistente por mas de 2 minutos. Ensayo del cloruro férrico: Permite reconocer la presencia de compuestos fenólicos y/o taninos en un extracto vegetal. Si el extracto de la planta se realiza con alcohol, el ensayo determina tanto fenoles como taninos. A una alícuota del extracto alcohólico se le adicionan 3 gotas de una solución de tricloruro férrico al 5 % en solución salina fisiológica (cloruro de sodio al 0.9 % en agua). Si el extracto es acuoso, el ensayo determina fundamentalmente taninos. A una alícuota del extracto se añade acetato de sodio para neutralizar y tres gotas de una solución de tricloruro férrico al 5 % en solución salina fisiológica, un ensayo positivo puede dar la siguiente información general: -Desarrollo de una coloración rojo-vino, compuestos fenólicos en general. -Desarrollo de una coloración verde intensa, taninos del tipo pirocatecólicos. -Desarrollo de una coloración azul, taninos del tipo pirogalotánicos. Ensayo de la ninhidrina: Permite reconocer en los extractos vegetales la presencia de aminoácidos libres o de aminas en general. Se toma una alícuota del extracto en alcohol, o el residuo de la concentración en baño de agua, si el extracto se encuentra en otro solvente orgánico, se mezcla con 2 mL de solución al 2 % de ninhidrina en agua. La mezcla se calienta 5-10 minutos en baño de agua. Este ensayo se considera positivo cuando se desarrolla un color azul violáceo. Ensayo de Shinoda: Permite reconocer la presencia de flavonoides en un extracto de un vegetal. Si la alícuota del extracto se encuentra en alcohol, se diluye con 1 mL de ácido clorhídrico concentrado y un pedacito de cinta de magnesio metálico. Después de la reacción se espera 5 minutos, se añade 1 mL de alcohol amílico, se mezclan las fases y se deja reposar hasta que se separen. Si la alícuota del extracto se encuentra en agua, se procede de igual forma , a partir de la adición del ácido clorhídrico concentrado. El ensayo se considera positivo, cuando el alcohol amílico se colorea de amarillo, naranja, carmelita o rojo; intensos en todos los casos. Ensayo de Kedde: Permite reconocer en un extracto la presencia de glicósidos cardiotónicos. Una alícuota del extracto en etanol se mezcla con 1 mL del reactivo y se deja reposar durante 5-10 minutos. Un ensayo positivo es en el que se desarrolla una coloración violácea, persistente durante 1-2 horas. El reactivo de Kedde se prepara de la siguiente forma: -Solución 1: Ácido 3.5 dinitrobenzóico al 2 % en metanol. -Solución 2: Hidróxido de potasio al 5.7 % en agua. Las soluciones se tienen preparadas de forma independiente y se mezcla igual cantidad en volumen de cada una de ellas justo en el momento de realizar el ensayo. Dicha mezcla es la que se adiciona a la alícuota a evaluar.

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Ensayo de antocianidinas: Permite reconocer en los extractos vegetales la presencia de estas estructuras de secuencia C6-C3-C6 del grupo de los flavonoides. Se calientan 2 mL del extracto etanólico 10 min. con 1 mL de HCL conc. Se deja enfriar y se adiciona 1 mL de agua y 2 mL de alcohol amílico. Se agita y se deja separar las dos fases. La aparición de color rojo a marrón en la fase amílica, es indicativa de un ensayo positivo. Ensayo de mucílagos: Permite reconocer en los extractos de vegetales la presencia de esta estructura tipo polisacárido, que forma un coloide hidrófilo de alto índice de masa que aumenta la densidad del agua donde se extrae. Para ello una alícuota del extracto en agua se enfría a 0-5 ºC y si la solución toma una consistencia gelatinosa el ensayo es positivo. Ensayo de principios amargos y astringentes: El ensayo se realiza saboreando 1 gota del extracto acuoso o del vegetal y reconociendo el sabor de cada uno de estos principios, bien diferenciados al paladar. También pueden realizarse otros ensayos no comprendidos en este esquema de tamizaje, para la detección de otros compuestos. A continuación expondremos algunos de estos ensayos. Glicósidos cianogenéticos: Coloque unos 5 g de material vegetal en un erlenmeyer de 125 mL y adicione suficiente agua para humedecer la muestra. Prepare un papel de picrato de sodio sumergiendo una tira de papel de filtro en una solución recién preparada de picrato de sodio (5 g de carbonato de sodio + 0.5 g de ácido pícrico y cantidad suficiente de agua para 1000 mL); conserve esta solución en frasco seco. Aproximadamente 1 mL de cloroformo se añade a la muestra humedecida para resaltar la actividad enzimática. Inserte el papel de picrato de sodio en el recipiente con la muestra, colocándolo de forma tal que no toque las paredes del mismo. Tape el recipiente y caliente a 35 ºC por unas 3 horas. Observe los cambios de coloración del papel, si en 3 h no se produce variación, puede afirmarse la ausencia de los glicósidos cianogenéticos, pero si en 15 min. el papel cambia de amarillo a diferentes tonos rojos, indica la presencia de HCN en cantidades apreciables. Aceites, hidrocarburos y carotenos: En un embudo de separación al cual se le coloca un pedacito de algodón en el orificio interior, se adicionan 5 g de droga en polvo y 15 mL de solvente de baja polaridad (éter de petróleo o tetracloruro de carbono). Tape el embudo para evitar la evaporación del solvente y déjelo en reposo 6 h como mínimo. Abra la llave del embudo y obtenga de esta forma el extracto. I- Ensayo de aceite fijo, secante o esencial: Tome 5 mL del extracto y déjelo evaporar sobre un vidrio reloj o placa petri a temperatura ambiente. La aparición de un líquido oleoso después de la evaporación, si deja mancha de grasa sobre el papel de filtro indica presencia de aceite fijo. Si al evaporarse el disolvente aparece una película fina resinosa, indica presencia de aceite secante. Si al evaporarse el disolvente aparece un líquido oleoso aromático que no deja mancha de grasa sobre el papel de filtro indica la presencia de aceite esencial. II- Ensayo de hidrocarburos: Tome 10 mL del extracto y déjelo evaporar al aire, disuelva el residuo obtenido en acetona calentando suavemente sobre baño de agua si fuera necesario. Deje algunas horas en el refrigerador. La aparición de un precipitado, indica la presencia de hidrocarburos.

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III- Ensayo de carotenos: Si el ensayo de hidrocarburos descrito en II, resultara positivo, filtre el precipitado obtenido y disuelva el residuo en 2 mL de cloroformo. Tome la solución clorofómica y adicione reactivo de Carr-Price. La aparición de una coloración verde-azulada indica presencia de carotenos. Determinaciones cuantitativas. Introducción. Los análisis cuantitativos de drogas y extractos requieren de una manipulación precisa para lograr dosificar los principios activos ensayados. Existen algunos métodos generales que permiten determinar la concentración de algunos principios activos en sus mezclas y otros que permiten cuantificar un principio activo en particular. Los análisis de las drogas no están restringidos a los métodos discutidos en el presente capítulo y pueden ser usados además, otros muchos métodos y técnicas de alta resolución, para ofrecer mayores detalles sobre las drogas y sus constituyentes. Determinación de taninos. Los taninos (o sustancias tánicas), son sustancias capaces de cambiar la piel en cuero por enlazamiento con las proteínas formando sustancias insolubles en agua, las cuales son resistentes a los enzimas proteolíticas. Este proceso cuando se aplica a tejidos vivos es conocido como acción terapéutica de los taninos. Están ampliamente distribuidos en las plantas y se encuentran disueltos en el jugo celular, con frecuencia en algunas vacuolas. Son sustancias de composición química compleja. Cuando se degradan o hidrolizan se obtienen polifenoles relativamente simples. En general son polímeros de alto peso molecular que forman soluciones coliodales cuando se disuelven con agua. Dan reacciones características de coloración con las sales férricas y algunos reactivos de precipitación. Existen diferentes métodos para su cuantificación, dentro de los cuales citaremos: A. Método espectrofotométrico con polvo de piel. Parte experimental. Materiales y reactivos. - SR ácido fosfotúngstico. - Matraz de 25 mL. - Soln. de carbonato de sodio. - Embudo.

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- Polvo de piel. - Papel de filtro 12 cm de diámetro - Pirogalol. - Espectrofotómetro UV-vis. Procedimiento. En un matráz de 25 mL se diluye la cantidad indicada de droga finamente pulverizada con 150 mL de agua. La mezcla se lleva a ebullición y se deja reposar durante unos 30 minutos en baño de agua. Posteriormente la mezcla se enfría en agua corriente a 20 °C y se diluye con agua potable a 250 mL. Después que se sedimentan las partículas de drogas, se filtra el líquido sobrenadante a través de un filtro de papel de 12 cm de diámetro. Los primeros 50 mL filtrados se desechan y los siguientes se utilizan para la determinación. Polifenoles totales : Se pipetean 5,0 mL de líquido filtrado y se diluyen con agua a 25,00 mL. A 2,00 mL de esta solución se le añaden 1,00 mL de solución reactivo de ácido fosfotúngstico y cuidadosamente se le añaden también 17,0 mL de solución de carbonato de sodio (50,0 g/100,0 mL). Después de 120 seg. de añadida la solución de carbonato de sodio, se mide la absorbancia (A1) de la solución en celda de 1 cm de espesor a una longitud de onda de 750 nm, usando agua como blanco. Polifenoles no reactivos con polvo de piel : A 10,0 mL de líquido filtrado se le añaden 0,100 g de polvo de piel y se agita por una hora. La mezcla se filtra. Se pipetean 5,00 mL de filtrado y se diluyen con agua a 25,0 mL. A 2,0 mL de esta solución se le añade 1,00 mL de solución reactivo de ácido fosfotúngstico y cuidadosamente se le añaden también 17,0 mL de solución de carbonato de sodio (50,0 g/100,0 mL). Después de 120 seg. de añadida la solución de carbonato de sodio se mide la absorbancia (A2) de la solución en celda de 10 mm de espesor a longitud de onda 750 nm, usando agua como blanco. Solución de referencia : Se disuelven 0,500 g de pirogalol en 100,00 mL de agua. Se pipetean 5,0 mL de esta solución y se diluyen con agua a 100,00 mL. A 2,00 mL de esta solución se le añaden 1,00 mL de solución reactivo de ácido fosfotúngstico y ciudadosamente se le añaden también 17,00 mL de solución de carbonato de sodio, se mide la absorbancia (A3) de esta solución en celda de 1 cm de espesor a la longitud de onda de 750 nm, usando agua como blanco. Expresión de los resultados:

6250 (A1 - A2)Ew1 % de tanino= -----------------------Ew2

(100-a) A3 donde: A1= absorbancia de los polifenoles totales. A2= absorbancia de los polifenoles no reactivos con polvo de piel. A3= absorbancia de la solución de comparación. a= pérdida por desecación en porcentaje de masa. Ew1= pesada de la droga en gramo.

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Ew2= pesada del pirogalol en gramo. % taninos, calculados como pirogalol sobre la base de la droga desecada a 105 ºC. B. Método del permanganato de potasio. Parte experimental. Materiales y reactivos. - Solución índigo carmín. - Beakers 1L. - Solución gelatina. - Bureta 50 mL. - Solución acidificada de NaCl - Probetas 25 y 50 mL. - Solución KMnO4 0,1 mole/L - Pipetas 2 mL. - Agitador de vidrio. Procedimiento. Adicionar 25 mL de solución de índigo carmín y 750 mL de agua a 2 mL de extracto acuoso. Añadir solución de permanganato lentamente con una bureta y con agitación hasta obtener coloración verde claro. Continuar la valoración hasta cambio de color a amarillo brillante con el borde rosado débil. Designe los mL de KMnO4 utilizados como "a". Mezcle 20 mL del extracto, 80 mL de agua destilada, 50 mL de solución de gelatina, 100 mL de solución ácida de NaCl y 10 g de Caolín polvo en un frasco. Tape el frasco y agite durante unos minutos. Deje sedimentar y filtre a través de papel de filtro. Mezcle 25 mL de filtrado, con 25 mL de solución de índigo carmín y 750 mL de agua. Valorar con KMnO4; designe los mL consumidos como “b” Calcule el porcentaje de taninos totales según:

(a-b) . equiv.KMnO4 . 0,0042 % taninos = ------------------------------------------------ . 100

mL de alícuota tomada del extracto. C. Método del tungsto-molibdico-fosfórico. Parte experimental. Materiales y reactivos. - Etanol - Balanza analítica.

