Facultatea de Zootehnie şi BiotehnologiiSecţia Zootehnie şi Piscicultură

DISCIPLINA

MICROBIOLOGIE

Anul II Zootehnie şi Piscicultură

Titular disciplină:Şef lucrări dr. Daniela Moţ

1

Cuprins

Definiţia şi obiectul Microbiologiei, Morfologie bacteriană 3Noţiuni de taxonomie bacteriană 4Aspecte particulare de variabilitate morfologică, Afinităţi tinctoriale 9Structura celulei bacteriene 14Membrana citoplasmatică şi citoplasma 18Nucleul şi structurile extraparietale 24Organite celulare : cilii şi pilii 27Sporul bacterian 32Rezistenţa şi determinismul genetic al sporilor 36Fiziologie bacteriană 38Enzimele bacteriene 43Respiraţia la bacterii. Creşterea şi multiplicarea bacteriilor 48Relaţiile dintre bacterii şi factorii de mediu fizici şi chimici. Micoorganisme cu structură particulară

52

Noţiuni de micologie 63Noţiuni de virusologie şi imunologie 82Bibliografie 96

2

Definiţia şi obiectul microbiologiei,Morfologie bacteriană

Cuvinte cheie: microbi, microorganism, saprofit, polimorfism.

Microbiologia poate fi definită ca ştiinţa care se ocupă cu studiul unor vieţuitoare numite generic „microbi”, termen atribuit prima oară în 1878 de către chirurgul francez Sedillot şi apoi preluat şi generalizat de cercetătorul Pasteur. Unii consideră termenul sinonim cu cel de bacterie, dar cei mai mulţi microbiologi îi atribuie un sens şi un conţinut larg (mikros=mic, bios=viaţă).

Prin noţiunea de microb sau microorganism, în accepţiunea largă, sunt definite grupe foarte variate de vieţuitoare, de dimensiuni foarte mici, invizibile cu ochiul liber, cu o structură şi organizare relativ simplă, situate pe trepte de evoluţie unicelulară sau subcelulară. Din categoria acestora fac parte virusurile, bacteriile, ciupercile microscopice, precum şi algele microscopice şi protozoarele. Prin anumite caracteristici, unele dintre acestea se apropie de regnul animal (protozoarele zooflagelate), iar altele de regnul vegetal (protozoarele fitoflagelate, bacteriile, ciupercile microscopice, algele). Deoarece aceste vieţuitoare au trăsături distinctive de restul lumii vii s-a propus să fie încadrate în sistematică într-un regn distinct, regnul Protista (Haeckel, l866), care cuprinde două încrengături:

- Protozoa, adică primele animale;- Protophyta, adică primele plante. În vederea stabilirii în cadrul regnului a poziţiei diverselor grupe sau clase de

microorganisme s-au întâmpinat mari dificultăţi. S-a impus diferenţierea în cadrul regnului a două mari categorii de vieţuitoare unicelulare, între care există deosebiri fundamentale mari privind tipul de organizare endocelulară:

– protistele superioare, vieţuitoare cu organizare endocelulară de tip eucariot (protozoarele, ciupercile microscopice, majoritatea algelor etc.);

– protistele inferioare, vieţuitoare cu o organizare endocelulară de tip procariot (bacteriile, algele albastre etc.).

Între aceste două categorii nu s-au identificat forme intermediare, de trecere, motiv pentru care se apreciază că pe plan evolutiv între ele există un „gol”, considerat ca cea mai mare discontinuitate cunoscută până în prezent în evoluţia lumii vii.

Unii cercetători au propus îmbunătăţirea sistematicii vieţuitoarelor, prin crearea a patru sau cinci regnuri, în unele din acestea urmând să fie cuprinse numai anumite categorii de microorganisme.

În preocupările microbiologiei intră numai câteva clase sau grupuri de protiste şi anume virusurile, bacteriile şi ciupercile microscopice. Acestea au dus la formarea unor ştiinţe distincte ca: bacteriologia, virusologia şi micologia. În cadrul microbiologiei s-au dezvoltat apoi, subramuri cum ar fi: microbiologia medicală, microbiologia industrială, microbiologia alimentară, microbiologia agricolă, microbiologia marină etc.

Caracterele generale ale bacteriilorBacteriile formează în sistematică clasa Schizomycetes (Naegeli, l857) sau

Bacteria (Cohn, 1872). Sunt vieţuitoare foarte heteromorfe, răspândite larg în natură, unde constitue o parte importantă a biosferei. Cele mai multe sunt saprofite (sapros=putrid) şi au rol foarte important în circulaţia complexă a materiei în natură.

3

Doar un număr relativ restrâns de specii bacteriene au evoluat spre o viaţă parazitară, devenind patogene pentru om, animale şi plante.

Cu toate că sunt foarte diversificate, bacteriile au câteva caracteristici generale care le pot defini ca un grup distinct de vieţuitoare.

Ecologic, bacteriile sunt apreciate ca fiind vieţuitoare ubicvitare. Se găsesc pretutindeni în natură, de la suprafaţa Terrei până în adâncul oceanelor, din zonele aride până în cele ale gheţurilor veşnice. Datorită plasticităţii lor, bacteriile s-au adaptat la condiţii foarte variate de mediu şi viaţă. Numeroase grupe specializate de bacterii trăiesc în sol, altele în apele de suprafaţă. Unele trăiesc ca floră epifită sau comensală pe pielea şi mucoasele omului şi animalelor, precum şi în anumite compartimente ale tubului digestiv. Un număr relativ restrâns de specii bacteriene au devenit parazite pentru organismele animale sau vegetale, la care produc boli specifice.

În concluzie, alături de alte microorganisme, bacteriile reprezintă o verigă esenţială în circulaţia complexă şi în sensuri multiple ale materiei. Prin mijlocirea lor, natura este supusă mereu unor procese de transformări fără de care viaţa pe planeta noastră ar fi imposibilă.

Bacteriile sunt vieţuitoare unicelulare, heteromorfe, cu dimensiuni cuprinse între 0,1 – 15 micrometri. Celula bacteriană este protejată de un perete sau membrană cu structură rigidă, care conferă forme caracteristice, cunoscându-se cele de coc, bacil, vibrion şi spirochet.

Bacteriile, prin structura şi organizarea endocelulară relativ simplă sunt definite ca vieţuitoare procariote. Unitatea morfo-biologică a celulei este protoblastul, formaţiune care cuprinde toate organitele endocelulare, delimitate la exterior de membrana citoplastică. Masa citoplasmatică este densă şi aparent omogenă, fără o structură bine definită. Dintre organitele citoplasmatice, la bacterii lipsesc mitocondriile. Aparatul nuclear este puţin individualizat, lipsit de membrană nucleară şi o structură internă propriu-zisă.

Multiplicarea bacteriilor se face obişnuit prin sciziparitate iar aparatul nuclear se divide pe cale amitotică. În mod excepţional, anumite grupe de bacterii se pot multiplica şi pe alte căi (înmugurire, fragmentare etc).

Majoritatea bacteriilor sunt lipsite de pigmenţi fotosintetizanţi. Energia necesară pentru activităţile vitale este procurată prin reacţii chimice exergonice. Din acest motiv, bacteriile se pot defini ca vieţuitoare strict chemotrofe (chemosintetizante). Au un bogat echipament enzimatic care le permite utilizarea în metabolismul plastic şi energetic a componentelor organice şi anorganice foarte variate.

Noţiuni de taxonomie bacteriană

De când Müller (1775) a încercat pentru prima oară să clasifice bacteriile şi până în zilele noastre s-au cunoscut numeroase sisteme de ordonare a acestora, bazate în principal pe caracterele morfo-fiziologice de diferenţiere, cele mai importante fiind cele elaborate de Cohn (1876), Lehmann şi Neumann (1890), Migula (1897), Pribam (1933), Hauduroy (1937, 1953), Krasilnikov (1949, 1959), Prévot (1961), Cowan (1968). Însă unul dintre cele mai complexe sisteme de clasificare a bacteriilor a fost elaborat de un colectiv larg de autori, fiind acceptat pe plan

4

internaţional şi cunoscut sub denumirea de "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", care a apărut în prima sa ediţie în anul 1923, de către David Hendricks Bergey. Ultima apariţie a manualului Bergey este alcătuit din cinci volume, primul publicat în anul 2001 iar ultimul urmând a fi publicat în anul 2011. Conform datelor din manualele Bergey clasifică microorganismele după conform următoarei scheme׃

Prokaryotes: Bacteria classification (phyla and orders) Domain: Archaea – Bacteria – EukaryotaG-/OM Terra-/Glidobacteria (BV1)

Eobacteria (Chloroflexi, Deinococcus-Thermus) · Cyanobacteria · Thermodesulfobacteria · thermophiles (Aquificae · Thermotogae)

Proteobacteria (BV2)

Alpha · Beta · Gamma (Enterobacteriaceae) · Delta · Epsilon

BV4

Spirochaetes Spirochaetes

SphingobacteriaFibrobacteres · Chlorobi/Bacteroidetes

Planctobacteria Chlamydiae/Verrucomicrobia · Planctomycetes

Other GNAcidobacteria · Chrysiogenetes · Deferribacteres · Fusobacteria · Gemmatimonadetes · Nitrospirae · Synergistetes · Dictyoglomi · Lentisphaerae

G+/no OM

Firmicutes(BV3)

Bacilli

Bacillales: Bacillaceae · Listeriaceae · Staphylococcaceae

Lactobacillales: Enterococcaceae · Lactobacillaceae · Leuconostocaceae · Streptococcaceae

Clostridia Clostridiales · Halanaerobiales · Thermoanaerobacterales

Tenericutes/Mollicutes

Mycoplasmatales · Entomoplasmatales · Anaeroplasmatales · Acholeplasmatales · Haloplasmatales

Actinobacteria(BV5)

ActinobacteridaeActinomycetalesActinomycineae: Actinomycetaceae

Corynebacterineae: Mycobacteriaceae · Nocardiaceae · Corynebacteriaceae

5

Frankineae: Frankiaceae

Micrococcineae: Brevibacteriaceae

BifidobacterialesBifidobacteriaceae

Other subclasses

Acidimicrobidae · Coriobacteridae · Rubrobacteridae · Sphaerobacteridae

Principalele criterii de taxonomie utilizate pentru clasificarea bacteriilor sunt׃- criteriul filogenetic, care este mai greu de respectat datorită absenţei unor

dovezi convingătoare, capabile să ateste filogenia bacteriilor;- criteriul omologiei materialului genetic, introdus în ultimii ani, când prin

tehnici fizico-chimice avansate s-au putut stabili unele caractere genetice care reprezintă un important criteriu de definire a speciei bacteriene, fiind luate în considerare aspecte cum ar fi׃ masa moleculară a citozinei şi guaninei raportată la întreaga masă moleculară a ADN-ului bacterian (exprimate în mol %), asemănările de structură ale ADN-ului, duplexurile de ADN heterolog şi ARN hibrid, asemănările de structură ale celor trei tipuri de ARN (ARNm, ARNt, ARNr) şi secvenţa oligonucleotidelor din ARNr;

- criteriul posibilităţii de recombinare genetică prin intermediul transformării, transducţiei şi conjugării între aceleaşi specii sau specii apropiate de bacterii;

- criteriul biochimic bazat pe studii minuţioase de fiziologie bacteriană, prin metode de investigaţie biochimică tot mai perfecţionate;

- criteriul antigenic care vizează identitatea antigenică a speciilor, cunoscută prin reacţiile serologice;

- criteriul asemănării caracterelor este cel mai utilizat criteriu în sistematica bacteriologică, putând fi luat în considerare prin două conduite taxonomice (conduita convenţională, pe un număr limitat de caractere şi taxonomia numerică sau taximetria, care are ca şi punct de plecare analiza unui număr foarte mare de caractere acceptate ca având o pondere egală.

Categorii de taxoni cu aplicabilitate în sistematica bacteriologică

Ca şi în cazul sistematicii plantelor, în bacteriologie există taxoni de rang superior speciei: regn, încrengătură, clasă, ordin, familie şi gen. În determinatoarele uzuale se lucrează foarte puţin cu regnul, încrengătura, clasa şi ordinul.

Familia este gruparea taxonomică cel mai des utilizată în bacteriologia aplicativă, în ciuda faptului că există încă multe genuri neîncadrate în vreo familie.

Genul reprezintă un taxon foarte important, care stă la baza diagnosticului bacteriologic curent.

Specia este considerată taxonul de bază în sistematică, mulţi dintre cercetători căutând să realizeze definirea speciei ca şi categorie taxonomică.

Stamatin (1958) considera că specia reprezintă suma indivizilor cu aceeaşi formă, care se dezvoltă în condiţii asemănătoare de mediu, producând mici aglomerări (în medii lichide) sau colonii (pe medii solide) de aproximativ acelaşi tip,

6

cu manifestări vitale apropiate şi cu o compoziţie chimică în totalitate sau în parte identică. Definiţii ale speciei au mai fost formulate şi de Cowan (1975), Stainer (1976) şi Gordon (1978). Staley şi Krieg (1984) au precizat că specia reprezintă o colecţie de tulpini bacteriene care au numeroase proprietăţi comune, însă diferă considerabil dealte tulpini, pentru fiecare specie existând o tulpină tip sau de referinţă, în jurul căreia gravitează celelalte tulpini cu caracteristici asemănătoare, care sunt incluse în mod justificat în specia respectivă. Subdiviziunile speciei au apărut ca urmare a observării unor diferenţe între microorganismele ce aparţin aceleiaşi specii şi anume:

- subspecia, care prezintă diferenţele între caracterele cele mai importante ale speciei;

- varianta (var) sau tipul, care se diferenţiază doar pe baza unui număr restrâns de caractere sau chiar printr-un singur caracter.

În practica bacteriologică mai se întâlneşte şi chimiotipul (chemotipul), ce are ca elemente de diferenţiere caracterele biochimice sau colicinotipul, a căror diferenţiere se face pe baza sensibilităţii la colicine.

Tulpina (suşa, clona) bacteriană este o cultură pură (alcătuită doar din bacterii ce aparţin unei singure specii) care îşi are originea într-o singură izolare dintr-un mediu natural. Este alcătuită dintr-o populaţie bacteriană şi reprezintă în bacteriologie elementul de lucru principal în procesul de identificare a bacteriilor, precum şi a încadrării acestora în sistematica bacteriană. Tulpinile sunt păstrate în colecţii bacteriene locale (laborator), naţionale şi internaţionale. Astăzi, pe plan mondial există cataloage de colecţii cu informaţii privind instituţiile, laboratoarele şi bacteriologii care deţin tulpini bacteriene, cu speciile distincte ale acestora.

Nomenclatura bacteriilor

În general bacteriile au denumiri ştiinţifice în limba latină, însă o parte din acestea au şi nume comune folosite în mod curent în practică (cum ar fi de exemplu bacilul rujetului, colibacilul, bacilul necrozei, al morvei etc).

Încregătura şi clasa sunt taxoni de rang superior şi au denumiri alcătuite din un nume generic la care se adaugă sufixe care pot fi diferite.

Ordinul şi familia sunt de obicei denumite cu numele genului cel mai reprezentativ pentru gruparea taxonomică respectivă, la care este adăugat sufixul ales pentru ordin (exemplu ordinul Spirochetales, ordinul Rickettsiales etc) şi aceae pentru familie (de exemplu familia Enterobacteriaceae, familia Mycobacteriaceae etc).

În nomenclatura bacteriilor a fost acceptată nomenclatura binară latină, în care unitatea de bază a taxonomiei – specia – este denumită prin două cuvinte, din care primul defineşte genul (scris întotdeauna cu majusculă) şi al doilea reprezintă un epitet specific (scris cu literă mică, spre exemplu Bacillus anthracis, Salmonella london, Brucella abortus etc).

Genurile bacteriene au denumiri care pot fi inspirate după:- caracterele morfologice (Bacillus, Staphylococcus, Streptococcus etc);- caracterele ecologice (Lactobacillus);- caracterele biochimice (Citrobacter);- caracterele de patogenitate (Erysipelothrix);

7

- numele bacteriologului care a izolat sau a avut merite deosebite în studiul bacteriei respective (Brucella, Bordetella, Pasteurella, Erwinia, Escherichia, Rickettsia, Nocardia, Naisseria, Erwinia etc).

Denumirea speciilor poate să fie dată de:- unul din caracterele morfologice, biochimice sau culturale (Staphylococcus

aureus, Lactobacillus acidophillus etc);- numele bacteriologului care a izolat sau a descris germenul (Actinobacillus

lignieressi, Clostridium chauvoei, Rickettsia rickettsi etc);

Morfologie bacteriană

Cunoaşterea caracteristicilor morfologice are o importanţă deosebită în cercetarea şi identificarea bacteriilor. În condiţii optime şi identice de viaţă şi mediu, caracterele morfologice proprii unor specii sau grupe de bacterii sunt constante, servind ca importante criterii taxonomice având şi utilitate practică în lucrările curente de diagnostic bacteriologic. Se pot întâlni în mod normal numeroase aspecte de variabilitate referitoare la forma, dimensiunile, prezenţa sau absenţa capsulei, cililor, sporilor etc.