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- Tungstato de sodio - Erlenmeyer. - Ac. fosfomolibdico - Zaranda. - Carbonato de sodio deshidratado - Embudo. - Ácido tánico - Papel de filtro. - Pipeta 5. - Matraz aforado 50 mL. - Equipo reflujo. Procedimiento. 10,0 g de la droga en polvo se lleva a un frasco cónico de 250 mL con 500 mL de alcohol al 50 %. Se mantiene en agitación durante 6 h en zaranda, se deja en reposo 8 h y se agita nuevamente 30 min. y se filtra. Se transfieren 3 mL del filtrado a un matráz aforado de 50 mL y se diluye con agua destilada hasta enrase (Sm). Se prepara un juego de 4 matraces aforados de 50 mL cada uno (B,P,M1 y M2) y se procede de la siguiente forma: Reactivo B P M1 y M2 Soln muestra. (SM) - - 1,0 mL Soln referencia - 3,0 mL - Agua destilada 5,0 mL 2,0 mL 4,0 mL Reactivo para taninos. 2,0 mL 2,0 mL 2,0 mL Se agita se deja en reposo 5 min. Reactivo B P M1 y M 2 Soln sodio carbonato 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL Se completa con agua destilada hasta enrase y se mezcla bien. Se leen las absorbancias de la soln de referencia y las muestras a 700 nm en un término no mayor de 2 min. Los cálculos se determinan según: Am . P . 1000 . 100 X= ---- -------------------- Ap . PM . (100-p) donde: X= % de taninos en la droga. Am= absorbancia de la muestra. Ap= absorbancia de la soln de referencia.

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P= masa de la sustancia de referencia (g). p= % de humedad de la droga. PM= masa de la droga (g) 1000 y 100= factor matemático para el cálculo. Reactivo para tanino. Se disuelven 10 g de tungstato de Na dihidratado, 0,2 g de ác. fosfomolibdico y 5 mL de ác. fosfórico al 85 % en 75 mL de agua destilada. se refluja la soln por 2 h y después se completa a 100 mL con agua. Solución de carbonato de sodio. Se disuelven 10 g de carbonato de sodio anhidro en 50 mL de agua destilada. Solución de referencia. Se pesan con exactitud 25 mg de ác. tánico (previamente secado a 100 ºC durante 2 h) y se disuelven en agua hasta completar 100 mL. Se pipetean 20 mL de la soln y se diluye a 100 mL con agua destilada (Sr). Determinación de antraquinonas. Introducción. Las quinonas son dicetonas insaturadas, que por reducción, se convierten en polifenoles, los que fácilmente las regeneran por oxidación. Por sus colores amarillo a violeta, contribuyen a la pigmentación de numerosos vegetales y de algunos animales. Algunas como la vitamina K, la ubiquinona (coenzima Q) y las plastoquinonas intervienen en los fenómenos respiratorios, transportando electrones, por lo que se les encuentra en todos los seres vivos. Sin considerar las anteriores, alrededor de la mitad de las conocidas se han encontrado en Angiospermas, otras tantas en hongos y vegetales unicelulares; pero casi no se han localizado quinonas en las monocotiledóneas. Por el sistema arómatico que dan al reducirse, se les puede dividir en: benzoquinonas, naftoquinonas, antraquinonas y fenantroquinonas. Si los grupos cetónicos están contiguos se le llama orto y si están separados por un grupo vinilo, para. Las antraquinonas constituyen el grupo más numeroso de quinonas. Se encuentran frecuentemente en las Rubiaceaes, Rhamnaceaes y Poligonaceaes. Las cualidades tintoreas y purgantes de algunas plantas de esta familias se debe a sus quinonas. La mayoría de las antraquinonas están hidroxiladas en C1 y C2 y con frecuencia están en forma de glicósidos, los que se hidrolizan durante el aislamiento.

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Parte esperimental. Materiales y reactivos. - Erlenmeyer de 150 mL - Metanol-agua 1:1 - Embudo - HCL 10 %. - Papel de filtro - Eter etílico. - Papel indicador rojo congo - H2S04 50 %. - Embudo separador - Soln. de NaOH de conc. molar en equiv. 1 mol/L. - Soln. HCO3Na de conc. molar en equiv. 1 mol/L. Procedimiento. En un erlenmeyer se colocan 10 g de planta molida y se le añaden 50 mL de una solución de metanol agua 1:1. Se agita durante 30 min. Se filtra y el residuo se somete nuevamente al mismo proceso dos veces más. Se elimina el metanol al vacío, en baño de agua y se acidifica la solución restante con HCL al 10 % hasta que tome coloración azul el papel de rojo congo. Extraer 5 veces con 20 mL de éter etílico. Reunir las fases etéreas y separar la fase acuosa que se desecha. La fase éterea se extrae con 5 mL de solución de HCO3Na de concentración molar equivalente 1 mol/L 4 veces, reuniendose los extractos acuosos y desechándose el extracto etéreo. Al extrato acuoso se le añaden 40 mL de éter y se acidifica con ácido sulfúrico al 50 %, teniendo cuidado pues se produce la eliminación de un gas. Se separa la fase etérea. La fase acuosa se extrae con 20 mL de éter 2 veces y se procede a unir con la anteriormente extraida. Filtre por papel y pase el filtrado a un matráz aforado de 100 mL y complete con éter. (Esta solución es muy sensible a la luz, por lo que se debe trabajar rápido. Tome 5 mL de esta solución y extraiga con 10 mL de NaOH de concentración molar en equivalente 1 mol/L. Tome la fase acuosa y añadale 0,3 mL de H2O2 al 3 %. Caliente en baño María durante 4 min. Enfrie. Lea en el fotocolorímetro con filtro 530. Determine la concentración de la muestra en la gráfica previamente trazada con el patrón.

Patrón. En un balón aforado de 100 mL, añada 0,01 g de 1,8 dihidroxiantraquinona y enrase a 100 mL con H2O. En 5 embudos de separación añada las siguientes cantidades: a) 29,9 mL de éter 0,1 mL de patrón b) 29,7 mL de éter 0,3 mL de patrón c) 29,5 mL de éter 0,5 mL de patrón d) 28,0 mL de éter 1,0 mL de patrón e) 28,0 mL de éter 2,0 mL de patrón.

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Añada 10 mL de NaOH de conc. molar en equivalente 1 mol/L a cada uno. Mezcle lentamente durante 3 min. y déjelo en reposo. Separe la fase acuosa y lea en cubeta de 1 cm con filtro 530 contra NaOH de concentración molar en equivalente 1 mol/L. Determine la gráfica y realice los cálculos. Determinación de aceites volátiles. Los aceites volátiles son caracterizados por su olor, apariencia oleosa y facilidad de volatilizarse a temperatura ambiente. Químicamente, están compuestos por lo general, por mezclas de diversos compuestos, entre los cuales se encuentran los monoterpenos y sesquiterpenos, tanto los hidrocarburos como sus derivados oxigenados, así como, algunos compuestos aromáticos. Para estos compuestos se emplean los términos de esencias, aceites esenciales y aceites volátiles; siendo éste último el preferido por ser el que mejor describe sus propiedades físicas. La obtención y caracterización de aceites esenciales responde a un método de obtención de extractos por destilación, pudiendo servir además como método cuantitativo de análisis. La destilación comprende variantes según si el material fresco o seco se altera por ebullición con agua. En la destilación de una mezcla de dos líquidos inmiscibles, las cantidades relativas en peso de los dos líquido que se recogen en el colector son directamente proporcionales a: 1.- Las tensiones de vapor de ambos líquidos a la temperatura de destilación. 2.- A sus masas molares. Además, la mezcla destilará a una temperatura constante mientras exista por lo menos algo de cada uno de los componentes. Para la obtención de aceites esenciales, pueden ser empleados alguno de los equipos representados en la Fig. 7

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Fig. 7 Equipos de obtención de aceites esenciales.

A y B, Hidrodestilación C. Arrastre con vapor

Parte experimental. Materiales y reactivos. - Balanza analítica.

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- Plancha eléctrica o fuente de calor. - Balón o matraz de destilación. - Aparato para la determinación de aceite esencial. - Pesa filtro de 25 mL. - Baño de agua termostatado. - Sulfato de sodio anhidro. - Eter etílico. - Sol. de NaCL 1 % m/v. Procedimiento. Se pesan 100 g de la droga seca y molida, si no se especifica otra cosa en la norma, se transfieren a un balón de destilación de 1 L, se añaden 400 mL de solución de cloruro de sodio y se conecta el equipo de destilación de aceite. Se calienta el balón a ebullición y se ajusta la destilación a 2-3 mL/min. Mantener la destilación por 2 h o más de acuerdo a la monografía de la droga. Finalizada la destilación, dejar enfriar y añadir por el condensador pequeñas porciones de éter dietílico. Transfiera el contenido a un embudo separador, añádale de 2-3 mL más el éter dietílico, agite y decante la fase acuosa. Al extracto etéreo, añádale 0,5 g de sulfato de sodio anhidro y lave el residuo con varias porciones de éter dietílico, los cuales se reúnen en el pesa filtro. Evapore el solvente cuidadosamente en baño de agua a temperatura no mayor de 40 °C.y determine la masa del aceite volátil por la diferencia entre las pesadas del pesafiltro vacío y con el aceite esencial. Expresión de los resultados. A1 . 100 % a.e= ------------ 100 (en base anhidra) 100-H Pa-Pv % a.e= --------- x 100 (en base hidratada) M donde: Pa= Masa del pesafiltro con acite volátil (g) Pv= Masa del pesafiltro vacío. 100= Factor matemático. M= Masa de la droga (g). H= Humedad de la droga (%) A1= % de aceite esencial en base hidratada. Los resultados se aproximan hasta las décimas. En los aceites esenciales pueden realizarse determinaciones cuantitativas de grupos y componentes que respondan a una misma función, atribuyendo el porcentaje de los mismos al componente en particular que presente mayor proporción.

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Los métodos que se describen a continuación permiten evaluar algunos componentes de los aceites esenciales. Parte experimental. A. Determinación del índice de acidéz. Materiales y reactivos. - Balanza analítica - Alcohol etílico al 90 %. - Fenolftaleina. - Solución alcohólica KOH 0,1 mol/L. Procedimiento. Se pesa exactamente, con presición hasta las milésimas, de 2 a 5 g del aceite a ensayar. Se añade alcohol etílico al 95 % (neutralizado) un volumen igual en mg a 5 veces el peso de la muestra y 5 gotas de fenolftaleina. Se agita hasta total disolución y se valora con solución alcoholica de KOH 0,1 mol/L. El índice de acidéz se calcula por la fórmula siguiente: 56,1 x V x Z IA= ------------------------ g donde: V= mLs de KOH 0,1 mol/L consumidos. Z= conc. molar en equiv. de la solución de KOH 56,1= miliequivalentes de KOH expresados en mg. g= peso de la muestra en gramos. B. Determinación del índice de ésteres y porciento de ésteres. Materiales y reactivos. - Balanza analítica - Etanol al 95 % - Frasco de saponificación - Fenolftaleina - Condensador - Soln acuosa NaOH 0,1 mol/L - Baño María - Soln alcoholica KOH 0,5 mol/L - Fragmentos de plato poroso - Soln HCL 0,5 mol/L

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Procedimiento. Se pesan exactamemtente de 2 a 5 g de la muestra en el frasco de saponificación,con una presición hasta la milésimas. Se añade alcohol etílico al 95 %, un volumen igual a 5 veces el peso de la muestra y 3 gotas de solución indicadora de fenolftaleina, neutralizando después los ácidos, con solución acuosa de NaOH 0,1 mol/L Se añaden 10 mL de solución alcoholica de KOH 0,5 mol/L medidos exactamente y algunos fragmentos de plato poroso y se ajusta el condensador de reflujo al frasco de saponificación, reflujando en Baño María durante 1 hora. Se deja enfriar y se añade al condensador 10 mL de alcohol etílico neutro. Se desmonta el condensador, se adiciona 5 gotas de solución indicadora de fenolftaleina y se valora el exceso se álcali con solución de HCL 0,5 mol/L. Paralelamente con el ensayo de la muestra se realiza un ensayo en blanco. El índice de ésteres se calcula por la fórmula siguiente, teniendo en cuenta el índice de acidéz. 56,1 . (V-V') . N IE= -------------------------- g donde: 56,1= Miliequivalentes de KOH expresados en mg. V= mL de KOH 0,1 mol/L consumidos. V'= mL de KOH consumidos en el ensayo en blanco. N= Conc. molar de la solución de NaOH 0,1 mol/L. g= gramos de aceite empleados para el ensayo. El porciento de ésteres se calcula por la siguiente fórmula. 56,1 . (V-V') . N % E= --------------------------- 10 g. donde: 56,1= miliequivalente de KOH expresados en mg. V= mL de la solución de KOH consumidos. V'= mL de la solución de KOH consumidos en el ensayo en blanco. N= Conc. molar de la solución de NaOH 0,1 mol/L. 10 g= cantidad de aceite empleado en el ensayo. Bibliografía. 1. World Health Organization. “Quality Control Methods for Medicinal Plant Materials”. WHO/Pharm 92 559. 2. The United States Pharmacopeia. “USP XXII”, 1990, suppl. 1990,1991.

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3. World Health Organization. “The use of essential drugs”. Technical Report Series, 796, Geneva, 1990. 4. World Health Organizatin. “WHO Expert Committee on Specifications for Pharmaceutical Preparations” Thirty first Report, Technical Report Series 790, p47, WHO, Geneva, 1990.

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METODOS DE EXTRACCION DE PRODUCTOS NATURALES. Concepto y fundamento del proceso de extracción. La extracción es uno de los procesos más utilizados desde el punto de vista farmacéutico y se refiere conceptualmente a la separación de las porciones medicinalmente activas a partir de los tejidos de las plantas y animales, de los componentes inertes de los mismos, mediante el uso de solventes selectivos denominados “menstruos”, utilizando procedimientos establecidos y correctamente estandarizados. Este término se diferencia del referido a la disolución donde toda materia debe ser soluble no quedando en el proceso componentes inertes insolubles. Los extractos como preparación se denominan popularmente como “galénicos” en honor a Galeno, el muy conocido médico Griego de la antigüedad, el cual dio grandes aportes en su época al desarrollo de la Farmacia y la Medicina, y generalmente se obtienen como líquidos, semisólidos o sólidos relativamente impuros. La extracción, es un proceso complejo que contempla varios fenómenos por separado o en conjunto como son: la diálisis, la desorción, la disolución y la difusión. Para ejecutar un proceso de extracción puede trabajarse con material fresco o seco. Cuando las células de los tejidos vegetales están vivas, la pared celular se comporta como un tabique impermeable que permite el intercambio entre la célula y el medio, intercambio que se regula fisiológicamente y donde juegan un papel importante las enzimas. Para evitar las transformaciones enzimáticas, las células se “matan” por desecación provocada por el calor o por tratamiento con alcohol. En ambos casos, al morir la célula, la pared celular pierde su carácter de tabique impermeable y se transforma en un tabique poroso, donde el proceso de intercambio ya no es fisiológico y se rige por fenómenos físico-químicos que se explican en las tres fases generales contempladas en todo proceso de extracción. La primera fase corresponde al traslado de las sustancias que se encuentran dentro de la célula hacia el exterior a través de la membrana celular ahora tabique poroso. Este proceso depende tanto de la difusión molecular libre como del coeficiente de difusión interno y su cuantificación puede realizarse a través de la ley de Fick y su forma de expresión que es la siguiente:

Sc = Dint . Fs C - c

l. t

donde: Sc: Cantidad de sustancia a difundir expresada en kilogramos. Dint: Coeficiente de difusión interior que corresponde a la cantidad de sustancia a difundir en un segundo a través de una superficie de 1m2. Fs: Superficie de contacto entre las fases del proceso expresada en m2. C-c: Diferencia de las concentraciones de sustancia entre las fases expresada en kg/m3. l: Espesor de la capa a través de la cual ocurre la difusión expresada en metros. t: Tiempo durante el cual ocurre el proceso de difusión expresado en segundos. De esta expresión, pueden analizarse los siguientes aspectos relacionados con la primera fase de un proceso de extracción.

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Con excepción al espesor de la capa a través de la cual ocurre la difusión, el resto de los factores influyen directamente sobre el proceso de difusión. Así, mientras mayor es la superficie de contacto, la diferencia de concentraciones y el tiempo de difusión, la cantidad de sustancia a difundir es mayor y por tanto la eficiencia del proceso es mayor. También, es evidente de la expresión que mientras menor es el espesor de la capa a través de la cual ocurre la difusión más eficiente es el proceso. Cuando las sustancias a difundir se trasladan a la capa de difusión limítrofe entre la pared y el menstruo de extracción, el proceso depende totalmente de la ley de difusión molecular libre que se explica por la siguiente expresión:

Dm =

RTNo

16rn

donde: Dm: Coeficiente de difusión molecular. R: Constante de los gases(8,32 Joule/mol). T: Temperatura absoluta expresada en grados Kelvin. No: Número de Avogadro(6,02 x 1023). r: Radio de las partículas a difundir expresado en metros. n: Viscosidad del medio expresada en Newton/seg. m . Al igual que en la primera fase del proceso, en ésta, la difusión también aumenta con la temperatura pero disminuye con el aumento de la viscosidad del medio y con el aumento del tamaño de las partículas a difundir (se relaciona directamente con su masa molecular lo que determina moléculas grandes o pequeñas). Finalmente la última fase del proceso corresponde al traslado de las sustancias difundidas al centro de flujo o menstruo del proceso. Esto se realiza a través de la difusión convectiva y depende de la velocidad de transporte del menstruo y de su capacidad de disolución. Mientras más se disminuya la capa limítrofe donde llegan las sustancias difundidas, más rápidamente se incorporarán las mismas al menstruo y más eficiente será el proceso de extracción. Sobre estas tres fases del proceso, hay varios factores que pueden influir de forma decisiva sobre la calidad del mismo. Por su importancia, enumeraremos y comentaremos algunos de ellos. Factores que influyen sobre el proceso de extracción. Grado de división de la droga. De acuerdo a la expresión de la ley de Fick, mientras mayor es el grado de división de la droga, mayor será la superficie entre las fases del proceso de extracción y por tanto, mayor será la difusión a través de la membrana porosa. No obstante, este análisis teórico no se cumple totalmente en la práctica, ya que a mayor grado de división de la droga, la misma se compacta más en presencia del menstruo y el proceso de difusión se dificulta en vez de mejorar.

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Por otra parte, una división muy grande del tejido vegetal puede romper células y esto puede aportar a la extracción sustancias indeseables. Por ello, para asegurar que el proceso de extracción cumpla con los requisitos de calidad, se sugiere por las normas cubanas y algunas Farmacopeas los siguientes tamaños de partículas para las drogas a extraer: - Hojas, flores y plantas herbáceas, no más dividido que 5mm. - Cortezas, tallos y raíces, no más de 3mm. - Frutos y semillas, no más de 0,5mm. Viscosidad del medio. Según la expresión de la ley de difusión molecular, la cantidad de sustancia a difundir guarda una relación inversa con la viscosidad del medio. Por ello, para un adecuado proceso de extracción no deben seleccionarse menstruos de una relativamente alta viscosidad. De la misma forma, debe ajustarse el tiempo del proceso de forma tal que la cantidad de sustancia extraída no aumente la viscosidad del medio para lo que, debe asegurarse una adecuada velocidad de transporte del menstruo. Balance de concentraciones. En la expresión de la ley de Fick queda claro que la difusión depende del balance de concentraciones. Cuando dentro de la célula hay más concentración de una sustancia que en el medio, la difusión hacia afuera ocurre de forma ágil, por lo que durante el proceso, debe asegurarse que en el medio siempre haya menor concentración de las sustancias a extraer. Esto puede lograrse a través del tiempo de contacto y remoción del solvente entre otros. Temperatura. En general, tanto la difusión interna como la molecular dependen directamente de la temperatura. No obstante, no siempre un aumento de la temperatura va a favor de una mejor calidad en la extracción. Cuando el menstruo es volátil no debe aplicarse temperatura al proceso, tampoco cuando las sustancias a extraer tienen estas características, como son los aceites esenciales, o cuando son termo-lábiles como es el caso de los alcaloides. Por ello, en preparaciones galénicas, se utiliza temperatura cuando se extrae con agua o menstruos donde prevalece el agua, o en el caso de aquellos tejidos córneos como es el caso de las raíces, rizomas, cortezas y hojas duras. Otro aspecto a considerar en la temperatura es que cuando la droga contiene almidones, estos se aglutinan por el calor, aumentan la viscosidad y por tanto disminuyen el proceso de difusión y la calidad de la extracción. Continuidad del proceso de extracción en el tiempo.

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Al inicio del proceso, la extracción es más ágil tanto por una mayor velocidad de difusión así como de las zonas del tejido de mayor acceso para el menstruo, no obstante, según aumenta el tiempo, la velocidad de difusión disminuye y la extracción se limita a las zonas de más difícil acceso para el menstruo. Por ello, debe estar definido el principio activo a extraer y en que momento se concluye el proceso de extracción y evitar pérdidas de tiempo y de solvente en el mismo. Grado de absorción de agua o de menstruo. Cuando se “mata” la célula vegetal, la superficie de la membrana disminuye dificultando la difusión, esto se expresa por la ley de Fick. Por ello, para mejorar la calidad del proceso, debe restituirse en la célula agua o menstruo en cantidad suficiente para restituir aproximadamente su volumen inicial y que el proceso de difusión ocurra con calidad. De esta forma, está demostrado que la extracción se favorece en un 15-20%. No obstante, hay muchos criterios respecto a como realizar este proceso de humectación e hinchamiento de la célula vegetal. De forma general se sugiere que se incorporen las siguientes cantidades en peso respecto a las drogas. Para raíces 1,5 veces el peso. Para hierbas, cortezas y flores 2,0 veces el peso. Para semillas 3,0 veces el peso. Estos valores se denominan coeficientes de absorción de agua y para algunas drogas oficiales se conocen con mayor exactitud. También, se propone una expresión para realizar éste cálculo y es la siguiente:

Cantidad de agua complementaria =

Volumen finalde Extracto +

Coeficiente de absorciónde agua de la droga ·

Proporción dela droga

Ej: Cuál será la cantidad de agua complementaria para humectar las flores de una droga previo a la extracción en una proporción droga solvente 10 en 180.? cant. de agua = 180 + (2,0 . 10) = 180 +20 cant. de agua = 200 mL Otro aspecto a considerar dentro de éste factor corresponde al tiempo de humectación previo a la extracción. Las drogas oficiales tienen definido este tiempo que en general, en dependencia de la droga puede fluctuar entre 15 minutos y 4 horas. La humectación previa es uno de los factores que más influyen en la calidad de un proceso de extracción. pH del medio. El pH es un factor que influye positivamente en un proceso de extracción en dependencia del tipo de sustancia que se desee obtener. En particular, los alcaloides se ven favorecidos por adición de ácidos al menstruo de extracción.

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Estandarización de la materia prima. Si la materia prima no cumple los parámetros de calidad establecidos en las normas correspondientes, la extracción no cumple con la calidad del proceso y el extracto no tiene los porcentajes establecidos respecto a los principios activos. Naturaleza química de la sustancia a extraer. El conocer aproximadamente la naturaleza química de la sustancia a extraer, permite ajustar adecuadamente los parámetros y factores que determinan la calidad del proceso de extracción, ya que lógicamente, por ejemplo la extracción de flavonoides no tiene que ver con el proceso de extracción de aceites esenciales o de alcaloides. Equipos para la extracción. En dependencia de la naturaleza química de las sustancia a extraer y el uso que se dará al extracto, así se seleccionará el tipo de extracto a preparar. En concordancia , cada tipo de extracto tiene su sistema de equipamiento particular que responde a la calidad requerida para el proceso y a la calidad final esperada para el extracto. Tipos de extractos y métodos para su preparación. Oficialmente se reconocen sólo tres tipos de extractos en cuanto a su forma física de presentación: I- Líquidos o semilíquidos de consistencia siruposa. II- Masa plástica denominada extracto sólido o pilular. III- Extracto pulverizado o polvo seco. Teniendo en cuenta la metodología empleada para la obtención del extracto, pueden describirse varios tipos de métodos relacionados con estos extractos los cuales se comentan a continuación. Infusión y Decocción. Ambos métodos de extracción utilizan el agua como menstruo, la infusión poniendo la droga en contacto con agua caliente o fría durante 15 minutos y la decocción hirviendo la droga conjuntamente con el agua durante 30 minutos todos los calentamientos se realizan en baño de agua o de vapor de agua. En cualesquiera de los métodos se utilizan recipientes de cristal, esmaltados o de acero inoxidable cerrados adecuadamente. Ambos métodos, además del principio activo extraen más cantidad de sustancias acompañantes o inactivas. De forma general, se sugieren tres proporciones que son las más utilizadas de cantidad de droga respecto al volumen de solvente. I - Proporción de 1 a 10 cuando la droga no tiene sustancias drásticas. II - Proporción de 1 a 30 cuando la droga tiene principios activos generales y usuales. III - Proporción de 1 a 400 cuando la droga tiene principios activos tóxicos.