Proprietatea unei specii bacteriene de a se prezenta sub aspecte morfologice variate se defineşte ca polimorfism sau pleomorfism. Apare mai evident în cazul germenilor cultivaţi în medii artificiale, la culturile mai vechi sau la celulele bacteriene îmbătrânite. La bacteriile patogene, cele mai caracteristice aspecte morfologice se găsesc în cazul germenilor prezenţi în materiale patologice, cum ar fi: cadavre, puroi, secreţii patologice etc.

Forma: bacteriile, în general, sunt heteromorfe, cu o mare diversitate de forme şi numeroase aspecte de variabilitate morfologică. Totuşi, pot fi încadrate în patru tipuri morfologice: coci, bacili, vibrioni şi spirochete.

Cocii sunt sferoidali, aparent rotunzi, uneori uşor ovalari sau chiar neregulaţi. Unele specii de coci au forme particulare, cum ar fi Streptococcus pneumoniae (pneumococ), cu celule ovalare, lanceolate şi Neisseria gonorrhoeae (gonococ), cu celule ovalare, reniforme.

Bacilii au formă cilindrică, mai mult sau mai puţin alungită, asemănătoare unui bastonaş. Unele specii sunt uşor aplatizate (Erysipelothrix insidiosa sau bacilul rujetului). Se pot întâlni numeroase specii de bacili care prezintă obişnuit aspecte de polimorfism: forme cocoide şi cocobacilare, forme naviculare, forme mult alungite, cu aspect filamentos etc. Între bacili există numeroase deosebiri în privinţa grosimii şi lungimii sau a formei pe care o au capetele acestora. Unele specii sunt sub formă de bacili subţiri, fini, rectilinii (E. insidiosa), iar altele sub forme bacilare uşor încurbate (Mycobacterium tuberculosis). Dimpotrivă, alte specii au forme bacilare groase (Bacillus anthracis, Clostridium spp.), însă majoritatea au capetele uşor rotunjite. Excepţie face B. Anthracis, care are capetele drepte, iar speciile din genul Fusobacterium au celulele subţiate spre capete, căpătând un aspect fusiform.

Vibrionii au forma alungită şi încurbată, uneori cu ondulaţii neregulate. Speciile din genul Vibrio au o formă încurbată, asemănătoare cu o virgulă sau cu un corn. La spirili, forma este mai alungită, cu câteva ondulaţii neregulate, care se produc în mai multe planuri, fără să formeze un tur complet de spiră.

Spirochetele au aspect filiform, filamentele sunt foarte subţiri şi lungi, cu numeroase ondulaţii sub formă de spire regulate, asemănătoare unui tirbuşon.

8

Aspectul spirelor este diferit (ex. genul Leptospira, cu zeci de spire regulate şi foarte strânse şi genul Borrelia, cu spire largi şi puţin regulate).

Aspecte particulare de variabilitate morfologică, Afinităţi tinctoriale

Cuvinte cheie: forme aberante, criteriu taxonomic, acido-alcoolo-rezistenţă.

La numeroase specii bacteriene se întâlnesc frecvent aspecte de polimorfism, acestea fiind de regulă mai accentuate în culturile vechi. În cazul cultivării unor bacterii în condiţii deosebite de mediu şi viaţă pot lua însă naştere forme care se abat de la aspectele morfologice normale. De exemplu, la unele specii bacteriene cultivate pe medii care conţin carbonat de litiu se pot întâlni forme în Y, ramificate, filamentoase, globuloase etc. Asemenea aspecte, definite în general ca forme aberante ( monstruoase) , pot apărea şi în alte condiţii de mediu. Uneori pot lua naştere forme aberante de tipul unor plasmodii (sinciţii sau symplaste), constituite din aglomerări de mai multe celule neseparate între ele. Semnificaţia biologică a formelor aberante este mai puţin elucidată, unele fiind considerate ca expresie a unor procese degenerative, determinate de condiţii de mediu şi viaţă mai puţin favorabile. Din contră, anumite aspecte de polimorfism sunt interpretate ca procese de variabilitate aparţinând unui ciclu evolutiv complex. Se ştie, de exemplu, că unele bacterii cultivate pe medii care conţin penicilină (sau în alte condiţii) pot trece prin procese complexe de transformare şi reorganizare morfologică, cunoscută sub denumirea de „ciclu L”. În cursul acestui ciclu iau naştere forme gigante, globuloase, care se pot fragmenta în formaţiuni corpusculare sau granulare de dimensiuni foarte mici ( forme filtrabile) , din care pot rezulta ulterior forme bacteriene cu aspect normal sau forme globuloase.

Mod de grupare la bacteriiLa majoritatea speciilor bacteriene celulele rezultate din diviziune se separă

răspândindu-se uniform în mediu. În cazul unor bacterii acestea rămân însă ataşate una de alta, de o manieră care duce la formarea de grupări caracteristice. Ca urmare, modul de grupare constituie la unele specii un important criteriu taxonomic, de mare utilitate în lucrările curente de diagnostic. Cele mai caracteristice modalităţi de grupare sunt întâlnite la coci, şi anume: diplococii, tetradele, stafilococii şi streptococii.

Diplococii (diplos=dublu) reprezintă cocii grupaţi câte doi. Gruparea este determinată de faptul că fiecare celulă bacteriană se divide totdeauna pe un singur plan, iar celulele fiice rămân ataşate în continuare realizându-se astfel grupări caracteristice de câte două celule sau înlănţuiri scurte de asemenea diplococi. La unele specii, aranjamentul faţă în faţă a celor doi coci se face de o manieră caracteristică. De exemplu, Str. pneumoniae (pneumococul) are o formă lanceolată şi se dispune totdeauna cu partea ascuţită faţă în faţă, iar Neisseria gonorrhoeae (gonococul) are formă reniformă şi se dispune totdeauna cu partea reniformă faţă în faţă.

Streptococii (streptos=lanţ) sunt coci dispuşi într-o înlănţuire liniară, asemănătoare unui şirag de mărgele. Gruparea în lanţ este determinată de faptul că toate celulele se divid pe acelaşi plan şi într-o singură direcţie, rămânând apoi ataşate una de alta.

9

Cocii care se grupează în acest fel formează în sistematică genul Streptococcus. Lungimea lanţurilor variază în anumite limite de la o specie la alta, unii streptococi se grupează frecvent în lanţuri lungi, formate adeseori din câteva zeci de coci, în timp ce alţii se grupează obişnuit în lanţuri mai scurte, formate uneori numai din câteva celule. Lungimea lanţurilor este în parte condiţionată de mediul în care au fost cultivaţi germenii şi de natura materialului patologic. De exemplu, Streptococcus equi, care produce gurma la cal, se găseşte în puroiul recoltat din abcesele gurmoase sub formă de lanţuri foarte lungi. Din contră, în sângele şi organele animalelor moarte de septicemie streptococică, se întâlnesc obişnuit coci izolaţi sau grupări constituite doar din câteva elemente. În culturile pe medii lichide lanţurile sunt de regulă mult mai lungi decât în culturile dezvoltate pe suprafaţa mediilor semilichide (geloză cu ser).

Gruparea în tetradă (tetra = patru) este alcătuită din câte patru coci dispuşi într-un aranjament regulat (sau în grămezi constituite din mai multe tetrade). Asemenea formaţiuni sunt consecinţa faptului că germenii se divid succesiv totdeauna pe două planuri perpendiculare, rămânând apoi ataşaţi în grupări de patru sau multiplu de patru. Speciile care se grupează în acest mod formează în sistematică genul Tetragenus.

Gruparea în octadă se caracterizează prin constituirea de grupări formate din opt coci dispuşi într-un aranjament cubic: patru într-un prim plan şi alţi patru într-un plan profund şi simetric. Formarea de octade este determinată de faptul că diviziunea celulelor se produce succesiv totdeauna pe trei planuri perpendiculare, orientate în cele trei direcţii ale spaţiului. Speciile care se grupează astfel formează în sistematică genul Sarcina.

10

11

Gruparea în grămezi neregulate (staphylos) este caracteristică stafilococilor, care se grupează în grămezi neregulate, mai mari sau mai mici, asemănătoare unor ciorchini de strugure. Gruparea este determinată de faptul că celulele se divid pe diverse planuri şi direcţii, rămânând apoi ataşate în grămezi fără un aranjament caracteristic. Mărimea grămezilor variază în raport cu mediul în care germenii au fost cultivaţi. Cocii care se grupează în acest mod formează în sistematică genul Staphylococcus.

La bacili se pot întâlni modalităţi de grupare mai mult sau mai puţin caracteristice cum sunt: diplobacilii, streptobacilii, gruparea în palisadă etc.

Diplobacilii sunt grupări formate din câte doi bacili dispuşi cap la cap. Aranjamentul este dat de faptul că cele două celule rezultate din diviziune rămân ataşate una de alta. În cazul bacilului rujetului formaţiunile diplobacilare au aspect caracteristic, germenii dispunându-se de regulă în unghi obtuz, asemănător literei V.

Streptobacilii sunt grupări constituite din mai mulţi bacili dispuşi cap la cap, într-un aranjament liniar, formând astfel o înşiruire de germeni în lanţ. Lungimea lanţurilor este variabilă, în funcţie de mediul în care germenii au fost cultivaţi sau de materialul patologic în care se găsesc. Acest mod de grupare este caracteristic pentru Bacillus anthracis, care în culturile pe medii artificiale se găseşte frecvent dispus în lanţuri uneori foarte lungi. Din contră, în frotiurile făcute din sângele şi organele animalelor moarte de antrax, germenii se găsesc izolaţi sau grupaţi în lanţuri scurte, formate din cel mult câteva elemente.

Gruparea în „grilaj” sau „palisadă” este întâlnită la germenii din genurile Mycobacterium şi Corynebacterium, fiind caracterizată prin dispunerea mai multor bacili într-un aranjament paralel, asemănător degetelor de la o mănuşă sau a scândurilor dintr-un gard. Aranjamentul este dat de faptul că bacilii rezultaţi din diviziuni succesive suferă un proces de basculare de 180 de grade în jurul peretelui de septare, celulele fiice luând astfel o poziţie paralelă.

DimensiunileBacteriile au dimensiuni de ordinul micronilor, cuprinse între limite de 0,1-15

μm. Deşi sunt supuse unor procese largi de variabilitate, dimensiunile fiecărei specii se încadrează în limite determinate genetic, constituind un important criteriu de

12

diagnostic. De exemplu, diametrul celor mai mici coci oscilează în jurul valorii de 0,6 μm, iar la cocii mai mari în jurul a 1,2 – 1,5 μm.

La bacili se apreciază lungimea şi grosimea. Cei mai mici bacili, cum sunt cei din genul Brucella, au grosimea de aproximativ 0,1μm şi lungimea în jur de 0,3 μm. Aceştia au dimensiunile apropiate de limita vizibilităţii cu microscopul optic. Una din cele mai mari specii bacteriene patogene este Clostridium septicum, care are dimensiunile medii de 1/10 μm. Între bacteriile de putrefacţie se întâlnesc germeni cu dimensiuni mai mari. Astfel, Clostridium putrefaciens atinge o lungime de până la 15μm. Spirochetele au o grosime mică (0,25 – 0,3 μm), dar o lungime apreciabilă (6 – 20 μm).

În cursul unor procese de variabilitate dimensiunile pot suferi modificări importante. Formele aberante, globuloase au dimensiuni gigante, în timp ce formele granulare rezultate în urma fragmentării acestora în timpul cursului evolutiv, au dimensiuni extrem de mici, fiind adesea filtrabile.

Volumul, greutatea şi densitateaÎn raport cu dimensiunile pe care le au, volumul şi greutatea bacteriilor sunt

foarte mici. Spre exemplu, un coc mare, cu diametrul de 1,2 μm, are un volum de 10-

12 cm3 şi o greutate de 1,1 x 10-12g.Densitatea bacteriilor oscilează de regulă în jurul valorii de 1,1. De aceea,

acestea sedimentează când sunt suspendate în mediile lichide cu o densitate mai mică.ceastă caracteristică este şi ea supusă variabilităţii naturale. Bacillus subtilis, care este un germen strict aerob, cultivat în bulion are o densitate mai mică de 1, ceea ce-i permite să se dezvolte sub formă de peliculă la suprafaţa mediului lichid. Acelaşi germen cultivat pe suprafaţa gelozei are o densitate mai mare de 1. Aceasta denotă posibilitatea de variabilitate adaptativă a densităţii celulei bacteriene în funcţie de condiţiile de viaţă oferite de mediu.

Afinităţi tinctorialeBacteriile manifestă o aviditate pronunţată pentru coloranţii bazici: albastru de

metilen, albastru de toluidină, cristal violet, fuxină bazică etc. Colorarea se caracterizează prin fixarea rapidă, intensă şi uniformă a colorantului pe suprafaţa celulei bacteriene care apare de regulă colorată omogen. Din această cauză, prin mijloacele uzuale de colorare şi investigaţie optică, în celula bacteriană nu este posibilă evidenţierea prezenţei unor organite citoplasmatice sau a aparatului nuclear.

Nu toate speciile bacteriene se comportă identic faţă de aceiaşi coloranţi şi metode de colorare, mai ales în privinţa intensităţii cu care fixează şi reţin coloranţii. Aceste deosebiri de comportament sunt definite ca afinităţi tinctoriale. Prin mijlocirea lor, lumea bacteriană poate fi împărţită în mai multe grupe importante pentru taxonomie, dar şi pentru lucrările curente de identificare a diferitelor specii bacteriene.

În vederea evidenţierii principalelor afinităţi tinctoriale ale bacteriilor se utilizează, de regulă, două metode de colorare: Gram şi Ziehl-Neelsen.

Metoda Gram permite împărţirea lumii bacteriene în două mari grupe: bacterii Gram pozitive, care se colorează în albastru şi bacterii Gram negative, care se colorează în roşu.

Metoda Ziehl-Neelsen evidenţiază bacteriile acido-rezistente şi împarte lumea bacteriană în două categorii: bacterii acido-alcoolo-rezistente, care se colorează în roşu şi bacterii neacido-alcoolo-rezistente, care se colorează în albastru.

13

În scopul evidenţierii unor caracteristici tinctoriale particulare ale unor specii se recurge la alte metode speciale de colorare.

Evidenţierea afinităţilor tinctoriale are utilitate practică, în lucrările de identificare, dar şi semnificaţie taxonomică, între grupe de bacterii cu afinităţi tinctoriale diferite observându-se şi alte caracteristici distinctive. Majoritatea bacteriilor Gram pozitive sunt mult mai sensibile la acţiunea toxică a coloranţilor bazici de anilină (cristal violet), precum şi la penicilină şi alte câteva antibiotice, în timp ce bacteriile Gram negative au o rezistenţă remarcabilă faţă de acestea.

Cauzele care determină Gram pozitivitatea şi Gram negativitatea sunt multiple, procesul de colorara fiind în esenţă un fenomen fizic şi coloido-chimic complex. Aviditatea diferită faţă de acelaşi colorant se datorează în principal deosebirilor de pH mediului endocelular. Bacteriile Gram negative au pH-ul endocelular în jur de 5, iar cele Gram pozitive în jur de 2, ceea ce face ca acestea să aibă o aviditate mai mare faţă de coloranţii bazici, respectiv faţă de violetul de genţiana.

În determinarea afinităţilor tinctoriale intervin şi alţi factori legaţi de natura componentelor endocelulare şi mai ales de deosebirile de structură morfochimică ale pereţilor celulari şi membranei citoplasmatice. Gram pozitivitatea este în dependenţă şi de starea fiziologică a celulei bacteriene. Aceasta, pe măsură ce îmbătrâneşte îşi pierde parţial afinităţile tinctoriale caracteristice, devenind treptat Gram-labilă.

Acido-alcoolo-rezistenţa este şi ea datorată unor deosebiri de structură morfochimică a peretelui celular. Penetraţia mai dificilă a colorantului în celulă şi rezistenţa la decolorare cu acizi diluaţi şi alcool se datorează ceridelor şi lipoproteinelor existente în cantităţi mari în peretele celular al bacteriilor acido-rezistente.

Se poate afirma că afinităţile tinctoriale ale bacteriilor au o mare semnificaţie biologică, iar metodele de colorare utilizate sunt veritabile mijloace de investigaţie citochimică, de mare utilitate practică.

Structura celulei bacteriene

Cuvinte cheie: Gram pozitive, Gram negative, unitate morfobiologică.