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Independientemente de esto, la medicina tradicional utiliza la proporción 1 a 20 como la más generalizada y divulgada. En estos métodos, es importante el tiempo de enfriamiento, que en el caso de las decocciones puede ser breve, pero en el caso de las infusiones no debe ser inferior a las 4 horas. Las decocciones aumentan la viscosidad con un enfriamiento prolongado lo que dificulta el colado o filtrado. En el caso de las infusiones el tiempo de enfriamiento debe ser prolongado para mejorar el proceso de extracción con un tiempo adicional en contacto la droga y el agua. Estos métodos eliminan proteínas y enzimas que ayudan a la fermentación, pero los extractos son muy poco estables y se preparan para consumo rápido. En general, es necesario adicionar preservativos químicos para mejorar algo la estabilidad de los mismos. En dependencia de los principios activos que tengan las drogas, se sugieren algunas reglas para la preparación de extractos por estos métodos y que son los siguientes: - Si la droga contiene alcaloides y conocemos el porcentaje de los mismos, la adición de igual porcentaje de ácido cítrico, ácido tartárico o ácido clorhídrico al agua favorece la extracción mediante la formación de sales solubles. - Si la droga contiene aceites esenciales debe utilizarse fresca, sin triturar, y si es seca, entera y con la calidad establecida por las normas correspondientes. Debe taparse adecuadamente el sistema de extracción sin agitarse y sólo filtrar después de enfriarse el tiempo establecido de acuerdo al método de extracción. - Si la droga contiene taninos como principio activo debe asegurarse un grado de trituración que asegure una buena extracción y siempre utilizar como método la decocción, de lo contrario no se extrae todo el tanino como principio activo. - Si la droga contiene glicósidos cardiotónicos debe cuidarse la trituración y la fermentación que destruye los glicósidos, así como cuidar la temperatura y el tiempo de calentamiento, pues puede acelerarse el proceso de hidrólisis de estos glicósidos. - Si la droga contiene glicósidos antraquinónicos el método de extracción debe ser decocción, ya que la infusión realiza una extracción incompleta. - Si la droga contiene glicósidos saponínicos, a diferencia de los alcaloides, la adición de 1g de bicarbonato de sodio por cada 10g de material vegetal a extraer, facilita una mejor y más rápida extracción. Maceración. La maceración, es un método de extracción que consiste en remojar la droga con la cantidad de menstruo preestablecida, a temperatura ambiente, en recipiente cerrado, durante un tiempo entre 2-14 días si no se conoce el tiempo necesario para una droga en particular, se sugiere 7 días como promedio para el proceso. El líquido de extracción se acostumbra a extraer por decantación, exprimiendo el residuo de la extracción. Este residuo se lava y exprime varias veces cuidando tener el volumen final requerido para el extracto.

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De acuerdo a la ley de la difusión y para evitar el aumento de la viscosidad por un aumento de la concentración de la capa límite entre la célula del tejido vegetal y el menstruo, y con el objeto de aumentar la velocidad de transporte del menstruo, la agitación hace más efectivo el proceso. Agitar la masa total produce un gasto energético excesivo, por lo que se acostumbra a resuspender el material vegetal en el menstruo y agitar éste, para que constantemente esté intercambiando con el material vegetal. La maceración es un método de extracción de elección cuando los principios activos pueden sufrir alteración por el calor o por el aire y son solubles a temperatura ambiente en un menstruo que no debe ser volátil. También cuando no puede aplicarse el método de lixiviación, que se considera uno de los más aplicados en preparaciones galénicas. Entre sus ventajas se tiene el hecho que no determina en el proceso el grado de trituración de la droga, ya que está implícita la desventaja de que no extrae todo el principio activo. Por ello, el proceso requiere más tiempo, aunque se asegura por el tipo de equipamiento que no hay pérdidas de solventes por evaporación. Digestión. Es un método de extracción que está basado en todos los principios del proceso que rige la maceración, aunque en este caso el principio activo admite la aplicación de calor. Para el mismo, se aplica una temperatura superior a la ambiente pero inferior a la de ebullición del menstruo y su aplicación mediante cualquier variante que permita su regulación. Lixiviación o percolación. Es un método de extracción muy relacionado al desarrollo de la Farmacia en cuanto a la extractiva se refiere en el siglo pasado, mérito que corresponde a los Boullays a partir de 1833, que lo aplicaron de forma general a drogas y plantas medicinales. La importancia de este método se evidencia, pues la Farmacopea de los Estados Unidos lo acepta como procedimiento oficial desde el año 1840. Se utiliza para la preparación de uno de los extractos más difundidos en preparaciones galénicas, los extractos fluidos. Los extractos fluidos son extractos líquidos de materias vegetales, de tal manera preparados, que la cantidad de extracto final en volumen es equivalente a la de la droga desecada al aire en peso, o sea, la relación peso de droga / volumen final de extracto 1 es a 1. Equipo para el proceso. El método de extracción utiliza un equipo denominado lixiviador o percolador que retiene la droga a través de la cual se hace fluir el menstruo en forma descendente. Existen diversas formas y variantes descritas para los lixiviadores o percoladores, no obstante la más generalizada es la que se representa en la Fig. 8

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Fig. 8 Tipos más empleados de percoladores. Para que un percolador permita agotar totalmente 500g de droga durante el proceso de extracción, se necesita que tenga 2 litros de capacidad. Para ello, la altura sin contar la parte estrecha, debe ser de 36 cm, el diámetro superior de 10 cm y el inferior de 6,5cm por lo que va estrechándose poco a poco haciendo que la desviación de las paredes de la vertical sea aproximadamente de 3 grados. Para lixiviadores mayores, la forma cónica puede ser más pronunciada aún, aunque la desviación no debe ser mayor de 5 grados para una buena extracción. De la misma forma, la parte final extrema no debe tener más de 5cm de altura. Se pueden fabricar de vidrio, de láminas de hierro esmaltado, de hojalata o de cobre estañado. Preparación del proceso. De forma general se describe la siguiente metodología para la preparación del proceso. La droga seca según la norma y con el grado de división que le corresponda, se humedece con la cantidad de menstruo calculada para una adecuada humectación de la misma. La mezcla se realiza con las manos en un recipiente adecuado de forma que quede una masa grisosa homogénea. El polvo humectado se deja en reposo 12 horas (si no se especifica otra cosa), bien tapado para un correcto hinchamiento sin pérdida de menstruo por evaporación. Posteriormente se pasa por una criba con frotación para que no quede apelmazado.

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En el percolador, que en su parte inferior tiene una placa porosa o una capa fina de algodón o lana de vidrio humedecida con el menstruo, se va colocando la droga húmeda en capas, presionando la misma de igual forma de modo que no queden espacios vacíos llenos de aire. Después de compactar la droga dentro del lixiviador, en la parte superior se coloca una capa doble de papel de filtro o absorbente cortado de forma circular, fijándola con una placa de porcelana con hueco o con una tapa de cristal grueso, para evitar la descomposición de la droga por el menstruo durante el proceso. Se abre la llave inferior del lixiviador y se vierte por la parte superior lentamente y con cuidado, menstruo, en cantidad apropiada para que la droga quede completamente impregnada de menstruo y un exceso de alrededor de 0,5cm de altura por encima de la droga. Se cierra nuevamente el lixiviador y la pequeña cantidad de menstruo que goteó se vierte en el lixiviador por la parte superior. Se cierra adecuadamente el lixiviador y se macera 48 horas a temperatura ambiente, si no se especifica otro tiempo. Desarrollo de la lixiviación. Transcurrido el tiempo previsto de la maceración, se comienza el desarrollo de la lixiviación. Se abre la llave inferior y se permite salir el menstruo a la velocidad establecida de acuerdo a lo que se explica más adelante, restituyendo con menstruo limpio el volumen de salida por la parte superior del lixiviador. Se recoge del macerado unas 75-85 partes del volumen final que le corresponderá al extracto y se conserva aparte. En otro frasco colector se continua el proceso, pasando la cantidad de menstruo necesaria para agotar la droga. Durante todo el proceso la droga debe estar embebida en el solvente y para una mejor calidad, debe lograrse la restitución automática del menstruo. La segunda fracción del lixiviado se concentra a presión reducida hasta consistencia de extracto blando y que reunido con la primera fracción separada completen las 1000 partes correspondientes al extracto final programado. Este extracto se deja reposar: - 4 días a una temperatura de 8-10oC - 10 días a una temperatura de 15-20oC - 20 días a temperatura ambiente. Después de transcurrido el tiempo de reposo, se filtra y el líquido obtenido se envasa como extracto fluido. Si, como ocurre en la mayoría de los casos, el vehículo es alcohólico, entonces, antes de la evaporación, el alcohol del segundo lixiviado se recupera por destilación, haciendo lo mismo con el disolvente que queda dentro del lixiviador y que se recupera por expresión final de la droga. La velocidad de salida de líquido se calcula de acuerdo a la cantidad de droga a utilizar en el proceso. Generalmente se establece entre 10-15 gotas por minuto para 1 Kg. de la droga y a partir de aquí se toman las proporciones. En otros casos, la velocidad de salida se estima de la siguiente forma: - lenta a razón de 1ml /min. - moderada a razón de 1-3ml /min. - rápida a razón de 3-5ml /min. En la medida de la velocidad de salida, no sólo influye la cantidad de la droga sino también el diámetro y altura del percolador. Con cantidades iguales de droga, un lixiviador estrecho produce, a igual

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velocidad de salida, una primera fracción más concentrada que uno ancho. La velocidad de salida puede ser, por lo tanto, mayor con una capa de droga más alta que con otra más baja. La Farmacopea de los Estados Unidos propone que la velocidad de salida del menstruo en el percolado se calcule teniendo en cuenta que en 24 horas se obtenga un volumen total de lixiviado equivalente a vez y media el peso de droga de partida. Según esto, para lixiviar un gramo de droga a la velocidad de salida del menstruo debe corresponder a 20 gotas por minuto. Tampoco, el agotamiento de la droga es igual en todos los casos, pues además de la velocidad de salida del menstruo depende de la naturaleza de la droga. En cada caso hay que comprobar de vez en cuando si el líquido que gotea contiene cantidades apreciables del principio activo. Se recoge 10g de líquido que gotea y se evapora a sequedad en baño de María, calculando por el peso del residuo cuando conviene detener la lixiviación. Si se tiene un ensayo cualitativo seguro, la lixiviación se detiene cuando el mismo dé resultados negativos para el principio activo deseado. Según la Farmacopea de los Estados Unidos, 1 Kg. de la droga se agota con 3 litros de lixiviado, o sea, para agotar una parte de droga se necesitan 10 partes de menstruo. Lixiviación fraccionada o dividida. (Relixiviación o Repercolación). Este proceso se sugiere especialmente para extraer drogas que contienen principios volátiles o sustancias a las cuales perjudica el calor. Primera variante: Cada 1000g de la droga se fracciona en tres partes. Parte I (500g) Parte II (300g) y parte III (200g). La parte I se humedece bien con la cantidad de menstruo calculada y se deja reposar 6 horas en un recipiente cerrado. se coloca en el lixiviador transcurrido éste tiempo con los cuidados ya descritos y se macera con el menstruo 48 horas. Se comienza el proceso de lixiviación y se separan los primeros 200ml, se recoge una segunda fracción de 1500ml y a partir de este momento numeradas en orden fracciones de 300ml hasta que se agote el principio activo. La parte II de la droga se humedece con la segunda fracción del primer lixiviador de la forma establecida. El proceso se desarrolla utilizando como menstruo el resto de la segunda fracción del lixiviado. Se separan los primeros 300ml y se recoge una segunda fracción de 500 mL y a partir de éste momento numeradas en orden, fracciones de 200ml hasta que se agote el principio activo. Como menstruo se utilizan en el mismo orden las fracciones de 300ml obtenidas del primer percolado. La parte III de la droga se humedece con la segunda fracción del segundo lixiviado y se monta el tercer lixiviador de la forma establecida. El proceso se desarrolla utilizando como menstruo el resto de la segunda fracción del lixiviado. Se lixivia hasta recoger 500ml. Estos 500ml se reúnen con los 200 y 300ml anteriores para completar los 1000ml que corresponde al extracto fluido. Segunda variante: La droga se fracciona en 4 partes. Una parte de la droga se humedece con una parte en volumen de menstruo y se prepara el percolador de la forma establecida. Se macera durante 24 horas. Se comienza la lixiviación recogiendo dos volúmenes de lixiviado adicionando al percolador 3 volúmenes de menstruo limpio. Con los dos volúmenes de lixiviado se humecta la segunda parte de la

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droga y se macera el segundo percolador. En cada percolador se repite el mismo proceso. El lixiviado del primero para el segundo y el del segundo para montar el tercero. Se repite el proceso hasta montar el cuarto percolador. A partir de este momento, no se coloca menstruo nuevo en el primer percolador, sino se pasan los lixiviados de un percolador a otro recogiendo del cuarto percolador cada día, el volumen de lixiviado que en conjunto al final aporten el volumen correspondiente al extracto fluido. Tipos de extractos. Conceptos. Tinturas. Las tinturas se definen como soluciones alcohólicas o hidroalcohólicas de los principios activos contenidos en vegetales. Para drogas que contienen principios activos muy potentes se preparan tinturas al 10% que representan el extracto de 10g de la droga en 100ml del solvente. Para el resto de las drogas que contienen otros principios activos se preparan tinturas al 20% que representan el extracto de 20g de droga en 100ml de solvente. Las tinturas pueden prepararse por el método de percolación teniendo en cuenta los detalles del método descritas. O pueden prepararse por maceración. En este caso, se usa el 80% del volumen total del menstruo para macerar y el 20% restante para lavar y exprimir la droga después de la maceración. Extractos fluidos. Los extractos fluidos se definen como preparaciones líquidas de los principios activos contenidos en vegetales, utilizando el etanol, como solvente, como preservativo o con ambos fines, de forma tal que cada mililitro de extracto contenga los principios activos que aporte 1g de droga. Extracto blando. El extracto blando se define como el extracto fluido correspondiente a 4-6Kg de la droga, concentrado con vacío a una temperatura inferior a 60oC hasta el peso de 1Kg de extracto. Extracto seco. El extracto seco se define como el extracto fluido concentrado con vacío a una temperatura inferior a 60oC, hasta que después de molinado quede en forma de polvo seco. A continuación se describen algunos métodos de obtención de extractos y tinturas: Obtención de extractos fluidos y tinturas. Para la obtención de estos tipos de extractos, pueden ser empleados los métodos de extracción siguientes: maceración, percolación y repercolación. Para realizar estos procedimientos debe haberse comprobado la calidad de las materias primas a utilizar (requisitos de calidad de la droga cruda y pureza y concentración del menstruo). El tamaño de párticula de la droga cruda no debe exceder de 5 mm. Debe efectuarse la comprobación de la masa de la droga y el volúmen de menstruo a utilizar para lograr los extractos de la forma prevista. Generalmente se preparan tinturas al 10 % para drogas potentes o muy activas (drogas heróicas) y de un 20 a 50 % para drogas de menor actividad. (drogas no heróicas).

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A. Obtención de tinturas por maceración. Parte experimental Materiales y reactivos. - Recipiente de vidrio o acero inoxidable con tapa. - Papel de flitración mediana. - Recipiente de color ámbar. - Balanza técnica. - Droga . - Menstruo seleccionado. Procedimiento. En un recipiente de vidrio o acero inoxidable con tapa, se vierte el 90 % del menstruo requerido; se le añade la droga cruda pesada y se mezcla bien. La mezcla debe ocupar como máximo las 3/4 partes del recipiente. Se tapa el recipiente y se macera el número de días establecidos, agitando 15 min. dos veces al día. Transcurrido el tiempo de maceración, el líquido se extrae por decantación y el residuo se filtra por papel de filtración de velocidad moderada, se escurre y se lava con menstruo hasta completar el volúmende tintura establecido. En este procedimiento debe evitarse lo más posible la evaporación del menstruo. Se deja reposar en un recipiente bien cerrado según el esquema siguiente: Temperatura. Tiempo de reposo. De 8-10 ºC No menos de 4 días De 15-20 ºC 15 días. Ambiente 30 días. Transcurrido ese tiempo se filtra y evapora en recipiente de vidrio ámbar y se extrae una porción para ensayos. B. Obtención de tinturas por percolación. Materiales y reactivos. - Recipiente de vidrio o acero inoxidable. - Percolador. - Algodón o gasa. - Papel de filtración de velocidad moderada. - Frasco ámbar. - Balanza técnica. - Droga cruda fragmentada.

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- Menstruo seleccionado. Procedimiento. 1) A un recipiente de vidrio o acero inoxidable (tanque, cubeta o cubo),de poca profundidad, se le transfiere la droga cruda pesada y se humedece con menstruo, procurando que no quede líquido residual.(Generalmente se emplea para la humectación un volumen no menor del peso de la droga). Se deja reposar (para que la masa vegetal embeba el menstruo y se hinche) de15 min a 4 h en dependencia de la dureza y cararterísticas de la droga cruda. 2) En un percolador cuyo orificio de salida se cubre con algodón o gasa u otro material inerte, se transfiere la droga humectada. La superficie se cubre con papel o placa de filtro o un disco metálico con orificio y se presiona. 3) Para garantizar que no queden burbujas de aire en la masa vegetal, se vierte menstruo con el orifico de salida del percolador abierto y cuando este comienza a salir se cierra el mismo. Se sigue vertiendo menstruo hasta que este cubra la masa vegetal y quede de 3-5 cm por encima de ella. Se recircula la tercera parte del volumen del líquido contenido en el percolador y si baja el nivel del líquido, este se repone. Se macera durante 24 h. 4) Se abre el orificio de salida y se deja salir el percolado a la vez que se añade mas menstruo, estableciendose un flujo de 3-5 mL/min hasta obtener la cantidad de tintura necesaria.( En base a un Kg de droga): 10 L si es tintura al 10 % 5 L si es tintura al 20 % 2 L si es tintura al 50 %. 5) Se deja reposar en un recipiente bien cerrado según el siguiente esquema: De 8 a 10 ºC. No menos de 4 días. De 15 a 20 ºC. 15 días. T. Ambiente. 30 días. 6) El líquido es evacuado por sifón del sedimento, posteriormente se filtra el restante por gravedad, a presión o con vacío a través de papel de filtración de velocidad moderada, evitando lo más posible la evaporación y se envasa en recipiente plástico apto para contener productos farmacéuticos. Se extrae una porción para ensayos y se le realizan los análisis establecidos, si cumple con los parámetros se envasa. C) Obtención de extractos fluidos por percolación. Materiales y reactivos. - Recipiente de vidrio o acero inoxidable - Percolador. - Algodón o gasa. - Papel de filtración mediana. - Frasco de color ámbar. - Balanza técnica.

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- Droga cruda fragmentada. - Menstruo seleccionado. Procedimiento. Los primeros tres pasos se desarrollan de la forma descrita en la obtención de tinturas por percolación, seguidamente se abre el orifio de salida y se deja salir el percolado a la vez que se añade más menstruo, estableciéndose un flujo de 3-5 mL/min hasta obtener una primera fracción de 85% de extracto, los que se guardan en un recipiente. Se detiene la extracción y con el volumen de menstruo requerido, se macera durante 24 h y se hace una extracción de 1 L del extracto. Este proceso se repite por segunda vez. Los últimos 2 L de extracto obtenido se reunen y se concentran a una temperatura que no exceda los 60 ºC hasta obtener el volumen requerido (15 % restante, se prefiere la concentración por vacío). Este extracto blando se mezcla con laprimera fracción obtenida y si fuese necesario se añade menstruo hasta completar el volumen del extracto fluido. Se deja reposar en un recipiente bien cerrado según el esquema siguiente: De 8 a 10 ºC. No menos de 4 días. De 15 a 20 ºC. 15 días. T. ambiente 30 días. Transcurrido el tiempo de reposo se filtra por papel de velocidad moderada, evitando lo más posible la evaporación, y se envasa en recipientes de vidrio color ámbar o recipientes de plástico aptos para contener productos farmaéuticos. Se toma una muestra para ensayo. D) Obtención de extractos fluídos por repercolación. Materiales. - 4 percoladores. - Algodón, gasa o papel de filtro. - Beaker. - Probeta. - Frasco con tapa. - Balanza técnica. - Droga cruda. - Menstruo seleccionado. Procedimiento. Excepto el paso de la extracción del percolador, los demás siguientes son válidos en este método. Se prepara una batería de percoladores (4 ó 5) con la misma cantidad de droga, utilizando el mesnstruo que va saliendo de un percolador para humectar el otro de la forma siguiente: Extracciones: 2do día: Del percolador I se evacúa un volumen H de extracto con el que se humedece la droga del percolador II y se deja humedecer de la misma forma que se hizo para el percolador I. Al percolador I se añade un volumen T = H + M de menstruo fresco estando la llave abierta. Se deja salir

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un volumen M de extracto del percolador I y se cierra hasta el otro día. La materia prima hinchada se carga en el percolador II y se le añaden los líquidos del percolador I (volumen M), se recircula y después se cierra la llave. Se deja hasta el día siguiente. 3er día: Siguiendo el mismo procedimiento se incorpora el percolador III a la bateria, teniendo presente siempreque el menstruo fresco se incorpora por el percolador de más tiempo montado (PI). 4to día: Idem al tercero. 5to día: Se evacua de los percoladores montados un volumen en litros equivalente al peso en Kg de la carga de material vegetal en cada percolador. La fracción obtenida del percolador IV constituye la primera fracción de producto terminado, la que se reserva en recipiente aparte. Se repone el volumen extraido del percolador No4 con la misma cantidad de extracto proveniente del percolador anterior y asi sucesivamente se transfieren las fracciones de un percolador al siguiente. La mecánica que se sigue es semejante a la descrita anteriormente con la diferencia de que del percolador I se extrae el líquido contenido en él después de lo cual se elimina este percolador del proceso. Por otra parte el líquido requerido para completar el volumen del percolador II, se hace con menstruo fresco. 6to día y sgtes: Siempre que haya droga cruda para seguir montando nuevos percoladores se sigue igual que para el 5to día. Se recuerda que la fracción del producto terminado se extrae del último, es decir del montado el día anterior; y que el percolador mas agotado en cuanto a droga sale del proceso. Cuando no haya más percoladores que montar, la transferencia de un percolador a otro, se limita a lacantidad del extracto que equivale a una fracción del producto terminado, extrayendo siempre la fracción correspondiente a cada percolador montado, por el último percolador. Lógicamente en los últimos percoladores montados queda siempre un remanente de menstruo que se reunen al final. Este líquido residual puede adicionarse a las fracciones de producto terminado siempre que se conozca el título de ambas partes; también se utiliza como menstruo en un próximo lote de la misma droga cruda. En resumen se obtienen tantas fracciones de producto terminado como percoladores se hayan montado, debiendo coincidir el volumen de extracto fluido con el peso de la droga cruda empleada. (Fig. 9).

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Fig. 9 Esquema de obtención de extractos fluidos por repercolación.