Peretele celulei bacteriene (membrana)Peretele bacterian este relativ compact, rezistent şi rigid. Are o grosime de 15

– 35nm, fiind mai subţire la celulele tinere. Bacteriile Gram pozitive au peretele bacterian cu o grosime mai mare decât cel al bacteriilor Gram negative. Reprezintă la unele specii bacteriene 25% din volumul celulei. Structura fundamentală se aseamănă cu o plasă sau reţea cu ochiuri regulate. Peretele celulei bacteriene are calitatea de membrană semipermeabilă, cu structură poroasă, care permite realizarea schimburilor active de metaboliţi între celulă şi mediu, în ambele sensuri.

La toate speciile bacteriene, în structura peretelui intră un component macromolecular, denumit mureină (mucocomplex, peptidoglican, mucopeptid). Din punct de vedere chimic, mureina este un polimer glicopeptidic, cu o configuraţie spaţială în reţea bi- sau tridimensională. Acest polimer formează în jurul celulei un veritabil „saccul mureinic”, cu o rezistenţă şi rigiditate consolidate prin legături covalente cu alte componente parietale. Peretele bacterian mai conţine: acizi

14

teichoici, complexe lipopolizaharidice, diferite ceride, fosfolipide, glucide şi polialcooli. Aceste componente formează două straturi: stratul R (rigid), în care predomină mureina şi care ocupă zona profundă a peretelui bacterian; stratul plastic, alcătuit din diverse componente glucidice, lipidice şi proteice.

Peretele bacteriilor Gram pozitive este mai gros, cu structură densă şi compactă. La unele specii, mureina ajunge până la 80 – 90% din greutatea uscată a componentelor parietale. Mai conţine proteine, lipide aşezate spre suprafaţa peretelui şi legate covalent de mureină. Cele mai caracteristice componente polizaharidice în cazul bacteriilor Gram pozitive sunt: acizii teichoici, acizii lipoteichoici şi acizii teichuronici.

Mureina este un polimer glicopeptidic, cu o configuraţie în reţea şi îndeplineşte rol de citoschelet pentru celula bacteriană, conferindu-i forma caracteristică.

Din punct de vedere chimic mureina este formată din un polimer glucidic liniar rezultat din condensarea alternativă a acetil-glucozaminei şi a acidului acetil-muranic.

Acizii teichoici (techos=zid) sunt polimeri liniari de glicerol fosfat sau ribitol fosfat, lungi şi flexibili. Numărul subunităţilor constitutive diferă cu specia. Ajung la bacteriile Gram-pozitive până la 40-60% din greutatea uscată a peretelui bacterian.În raport cu poziţia şi natura lor există trei categorii de acizi teichoici:

-acizi teichoici parietali, care sunt coponente de suprafaţă legate de mureină şi care contribuie la asigurarea rezistenţei peretelui bacterian;

-acizi teichuronici, alcătuiţi din subunităţi dizaharidice repetate, găsindu-se asociaţi cu prima categorie de acizi teichoici;

-acizi teichoici membranari sau lipoteichoici, formaţi în urma polimerizării a 20-30 de unităţi de glicerol fosfat. Sunt situaţi în zona profundă, între perete şi membrana citoplasmatică, unde formează o reţea.

Acizii teichoici protejează mureina de anumite enzime şi detergenţi (de ex. lizozimul lezează peretele bacterian după îndepărtarea acizilor teichoici).

Tot acizilor teichoici li se atribuie rolul de a menţine în zona de suprafaţă a membranei citoplasmatice a unei anumite concentraţii de ioni metalici, mai ales Mg, lucru foarte important pentru activitatea unor sisteme enzimatice membranare. S-a demonstrat că acizii teichoici au şi acţiune antifagocitară, fiind receptori pentru fagi.

Peretele bacteriilor Gram negative este mai subţire şi mai puţin rigid. Are doar 5-20% mureină din totalul componentelor parietale. Conţine mari cantităţi de lipopolizaharide, lipoproteine şi fosfolipide, având o structură mai complexă, iar la microscopul electronic apare triplu stratificat:

-stratul profund (corespunzător stratului R, cu o grosime de 1,5-3nm şi cu un conţinut predominant de mureină şi lipoproteine;

-stratul plastic sau membrana externă alcătuit din celelalte componente, cu o grosime de 6-20 nm. Conţine lipopolizaharide (50%), fosfolipide (35%), şi proteine (15%). Datele existente pledează pentru ipoteza că fosfolipidele alcătuiesc un strat intern continuu, care se leagă prin lipoproteine la stratul mureinic profund. Lipopolizaharidele sunt asociate stratului extern, glucidele din complex fiind orientate spre suprafaţă, ele fiind purtătoare ale specificităţii antigenice.

Lipopolizaharidele predomină la toate bacteriile Gram negative . Au rol structural, reprezintă antigenii „O” şi endotoxinele bacteriilor. Pot îndeplini şi rolul de receptori pentru bacteriofagi. Compoziţia şi secvenţa lor diferă cu specia şi cu varianta determinând specificitatea antigenică a complexului lipopolizaharidic. Pe baza lor, la unele specii s-au identificat numeroase serotipuri şi chemotipuri.

15

Rolul biologic al peretelui celulei bacteriene:-Prin structura sa compactă, densă şi relativ rigidă, membrana bacteriană

conferă bacteriei forma caracteristică în vederea menţinerii integrităţii celulei, asigurând protecţia faţă de şocurile din mediu. Contracarează presiunea osmotică endocelulară, se opune şi limitează mecanic pătrunderea în celulă a unor mari cantităţi de apă ce este atrasă de hidrofilia materiei citoplasmatice.

-Datorită structurii poroase se comportă ca o membrană semipermeabilă ce permite realizarea unor schimburi continue şi selective de metaboliţi între celulă şi mediu. Intervine în unele procese de fixare şi transport ionic.

-De caracterele structurale şi chimice ale peretelui bacterian depind afinităţile tinctoriale ale bacteriilor.

-Peretele celulei bacteriene participă la procesele de diviziune celulară: creşte centripet septând şi separând complet cele două celule fiice rezultate din diviziune.

-Specificitatea antigenică este conferită de componentele glucidice din cadrul macromoleculelor parietale.

-Unele componente parietale au rol în agresivitatea germenilor, fiind considerate factori de patogenitate.

-Peretele bacterian prin structura sa chimică are rol important în comportamentul unor bacterii faţă de factorii de apărare ai organismului. Astfel bacilul TBC rezistă în citoplasma fagocitelor datorită bogăţiei peretelui celular al acestuia în ceride şi fosfolipide.

-Anumite grupări chimice de suprafaţă din structura peretelui bacterian (lipopolizaharidele) au rol de receptori pentru bacteriofagi.

Spaţiul periplasmaticEste caracteristic numai la bacteriile Gram negative. Cuprinde zona profundă

delimitată spre exterior de membrana externă a peretelui, iar spre interior de membrana citoplasmatică. Este deci cuprins în acest spaţiu şi stratul R al peretelui, format din mureină şi lipopolizaharide. În această zonă există numeroase enzime şi anumite proteine neenzimatice cu rol de a lega specific anumite componente şi de a le transporta la membrana citoplasmatică (glucide, aminoacizi, ioni organici etc).

ProtoplastulReprezintă o formaţiune bine individualizată, obţinută în urma îndepărtării

peretelui bacterian. Acesta conţine toate componentele endocelulare (citoplasmă, organite citoplasmatice şi aparat nuclear), delimitate la exterior de membrana citoplasmatică. Masa protoplaştilor reprezintă aproximativ 60 – 80% din greutatea uscată a celulei bacteriene.

Protoplaştii pot fi obţinuţi mai uşor din bacteriile Gram pozitive, al căror perete este predominant glucidic. În acest scop se poate recurge la tratarea bacteriilor cu lizozim, care hidrolizează mureina şi îndepărtează peretele celular. Formaţiuni asemănătoare se pot obţine şi prin cultivarea bacteriilor în prezenţa penicilinei, antibioticul interferând sinteza mureinei şi implicit a peretelui celular. În prezenţa antibioticului, celulele fiice rezultate din diviziune nu-şi mai pot sintetiza integral peretele, dând astfel naştere la sferoplaşti, formaţiuni care mai păstrează resturi de perete.

Protoplaştii s-au putut obţine şi prin cultivarea unor bacterii în prezenţa glicinei sau prin dezintegrarea peretelui bacterian cu enzime litice extrase din peretele sporal.

16

Din bacteriile Gram negative care au cantităţi mai reduse de mureină în peretele celular, se pot obţine doar formaţiuni sferoplastice, deoarece peretele celular îşi conservă parţial structura predominant lipoproteică şi lipopolizaharidică.

Protoplastul reprezintă unitatea morfobiologică de bază a celulei bacteriene conservând toate calităţile esenţiale ale acesteia. Dacă sunt menţinuţi în condiţii convenabile de mediu, protoplaştii pot desfăşura o activitate metabolică, energetică şi plastică fără alterări esenţiale. Protoplaştii pot fi consideraţi celule bacteriene lipsite de peretele celular.

Membrana citoplasmatică şi citoplasma

Cuvinte cheie: lipoproteine, echilibru dinamic, sistem coloidal complex, balanţă energetică celulară.

Membrana citoplasmatică poate fi evidenţiată doar prin mijloace speciale de investigaţie (microscopie electronică). Se mulează perfect la faţa internă a peretelui, cu care are doar raporturi de contiguitate. Raporturile însă sunt foarte strânse cu masa citoplasmatică. Acest lucru este atestat de constatarea că, dacă bacteriile sunt suspendate în mediu hipertonic survine un proces de plasmoliză, caracterizat prin pierderea de apă şi retractarea masei citoplasmatice. Membrana citoplasmatică se desprinde de perete şi însoţeşte fidel conţinutul endocelular. În acest mod, la unele bacterii Gram pozitive mari, membrana citoplasmatică se poate evidenţia chiar la microscopul optic, în urma colorării prin metode speciale care o diferenţiază de materia citoplasmatică şi de peretele bacterian.

Membrana citoplasmatică este formată din lipoproteine, dispuse în strat dublu subţire, colorabil, cu grosime de 7,5 – 10 nm. Are o densitate superioară materiei citoplasmatice şi o mare elasticitate. La microscopul electronic apare triplu stratificată, alcătuită din două straturi elctrono-opace, separate de un strat median electrono-transparent. Acest aspect este datorat matricei membranei citoplasmatice care este alcătuită din fosfolipide, dispuse în strat dublu. Moleculele acestora au o structură complexă, cu o extremitate polară hidrofilă şi alta hidrofobă. Ele sunt dispuse în stratul dublu lipidic, cu extremităţile polare hidrofobe orientate spre interior, respectiv faţă în faţă, formând stratul median electrono-transparent. Extremităţile ionice hidrofile sunt orientate spre exterior, formând cele două straturi electrono-opace. Asemenea aranjare conferă membranei citoplasmatice rolul de barieră osmotică şi de filtru selectiv, fiind penetrabilă numai pentru moleculele liposolubile şi nepenetrabilă pentru cele hidrosolubile.

Moleculele proteice globulare sunt inclavate şi plutesc în stratul fluid dublu lipidic. Se pot deplasa liber, orientându-se cu regiunile hidrofile spre suprafaţă. De unele proteine sunt legate cantităţi mici de glucide (polizaharide). Aceste proteine mebranare sunt de două tipuri:

- integrate (transmembranare), care străbat toată grosimea membranei, unele fiind mai expuse spre o suprafaţă sau alta;

- de surpafaţă (periferice), situate în stratul lipidic extern sau în cel intern, de regulă legate de proteinele integrate.

17

Proteinele membranare au rol de: enzime, implicate în sinteza învelişurilor parietale (perete, membrană citoplasmatică etc.); proteine de transport, prin care se asigură transferul moleculelor solubile în ambele sensuri; citocromi şi alte enzime din sistemul transportor de electroni. Rolul biologic al membranei citoplasmatice este de barieră osmotică, la al cărei nivel se activează numeroase enzime de tipul „permeazelor”, cu rol în fixarea şi transportul metaboliţilor în ambele sensuri.

Rolul de „barieră” cu permeabilitate selectivă este atestat şi de faptul că, membrana citoplasmatică permite ieşirea din celulă a unor componente proteice, cum sunt exoenzimele şi exotoxinele, intervenind în reglarea acestor procese. Faptul este confirmat de constatarea că, la anumite variante, membrana citoplasmatică poate reţine în celulă unele exoenzime, proces definit ca „fenomen de cripticitate”.

La nivelul membranei citoplasmatice sunt localizate şi activează numeroase enzime respiratorii de tipul citocromilor. Ca urmare, aceasta are rol important în metabolismul energetic. Răspândirea enzimelor respiratorii nu este însă uniformă, o mare parte fiind localizate şi concentrate în mezozomi. Membrana citoplasmatică este şi sediul unor procese de sinteză. La acest nivel se realizează sinteza unor componente care intră în structura peretelui bacterian, a capsulei, a cililor etc. În cursul procesului de diviziune participă la sinteza septumului care separă conţinutul endocelular.

MezozomiiSunt structuri membranare intracitoplasmatice, cu aspect de „sac” sau „pungă”,

formate prin creşterea şi invaginarea membranei citoplasmatice. Unii mezozomi se găsesc de regulă asociaţi fizic şi topografic cu septumul de diviziune, cu cromozomul celulei şi cu formarea sporului. După localizare se disting trei tipuri de mezozomi: septali, nucleari şi periferici.

Sunt mai numeroşi şi mai bine dezvoltaţi la bacteriile Gram-pozitive. La bacteriile Gram-negative sunt rudimentari, slab dezvoltaţi, mai greu de observat şi în număr mai mic.

Din punct de vedere morfologic aspectul mezozomilor poate varia, distingându-se trei tipuri:

-mezozomi lamelari, formaţi prin creşterea, invaginarea şi plierea membranei citoplasmatice în spirale răsucite ca un ghem;

-mezozomi tubulari, constituiţi din formaţiuni tubulare, mai mult sau mai puţin lungi şi încolăcite;

-mezozomi veziculari (saciformi) cu aspect de vezicule aproape sferice.

Mezozomii iau naştere în zone determinate genetic, în care membrana citoplasmatică creşte mai repede decât peretele, ducând la invaginarea sa şi rezultând iniţial o formaţiune sferoidală, conectată la membrana citoplasmatică printr-un peduncul cu deschiderea spre spaţiul periplasmatic. Într-o fază mai avansată se produc noi invaginări, plieri şi turtiri care duc la formarea în interior a unor structuri lamelare, veziculare sau tubulare.

Mezozomii sunt organite neesenţiale pentru viabilitatea celulei. Au însă o mare plasticitate, fiind în permanenţă influenţaţi de dinamica proceselor celulare.

Semnificaţia lor biologică este complexă, mezozomii îndeplinind mai multe funcţii. Prin mijlocirea lor se măreşte considerabil suprafaţa membranei citoplasmatice, influenţând favorabil activitatea celulară, ca răspuns la condiţiile oferite de mediu. Au rol în replicarea şi segregarea cromozomului şi în transmiterea de la suprafaţa celulei a semnalului biochimic care iniţiază replicarea. Sunt organite echivalente mitocondriilor, la nivelul mezozomilor fiind concentrate

18

cantităţi mari de enzime respiratorii, implicate în procese de fosforilare, de oxido-reducere şi de transport de electroni. Au rol în producerea şi eliberarea unor enzime (penicilinaza), în sinteza membranei celulare şi a septumului de diviziune a peretelui celular etc. Se admite că pot acţiona ca regiune specializată pentru pătrunderea în celulă a unor fragmente străine de ADN transformant, favorizând astfel procesele de variabilitate.

Citoplasma

Citoplasma reprezintă cantitativ componentul major al celulei bacteriene. Raportul cantitativ dintre aceasta şi materia nucleară variază între 2:1-10:1, în funcţie de specie şi de starea fiziologică a celulei.

Din punct de vedere al morfo-structurii, citoplasma nu are o structură şi o organizare internă bine definită. Ea se prezintă ca o masă relativ omogenă şi foarte densă, fără reticul endoplasmatic. Lipsesc, de asemenea, unele organite citoplasmatice, cum sunt mitocondriile. În schimb este foarte bogată în ribosomi.Secţiunile ultrafine prin celula bacteriană, examinate la microscopul electronic, au relevat că citoplasma are obişnuit o structură pronunţat granulară, aspect conferit în special de formaţiunile mezozomale răspândite neuniform în masa sa. Uneori, în functie de starea fiziologică a celulelor, citoplasma bacteriilor poate avea un aspect fibrilar sau chiar reticular. De altfel, omogenitatea şi densitatea materiei citoplasmatice variază în funcţie de starea fiziologică şi de vârsta bacteriilor, precum şi de condiţiile de cultivare ale acestora. În general, bacteriile din culturile vechi au o citoplasmă mai vâscoasă şi mai puţin omogenă, cu zone de densitate variabilă, cu un aspect granular mai pronunţat, iar uneori chiar cu prezenţa în citoplasmă a unor vacuole şi granule.Spre deosebire de acestea, celulele din culturile tinere, în plină activitate metabolică, au citoplasma mai fluidă, cu o pronunţată omogenitate şi o puternică bazofilie, datorită mai ales bogăţie în ARN citoplasmatic.