Análisis de Extractos. Una vez preparados los diferentes tipos de extractos, deben establecerse los parámetros que definan la calidad de los mismos. Teniendo en cuenta que los extractos desde el punto de vista físico se presentan de diferente forma, los parámetros usuales para definir su calidad presentan también diferencias entre ellos. Hay métodos de análisis que se ensayan en todos los tipos de extractos y otros que no. La forma práctica de realizar estos ensayos, así como de realizar los cálculos correspondientes, están descritos en los libros oficiales, tanto Farmacopeas como normas internas para el trabajo con drogas y plantas medicinales. (Tabla I) La evaluación de los extractos comprende un conjunto de métodos, alguno de los cuales serán descritos a continuación. A. Determinación de los requisitos organolépticos. Determinación de olor: Se toma una tira de papel secante de aproximadamente 1 cm de ancho por 10cm de largo y se introduce un extremo en la muestra de ensayo. Se huele y se determina si corresponde con la característica del producto. Determinación del color: Se toma un tubo de ensayos bien limpio y seco y se llena hasta las tres cuartas partes con la muestra de ensayo y se observa el color, la transparencia, la presencia de partículas y la separación en capas. Se informa los resultados. Tabla I . Diferentes ensayos que se les aplican a Extractos y Tinturas para el análisis de la calidad. Ensayos Tinturas Extracto

Fluido Extracto Blando

Extracto Seco

1. Descripción del extracto sí sí sí sí 2. pH sí sí sí sí3. Índice de refracción sí sí no no 4. Peso específico sí sí no no 5. Sólidos Totales solubles sí sí sí no 6. Análisis capilar sí sí no no7. Contenido de etanol sí sí no no8. Determinación cualitativa de principios activos

sí sí sí sí

9. Composición química general sí sí sí sí10. Identificación general sí sí sí sí

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11. Solubilidad no no sí sí12. Humedad o residuo seco no no sí no 13. Cenizas no no sí sí B. Determinación de la densidad relativa. Se entiende por densidad relativa a la relación entre la masa de un volumen de la sustancia a ensayar a 25 ºC y la masa de un volumen igual de agua a la misma temperatura. Este término equivale a peso específico. Materiales y reactivos. - Picnómetro de al menos 10 mL de capacidad. - Balanza analítica VD 0,1 mg LSP 200 g. Procedimiento: Primeramente pésese el picnómetro vacío y seco a 2 ºC y llénese con la porción de ensayo, manténgalo a la temperatura de 25 ºC (± 1 ºC) durante 15 min. y ajústese el líquido al nivel empleado, si es preciso, una tira de papel para extraer el exceso y secar exteriormente el picnómetro. Se pesa cuidadosamente el picnómetro con la porción de ensayo y se repite la operación con el agua destilada a 25 ºC, después de limpio el picnómetro. Expresión de los resultados: La densidad relativa a 25 ºC se calcula por la sguiente fórmula: M1 - M D25 = ------------ M2 - M donde: M1 : peso del picnómetro con la muestra (g) M2 : peso del picnómetro con el agua (g) M: peso el picnómetro vacío (g). Los resultados se aproximan hasta la tercera cifra. C. Determinación del índice de refracción. El índice de refración es una constante característica de cada sustancia, la cual representa la relación entre el seno del ángulo de incidencia de la luz y el seno del ángulo de refracción cuando la luz pasa oblicuamente a través del medio. Esta relación viene dada por la sgte ecuación:

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Sen i --------- = n Sen r Asi los refractómetros utilizan como principio de medición, la determinación del ángulo límite el cual presenta en el campo visual un contraste claro y otro oscuro. La línea de separación entre ambos campos establece el ángulo límite de la luz incidente. Materiales y reactivos. - Refractómetro de Abbé - Varilla de vidrio. - Solución mezcla de alcohol etílico-éter dietílico (1:1) para la limpieza del equipo. Procedimiento: Se coloca sobre el prisma de medición una gota de agua destilada, utilizando para ello una varilla de vidrio que no tenga cantos agudos, se ajusta el equipo seleccionando la zona del espectro visible que aparece en la línea límite del campo visual, moviendo el compensador cromático y colocando la intersección del retículo sobre la línea límite de los campos claro y oscuro. Después de haber realizado el ajuste del refractómetro, se coloca una gota de la muestra de ensayo sobre el prisma de medición, se cierra el termo prisma y se enfoca la luz por medio del espejo, de modo tal que la misma incida sobre la apertura de entrada del prisma de medición y se proceda de la misma forma que con el agua. Expresión de los resultados. Se hacen tres lecturas y se calcula el promedio de las mismas. Dos o mas lecturas no deben diferir en mas de 0.002 No. Si las determinaciones no se efectuan a la temperatura de referencia se emplea la fórmula siguiente: Nd

25 =Ndt + 0.00044 (t-25)

donde: Nd

25 = Indice de refracción a 25 °C Nd

t = valor leído en la escala del aparato a la temperatura t. t = valor de la temperatura a que se realiza la medición (°C)

0.00044 =factor de corrección por grado celcior. Los valores se aproximan hasta las milésimas. D. Determinación del pH de extractos y tinturas:

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La acidéz o la alcalinidad de las soluciones acuosas se caracterizan por el valor del índice de hidrógeno, pH. El pH es por tanto un índice númerico que se utiliza para expresar la mayor o menor acidéz de una solución en función de los iones hidrógeno. Se calcula teóricamente mediante la ecuación: pH= -log aH+ aH + = actividad de los iones hidrógeno. En la práctica, la medición de pH se lleva a cabo por medio de la lectura de pH en la escala de un instrumento medidor de pH, ya sea digital o analógico. Esta lectura está en función de la diferencia de potencial establecida entre un electrodo indicador y un electrodo de referencia usando como solución de ajuste de la escala del medidor de pH, una solución reguladora del mismo. Materiales y reactivos - Medidor del PH con electrodo de vidrio combinado. - Solución reguladora de PH, para rango de 0-7, preparada de la siguiente forma: 2,5 g de Bitartrato de potasio para 250 mL de agua (PH= 3,5). Procedimiento. Ajuste el equipo con la solución reguladora de pH adecuada al rango en que se realizará la determinación. Posteriormente determínese el valor del pH de la muestra. Los resultados se darán apreciando hasta la décima. E. Determinación de los sólidos totales. La determinación de la variación de la masa, debido a la pérdida o eliminación de sustancias volátiles por acción el calor, mediante un proceso de evaporación de la porción de ensayo y secado del residuo en estufa, hasta masa constante, se le asigna como sólidos totales. Materiales y reactivos. - Cápsula de porcelana, platino o cristal. - Baño de agua. - Balanza analítica de LSP 200 g y VD 0.1 mg. - Desecadora conteniendo sílica gel. - Estufa con temperatura controlada (105 ± 2 ºC) - Pipeta aforada de 5 mL. Procedimiento:

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5,0 mL del producto se llevan a una cápsula previamente tarada a 105 ºC, se evapora sobre baño de agua hasta que el residuo esté aparentemente seco. Se pasa entonces hacia una estufa y se deja hasta peso constante (aproximadamente 3 h). Se retira la cápsula de la estufa y se coloca en una desecadora hasta que alcance la temperatura ambiente. Para obtener la masa constante entre una pesada y otra se mantendrá un tiempo de secado de 60 minutos. Expresión de los resultados. La cantidad de sólidos totales, expresado en %, R, se calcula por la siguiente fórmula: Pr-P St = -------100 V donde: Pr= masa de la cápsula más el residuo (g) P= masa de la cápsula vacía (g) V= volumen de la porción de ensayo. 100=factor matemático para el cálculo. Observación: En caso de aceites esnciales se denomina como residuo de evaporación (R). F. Determinación del contenido alcohólico. Consiste en la obtención de una solución hidroalcohólica mediante el proceso de destilación de la muestra y donde debe garantizarse que todo el alcohol presente en la misma sea arrastrado hacia el destilado. Con la posterior determinación del peso específico de dicho destilado se obtiene el porcentaje de alcohol de la muestra. Materiales y reactivos. - Equipo de destilación de contenido alcohólico. - Matraz aforado de 100 mL. - Pipeta aforada de 25 mL. - Picnómetro con termómetro (Geissler). Procedimiento Se seleccionará el método A ó B en depedencia del producto que se vaya a analizar. Método A: (Para productos que no contengan sustancias volátiles, ni sustancias ácidas resinosas). Se miden 25 mL del producto, el cual ha sido enfriado a 20 ºC (± 2 ºC); a un balón de destilación de 500 mL se añaden 150 mL de agua para análisis y algunas perlas de vidrio u otro material que contraste el bumping. Se conecta teniendo cuidado que las uniones estén bien

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cerradas. Se destilan de 90-95 mL recogiendo el mismo en un matráz aforado de 100 mL, el cual se encuentra sumergido en un baño de hielo. Se lleva la temperatura del destilado a 20 ºC (±1 ºC) aproximadamente y se enrasa con agua para análisis la cual ha sido enfriada a 20 ºC (± 2 ºC). También se determina el peso específico de la solución a 20 ºC (± 1 ºC) empleando un picnómetro con termómetro (Geissler). Método B: Para productos con sustancias volátiles o resinosas ácidas. Se miden 25 mL de la preparación la cual ha sido enfriada a 20 ºC (± 2 ºC) y se transfiere a un balón de destilación de 500 mL. Se añaden 150 mL de agua para análisis y algunas perlas para evitar el bumping. Se conecta el equipo teniendo cuidado de que las uniones estén bien selladas. Se destilan alrededor de 100 mL recogiendo el destilado en un embudo separador de 500 mL, se añade suficiente cantidad de cloruro de sodio para saturar el líquido (aproximadamente 31 g). Se añaden 100 mL de éter de petróleo de 40-60 ºC y se agita vigorosamente durante 2 ó 3 min. Se deja reposar la mezcla durante unos 20 min, se lleva la capa inferior a un balón de destilación. La capa etérea remanente se lava con 25 mL de una solución saturada de cloruro de sodio, se dejan separar bien ambas capas y se incorpora la capa acuosa (inferior) al balón de destilación. Se hace alcalina la solución del balón con NaOH 1 mol/L, usando fenolftaleína sódica como indicador, se añaden algunas perlas de vidrio u otro material para evitar el bumping además de 100 mL de agua para análisis. Se conecta el equipo y se destila alrededor de 95 mL del líquido, recogiendolo en un matráz aforado de 100 mL que se encuentra en un baño de hielo. Llevar la temperatura del destilado a 20 ºC antes de diluir hasta el enrase usando agua para análisis previamente enfriada también a 20 ºC. Expresión de los resultados. El peso específico se determina como sigue: M1 - M P.E = ---------- M2 - M donde: M1 = peso del picnómetro con la muestra a 20 ºC. M2 = peso del picnómetro con agua a 20 ºC M = peso del picnómetro vacío Se determina el porciento de alcohol en la muestra según los datos de la Tabla II.

G. Análisis capilar: (Específico de extractos y tinturas)

Es un método ingenioso e interesante para la caracterización de extractos y tinturas. Este método se basa en los fenómenos de absorción y de repartición de sustancias en materiales colorantes a través de los espacios capilares del material inerte que constituye el papel de filtro.

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Materiales y reactivos - Beaker pyrex de 100 mL de aproximadamente 5 cm de diámetro y 70 cm de alto. - Bandas de papel de filtro de 4 cm x 20 cm. - Cámara protectora de la luz. - Probeta o copa graduada de 25 mL. - Lámpara de luz UV de 366 nm. Procedimiento Se vierten 20 mL de la muestra o de la disolución de la muestra cuando la monografía lo indique en un bewaker de 100 mL, colóquelo en la cámara protectora. Coloque una banda de papel de filtro verticalmente de manera que su extremidad inferior esté sumergida dentro de la muestra, pero sin tocar el fondo ni las paredes del recipiente. (Fig. 10 ). Cierre la cámara y deje transcurrir 2 horas, al cabo de este tiempo se retirará el papel y se deja secar. Una vez seco se procederá a su inspección visual y caracterización. Exámen e interpretación de la imagen Para el análisis e interpretación de la imagen se tienen en cuenta los aspectos siguientes: - Color. - Altura. - Descripción de las diferentes partes. - Cambios de coloración con vapores de amoníaco. - Examen bajo la luz ultravioleta. Tabla II. Valores de peso específico para la determinación del contenido alcohólico.

Peso % alcohol Peso % alcohol específico (V/V) específico (V/V) 0,9710 95,93 0,9850 45,02 0,9715 94,12 0,9855 43,32 0,9720 92,32 0,9860 41,62 0,9725 90,49 0,9865 39,95 0,9730 88,66 0,9870 38,28 0,9735 86,81 0,9875 36,63 0,9740 84,96 0,9880 34,99 0,9745 83,11 0,9885 33,37

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0,9750 81,26 0,9890 31,76 0,9755 79,39 0,9900 30,19 0,9760 77,53 0,9905 27,07 0,9765 75,67 0,9910 25,53 0,9770 73,82 0,9915 24,01 0,9775 71,96 0,9920 22,49 0,9780 70,10 0,9925 20,99 0,9785 68,24 0,9930 19,50 0,9790 66,38 0,9935 18,04 0,9795 64,55 0,9940 16,59 0,9800 62,72 0,9945 15,15 0,9805 60,90 0,9950 13,71 0,9810 59,09 0,9955 12,01 0,9815 57,28 0,9960 10,89 0,9820 55,48 0,9965 9,49 0,9825 53,71 0,9970 8,10 0,9830 51,94 0,9975 6,74 0,9835 50,19 0,9980 5,38 0,9840 48,45 0,9985 4,03 0,9845 46,73 0,9990 2,68 0,9995 1,34

1,0000 0,00

Fig.10. Esquema del análisis capilar.

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Color: El color de la imagen se define en su conjunto inicialmente como: - Vivamente coloreada. - Poco coloreada. - Muy poco coloreada. En dependencia de la tonalidad que predomine en toda la imagen y posteriormente se detallan los colores caracteristicos de cada una de las 4 zonas si son fácilmente detectables. Altura: La altura de una imagen capilar se determina midiendo con una regla graduada en cm, del borde inferior del papel a la franja, siendo esta inversamente proporcional al grado alcohólico de la muestra. La altura promedio de una imagen capilar es de 8 cm aproximadamente, de ahi que se pueden clasificar las imagenes en: Altas: De 8,0 cm en adelante. Mediana: Entre 5,0-8,0 cm. Pequeñas: Menos de 5,0 cm. En el análisis de la imagen es posible distinguir 4 zonas: - Franja: Límite superior de ascención del líquido.

- Sub-franja: Región generalmente poco coloreada, comprendida entre la franja y la zona superior de la banda.

- Banda: Zona generalmente pigmentada debido a la presencia de sustancias coloreadas. - Sub-banda: Situada debajo de la banda hasta el límite de inmersión (Fig. 11).

Fig.11 Partes de la imagen capilar

Descripción de las diferentes partes:

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Una de las zonas de mayor interés es la franja, que ésta puede ser o no traslucida, lo que denotará la presencia de resinas o aceites escenciales y grasas. En la franja también debe describirse la forma que esta adopta, dentro de ella: (Fig. 12 ). - Lineal. - Festonada - Dentada ( regular o irregular). - Profundamente dentada.

Fig. 12 Formas de la franja.

En la sub-banda debe considerarse el color y la longitud de la misma. La banda debe observarse a trasluz, ya que puede ser translúcida. En algunas imagenes como en la de la tintura de ajo, colombo, condurango ó aloe, no se aprecia la banda, mientras que en otras aparecen bandas dobles como la grindelia. La sub-banda que comprende toda la parte de la imagen situada debajo de la banda, es quizá la menos importante, aunque debe considerarse su color. Posibles cambios por alcalinidad La alcalinización consiste en exponer la imagen capilar a los vapores de amoníaco, para observar los posibles cambios de coloración. Es recomendable realizar la alcalinización de la imagen capilar inmediatamente después de su análisis para garantizar que la misma aún esté húmeda. El efecto de la alcalinización es temporal ya que debe desaparecer al retirar la tira de papel de los vapores amoniacales. Las imagenes pueden variar su coloración desde el amarillo hasta el violeta, por la acción de estos vapores y en otros casos puede no cambiar, es por ello que resulta de gran interés para la caracterización de la imagen.

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Exámen bajo la luz UV a 366 nm Resulta de gran interés para la caracterización de algunas muestras, ya que en ellas aparecen materiales fluorescentes que se detectan facilmente exponiendo la tira de papel con la imagen capilar bajo los rayos de la luz UV. Así tenemos por ejemplo los extractos de quina que exhiben una fluorescencia azul o los de hidrastis, con una fluorescencia amarillo brillante. Contrariamente con el ensayo de alcalinidad en este caso debe dejarse secar bien la tira de papel después de corrido el análisis, antes de observarla bajo la luz. Factores que influyen en el análisis capilar 1.Factores extrínsecos: a) Calidad del papel de filtro. b) Temperatura en que se desarrolla el análisis. c) Tiempo de corrimiento. 2.Factores intrínsecos: a) Tiempo de fabricación de la tintura. 1.a) Calidad del papel de filtro: El soporte del análisis capilar, o sea, el papel de filtro, juega un rol importante en el aspecto de la imagen obtenida, ya que el mismo puede variar la altura de la imagen, el aspecto de la franja, etc. Debe por tanto tenerse en cuenta la clase de papel y el sentido de la fibra del papel al cortar las tiras. 1.b y c) Temperatura y tiempo de corrimiento: Se ha comprobado que a bajas temperaturas la altura se reduce, mientras que a temperaturas mayores de ºC tiende a subir de 1 a 2 cm por encima de lo normal. De igual forma para corrimiento de más de 2 horas la imagen obtenida es más oscura y la franja tiende a tomar borde irregularmente dentado . Por lo que los mejores resultados se obtendran para 2 horas y a temperaturas de 25 ºC (± 1). 2.a) Tiempo de fabricación de la tintura: - La altura de la imagen disminuye con relación a la normal para muestras de mas tiempo de fabricación. - El color de imagen disminuye en intensidad en muestras con mayor tiempo de fabricación. - Influye también en el aspecto de la franja y la banda. Bibliografía. 1- Farmacopea de la URSS XI vol. 1, 1987. 2- The United States Pharmacopeia.Edic XXI y XXII, 1990, 1991. 3- Hager. “ Tratado de Farmacia Práctica”. Tomo II. Editorial Labor SA 1948. 4- Remigton. “Farmacia Práctica XII”. Edición Revolucionaria 1972. SOLUCIONES Y REACTIVOS

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1. Alcohol extractivo : 84 mL de alcohol de 95 % y agua destilada csp 100 mL. 2. Ácido clorhídrico diluido (10 %) : 36 mL HCL concentrado (d=1,16;31 %) en agua csp 1L. 3. Ácido clorhídrico c(HCl/z*) l mol/L 85 mL de HCL concentrado, en agua csp 1 L. 4. Ácido sulfúrico diluído (10 %) : 52 mL de H2 S04 concentrado en unos 100 mL de agua destilada. Enfríese a temperatura ambiente y diluya con agua a 1 L. 5. Sol. saturada de ácido pícrico : 2 g de Ác. pícrico en agua destilada csp 100 mL. Se reposa por 24 h, se agita y se filtra. 6. Sol. pícrica-clorhídrica : La solución saturada acuosa de ácido se mezcla con el cuádruple volumen de HCL al 30 %. 7. Sol de ácido picrolónico : Solución saturada en alcohol al 20 % o en agua. 8. S.R de acetato de plomo c (PbAc 2 /z*) 0,5 mol/L 6,5 g de cristales transparentes de acetato de plomo se disuelven en suficiente agua recíen hervida para obtener 100 mL. Se preserva en frascos ámbar bien cerrados. 9. S.R de acetato de calcio : Acetato de calcio al 10 % en agua destilada. 10. Sol. de ácido silicotúngstico : 5g de Ac. silicotúngstico se disuelven en H 2 SO 4 c(H 2 SO 4 /z*) 6 mol/L csp 100 mL. 11. S.R de amoníaco : 400 mL de amoníaco concentrado al 28 % en suficiente cantidad de agua para 1 L. 12. Almidón indicador : Se tritura 1 g de almidón soluble en 10 mL de agua fría y se vierte lentamente, con agitación constante, en 200 mL de agua hirviente. Se hierve hasta obtener un líquido transparente; deje sedimentar, filtre y utilice solamente el líquido sobrenadante. 13. Sol de ácido tánico : 1 g de tanino (ácido tánico) en 8 mL de agua y 1 mL de etanol. Debe prepararse en el momento de usarse. 14. S.R de anilina clorhídrica : 2 g de Cloruro de anilina se diluyen en 65 mL de etanol al 90 % y 35 mL de agua destilada; se añaden 2 mL de HCL concentrado. 15. Sol. de ácido crómico : Solución acuosa al 50 % 16. S.R de Bial : 1 g de orcinol se disuelve en 500 mL de HCl, agregando luego 25 gotas de una solución de cloruro férrico al 10 %. 17. Sol de bencidina : Solución alcohólica al 5 % o en ácido al 5 %. 18. Sol de bencidina cúprica : 10 mL de sol. de acetato de bencidina, se satura con acetato de cobre al 3 %. 19 Sol de Bromuro de potasio : Bromuro de potasio al 20 % en agua.

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20. Reactivo de Baljet : Sol.A: 1 g de ácido pícrico (2,4,5-Trinitrofenol) en 100 mL de etanol. Sol.B: 10 g de NaOH en 100 mL de agua. 21. Reactivo de Benedict : Sol.A: 17,3 de citrato de sodio; 10 g de carbonato de sodio anhidro y 60 mL de agua. Sol.B: 1,73 g de CuSO4 5H2O en 15 mL de agua. Se mezclan ambas soluciones y se afora a 100 mL. 22. Reactivo de Bertrand : 5 g de ácido silicotúngstico cristalizado se disuelven en 100 mL de agua destilada. Para detectar ciertos alcaloides, se acidula la solución con HCL al 10 %. 23. Reactivo de Burchardat :2 g de cristales de yodo, 4 g de KI y agua destilada csp 100 mL. 24. Buffer de acetato : Acetato de amonio al 10 %; se le añade en el momento de usarse, suficiente cantidad de amoníaco al 10 % para llevar el pH a 8,1-8,3. 25. Buffer de Borato : 3,092 g de ácido bórico y 3,728 g de cloruro de potasio, en 250 mL de agua; se agrega suficiente cantidad de NaOH c(NaOH/z*) 1 mol/L, para llevar el pH a 8,1-8,3. 26. S.R de cloruro de calcio : Solución acuosa de cloruro de calcio al 10 %. 27. S.R de cloruro de bario : Cloruro de bario al 10 % en agua. 28. S.R de cloruro de hierro : Cloruro férrico al 10 % en agua. 29. S.R de cloruro mercúrico : Disuelva 68 g de HgCl2 en agua y diluya hasta 1 L. 30. S.R de cloruro férrico-ferricianuro : Se mezclan partes iguales de cloruro férrico al 0,3 % y ferricianuro de potasio al 0,3 %. Si se utiliza en cromatografía de papel, el cromatograma se sumerge en la mezcla reactiva, luego en HCl diluído y por último en agua; finalmente se seca. 31. Sol. de clorozinc-yodo : 30 g de cloruro de zinc, 5 g de yoduro de potasio, y 1 g de cristales de yodo, se dicuelven en 14 mL de agua. Conservar en frasco ámbar. 32. Sol. de cuoxam (cobre amoniacal) : Triturar 0,5 g de carbonato cúprico con 10 cc de Sol. concentrada de amoníaco (d=0.88), lentamente y agitando la mezcla. 33. Sol. de carbonato de sodio c(CO 3 Na 2 /z*) 2 mol/L : 12,5 g de carbonato de sodio se disuelven en agua destilada, csp 100 mL. 34. Solución cromo-acética : Fuerte: 1 mL de ac. acético glacial y 100 mL de ac. crómico al 1 %. Débil: 10 mL de ac. acético glacial; 25 de ac. crómico al 1 %; 65 mL de agua. 35. Solución de Calberla : 5 mL de glicerina; 10 mL de etanol y 15 mL de agua destilada; se le agregan 2 gotas de fushina básica en solución acuosa saturada. 36. S.R de Carr-Price : Cloruro de antimonio en cloroformo, al 20 %. 37. S.R de Dragendorff :Mezclar 21,3 mL de ácido nítrico (d:1,42) con suficiente agua destilada para hacer 62 mL. En 20 mL de esta solución se disuelven 5 g de subnitrato de bismuto. Por separado, se disuelven 31.2 g de yoduro de potasio en 69 mL de agua. Mezclar luego ambas soluciones.