În citoplasma unor bacterii pot exista vacuole de apă şi granule sau corpusculi metacromatici. Materia citoplasmatică are un pronunţat caracter hidric, dar cu toate acestea este lipsită de curenţi perceptibili. Ca urmare, schimburile de metaboliţi între structurile şi organitele endocelulare se realizează la bacterii prin procese de difuziune. În apa citoplasmatică se găsesc în stare de dispersie coloidală numeroase componente moleculare organice şi anorganice (proteine, glucide, lipide, săruri minerale),citoplasma constituind în ansamblul ei un sistem coloidal complex. Acesta se menţine permanent în stare de gel deşi este supus la transformări continui, determinate de activitatea metabolică deosebit de intensă şi de schimburile metabolice foarte active dintre celulă şi mediu. Cu toate acestea, mediul citoplasmatic se menţine într-un echilibru dinamic perfect, pe de o parte prin multitudinea forţelor fizico-chimice care acţionează la nivel atomic, molecular şi intermolecular, iar pe de altă parte, prin intervenţia unor mecanisme de autoreglare, totalitatea acestora realizând, în esenţă, menţinerea nealterată a constantelor fizico-chimice endocelulare. Spre deosebire de celulele altor vieţuitoare, citoplasma bacteriilor este foarte bogată în special în proteine (din care foarte multe enzime) şi ribonucleoproteine, acestea conferindu-i caracteristicile de densitate şi cvasiomogenitate, precum şi reacţia pronunţat acidă care variază între limite de pH=2-3.

19

Ribosomii Sunt organite intracitoplasmatice de formă aproximativ sferică, cu diametrul de

cca 20 nm şi o constantă de sedimentare de 70 S. Au rol esenţial în metabolismul proteic, la nivelul lor realizându-se sinteza proteinelor bacteriene. Din punct de vedere chimic sunt complexe macromoleculare ribonucleoproteinice, formate din 55 molecule proteinice şi 3 molecule de ARN. Raportul ARN/proteine variază între 2 la 1 (la E. coli) şi 2 la 3 (la alte bacterii).

Se apreciază că o celulă poate conţine între 1500-100000 de ribosomi, numărul lor fiind în corelaţie cu intensitatea deosebită a proceselor de biosinteză a proteinelor în celula bacteriană. Majoritatea ribosomilor plutesc liber în citoplasmă, dar o parte se găsesc plasaţi la faţa internă a membranei citoplasmatice. O mare parte sunt legaţi în formaţiuni poliribosomale, la nivelul cărora se realizează sinteza polipeptidelor, ceea ce implică traducerea informaţiei genetice adusă de ARNm şi translaţia acesteia în structura polipeptidei, respectiv în ordinea de succesiune a acizilor aminaţi.

Granulaţiile şi corpusculii metacromaticiÎn anumite condiţii de mediu, în citoplasma unor bacterii se pot depozita

cantităţi apreciabile de substanţe de rezervă (glucide, lipide, metafosfaţi), sub formă de polimeri insolubili în mediul hidric endocelular, cu aspect granular sau corpuscular. Polimerizarea se realizează prin legături fosfoergice în care se înmagazinează cantităţi mari de energie. Ca urmare, asemenea polimeri servesc nu numai ca surse de C, P şi alte elemente, ci şi ca surse de energie, fiecare etapă a depolimerizării eliberând cantităţi apreciabile de energie calorică. Depozitarea ca polimeri insolubili are o mare semnificaţie biologică, deoarece permite acumularea de cantităţi mari de substanţe de rezervă, fără riscul de a perturba echilibrul fizico-chimic endocelular (ionic şi osmotic). Pe de altă parte, procesele de polimerizare-depolimerizare constituie mecanisme importante de asigurare şi autoreglare a balanţei energetice celulare.

-Granulele glucidice. În citoplasma unor bacterii, în mod deosebit la bacteriile coliforme, glucoza poate fi polimerizată şi depozitată sub formă de granule de amidon sau de glicogen. Acestea apar, de regulă, sub forma unor granulaţii fine, uneori vizibile numai prin microscopie electronică. Identificarea lor se poate face biochimic, prin colorare cu iod, granulele de glicogen colorându-se spre brun, cele de amidon în albastru, iar citoplasma bacteriană în galben.

-Granulele lipidice.Sunt frecvente la unele bacterii din genul Bacillus (B. megaterium). Ele rezultă din polimerizarea acidului betahidroxibutiric. Au de regulă dimensiuni mai mari, fiind vizibile la microscopul optic, mai ales la microscopul cu contrast de fază. Pot fi evidenţiate prin colorarea selectivă cu negru de Sudan.

-Granulele de metafosfaţi sau de volutină. Sunt formate prin polimerizarea metafosfatului, care împreună cu ARN dau complexe macromoleculare insolubile. Apar de regulă sub forma unor corpusculi sau granule de dimensiuni mari, până la 0,6 m, vizibile la microscopul optic. Au afinităţi pentru coloranţii bazici albaştri (albastru de toluidină, albastru de metilen) manifestând proprietăţi de metacromazie (corpusculii se colorează în roşu, iar soma bacteriană în albastru). Asemenea granule au primit şi denumirea de volutină, după specia bacteriană (Spirillum volutans) la care au fost identificate. Granulaţii metacromatice similare au fost descrise şi la bacilul difteric de către Babeş (corpusculii metacromatici Babeş-Ernst).

În citoplasma unor bacterii se pot forma şi alte granulaţii, cum ar fi granulaţiile de sulf (la sulfobacterii), granulaţiile de carbonat de calciu, granulaţiile de pigmenţi (la bacterii pigmentogene) etc.

20

VacuoleleÎn citoplasma bacteriilor se pot forma vacuole de apă. Acestea sunt izolate de

materia citoplasmatică printr-o semimembrană numită tonoplast (formată prin condensarea de proteine şi lipide). Dimensiunile lor variază între 0,3-0,6 m. Depozitarea de apă în vacuole izolate de materia citoplasmatică are raţiuni biologice. Celulele în plină activitate metabolică au nevoie de rezerve endocelulare de apă, prin care să-şi poată autoregla prompt echilibrul ionic şi osmotic. Apa din vacuole poate servi apoi la solvarea şi acumularea în vacuolă a unor metaboliţi sau substanţe toxice.

Nucleul şi structurile extraparietale

Cuvinte cheie: formaţiuni nucleare, electronooptice, înveliş mucos.

La bacterii, formaţiunile nucleare nu pot fi puse în evidenţă prin metodele uzuale de examinare şi colorare, deoarece sunt mascate de materia citoplasmatică deosebit de densă şi foarte avidă pentru coloranţii bazici. De aceea, timp îndelungat, existenţa şi organizarea aparatului nuclear au fost supuse controverselor. Incertitudinile au fost înlăturate parţial odată cu punerea în evidenţă în celula bacteriană a materiei cromatice nucleare (1937). Ulterior, prin mijloace moderne de investigaţie - citochimice, enzimologice, electronooptice - şi în ultima perioadă prin cele de citogenetică, s-a reuşit treptat să se clarifice aspectele esenţiale referitoare la forma şi organizarea aparatului nuclear la bacterii.

În comparaţie cu nucleul celulelor eucariote, nucleul bacterian este mai puţin individualizat şi evoluat, fiind lipsit de membrană nucleară şi de o structură internă propriu-zisă. De altfel, mulţi preferă definirea sa prin termenii de nucleoid, nucleozom, genom, cromozom etc. O asemenea organizare a aparatului nuclear defineşte bacteriile ca vieţuitoare procariote. Sub aspect morfologic, nucleul bacterian se prezintă ca o masă compactă de materie cromatică, fără o formă bine determinată. De regulă, la coci masa nucleară are o formă ovalară, iar la bacili o formă alungită. La celulele bacteriene care se găsesc în faza de multiplicare activă formaţiunile nucleare sunt mai polimorfe, de regulă multilobate, fiind constituite din două sau chiar patru formaţiuni. Acest aspect este consecinţa faptului că multiplicarea nucleului precede diviziunea propriu-zisă a celulei. Ca urmare, în mod tranzitoriu, în aceeaşi celulă se pot găsi două sau chiar mai multe formaţiuni nucleare. Aparent, formaţiunea nucleară pluteşte liberă în citoplasmă. În realitate, ea se găseşte ancorată la un mezozom din zona ecuatorială a celulei, iar prin intermediul acestuia la membrana citoplasmatică. În procesul de diviziune celulară participă succesiv şi coordonat toate aceste formaţiuni, începând cu aparatul nuclear. În imaginile electrono-optice, formaţiuni nucleare apar constituite dintr-o îngrămădire informă de fibre. Prin derularea şi electronografierea acestora s-a precizat că nucleul bacterian este format de fapt dintr-un singur filament foarte lung de ADN dublu helicoidal, care formează o macromoleculă gigantă. Capetele filamentului sunt legate unul de altul, dând astfel macromoleculei de ADN o configuraţie circulară, aceasta reprezentând şi cromozomul unic, circular, al celulei bacteriene. Ca urmare, având un singur cromozom, bacteriile sunt definite ca vieţuitoare cu o organizare genetică haploidă În structura filamentului de ADN cromozomal se găseşte materializată o cantitate foarte mare de informaţie genetică. Prin plieri, răsuciri şi super-răsuciri,

21

macromolecula de ADN este foarte mult condensată şi adusă la o masă compactă de dimensiuni relativ mici, care ocupă doar 5-16% din volumul celulei. Cantitativ, raportul dintre materia nucleară şi citoplasmă variază între 1 la 2 şi 1 la 10, în funcţie de specie şi de starea fiziologică a celulei.

Multiplicarea nucleului se face pe cale amitotică, prin replicarea (duplicarea) ADN-ului. Procesul are caracter de multiplicare semiconservativă şi constă în scindarea macromoleculei de ADN în cele două catene, fiecare catenă servind apoi ca matriţă la sinteza complementară a catenei congenere. În final rezultă două macromolecule identice de ADN, în care se conservă nealterată întreaga informaţie genetică deţinută în cromozom de celula mamă.

Structurile extraparietale

- Glicocalixul- reprezintă acele structuri de origine bacteriană ce conţin polizaharide şi sunt situate la exteriorul membranei externe a bacteriilor Gram negative, sau la exteriorul peptidoglicanului (= structură de bază a peretelui celular, prezentă în cantităţi diferite la majoritatea bacteriilor cu perete celular) bacteriilor Gram pozitive. Există două tipuri de glicocalix , şi anume glicocalixul regulat de suprafaţă şi glicocalixul capsular.

- Capsula – reprezintă un înveliş celular secretat la unele bacterii de membrana citoplasmatică, cu scopul de a apăra bacteriile de anumiţi factori nefavorabili din mediul lor de viaţă. Capsula protejează bacteriile, în organism, de acţiunea enzimelor şi a anticorpilor (maschează antigenii din peretele celular împiedecând formarea complexului antigen-anticorp). La bacteriile saprofite împiedică probabil înglobarea acestora de către protozoare şi face imposibilă fixarea fagilor (virusuri parazite pentru bacterii), deci oferă imunitate antifagică.

- Învelişul mucos – multe bacterii sintetizează substanţe insolubile sau puţin solubile în mediile hidrice, care se depun la suprafaţa peretelui celular sub forma unei mase neorganizate de materie mucoasă. Se formează astfel un înveliş mucos care este, la cele mai multe specii, subţire, fin discret şi dificil de evidenţiat. Din contră, la unele specii bacteriene aceste substanţe mucoase sunt secretate în cantităţi excesive, formând în jurul celulei un înveliş mucos amorf şi gros. O parte a substanţelor mucoase difuzează în mediu, dând culturilor bacteriene aspecte caracteristice.

Organite celulare: cilii şi pilii

Cuvinte cheie: apendice filamentoase, organite neesenţiale, deplasări taxice.

Cilii sau flagelii reprezintă apendice filamentoase unice sau multiple aflate la suprafaţa bacteriilor şi reprezentând organitele de locomoţie caracteristice organismelor procariote. La celulele eucariote există structuri cu funcţii similare, dar cu o structură mult mai complexă, denumite cili sau flageli de tip eucariot.

Posibilitatea de deplasare independentă nu este o caracteristică generală la bacterii, întâlnindu-se numai la anumite specii. Ea s-a dezvoltat, se pare, odată cu alungirea celulei, fiind întâlnită la bacili, vibrioni, spirili şi doar excepţional la bacteriile sferice.

22

Originea cililor se găseşte într-o formaţiune denumită corpuscul bazal (blefaroblast, disc) aflat la faţa internă a membranei citoplasmatice. Existenţa cililor, numărul şi poziţia lor pe suprafaţa bacteriei sunt caracteristici determinate genetic, cu o mare importanţă în taxonomie sau în diagnostic. Cilii sau flagelii se pot pune în evidenţă prin metode speciale de colorare, însă de obicei se recurge doar la evidenţierea lor în mod indirect, prin examenul mobilităţii bacteriilor.

În raport cu numărul şi poziţia cililor bacteriile se clasifică în

-atricha (gr. tricha=păr) sunt bacteriile lipsite de cili, imobile

-monotricha sunt bacteriile cu un singur cil sau flagel situat la unul din polii celulei

-amphitricha sunt bacteriile care posedă doi cili , situaţi câte unul la polii celulei

-lophotricha sunt bacteriile cu mai mulţi cili (5-30) situaţi sub forma unui smoc la un pol al celulei

-peritricha sunt bacteriile cu un număr mare de cili (30-100) situaţi în jurul celulei, pe toată suprafaţa sa (Proteus vulgaris are chiar câteva sute).

Cilii sunt organite neesenţiale pentru bacterie, fiind foarte fragili se pot rupe, fără să afecteze viaţa celulei. Cilii sunt supuşi proceselor de varibilitate fenotipică şi genotipică. La unele specii s-au obţinut chiar variante aciliate, stabile genetic. La alte specii, sinteza cililor a fost influenţată temporar de factori de mediu,ca temperatura, diferite substanţe adăugate mediilor de cultură. Spre exemplu, Yersinia pseudotuberculosis şi Listeria monocitogenes sunt bacterii ciliate şi mobile doar la cultivare la 20-25C, în vreme ce la 37C, în culturile incubate, acestea sunt imobile. Cilii se pierd dacă bacteriile sunt cultivate pe medii la care s-au adăugat substanţe în concentraţii moderate ca fenol, acid boric, sulfatiazol etc. Cilii cresc rapid, cu o viteză de 0,15 m/minut. Cilii sunt mai lungi la celulele bacteriene îmbătrânite şi la celulele care trăiesc în medii lichide.

Din punct de vedere al structurii morfo-chimice, cilii sunt structuri filamentoase, subţiri, flexibile şi fragile, de formă helicală, cu spire neuniforme. Grosimea şi lungimea lor variază cu specia, condiţiile de mediu şi starea fiziologică. Grosimea cililor este neuniformă pe lungimea lor, diametrul variază între 10 şi 30 nm. De exemplu, Salmonella typhimurium are cili cu grosimea de aproximativ 10 nm, iar Vibrio metchnicovii, de aproximativ 30 nm. Lungimea cililor este de 25-30 m, însă unii spirili saprofiţi ajung şi la 72 m. Filamentul ciliar este format din molecule proteice predominante, sferoidale, numite flagelină. Acestea au un diametru de 4,6 nm şi o masă moleculară de 40 000 daltoni, fiind alcătuite din 11 tipuri de polipeptide. Flagelina este antigenică, ea reprezintă antigenii H ai bacteriilor mobile.