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38. Dragendorff modificado : Sol.A: 17 g de subnitrato de bismuto; 200 g de ácido tartárico, en 800 mL de agua. Sol.B: 160 g de yoduro de potasio en 400 mL de agua. 39. S.R de la DNP (2,4-dinitrofenilhidracina) : 0,4 g de DNP se disuelven en 100 mL de HCl c(HCl/z*) 2 mol/L 40. Sol. de dicromato de potasio c(K 2 Cr 2 O 7 /z*) 1mol/L : 49,035 g del reactivo pulverizado y desecado a 120 o C, se disuelven en agua hasta 1 L. 41. S.R del p-dimetilaminobenzaldehido (EHRLICH) : Solución acuosa al 10 %. 42. S.R de difenilamina sulfúrica : Difenilamina disuelta en H 2SO4 concentrado al 1 %. 43. S.R de digitonina : Digitonina al 0,5 % en etanol al 85 %. 44. S.R de Duquenois : Acetaldehido fresco 12 gotas, 1 g de vainillina en 50 mL de alcohol. 45. S.R de Emerson : Es la mezcla de las soluciones de carbonato de sodio al 0,5 %, 4-aminoantipirina al 5,4 % y ferricianuro de potasio al 5,4 %. 46. S.R de florogucina : Solución al 1 % en alcohol de 90 %. 47. S.R de Fehling : Sol.A: 7 g de sulfato de cobre se disuelven en 100 mL de agua destilada, conteniendo 0,1 mL de ac. sulfúrico. Sol.B: 35 g de tartrato de sodio y potasio y 15,5 g de NaOH disueltos en 100 mL de agua. Se mezclan partes iguales de A y B, en el momento de usarse. 48. S.R de Flin : 100 g de tungstato de sodio disueltos en 750 mL de agua; 20 g de ácido fosfomolíbdico mezclados con 50 mL de ácido fosfórico. Se refluja por 2 horas, flitrar y enrasar a 1 L. 49. S.R de fosfato de sodio : Solución acuosa al 1 %. 50. S.R de Ferricianuro de potasio : 1 g de ferricianuro de potasio en 10 mL de agua. 51. S.R de Frohde : 1 g de molibdato de sodio en 100 mL de ac. Sulfúrico. 52. Solución de gelatina : 1 % de gelatina en agua. Si se desea prepararle en glicerina, se utiliza la misma al 50 %, con un 1 % de fenol como conservador. 53. Glicerina yodada : Yoduro de potasio al 3 % en glicerina al 50 %. 54. Solución de resina de guayaco : 1 % de resina de guayaco en alcohol al 90 %. 55. S.R de Gibbs : 2,6-dicloroquinona cloroimida al 2 % en cloroformo. 56. S.R de Guignard (papel de picrato) : Se sumerge una tira de papel de filtro en solución saturada de ácido pícrico c(ác. pícrico/z*) 0,05 mol/L; se deseca y luego se humedece con carbonato de sodio al 10% y se deseca de nuevo.

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57. Gelatina salina (para sangre) : Gelatina al 3 % se mezcla con una solución de sal común (NaCl al 0,7 %, con adición de 0,6 g de fosfato de sodio para obtener un pH de 7,4. Después de calentar a unos 35 ºC, añadir un 5% de sangre desfribrinada. Puede añadirse 0,50 % de Nipagín como conservador. 58. Sol alcoholica de hidróxido de potasio c(KOH/z*) 0,5 mol/L: Se disuelven 28,05 g de hidróxido de potasio en 1000 mL de alcohol. Se titula contra HCl c(HCl/z*) 0,05 mol/L en presencia de anaranjado de metilo. Use tapón de goma. 59. Sol. de hidróxido de potasio c(KOH/z*) l mol/L : Disuelva 14,3 g de KOH en suficiente cantidad de agua destilada para hacer 100 mL. 60. Sol. de hidróxido de sodio : 10 % de NaOH en agua. 61. S.R de Hirsch : Solución de ácido tricloroácetico al 10 % 62. Sol. de hidrato de cloral : Solución acuosa al 66 % 63. Sol. de hidróxido de calcio (agua de cal) : Aproximadamente Ca(OH) 2 al 0,15 % en agua. 64. S.R de Kedde (modificación de Bush y Taylor) : Ácido 3,5-dinitrobenzóico al 2 % en metanol. KOH al 5,7 % en agua. 65. Solución de Lugol : Yodo al 1 % con un 2 % de KI, en agua. 66. S.R de Legal : Nitroprusiato de sodio al 5 % en agua; se sigue con 3 gotas de NaOH c(NaOH/z*) 2 mol/L. 67. S.R de Liebermann : 1 mL de ac. sulfúrico concentrado se mezclan con 20 mL de anhídrido acético y 50 mL de cloroformo. 68. S.R de Marquis : Ácido sulfúrico, seguido de 1 gota de formaldehido al 40 %. 69. S.R de Mayer : 1,258 g de cloruro mercúrico se disuelven en 60 mL de agua. Por otra parte se disuelven 5 g de yoduro de potasio en 20 mL de agua, se mezclan ambas soluciones y se enrasa a 100 mL con agua. 70. S.R de Millión : Se disuelven 6 mL de mercurio en 54 mL de ácido nítrico fumante (d=1,52), sin calentar y diluyendo la solución con un volumen igual de agua. 71. S.R de Marme : Disolver 5 g de yoduro de cadmio y 10 g de yoduro de potasio en 100 mL de agua. 72. S.R de Mandelin : Disolver 1 g de vanadato de amonio en 200 mL de ac. sulfúrico concentrado (d=1,843).Déjese sedimentar y filtre. Preparar al momeno de usarse. 73. S.R de Molisch : 15 % de -naftol en alcohol de 95 %. Se añaden 3 gotas de ac. sulfúrico concentrado. 74. Sol. de nitrato de plata : Solución acuosa al 10 %.

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75. S.R de Nesler : Se disuelven 3,5 g de yoduro de potasio y 1,25 g de cloruro mercúrico en 80 mL de agua, añadiendo una solución saturada en frío de cloruro mercúrico, con agitación constante hasta que permanezca un precipitado ligeramente rojizo y luego disolviendo 12 g de hidróxido de sodio. Después de añadir algunos mL más de la solución de cloruro mercúrico, el volumen se lleva a 100 mL con agua. 76. S.R de p-nitrofenilhidracina : Solución del reactivo, saturada en ácido acético al 15 %. 77. Sol. de permanganato de potasio c(KMnO 4 /z*) 1 mol/L : Disolver 3,3 g de KMnO 4 en un litro de agua destilada. Se hierve por 15 minutos; se cubre el recipiente y se deja en reposo por dos días, para luego filtrar por asbesto. 78. Sol. de Picrato de sodio : 0,5 g de ácido pícrico y 5 g de carbonato de sodio. Agua csp 100 mL. 79. S.R de Raymond : Solución al 1 % de m-dinitrobenceno en etanol. 80. S.R de rojo escarlata : Una solución al 0,5 % en hidrato de cloral al 66 %, se añaden gotas de amoníaco. 81. S.R de Sanin : 20 g de tártaro emético, 20 g de cloruro de sodio, 40 de acetato de sodio, 50 de bitartrato de sodio y potasio, todo disuelto en agua csp 1000 mL. 82. S.R de Sonneschein : 17,5 g de ácido molíbdico, 13,5 g de carbonato de sodio y fosfato disódico al 5 %, 30 mL. 83. S.R de Seliwanoff : 0,30 g de resorcinol en 100 mL de HCL al 12,5 %. 84. S.R de Shonteten : Solución de borato de sodio 1:20, en agua. 85. Solución de subacetato de plomo : Triturar 14 g de PbO hasta consistencia homogénea, con 10 mL de agua; transfiera esta pasta a un frasco, usando otros 10 mL de agua, para enjuagar. Disuelva 22 g de acetato de plomo en 70 mL de agua y añádase esta solución a la mezcla. Agítese vigorosamente durante 5 min. y luego deje reposar por 7 días, agitando eventualmente. Fíltrese y añádase por el filtro agua hervida csp 100 mL. 86. Solución reveladora para cromatografía de carotenoides : Bencina: 60 partes, benceno: 35 partes, cloroformo: 1,25 partes, isopropanol:0,06 partes y acetona 0,55 partes. 87. S.R de sulfato mercúrico : Solución acuosa al 1%. 88. S.R de sulfato de magnesio : Solución acuosa al 1 %. 89. Solución salina normal : Cloruro de sodio al 0,9 % en agua. 90. S.R de Sudán III : Solución al 6 % en partes iguales de alcohol y glicerina. 91. Sol. de sulfato de anilina : Solución al 2 % en ácido sulfúrico al 0,5 %.

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92. Sol. para la Taleoquinina : 1 mL de agua de bromo, adicionándose gotas de amoníaco, en presencia de una sol. de quinina al 1:200. 93. S.R de Tartrato ferroso : 1 g de sulfato ferroso anhidro se disuelve en 1 L de agua, conjuntamente con 5 g de tartrato de sodio y potasio. 94. S.R de Tollens : A 2 mL de nitrato de plata al 5 % se le añade 1 gota de NaOH al 10 %. Se agrega hidróxido de amonio hasta redisolver el precipitado. 95. S.R de Vainillina : Solución alcohólica al 1 %. 96. S.R de Vainillina clorhídrica (Reactivo de Rosenthaler) : 1 g de vainillina en 10 mL de HCL concentrado. 97. S.R de Vainillina sulfúrica : 0,5 de vainillina disueltos en 8 mL de etanol y 2 mL de ac. sulfúrico concentrado. 98. S.R de Valser : Agrege una solución de 10 g de yoduro de potasio en suficiente agua destilada para hacer 100 mL, a 14 g de yoduro mercúrico, hata la disolución de este. Filtre y deseche el exceso. 99. S.R de Van UrK : p-dimetilaminobenzaldehido al 0,2 % en ácido sulfúrico al 65 %. Se le añaden 0,2 mL de Sol. de cloruro férrico al 5 %, por cada 100 mL de reactivo. 100. S.R de Vrins : A una solución de 10 partes de molibdato de amonio en 100 p. de agua, se añaden 60 p. de ácido nítrico puro (d: 1,15). Se digiere algunas horas al bdm y se añade a la solución enfriada, ácido fosfórico al 25 %, hasta que no se forme precipitado. Se lava el precipitado de fosfomolibdato, se mezcla con agua regia en un matráz de vidrio y se hierve para expulsar el amoníaco. Se evapora el líquido a sequedad, se disuelve el residuo en ac. nítrico diluido (10 %) y se filtra. 101. S.R Verde de bromocresol : A una solución al 0,3 % del colorante en metanol al 80 % se le añaden 8 gotas de NaOH al 30 % por cada 100 mL. 102. S.R de Vitali : HNO3 conc. (d=1,40) una gota; evaporar a sequedad, enfriar. Repetir. Luego agrgar gotas de KOH al 10 % en metanol, recien preparado. 103. S.R de Wagner : Se disuelven 2 g de yodo y 2 g de yoduro de potasio en un pequeño volumen de agua, y luego llevando el enrase a 100 mL, con agua . 104. S.R de Wassacky : 2 g de p-dimetilaminobenzaldehido, con 6 g de ácido sulfúrico conc. y 0,4 mL de agua. 105. S.R de Xantidrol : 0,5 mL de solución de xantidrol, se la añaden a 1 mL de ac. clorhídrico fumante y se completa a 100 mL con ac. acético de 96 %. 106. S.R de Yoduro de potasio : 16,5 g de KI se disuelven en suficiente agua para obtener 100 mL. 107. Sol. de Zincuranilo : 10 g de acetato de uranilo se disuelven en 6 mL de ac. acético al 30 % bajo calentamiento, y se lleva a 50 mL con agua (solución A). 30 g de acetato de Zinc se mezclan con 3 mL de ac. acético al 30 % y se diluye con agua a 50 mL (solución B). Se mezclan A y B en caliente,

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formándose un líquido transparente al cual se le agrega una pizca de sal y se filtra después de reposo de 24 horas. 108. Indigo carmín (Indicador) : 3 g de indicador en sol. de ácido sulfúrico (25 mL en 500 mL de agua destilada)csp 500 mL. 109. S.R gelatina : Embeber 25 mL de gelatina durante 1 h en sol. saturada de ClNa, calentar hasta disolución de gelatina, enfrie, diluya con solución no saturada de ClNa hasta 1L. 110. Sol. acidificada de cloruro de sodio : Acidifique 975 mL de sol. saturada de CLNa con 25 mL de ácido sulfúrico. ----------------------------------------------------------------------------------------------------- Nota: Para la preparación de estas soluciones reactivos, algunas publicaciones pueden sugerir ciertas variaciones, sin que por ello se introduzcan cambios sustanciales. Los porcentajes anotados se entienden que son en peso/volumen, excepto para los alcoholes donde están en v/v. -----------------------------------------------------------------------------------------------------