Din punct de vedere al infrastructurii, cilii au în alcătuirea lor trei componente

a) Corpuscul bazal.b) Cârligul sau articulaţia.c) Filamentul ciliar helicoidal.

a) Corpusculul bazal reprezintă formaţiunea în care cilii îşi au originea. Are rol de piesă rotor care imprimă cililor mişcări rotatorii, în ambele sensuri. Prezintă 4 discuri la bacteriile Gram negative şi doar două la cele Gram pozitive. Prin intermediul lor corpusculul bazal se găseşte ancorat în membrana citoplasmatică şi în stratul profund al peretelui bacterian (stratul R sau rigid). Discurile sunt prinse între

23

ele printr-o piesă intermediară cu rol de ax de transmisie a mişcărilor de rotaţie. Acestea sunt notate cu iniţialele M, S, P, L, funcţie de rolul pe care-l au sau stratul parietal în care se găsesc, astfel

-discul M (de membrană) situat în stratul dublu lipidic al membranei citoplasmatice, având rol de rotor

-discul S sau stator, situat supramembranar, la faţa externă a membranei citoplasmatice

-discul P inclavat în peretele bacterian, în stratul mureinic rigid R

-discul L situat în profunzimea membranei externe , lipopolizaharidice a peretelui celular.

b) Cârligul sau articulaţia flexibilă, intercalată între corpusculul bazal şi filamentul ciliar.

c) Filamentul ciliar helicoidal este cilul propriu-zis. Conţine molecule sferoidale de flagelină aşezate helicoidal. Prin rotirea filamentului se imprimă celulei mişcări variate, orientate într-un anumit sens sau mişcări de rostogolire. Când discul M se roteşte în sensul acelor de ceasornic se imprimă mişcări de rostogolire, când se roteşte invers imprimă celulei deplasare în linie dreaptă. Pot avea loc 40-50 rotiri/minut, imprimând bacteriilor mişcări rapide, cu viteze de 20-80 m/secundă, de 40 de ori lungimea celulei (ghepardul, considerat cel mai rapid alergător parcurge în o secundă doar aproximativ de 3 ori lungimea sa corporală). Mişcarea de rotire este imprimată de încărcătura electrică de sens contrar care determină o translocaţie a ionilor de pe discul “M” pe discul “S”. Baza biochimică a energiei necesare deplasării nu este pe deplin cunoscută, se pare că este generată în cadrul unui sistem, cu participarea ATP-ului (similar fenomenelor care au loc în fibra musculară).

Mobilitatea bacteriilor datorată cililor are o importanţă deosebită, permiţând bacteriilor să realizeze în medii hidrice deplasări taxice, spre zonele care le oferă condiţii optime de viaţă. Mişcările de rotaţie şi cele ondulatorii sunt realizate sincronizat, de către toţi cilii în acelaşi sens, deplasând celula în spaţiu spre o anumită direcţie. Alte specii pot sincroniza mişcările la toţi germenii unei colonii spre medii semilichide. Într-un mediu cu concentraţii diferite de oxigen, bacteriile aerobe se deplasează spre zonele cu oxigen în concentraţii maxime, fenomen cunoscut sub denumirea de aerotaxie. Spre exemplu, germenii depuşi într-o picătură, între lamă şi lamelă, se vor orienta în funcţie de cerinţele pentru oxigen astfel : bacteriile aerobe spre marginile lamelei, unde concentraţia în oxigen este maximă, bacteriile anaerobe spre zona centrală a picăturii, cu concentraţii minime de oxigen. Deplasările taxice pot fi influenţate şi de alţi factori. Spre exemplu, bacteriile care posedă pigmenţi fotosintetizanţi se deplasează în medii hidrice spre zonele luminoase, fenomen cunoscut sub denumirea de fototaxie. Un chemotactism pozitiv exercită substanţele utile în metabolism, cum sunt glucidele, acizii aminaţi, ionii de calciu, magneziu, în timp ce substanţele nocive ca acizii graşi, alcoolii, sărurile metalelor grele, au un efect chemotactic negativ.

Pilii (fimbriile)

Sunt organite filamentoase cilindrice foarte subţiri, scurte şi drepte, aparent rigide, răspândite pe toată suprafaţa celulei bacteriene (ca o perie). Se observă numai prin microscopie electronică, la unele bacterii Gram negative.

24

Se diferenţiază 6 tipuri de pili: I, II, III, IV, V şi F(pilii de sex). Azi se tinde să se utilizeze termenul de fimbrii pentru tipurile I-V (fimbrii=franjuri) şi a termenului de pili, pentru definirea tipului F (pili=păr). Numărul pililor diferă cu specia şi cu tipul acestora : există între 1 şi 1000 în cazul tipurilor I-V şi între 1 şi 10, în cazul tipului F.

Din punct de vedere morfochimic, pilii I-V sunt organite tubulare subţiri, cu diametrul de 3-14 nm şi lungime de 1-20 m, alcătuiţi din molecule de “fimbrilină” (o proteină cu masa moleculară de 16 600 daltoni), dispuse pe un singur rând, aranjate helicoidal. Pilii sexuali F sunt organite tubulare mai groase, cu diametrul de 6-15 nm şi lungimea de 20 m. Sunt alcătuiţi din molecule de pilină, o fosfoglicoproteină cu masa moleculară de 11 800 daltoni. Subunităţile ei sunt dispuse pe un rând, helicoidal, delimitând un canal axial cu diametru de 25 A prin care trec molecule de ADN dublu catenar. Capătul acestor pili este sub forma unui buton, alcătuit dintr-un disc cu diametru de 5-20nm şi o formaţiune de 40-80 nm cu aspect de cupă sau caliciu.

Rolul biologic al pililor nu se cunoaşte în totalitate. Pilii de tip I-IV ajută la fixarea bacteriilor pe anumite suporturi celulare sau de altă natură, pe care le pot coloniza. Conferă unor enterobacterii patogene capacitatea de a se fixa şi coloniza la suprafaţa mucoasei intestinale. Pilii conferă acestor serotipuri de enterobacterii un plus de agresivitate, acţionând ca un factor veritabil de patogenitate. Pilii F îndeplinesc rolul de organite de copulare, care realizează în timpul proceselor de conjugare cuplarea bacteriilor F(+) cu cele F(-) (bacteriile F pozitive sunt donatoare de material genetic fiind considerate mascule, iar cele F negative sunt acceptoare de material genetic, considerate femele). Pilii au rol de “zonă receptoare” pentru unii bacteriofagi lipsiţi de apendice caudal (fagii “m” şi “R17”), genomul lor fiind introdus în celulă tot prin canalul papilar.

Sporul bacterian

Cuvinte cheie: sporogeneză, perete sporal, procese de germinare.

Reprezintă o formaţiune morfo-biologică dotată cu rezistenţă crescută la agenţii fizico-chimici (uscăciune, căldură, frig, radiaţii, antiseptice şi dezinfectante), prin care bacteria îşi poate conserva viabilitatea timp îndelungat, în stare latentă, în condiţii în care forma vegetativă nu ar putea supravieţui. Proprietatea de a sporula o au un număr restrâns de specii bacteriene, toate încadrate în familia Bacillaceae. Speciile aerobe sporulează facultativ şi formează genul Bacillus (B. anthracis, B. subtilis, B. cereus, B. megaterium etc), iar speciile anaerobe sporulează constant şi formează genul Clostridium (Cl. botulinum, Cl. tetani, Cl. septicum, Cl. chauvoei, Cl. welchii etc). În mod excepţional proprietatea de a sporula o pot avea şi unii coci (Sporosarcina ureae).

Sporogeneza

Sporul se formează în celula bacteriană prin procese complexe de reorganizare morfo-chimică. Se deosebeşte fundamental de forma vegetativă din care provine. De regulă, dintr-o celulă bacteriană rezultă un singur spor, iar din acesta, prin germinare, ia naştere o singură formă vegetativă. Ca urmare, sporogeneza nu constituie pentru bacterii o modalitate şi un mijloc de multiplicare. Prin natura sa este un fenomen unic pe plan biologic, în cursul căruia forma

25

vegetativă se transformă într-o “unitate biologică”, capabilă să conserve viaţa bacteriei în stare latentă timp îndelungat (luni sau ani). Mult timp s-a considerat că sporularea este indusă de condiţii nefavorabile de viaţă, care impun transformarea bacteriei într-o formă de rezistenţă. Opinia este însă infirmată de numeroase date, în special de constatarea că sporularea se manifestă cu intensitate maximă mai ales când germenii se găsesc în condiţii optime de mediu şi viaţă. De aceea, în accepţiunea actuală, sporogeneza este considerată ca un fenomen normal în evoluţia celulei bacteriene, procesul fiind controlat şi dirijat morfogenetic de cca 50 de gene. Proprietatea de a sporula este supusă unor procese multiple de variabilitate fenotipică, sporogeneza fiind stimulată sau inhibată de numeroşi factori exogeni. De exemplu, oxigenul molecular este un factor indispensabil sporulării bacteriilor aerobe ; pentru bacteriile anaerobe este însă nociv, sporulare lor putând fi inhibată complet de prezenţa acestuia în mediu. Bacilul antraxului nu sporulează în organismul animal, dar sporulează intens în materialele patologice (sânge, secreţii, piei) când acestea vin în contact cu aerul. În culturile dezvoltate pe suprafaţa mediilor solide, cât şi în cele dezvoltate în mediile puternic aerate, aceeaşi bacili sporulează mult mai rapid şi mai intens. Temperatura influenţează, de asemenea sporularea. De exemplu, Bacillus anthracis sporulează la temperaturi cuprinse între 16C - 42C; în afara acestor limite sporularea încetează, deşi multiplicarea germenilor mai poate cotinua.

Sporogeneza este influenţată şi de alţi factori de mediu, cum ar fi : pH-ul, diferite substanţe chimice etc. Este stimulată de fosfaţi, săruri de amoniu, acid ascorbic, cazeină etc., dar este inhibată total sau parţial de ionii de calciu, de glicerină etc. Morfogeneza sporului a fost amplu studiată prin microscopia electronică. În faza premergătoare sporulării se produce replicarea şi reorganizarea aparatului nuclear, o formaţiune nucleară fiind antrenată, prin mezozomul de care se leagă, spre zona de formare a sporului. În jurul acesteia, materia citoplasmatică se restructurează şi se densifică, devenind tot mai refringentă (mai opacă la lumină şi electroni) formând astfel sporoplasma. Componentele sporale sunt apoi separate de conţinutul endocelular printr-o membrană sporală proprie (derivată iniţial din membrana citoplasmatică). În fazele ulterioare se formează un perete pluristratificat, compact, gros şi foarte rezistent. Odată cu morfogeneza acestuia se produce şi o organizare a constituenţilor sporali, atingându-se astfel stadiul de maturare a sporului. În final rezultă un spor bine individualizat din punct de vedere morfochimic. De regulă, după sporulare, peretele bacterian este dezintegrat, la unele specii rapid, la altele mai lent, prin enzimele autolitice conţinute de celulă, sporul fiind astfel eliberat în mediul ambiant. Uneori, în jurul sporului se pot păstra resturi din peretele bacterian care formează un înveliş exterior denumit exosporium.

Morfo-chimic, sporii au o formă sferoidală, uşor ovalară, avînd dimensiuni care variază cu specia bacteriană, fiind cuprinse între 0,5-2m. Se pot forma în celula bacteriană în zona centrală, subterminală (spre un capăt) şi terminală (la capătul formei vegetative). Dimensiunile şi poziţia sporilor, raportate la forma vegetativă, deşi variabile sunt deosebit de caracteristice la unele specii bacteriene şi au o valoare taxonomică, fiind de mare utilitate în lucrările curente de identificare a genului şi a speciilor.

Infrastructura este asemănătoare la toţi sporii. Protoplastul sporal (celula sporală propriu-zisă) conţine materia nucleară (sau nucleoplasma) formată din ADN cromozomal şi o cantitate relativ redusă de sporoplasmă cu aspect granular, mult mai densă şi electrono-opacă decât citoplasma. Granulele au dimensiuni de circa 10 nm şi reprezintă probabil ribosomii. Acest conţinut sporal este delimitat de o

26

membrană sporală, care reprezintă în acelaşi timp şi stratul intern al peretelui sporal pluristratificat. Peretele sporal este de natură preponderent proteică. Are o infrastructură lamelară complexă, fiind alcătuit din trei straturi principale:

-stratul intern, denumit şi intimă, care reprezintă membrana sporală propriu-zisă (similară membranei citoplasmatice);

-stratul median, respectiv cortexul, gros şi mai puţin dens, cu opacitate electrono-optică mai redusă, conţine mureină modificată;

-stratul extern sau exina, frecvent pluristratificat (format din mai multe “tunici sporale”). Sporii unor bacterii mai pot prezenta un înveliş exterior suplimentar numit exosporium.

Ansamblul acestor caracteristici structurale fac ca sporii să aibă afinităţi tinctoriale diferite de cele ale formelor vegetative. Ei pot fi coloraţi numai prin metode energice, care forţează pătrunderea coloranţilor prin peretele şi în conţinutul sporal.

Sporii se deosebesc fundamental de formele vegetative prin numeroase alte caracteristici fizico-chimice. Conţin foarte puţină apă liberă, puţine enzime şi o cantitate mult mai mică de ribonucleoproteine. Au un conţinut mai redus de săruri de K şi P, dar mult mai ridicat de ioni de Ca, Mg , Mn şi de 4-5 ori mai multă cisteină. De asemenea , conţin o cantitate apreciabilă de acid dipicolinic (existent numai în spor, în cantitate de circa 10% din greutatea uscată.

Sporii nu desfăşoară activitate metabolică şi nu au schimburi de substanţe cu mediul. Enzimele pe care le conţin în cantitate redusă sunt sub o formă inactivă. În schimb, conţin enzime catalitice faţă de alanină în cantitate de 2-10 ori mai mari decât formele vegetative, acestea având un rol important în procesele de germinare.

Rezistenţa şi determinismul genetic al sporilor

Cuvinte cheie: germinare, bacterii sporogene, caracter hidric.

Sporii au rezistenţă mare la numeroşi agenţi fizico-chimici. Se remarcă în special rezistenţa termică mare, sporii fiind distruşi la o căldură uscată de 160-180C după 30-60 minute, iar la o căldură umedă de 120C după 20-30 minute. Sporii unor specii bacteriene pot rezista la fierbere până la 1-2 ore, în timp ce formele vegetative sunt distruse în 10 minute la 70-80C. Rezistenţa sporilor este deosebit de mare la uscăciune şi la radiaţii. Îşi pot menţine viabilitatea în pământ şi în diverse materiale patologice, timp foarte îndelungat. De exemplu, sporii de Bacillus anthracis îşi pot menţine viabilitatea în pământ timp de peste 70 de ani ; sporii unor bacterii saprofite au supravieţuit în conserve alimentare timp de peste 114 ani. La fel, sporii de Clostridium tetani s-a observat că au supravieţuit într-un cordon ombilical de copil timp de peste 60 de ani. În comparaţie cu formele vegetative, sporii sunt mult mai rezistenţi la substanţele antiseptice şi dezinfectante. Spre exemplu, sporii bacililor cărbunoşi se menţin viabili câţiva ani în soluţie cu adaos de 40-50% glicerină, în timp ce formele vegetative sunt distruse în câteva ore. Sporii unor bacterii rămân vii până la o săptămână în soluţie de fenol 5% şi mai multe săptămâni în alcool.

Aceste aspecte subliniază rolul lor biologic, care constă în conservarea îndelungată a viabilităţii germenilor sub o formă latentă, în condiţii de mediu şi de

27

viaţă în care formele vegetative nu pot rezista, asigurând astfel supravieţuirea germenilor în natură.

Germinarea sporilorTransformarea sporilor în forme vegetative este un proces complex, care se

desfăşoară în strânsă corelaţie cu factorii de mediu. Se desfăşoară în trei etape succesive: activarea, germinarea şi creşterea formei vegetative noi. Activarea şi germinarea sunt stimulate de caracterul hidric al mediului şi de prezenţa unor componente chimice uşor metabolizabile. În prima fază se produce o absorbţie intensă de apă, însoţită de creşterea în volum a sporului uneori de 100% şi de pierderea refringenţei. Concomitent se produc modificări structurale şi biochimice, în cursul cărora se produce activarea şi îmbogăţirea echipamentului enzimatic cu rol energetic şi plastic. Celula nou formată desfăşoară o activitate metabolică deosebit de intensă, creşte şi se divide într-un ritm rapid, vădind parcă un proces de întinerire. Viteza de germinare diferă în limite largi, în funcţie de specie şi de vechimea sporilor. Sporii de B. anthracis recent formaţi, ajunşi în condiţii favorabile, germinează de regulă în 60-90 secunde, în timp ce germinarea sporilor vechi începe abia după 1-2 ore sau chiar mai mult.

Determinismul genetic

Sporogeneza şi germinarea sporilor sunt procese controlate şi dirijate genetic de aproximativ 50 de gene, situate în cromozom în “locus”-suri diferite. Acestea se menţin în forma vegetativă în stare represată, până când sub acţiunea unor inductori endogeni şi exogeni (de mediu) sinteza represorului încetează. Aşa cum s-a mai amintit, factorii de mediu exercită un rol activant sau inhibant asupra sporogenezei, dar şi asupra germinării sporilor, procesul de germinare fiind influenţat pozitiv de o temperatură apropiată de cea optimă multiplicării, de umiditate, de diferite substanţe prezente în mediu (glucoză, acizi aminaţi ca L-alanina, ioni de Na, K şi Ca etc).

Din punct de vedere al implicaţiilor ecologice, bacteriile sporogene sunt caracterizate prin posibilitatea de a duce o viaţă saprofită. Speciile patogene pentru animale şi om se pot conserva timp nelimitat în mediul ambiant, iar unele chiar pot trăi şi se pot multiplica în sol. Sporii acestora ajunşi în organism pe căi accidentale convenabile, pot determina însă infecţii grave. Datorită acestei caracteristici biologice şi ecologice, bolile provocate de bacteriile sporogene sunt practic neeradicabile, dar incidenţa lor poate fi redusă considerabil (antrax, teteanos etc.) prin măsurile imunoprofilactice aplicate în masă consecvent.

Fiziologie bacteriană

Cuvinte cheie: factori genetici, macromolecule, structură monocatenară.

Compoziţia chimică a bacteriilor

28

-Apa– este componentul predominant din punct de vedere cantitativ, reprezentând aproximativ 75-85% din greutatea umedă a celulei bacteriene. O parte se găseşte sub formă de apă de constituţie, încorporată în structura diverselor componente chimice celulare. Cea mai mare parte se găseşte însă ca apă liberă, conferind mediului endocelular un pronunţat caracter hidric. În apa liberă se găsesc solvate cantităţi apreciabile de săruri minerale. De caracterul hidric endocelular depinde desfăşurarea în bune condiţii a întregului metabolism. Apa liberă participă ca substrat în majoritatea reacţiilor biochimice. Diminuarea conţinutului în apă determină o încetinire a ritmului de desfăşurare a proceselor metabolice. Apa intervine în reglarea echilibrului osmotic endocelular, a pH-ului şi a potenţialului oxidoreducător. Conţinutul în apă liberă influenţează rezistenţa celulei la unii factori chimici şi fizici, diminuarea ei crescând rezistenţa bacteriei la uscăciune, temperatură şi la unele substanţe chimice.

-Sărurile minerale- reprezintă între 2-30% din greutatea uscată a celulei bacteriene. Cantitatea lor variază cu specia, cu starea fiziologică a celulei, cu compoziţia chimică a mediului etc. De obicei celulele bacteriene tinere conţin săruri minerale în cantităţi de 6-7 ori mai mari decât celulele bătrâne. Dintre componentele minerale cel mai bine reprezentate cantitativ sunt: P, K, Na, Mg, Ca, S, Cl. În cantităţi mai mici se găsesc Zn, Fe, Cu, Mn etc. Predomină compuşii de P, care reprezintă în medie 45% din totalul componentelor minerale (la M. tuberculosis pot ajunge până la 74%). Unii compuşi minerali intră în structura componentelor macromoleculare cu rol plastic; alţii intră în structura enzimelor şi coenzimelor sau îndeplinesc rol de activatori în diverse procese metabolice (Ca, Na, Zn). Constituenţii minerali intervin apoi în numeroase procese: asigură reglarea presiunii osmotice endocelulare şi menţinerea echilibrului de membrană, influenţând permeabilitatea acesteia; contribuie la reglarea pH-ului şi a potenţialului oxido-reducător etc.

Compuşii de P au rol esenţial în metabolismul energetic al celulei bacteriene. În legăturile fosforice macroergice ale acestora se pot stoca cantităţi mari de energie, pe care celula o poate elibera în raport cu cerinţele sale. Bacteriile sunt vieţuitoare cu necesităţi minerale mari şi multiple. Cunoaşterea acestora are o importanţă deosebită în practica cultivării germenilor pe medii artificiale, iar în multe cazuri chiar la izolarea şi identificarea unor specii.

-Glucidele- reprezintă 4-25% din greutatea uscată a celulei. Conţinutul lor variază cu specia şi cu starea fiziologică a bacteriilor. Ozidele se găsesc libere, în curs de metabolizare, sau legate de componente de altă natură. Cele mai cunoscute ozide sunt: glucoza (sau derivaţi ca glucozamina, acidul glucuronic), galactoza, manoza, arabinoza etc. Dintre pentoze, în categoria ozidelor intră riboza şi dezoxiriboza, care se găsesc în structura acizilor nucleici.

Poliozidele se găsesc sub formă de polimeri simpli sau complecşi, fiind definite generic “polizaharide bacteriene”. Dintre polimerii simpli, în citoplasmă pot fi întâlniţi amidonul sau glicogenul, care servesc ca materii de rezervă. În celula bacteriană pot fi întâlniţi frecvent polimeri complecşi formaţi din ozide conjugate cu acizi uronici: cidul hialuronic din structura capsulei la streptococi, polizaharidele capsulare la pneumococi etc. Unele glucide se leagă cu anumite polipeptide formând polimeri complecşi cu rol structural, cum este, de exemplu, mureina din structura peretelui bacterian. Alte glucide formează cu diverse lipide complexele lipopolizaharidice (lps) prezente în peretele celular la bacteriile Gram negative, constituind antigenii “O” şi endotoxinele acestora. Multe polizaharide extrase din celula bacteriană au caracter de antigeni incompleţi sau haptene (pot intra în reacţie cu anticorpii, dar nu pot induce sinteza lor).

29

-Lipidele- diferă cantitativ în limite largi de la o specie la alta. Reprezintă 2-40% din greutatea uscată a celulei bacteriene. Bacteriile cele mai sărace în lipide sunt stafilococii (2,8%), iar cele mai bogate în lipide sunt bacteriile din genul Mycobacterium. Conţinutul în lipide variază la aceeaşi specie în funcţie de vârsta celulelor şi de compoziţia chimică a mediului. La unele specii bacteriene lipidele se pot acumula în celulă şi ca materie de rezervă, mai ales când germenii sunt cultivaţi în condiţii restrictive (pe medii bogate în C şi în surse energetice, dar sărace în N) sau pe medii cu o anumită compoziţie chimică. Lipidele bacteriene sunt în general foarte variate, o parte se găsesc sub formă de compuşi esterificaţi cu alcooli. Multe lipide reprezintă pentru celula bacteriană o importantă sursă de C şi energie. Unele îndeplinesc rol structural, cum sunt cele din peretele bacteriilor Gram negative şi din peretele bacteriilor acido-rezistente. Fosfolipidele intră în structura membranei citoplasmatice.

În general, lipidele bacteriene pot fi grupate în trei categorii:

a) lipide neutre, unele acumulându-se în celulă ca materie de rezervă, sub formă de polimeri ai acidului betahidroxibutiric;b) ceride, formate prin esterificarea acizilor graşi (cu greutate moleculară mare) cu alcool. Sunt prezente mai ales la bacteriile acido-rezistente, în proporţie de 5-10% din greutatea lor uscată. Lipsesc sau se găsesc în cantităţi reduse la bacteriile neacido-rezistente;

c) fosfolipidele, bine reprezentate cantitativ la toate bacteriile (conţin acizi graşi, alcooli, baze azotate şi acid fosforic). De exemplu, la enterobacterii fosfolipidele reprezintă până la 50% din totalul lipidelor. Lipidele din complexele lipopolizaharidice sunt fosfolipide în proporţie de 80-95%.

-Proteinele. Bacteriile sunt foarte bogate în proteine, acestea reprezentând în medie 60% din greutatea lor uscată. Se apreciază că într-o celulă există circa 106 molecule proteice, aparţinând la 2000-3000 de tipuri. Variaţiile cantitative şi calitative sunt în general restrânse, dependente mai ales de starea fiziologică a celulelor bacteriene. Majoritatea proteinelor sunt combinate sau conjugate cu componente neproteice (lipide, glucide, acizi nucleici sau componente anorganice), formând cu acestea diferite heteroproteine (nucleoproteine, metaloenzime, enzime cu grupări prostetice de tipul hemului etc.), precum şi complexe macromoleculare cu rol structural (lipoproteine, lps etc.).

Acizii nucleiciAcidul dezoxiribonucleic (ADN) Se găseşte în celula bacteriană în cantitate relativ constantă la fiecare specie,

cuprinsă între 1-5% din greutatea uscată. Cea mai mare parte formează o macromoleculă gigantă, care reprezintă nucleotidul, respectiv cromozomul unic al bacteriei (cu o greutate moleculară de 2,5x1010 ) . În citoplasmă se mai pot găsi macromolecule de ADN nesemnificative cantitativ, acestea formând plasmidele, respectiv factorii genetici extracromozomali. În structura acestui component macromolecular intră 4 tipuri de nucleotide care se deosebesc prin baza aminată purinică (adenina, guanina) sau pirimidinică (citozina, timina) pe care o conţin. Macromoleculele de ADN au proprietatea esenţială de a se automultiplica prin replicare (duplicare).

Modelul acestei autoreproduceri “semiconservative” a fost enunţat ipotetic pentru prima dată de Watson şi Crick. Ipoteza a fost confirmată iniţial prin cercetări efectuate pe Escherichia coli. În procesul de replicare intervin trei enzime:

30

-ADN-endonucleaza, cu rolul de a secţiona cele două catene;-ADN-polimeraza, cu rolul de a sintetiza catenele noi;-ADN-ligaza, cu rolul de a lega fragmentele de ADN format prin replicare.

PlasmideleSunt factori genetici extracromozomali. Cantitativ reprezintă până la 1% din

masa genomului bacterian. Se găsesc în citoplasmă ca elemente genetice autonome. Unele plasmide au însă proprietatea de a se putea integra tranzitoriu în cromozom, replicându-se şi funcţionând solidar cu acesta. Plasmidele care se pot integra în cromozom au fost denumite mult timp “epizomi”, termen la care s-a renunţat. Proprietatea de integrare este definită ca funcţie “epizomală”.

Plasmidele au fost descoperite iniţial la E. coli, în corelaţie cu fenomenul de conjugare, iar apoi la alte enterobacterii. Ulterior au fost identificate la toate bacteriile studiate, astăzi fiind cunoscute un număr foarte mare de tipuri de plasmide. Cele mai amplu studiate sunt: factorul “F”, factorul “R”, factorul “col”, factorul “ent” etc. De menţionat este faptul că anumiţi fagi temperaţi se comportă similar plasmidelor.

Acidul ribonucleic (ARN)Este un component macromolecular mult mai heterogen ca structură, mărime

şi funcţii. Din punct de vedere chimic este un polimer ribonucleotidic format din patru tipuri de nucleotide, care conţin adenină (A), guanină (G), citozină (C) sau uracil (U). Majoritatea tipurilor de ARN au o structură monocatenară şi o configuraţie spaţială lineară.

Bacteriile conţin, la fel ca toate celulele, trei tipuri de ARN implicate în mecanismele de biosinteză a proteinelor: ARNm

, ARNt şi ARNr.ARNm (sau mesager) are rolul de a transmite informaţia genetică de

biosinteză a proteinelor de la cromozom la ribosom şi de a specifica ordinea de incorporare a acizilor aminaţi în lanţul polipeptidic. Reprezintă cantitativ cca 1-2% din totalul ARN-ului celular. Sinteza de ARNm este mediată de o ARN-polimerază dependentă de ADN, succesiunea bazelor fiind specificată pe baza complementarităţii, de ordinea în care bazele aminate se succed în catena de ADN care serveşte ca “matriţă”. În acest mod se realizează, de fapt, “transcrierea” fidelă din ADN în ARNm a informaţiei genetice de biosinteză a proteinei. Procesul de formare a ARNm pe “matriţa” de ADN a putut fi vizualizat electrono-optic la E. coli. Rata de sinteză este foarte ridicată, celula îşi reînnoieşte în permanenţă macromoleculele de ARNm, în concordanţă cu cerinţele de biosinteză a proteinelor. La E. coli rata de sinteză este de 55 nucleotide/secundă, la 37C.

ARNt (sau de transport) are rolul de a lega şi transporta acizii aminaţi din citoplasmă la ribosomi. Moleculele sale sunt relativ mici, fiind formate din aproximativ 70-90 nucleotide. Catena lor formează prin pliere “bucle” şi “braţe” care dau moleculei o configuraţie spaţială caracteristică, asemănătoare cu o frunză de trifoi. Sinteza macromoleculelor de ARNt este specificată de anumite gene din ADN-ul celular. Se apreciază că E. coli are pentru sinteza diferitelor tipuri de ARN t cca 30-40 gene, unele fiind situate în tandem în grupări de 3-4 gene.

ARNr (ribosomal) leagă ribosomii în formaţiuni “poliribosomale”, constituind scheletul structural al acestor formaţiuni. Rolul pe care îl are în procesele de biosinteză a proteinelor este încă mai puţin cunoscut. Cantitativ reprezintă 80-90% din totalul ARN-ului celular.

31

Enzimele bacteriene

Cuvinte cheie: echipament enzimatic, autotrof, heterotrof, bacterii prototrofe.

Bacteriile au un echipament enzimatic deosebit de bogat şi variat, care le permite să metabolizeze o mare diversitate de componente organice şi anorganice. Deşi bacteriile sunt vieţuitoare de dimensiuni foarte mici, ele au totuşi nevoie de un echipament enzimatic foarte bogat şi variat, care să le satisfacă cerinţele impuse de diversitatea activităţilor metabolice şi vitale. Se apreciază că pentru realizarea metabolismului plastic şi energetic, fiecare bacterie are nevoie până la circa 2000 tipuri de enzime. Marea diversitate enzimatică oferă bacteriilor posibilitatea de-a se adapta în medii naturale foarte variate, asigurând circulaţia complexă a materiei prin următoarele procese:

-scindarea moleculelor mari din mediul înconjurător, în molecule mici , care să poată traversa membrana citoplasmatică;

-asigurarea energiei necesare proceselor metabolice viitoare;-sintetizarea macromoleculelor proprii fiecărei specii bacteriene, în interiorul

celulelor gazdă. De ultimul aspect depinde capacitatea de a elabora anumite componente cu funcţii enzimatice (agresine, toxine, etc), care alături de unii metaboliţi nocivi imprimă bacteriilor proprietăţi patogene. Cunoaşterea enzimelor în corelaţie cu metabolismul bacterian, permite înţelegerea unor aspecte fundamentale ale biologiei bacteriilor, din care unele se aplică în practica medicală (stabilirea diagnosticului), iar altele în industria fermentativă (alcoolică, lactică, acetică etc.), în panificaţie, în prepararea brânzeturilor, la fabricarea antibioticelor şi multe alte aspecte. Clasificarea enzimelor permite o sistematizare, pe de o parte a proceselor pe care le catabolizează, iar pe de altă parte, a raporturilor cu celula bacteriană şi viteza de acţiune a acestora. După raporturile cu celulele bacteriene se cunosc:

-exoenzimele, care sunt elaborate în interiorul celulei bacteriene şi care acţionează asupra componentelor macromoleculare din mediul exterior, scindându-le în produşi accesibili metabolismului energetic şi plastic al bacteriilor. O parte din exoenzime joacă un rol în apărarea bacteriilor faţă de anumite elemente nocive din mediu. Astfel, penicilinaza atacă penicilina şi în felul acesta unele bacterii sunt rezistente la acest antibiotic ;

-endoenzimele, care acţionează endocelular, asigurând procesele de anabolism şi catabolism, fiind strâns legate de anumite structuri celulare. Astfel, citocromoxidazele sunt legate de membrana citoplasmatică (mezozomi), nucleazele de ADN-ul celular, iar proteazele de ribosomi.

După viteza de acţiune şi prezenţa lor în celule se împart în:-enzime constitutive, prezente constant în celule, indiferent de prezenţa sau

absenţa în mediul ambiant a substanţelor asupra cărora acţionează, de aceea atunci când vin în contact cu acestea acţionează imediat;

-enzime inductibile sau adaptatative, care sunt sintetizate de către bacterii numai după ce vin în contact cu substratul metabolizabil, sintetizarea acestora fiind un proces indus de prezenţa factorului inductor (substanţe metabolizabile).

32

Elaborarea acestor enzime reprezintă o caracteristică genetică prezentă în celulă sub formă latentă. Acţiunea acestor enzime este slabă şi tardivă.

Bacteriile dispun de mecanisme de autoreglare prin care îşi pot elibera (prin prezenţa factorului inductor) sau bloca (prin acţiunea metabolitului final), temporar căile genetice de sintetizare a unor enzime. Fenomenul de elaborare-blocare a sintezei enzimatice, printr-un produs finit, poartă numele de retroinhibiţie sau “feed-back”. După reacţiile pe care le determină, enzimele se împart în:

a. Hidrolaze, care acţionează preponderent exocelular, scindând enzimatic legăturile secundare dintre C şi O sau C şi N, cu fixarea unei molecule de apă, prin adiţionarea OH pe unul din fragmentele moleculei simple rezultate, iar H pe celălalt, aşa cum invers, la sinteza unei macromolecule organice se eliberează o moleculă de apă. În raport cu substratul pe care-l descompun, se disting:

-proteaze, care încadrează gelatinaze, colagenaze, peptidaze, aminoacidaze, nucleaze etc.;

-carbohidraze, şi anume zaharaza, maltaza, hexozidaze, poliaze;-glucoproteinaze, cu hialuronidaza şi muralizina;-esteraze, care cuprinde lipaza, fosfataza, lecitinaza etc.b. Desmolaze, acţionează de obicei endocelular scindând legăturile dintre doi

atomi de carbon, cu eliberare de energie. Catalizează oxido-reducerile şi participă la procesul de respiraţie celulară, fiind reprezentate de:

-dehidrogenaze, care mijlocesc oxido-reducerile şi stau la baza fermentării glucidelor prin intermediul glucidazei;

-carboxilaza, care descompune acizii aminaţi şi cetonici, cu eliberare de CO2;-oxidaze, care lipsesc la bacteriile anaerobe (citocromul, indolfenoloxidaza)

sunt acceptori de hidrogen favorizând prin aceasta oxidările.

Nutriţia şi metabolismul bacteriilor

Nutriţia reprezintă totalitatea proceselor prin care bacteriile îşi procură substanţele energetice şi plastice necesare. Aceasta corespunde de altfel, cu noţiunea de anabolism, dar nu cu cea de metabolism care cuprinde şi pe cea de catabolism. Prezentarea separată a acestor procese nu este posibilă, deoarece în realitate acestea au unele puncte comune, din care (prin mecanismele de autoreglare ale bacteriilor) procesele pot fi orientate fie spre catabolism, fie spre anabolism. Prin aceste procese de interacţiune rezultă un echilibru dinamic, care menţine celula bacteriană ca un tot unitar, cu proprietatea de a-şi păstra identitatea, datorită descompunerii substanţelor proprii sau străine (cu eliberare de energie) în vederea asimilării (cu consum de energie) a unor substanţe proprii. Bacteriile fiind vieţuitoare cu un ritm de creştere şi multiplicare foarte intense vor avea şi un metabolism activ, cu un consum ridicat de energie pe care bacteriile şi-o procură prin intermediul reacţiilor chimice exoergice, motiv pentru care sunt denumite organisme chemotrofe. Bacteriile pot fi , din punct de vedere al nutriţiei chemolitotrofe (autotrofe) şi chemoorganotrofe (heterotrofe). Deci bacteriile se împart, după substanţele nutritive folosite în scopul asigurării surselor de carbon şi azot în autotrofe şi heterotrofe. Bacteriile autotrofe folosesc ca sursă de C şi N componente în exclusivitate anorganice, asemănându-se în acest sens cu plantele verzi. Sunt bacterii lipsite de patogenitate pentru animale şi om. Ca sursă de carbon utilizează CO, CO2 şi carbonaţi, iar sursă de N folosesc NH3, nitriţi şi nitraţi. Astfel, bacteriile din

33

genul Nitrosomas oxidează NH3 în nitriţi, iar cele din genul Nitrobacter oxidează nitriţii şi nitraţii. Aceste specii bacteriene au o contribuţie majoră la îmbogăţirea solului în compuşi azotaţi. Cu ajutorul energiei obţinute din aceste reacţii se reduce CO2 (unica sursă de C) transformându-se în formaldehidă sau acetilaldehidă, care împreună cu NH3 stau la baza sintetizării aminoacizilor. Bacteriile heterotrofe utilizează în vederea satisfacerii necesităţilor de carbon, o mulţime de compuşi organici ai acestuia, iar pentru acoperirea necesităţilor de N folosesc de asemenea o serie de compuşi organici şi chiar anorganici. Un număr restrâns de bacterii heterotrofe ca sursă de C pot folosi CO2, iar ca sursă de N, unele heterotrofe pot folosi azotul atmosferic elementar, altele utilizează NH3, nitriţii, sărurile de amoniu şi compuşii organici mai complecşi, cum ar fi aminoacizii, polipeptidele, proteinele etc. În raport cu particularităţile metabolice, între heterotrofe se individualizează grupul bacteriilor prototrofe. Acestea îşi asigură sursele de C prin metabolizarea carbohidraţilor, iar sursele de N pe seama exclusiv a unor componente anorganice, în special prin metabolizarea N molecular atmosferic. Dintre prototrofe, un rol foarte important în natură îl au bacteriile din genul Azobacter, care trăiesc libere în sol şi ape, precum şi cele din genul Rhisobium, care trăiesc în sol, în simbioză cu plantele leguminoase, fiind localizate preponderent în nodozităţile formate la nivelul rădăcinilor. Din rândul heterotrofelor mai fac parte şi bacteriile auxotrofe. Multiplicarea acestora este dependentă de prezenţa în mediu a unuia sau mai multor acizi aminaţi, pe care bacteriile respective nu-i pot sintetiza (monoauxotrofe, dependente de un anumit acid aminat; diauxotrofe, triauxotrofe, poliauxotrofe, dependente de doi, trei, respectiv mai mulţi acizi aminaţi). Spre exemplu, Salmonella typhi necesită prezenţa în mediu a triptofanului, iar Leuconostoc mesenteroides prezenţa a 17 aminoacizi în mediu.

Creşterea şi multiplicarea unor bacterii heterotrofe poate fi dependentă de prezenţa în mediu a unor componente cu rol de factori de creştere, care acţionează ca biocatalizatori: tiamina (vit. B1), riboflavina (vit. B2), piridoxina (vit. B6), biotina (vit.H), nicotinamida (vit. PP), hemina (factorul X), fosfopiridin-nucleotida (factorul V).

Peretele bacterian este o formaţiune suficient de poroasă, care permite

pătrunderea fără dificultate a substanţelor chimice cu o structură relativ simplă. Complexele macromoleculare vor trebui degradate enzimatic în prealabil, în componente moleculare constitutive. Pătrunderea substanţelor nutritive prin membrana citoplasmatică este un proces complex şi foarte selectiv. Unele substanţe solubile în lipide sau cu molecule în lanţ pot traversa membrana citoplasmatică prin mecanisme nespecifice, strecurându-se prin porii reţelei lipoproteice. Alte substanţe, care în mediu se găsesc în concentraţii mai mari decât în celulă, pot pătrunde prin procese de difuziune. Majoritatea metaboliţilor pătrund în celulă prin procese de transport selectiv. Aceasta necesită fixarea prealabilă a moleculelor respective pe anumite zone combinate ale membranei citoplasmatice. Transportul prin membrană este apoi mediat de permeaze, care asigură penetraţia substanţelor respective, chiar dacă în celulă acestea se găsesc în concentraţie mai mare decât în mediu.

Respiraţia la bacterii. Creşterea şi multiplicarea bacteriilor

Cuvinte cheie: oxidoreducere, aerob, anaerob, diviziune,

Ansamblul reacţiilor biochimice de oxido-reducere, prin care celula bacteriană îşi asigură balanţa energetică, fac parte din procesele respiratorii. Conceptul de respiraţie bacteriană devine sinonim cu cel de metabolism energetic. Toate enzimele respiratorii care intervin în activarea şi transportul de H, respectiv de electroni, de la

34

un substrat donator la unul acceptor, sunt definite generic enzime respiratorii. Acestea sunt dehidraze iar H este transportat de coenzimele lor (care servesc ca acceptori tranzitorii de H). După ordinea în care dehidrazele intervin în desfăşurarea procesului respirator şi după natura chimică a coenzimelor cu care se asociază, acestea se împart în trei grupe:

dehidraze piridinice, ale căror coenzime sunt NAD (nicotinadenin-dinucleotid) şi NADP (nicotinadenin-dinucleotidtrifosfat), gruparea activă fiind nicotinamida. Acestea sunt întâlnite la toate bacteriile;

dehidraze flavinice, care la bacteriile aerobe intervin în transportul H de la dehidrazele piridinice la citocromi. Sunt enzime flavoproteinice care au în structură o grupare prostetică bine fixată, cu rol de cofactor, reprezentată de FMN (flavin-nucleotida) sau de FAD (flavin-adenin-dinucleotida);

sistemul citocromilor, reprezentat de enzime care sunt conjugate cu grupări prostetice de tipul hemului. Acestea realizează transportul de H de la dehidraze, succesiv pe diferiţi citocromi, până la O2 care este acceptorul final de H, ultima etapă fiind mediată de citocromoxidază. Enzimele din grupul citocromilor sunt caracteristice şi bine reprezentate la bacteriile aerobe. În funcţie de natura acceptorului final de H, reacţiile de oxido-reducere se pot realiza la bacterii pe trei căi:

calea oxibiotică sau aerobă, în care acceptorul final de H este O2;

calea anoxibiotică sau anaerobă, în care acceptorul final de H este un compus de natură anorganică;

calea fermentativă, în care acceptorul final de H este un compus de natură organică, acesta fiind de regulă un produs final rezultat dintr-o succesiune de reacţii de oxido-reducere a substratului metabolizabil. Posibilitatea de a utiliza una sau alta din aceste căi depinde de echipamentul enzimatic pe care îl posedă fiecare specie bacteriană. În raport cu comportamentul faţă de O2 lumea bacteriană se împarte în două categorii: bacterii aerobe şi bacterii anaerobe.

Respiraţia la bacteriile aerobe. Acestea dispun de un bogat echipament enzimatic de tipul citocromoxidazelor, care condiţionează realizarea proceselor respiratorii pe cale oxibiotică. În funcţie de caracteristicile proceselor respiratorii, bacteriile aerobe se diferenţiază în mai multe subgrupe sau subtipuri respiratorii:

bacterii strict aerobe, cum sunt Bacillus anthracis (bacilul antraxului), Mycobacterium tuberculosis (bacilul TBC), care se dezvoltă numai în medii cu presiune parţială normală de oxigen (corespunzătoare concentraţiei atmosferice de circa 21%);

bacterii microaerofile (Spirochetales), care se dezvoltă numai în medii cu presiune parţială redusă de oxigen (în concentraţie de regulă sub 1%);

bacterii capneice (Brucella) care necesită o atmosferă îmbogăţită în CO2 şi concentraţii mai mici de O2. La acestea CO2 acţionează ca factor stimulator al metabolismului energetic dar şi ca sursă de C;

bacterii aerobe facultativ anaerobe (Escherichia coli, Staphylococcus, Streptococcus etc.), care se dezvoltă optim în condiţii de aerobioză, dar se pot multiplica şi în condiţii de anaerobioză. Un asemenea comportament este determinat de faptul că bacteriile respective îşi pot orienta metabolismul energetic pe cale oxibiotică sau pe cale fermentativă, în funcţie de disponibilităţile mediului în O2.

Respiraţia la bacteriile anaerobe. Acestea îşi procură energia prin metabolizarea pe cale anoxibiotică a unor compuşi anorganici sau organici.

35

Metabolizarea pe cale anoxibiotică a substratului nutritiv este consecinţa faptului că bacteriile anaerobe sunt lipsite de citocromi şi citocromoxidază, precum şi de catalază şi peroxidază. Prezenţa în mediu a O2 acţionează ca factor nociv, determinând la unele bacterii anaerobe oxidarea ireversibilă a unor enzime, fapt care duce la blocarea uneia sau chiar mai multor căi metabolice. La numeroase specii bacteriene, metabolizarea anoxibiotică a unor compuşi organici (proteine, glucide) se face pe calea fermentativă. În raport cu comportamentul bacteriilor anaerobe faţă de prezenţa în mediu a O2, acestea se împart în:

bacterii strict anaerobe sau oxisensibile (Clostridium tetani, Clostridium botulinum etc.), care nu tolerează prezenţa în mediu a O2, acesta având acţiune cu adevărat toxică;

bacterii anaerobe aerotolerante sau oxitolerante, care se multiplică şi în prezenţa unor cantităţi reduse de O2, putând fi definite din această cauză bacterii anaerobe facultativ aerobe.

Creşterea şi multiplicarea bacteriilor

Activitatea metabolică deosebit de intensă pe care o pot desfăşura bacteriile se exprimă printr-un ritm foarte rapid de creştere şi multiplicare, neîntâlnit la vieţuitoarele din regnul vegetal sau animal. Intensitatea de sinteză a materiei vii, finalizată prin creşterea numerică a populaţiei bacteriene, poate atinge proporţii nebănuite. Multe bacterii se divid la intervale de circa 20 minute, respectiv tot la 20 minute apare o nouă generaţie, populaţia bacteriană crescând astfel în progresie geometrică. Multiplicarea populaţiilor bacteriene este limitată în condiţii naturale de intervenţia multor factori care menţin lumea microorganismelor într-un echilibru dinamic.

Creşterea celulei bacteriene. Este un fenomen obiectiv, controlat şi dirijat genetic, fiind mai evident la bacteriile care se găsesc în plin proces de diviziune. La bacterii creşterea şi multiplicarea sunt procese care se desfăşoară într-o corelaţie strânsă, ca un fenomen biologic unitar, în timp ce la alte vieţuitoare (vegetale, animale), creşterea individului este un fenomen diferit de cel de multiplicare. La bacterii, creşterea celulei precede multiplicarea, dar procesul în sine este mai puţin evident, devenind semnificativ numai în măsura în care bacteriile se divid şi populaţia creşte numeric. Procesele de creştere afectează în general toate dimensiunile bacteriei, dar depunerea materiei nou sintetizate se face dirijat şi preponderent spre anumite zone celulare. Mărirea în volum a bacteriei implică alungirea şi lărgirea peretelui celular, în special a “sacculului mureinic”. Unele cercetări atestă că sub acţiunea peretelui se pot forma breşe care apoi sunt completate prin noi unităţi muro-peptidice, care se intercalează şi se organizează pe modelul de structură existent. La multe bacterii creşterea în lungime a celulei şi a peretelui are preponderent caracter unipolar, materia nou sintetizată fiind dirijată şi organizată la unul din polii celulari. O asemenea modalitate de creştere este evidentă, de exemplu, la bacteriile sporulate, la care forma vegetativă rezultată din germinarea sporului creşte prin alungirea polului ce emerge din spor.

Multiplicarea bacteriilor. Bacteriile se înmulţesc obişnuit prin diviziune directă (sciziparitate). Numai excepţional, un număr redus de grupe de bacterii se pot multiplica prin alte modalităţi: ramificare şi înmugurire (actinomicetele şi unele bacterii fotosintetizante), corpusculii elementari (micoplasme) sau prin spori (unele actinomicete).

36

-Diviziunea directă. Creşterea în volum a celulei bacteriene se face până la anumite limite, procesul fiind urmat de declanşarea diviziunii celulare ca o necesitate de restabilire a raportului optim dintre suprafaţă şi volum. La bacterii raportul optim suprafaţă/greutate este de cca 400 000 ori mai mare decât la om. Procesul de diviziune, la majoritatea bacteriilor, se produce la intervale cuprinse, în medie, între 20-30 minute.

-Diviziunea prin strangulare este caracteristică bacteriilor care aparţin tipului “S”. Procesul constă în invaginarea membranei citoplasmatice în zona ecuatorială a celulei, urmată fidel de invaginarea peretelui bacterian, care în final separă cele două celule.

-Diviziunea prin septare este caracteristică bacteriilor ce aparţin tipului “R”. Procesul se realizează prin creşterea centripetă a structurilor parietale, iniţial a membranei citoplasmatice, care formează un sept transversal, separând astfel conţinutul endocelular. Apoi se produce creşterea peretelui celular, care desăvârşeşte separarea celor două celule.

Relaţiile dintre bacterii şi factorii de mediu fizici şi chimici. Microorganisme cu structură particulară

Cuvinte cheie: bacteriostatic, bactericid, antifungic, chimiosinteză, antibacterian, antibiorezistenţă.

Cunoaşterea comportamentului bacteriilor şi a acţiunii pe care o exercită factorii fizici şi chimici asupra celulelor bacteriene are o mare importanţă teoretică şi practică. Mulţi factori fizici şi chimici, când se găsesc în cantitate moderată sau optimă, pot exercita o acţiune favorabilă asupra bacteriilor. Din contră, aceiaşi factori, la intensităţi sau concentraţii crescute, pot exercita un efect nociv, bacteriostatic (opresc multiplicarea) sau bactericid (distrug bacteriile).

Acţiunea factorilor fiziciTemperatura. Activitatea metabolică a celulei bacteriene se poate desfăşura

numai în limite termice moderate, cuprinse între 5C şi 50C, în timp ce temperaturile extreme au acţiune nocivă. În privinţa limitelor termice care permit creşterea şi multiplicarea bacteriilor, bacteriile se împart în trei grupe:

bacterii psichrofile, sau criofile, denumite şi bacteriile frigului, fiind în totalitate saprofite. Se multiplică între limitele termice cuprinse între -10C şi -30C, temperatura optimă de multiplicare fiind situată sub 20C. Acestea trăiesc în natură în apele reci din lacuri şi mări, în pământ, la altitudini, în zonele arctice. Unele bacterii criofile se multiplică pe alimentele conservate la frig (carne, lapte, fructe, legume etc.)provocând degradarea şi alterarea lor;

bacteriile mezofile se multiplică la temperaturi cuprinse între 10C şi 45C, temperatura optimă de multiplicare fiind în jurul a 37-38C. Din această grupă fac parte toate bacteriile patogene şi numeroase bacterii saprofite.;

bacteriile termofile se multiplică în condiţii optime la temperaturi care depăşesc 45C. Limitele termice care permit multiplicarea diferă cu specia termofilă.

37

Temperatura minimă care permite multiplicarea unor specii este cuprinsă între 20-40C, iar temperatura maximă poate ajunge până la limite de 70-80C. Desfăşurarea activităţii vitale la temperaturi atât de ridicate pare să fie posibilă datorită faptului că, proteinele structurale şi mai ales enzimele acestor bacterii au o termostabilitate crescută. Unele bacterii termofile trăiesc în natură în apele termale, altele pe materiile organice de natură vegetală şi animală, cum sunt gunoaiele depozitate pe platforme, furajele însilozate etc. Procesele lor fermentative sunt însoţite de degajări mari de căldură, ceea ce duce la ridicarea temperaturii în silozurile de furaje şi în platformele de gunoi până la limite care sunt nocive pentru bacteriile netermofile. De exemplu, în gunoiul depozitat în platforme, temperatura se poate ridica până la limita de 70-80C, care este letală pentru bacteriile patogene. Pe aceasta se bazează procedeul de sterilizare biotermică a gunoiului provenit din focarele de boală.

Speciile termofile, cum sunt Lactobacillus delbrukii şi L. plantarum, produc în furajele fibroase însilozate fermentarea lactică a maltozei, transformându-le astfel în furaje murate cu o valoare nutritivă superioară, cu un gust şi miros aromat, plăcut. Alte specii termofile din genul Lactobacillus sunt utilizate în industria fermentativă a laptelui, la prepararea iaurtului şi a chefirului, la fermentarea unor brânzeturi etc.

Temperaturile scăzute sunt în general mai puţin nocive, fiind suportate mai uşor de către bacterii. Acestea pot suporta temperaturi extrem de scăzute, ca cele de îngheţare a aerului lichid (-190C) sau chiar a heliului (-250C). Expunerea la asemenea temperaturi joase este însă nocivă pentru majoritatea celulelor bacteriene, dar dintr-o populaţie rămân totuşi viabile o parte din bacterii care, repuse în condiţii favorabile, sunt capabile să se multiplice. Moartea bacteriilor la temperaturi foarte scăzute este consecinţa denaturării structurilor celulare prin deshidratarea lor, în urma formării cristalelor de gheaţă intra şi extracelular, cât şi prin dezechilibrul hidromineral al celulei. Sunt foarte nocive îngheţul şi dezgheţul repetat. Congelarea lentă, la temperaturi foarte scăzute este mai nocivă decât congelarea rapidă. Temperaturile în jurul valorii de 0C produc o blocare a activităţii metabolice, fără să lezeze componentele structurale, în special enzimele, ceea ce permite conservarea îndelungată a viabilităţii celulei într-o stare latentă. De exemplu, streptococii, diplococii şi alte specii patogene mor la temperatura camerei, de regulă, în câteva zile, dar la temperatura de 0-4C îşi menţin viabilitatea până la 30 de zile.

Temperaturile de -20C până la -70C permit conservarea optimă a viabilităţii bacteriilor, mai ales dacă celulele sunt supuse concomitent şi la o desicaţie rapidă în vid. Pe aceasta se bazează conservarea culturilor microbiene şi a vaccinurilor vii, prin liofilizare. Procedeul constă într-o sublimare rapidă a apei în vid, din culturile puse pe gheaţă carbonică, la temperaturi de -30C până la -80C. Asemenea culturi desicate, obţinute sub formă de pulbere şi păstrate la +4C în fiole închise în vid, îşi pot menţine viabilitatea chiar mai mulţi ani.

Bacteriile sunt mult mai puţin rezistente la căldură. De exemplu, formele vegetative ale bacteriilor patogene (mezofile) sunt omorâte după menţinerea timp de 30 minute la căldură umedă de 50-60C. Căldura uscată este mai puţin nocivă, formele vegetative fiind distruse în totalitate abia după 10 minute la 100C. Sporii sunt mult mai rezistenţi decât formele vegetative din care provin. Ei pot fi omorâţi numai prin menţinerea timp de 30 minute la căldură umedă de 120C sau după 30-60 minute la căldură uscată de 160-180C. Acţiunea letală a căldurii este consecinţa unor efecte multiple. În general, căldura moderată determină accelerarea proceselor metabolice, mai ales a celor catabolice, ceea ce duce la acumularea rapidă de metaboliţi, urmată de intoxicarea celulei. La aceasta se însumează, la bacteriile aerobe, insuficienţa acută de O2 care determină alterări funcţionale asfixice.

38

Radiaţiile Energia radiaţiilor luminoase, ultraviolete şi a radiaţiilor ionizante (X, gamma

etc.) este adsorbită de componentele celulare, în special de proteine şi acizi nucleici, ceea ce poate produce modificări sau lezări grave, unele incompatibile cu viaţa. Gravitatea acestor lezări depinde direct de lungimea de undă a radiaţiilor şi de doza de iradiere, exprimându-se biologic fie ca efect mutagen (când iradierea este moderată), fie ca efect letal (când iradierea este intensă).

-Radiaţiile luminoase (vizibile). În general, radiaţiile spectrului solar au efecte sterilizante moderate. Sunt adsorbite de componentele celulare în proporţie redusă. Efectul bactericid este mai ales consecinţa deshidratării celulelor bacteriene, determinată de expunerea mai îndelungată la acţiunea calorică a radiaţiilor infraroşii şi , în mai mică măsură, a radiaţiilor U.V. conţinute de spectrul solar. Sensibilitatea germenilor la lumina solară variază cu specia, streptococii având o sensibilitatea maximă, în timp ce stafilococii şi colibacilii sunt mult mai rezistenţi. Sporii sunt deosebit de rezistenţi comparativ cu formele vegetative. De exemplu, formele vegetative de Bacillus anthracis, suspendate într-o picătură de lichid mor în proporţie de 90%, după o expunere de 30 minute la lumină solară, în timp ce sporii expuşi în condiţii identice rezistă până la 2 ore. Radiaţiile luminoase pot exercita şi alte efecte: foto-protector, atunci când bacteriile sunt expuse concomitent la iradierea cu U.V., sau pot avea un efect de foto-reactivare a bacteriilor care au fost expuse în prealabil la iradierea cu doze letale de U.V. (expunerea la lumină poate “repara” alterările celulare produse de U.V., printr-un mecanism încă necunoscut. Drept urmare, un număr de celule bacteriene iradiate pot “reînvia”, dacă în următoarele ore sunt expuse la lumină).

-Radiaţiile ionizante (radiaţiile corpusculare, alfa, beta, protonii şi radiaţiile electromagnetice X, gamma) au asupra bacteriilor efecte nocive mult mai puternice decât radiaţiile U.V. Efectele nocive sunt produse mai ales de faptul că radiaţiile ionizante “bombardează” şi “lovesc” o serie de atomi din structura celulei, ceea ce determină desprinderea şi smulgerea de pe orbită a unor electroni. Ionizarea intensă produce alterarea sau distrugerea unor substanţe esenţiale pentru celulă, blocarea unor enzime, a diviziunii celulare etc. Efectul bactericid cel mai intens îl au radiaţiile X şi gamma. Microorganismele sunt mai rezistente la iradiere decât mamiferele. Astfel, pentru om este letală o doză de aproximativ 300 gamma, în timp ce pentru E. coli este letală o doză de eproximativ 10 000 gamma, iar pentru levuri dozele de 30 000 gamma. Bacteriile Gram pozitive sunt mai rezistente decât bacteriile Gram negative. Datorită efectelor lor bactericide, razele X, beta şi gamma pot fi folosite la sterilizarea unor produse şi materiale sanitare (bandaje, fire de sutură, segmente arteriale), la sterilizarea unor produse alimentare, iar în unele cazuri la inactivarea vaccinurilor.

Ultrasunetele Vibraţiile ultrasonice şi supersonice au efecte letale, determinând în celula

bacteriană fenomene de cavitaţie, manifestate prin dezintegrarea structurilor, însoţite frecvent de ruperea peretelui celular. Sunt mai nocive vibraţiile cu frecvenţă relativ joasă, dar cu intensitate mare. Sensibilitatea germenilor este variabilă, cocii fiind în general mai rezistenţi decât bacilii, iar sporii mai rezistenţi decât formele vegetative. Efectele nocive ale ultrasunetelor pot fi utilizate la sterilizarea unor produse (lapte). Ultrasunetele pot fi utilizate în cercetarea structurii celulei bacteriene pentru obţinerea unor constituenţi chimici şi antigenici, la separarea enzimelor de celelalte componente structurale etc.

39

Presiunea osmotică Celula bacteriană, protejată de un perete elastic şi rezistent suportă variaţii

mari de presiune osmotică, dacă acestea nu se produc prea brusc şi în limite exagerate. În mediile în care presiunea se abate de la izotonicitate, celula bacteriană suferă anumite modificări caracteristice. În mediile hipertonice (soluţii saline concentrate) celula pierde cantităţi mari de apă, se reduce în volum şi se retractă, membrana citoplasmatică desprinzându-se de peretele celular. Se produce astfel o veritabilă ratatinare a celulei, fenomenul fiind denumit plasmoliză. Din contră, în mediile hipotonice, datorită pătrunderii apei în celulă, aceasta devine turgescentă, fenomen denumit plasmoptiză. În general, majoritatea bacteriilor sunt “sensibile” la clorură de sodiu, în sensul că nu suportă concentraţii mai mari de 2%. Fac excepţie bacteriile halofile (halos = sare; philus = a iubi) din apele marine şi saline care trăiesc în medii cu un conţinut mare de NaCl, până la 15%.Unele bacterii se pot dezvolta şi în medii cu concentraţii între 16-35% NaCl (Halobacterium sp.). Anumite bacterii halofile se pot dezvolta în produsele conservate prin sare (măsline, peşte sărat, cărnuri saramurate, brânzeturi etc.), unele specii fiind utile în “maturarea” produselor respective, în timp ce altele produc degradarea lor.

Presiunea hidrostaticăBacteriile sunt foarte rezistente la presiune. Există totuşi deosebiri între

bacteriile care trăiesc la suprafaţa pământului, în organismele animale sau în apele de suprafaţă, faţă de cele care trăiesc în adâncimea oceanelor. Cele din prima categorie sunt considerate baro-sensibile, deoarece activitatea fiziologică şi multiplicarea lor sunt afectate de presiuni care depăşesc echivalentul a 200-600 atmosfere. Speciile care trăiesc în adâncul oceanelor sunt barofile, ele fiind adaptate la presiuni hidrostatice foarte ridicate, care depăşesc uneori echivalentul a 1 000 atmosfere.

Gradul de ionizare a mediului (pH-ul) Concentraţia mediului în ioni de hidrogen şi oxidrili influenţează activitatea

vitală şi multiplicarea bacteriilor. Majoritatea bacteriilor se dezvoltă în limite relativ largi de pH, cuprinse în general între 6-9, ceea ce este echivalentul unor variaţii ale concentraţiei ionilor de H de 1-1 000. Această toleranţă se explică prin faptul că, celula bacteriană este puţin penetrabilă pentru ionii de H şi OH, având capacitatea de a-şi păstra reacţia endocelulară la variaţii relativ mari de pH. În privinţa pH-ului optim şi a limitelor tolerabile există deosebiri mari de la o specie bacteriană la alta. Mediile acide sunt mai toxice decât cele alcaline. Sunt însă unele specii de bacterii saprofite acidofile, care preferă medii cu un pH puternic acid. Astfel, bacteriile din genul Thiobacillus trăiesc în apele sulfuroase şi se dezvoltă la un pH optim de 3-4. Alte specii bacteriene trăiesc chiar la pH=0. De asemenea, lactobacilii care produc fermentarea laptelui şi a furajelor însilozate se dezvoltă la un pH acid, care atinge obişnuit valori cuprinse între 3 şi 5.

Acţiunea substanţelor chimiceBacteriile se găsesc într-o permanentă interacţiune cu substanţele chimice

prezente în mediul lor de viaţă. Dintre acestea multe au o acţiune utilă, stimulând fie multiplicarea bacteriilor, fie anumite procese metabolice (sinteza unor enzime, toxigeneza, elaborarea de substanţe cu acţiune antibiotică etc.). Alte substanţe au acţiune nocivă asupra celulei bacteriene, manifestată fie ca efect bacteriostatic

40

(opresc multiplicarea), fie ca efect bactericid (omoară celula bacteriană). Substanţele chimice cu acţiune nocivă asupra bacteriilor au o largă utilitate în practica medicală, unele fiind utilizate în lucrările de dezinfecţie, altele în terapia infecţiilor. După caracteristicile de acţiune şi utilitatea lor, acestea se grupează în două categorii:

a) substanţele chimice cu acţiune nespecifică (dezinfectantele şi antisepticele);

b) substanţe chimice cu acţiune specifică (chimioterapicele de sinteză şi antibioticele).

a) O serie de substanţe chimice active în concentraţii foarte mici sunt definite ca având o acţiune nespecifică, deoarece în dozele în care sunt nocive pentru bacterii sunt, de regulă, nocive şi pentru celulele şi ţesuturile animale. Substanţele dezinfectante au acţiune bactericidă în concentraţie foarte mică, dar sunt la fel de nocive şi pentru celulele şi ţesuturile animale. Se pot utiliza numai la dezinfecţia locuinţelor, a adăposturilor, a padocurilor şi a terenurilor contaminate, a vehiculelor, obiectelor, apei etc. Dintre acestea , cea mai largă utilitate în practica medicală veterinară o au: hidroxidul de sodiu, varul cloros, formolul, fenolul, crezolul etc. Substanţele antiseptice sunt de regulă bacteriostatice, uneori bactericide, dar în concentraţii active pentru bacterii sunt mai puţin nocive faţă de celulele şi ţesuturile animale. Din acest motiv ele pot fi utilizate la dezinfecţia pielii, a mucoaselor, a plăgilor, câmpului operator, iar unele chiar în terapia unor infecţii superficiale. Din această categorie fac parte alcoolii, tinctura de iod, soluţia de permanganat de potasiu, peroxidul de hidrogen, rivanolul, detergenţii, unii coloranţi bazici sub formă de soluţii (albastru de metilen, cristalul violet, pioctanina), unii compuşi ai metalelor grele, sub formă de soluţii sau pomezi (de argint, cupru , mercur).

b) Substanţele cu acţiune specifică sunt utilizate pe scară largă în terapia infecţiilor la om şi animale. Sunt definite ca substanţe cu acţiune specifică pentru că în dozele mici în care sunt active pentru bacterii, sunt practic lipsite de nocivitate pentru celulele şi ţesuturile animale.

Substanţele chimioterapice sunt produse de chimiosinteză cu efect bacteriostatic, cele mai multe acţionând ca “inhibitori competitivi” ai unor metaboliţi esenţiali pentru celula bacteriană. Principalele grupe de chimioterapice sunt: sulfamidele, sulfonele,nitrofuranul şi derivaţii acestuia,acidul paraaminosalicilic (PAS) şi hidrazida acidului izonicotinic (HIN). La scurt timp după introducerea lor în practica medicală s-a constatat că bacteriile pot deveni rezistente la acţiunea sulfamidelor.

S-a stabilit că în populaţiile bacteriene pot să apară , prin mutaţii spontane, celule rezistente la sulfamidă, care se selectează în prezenţa chimioterapicului. Sulfamida exercită asupra populaţiei o puternică “presiune de selecţie” înlăturând celulele sensibile, fără să stânjenească multiplicarea mutantelor rezistente (din care rezultă alte variante rezistente la chimioterapic). Cercetări recente arată că numeroase stări de rezistenţă sunt de natură plasmidică, fiind mediate de factorul “R”. Această plasmidă este adeseori purtătoare a unor “markeri” de rezistenţă la sulfamide sau la alte chimioterapice.

Antibioticele sunt secreţii sau componente de origine biologică cu acţiune antibacteriană sau antifungică. Pot fi clasificate şi definite din mai multe puncte de vedere: origine, natură chimică, spectru şi mecanisme de acţiune.

După origine, antibioticele se împart în :-bacteriene, elaborate de bacterii;

41

-micoine, elaborate de ciuperci microscopice;-fitoncide, conţinute de plante (alicina din usturoi şi ceapă, humulonul din

hamei, tomatina din tomate etc.);-zoocide, componente elaborate de celulele şi ţesuturile organismelor animale

şi care acţionează ca factori naturali de apărare antimicrobiană. După spectrul de acţiune faţă de bacterii, antibioticele pot fi împărţite în:-antibiotice cu spectru de tip streptomicinic, predominant active faţă de

bacteriile Gram negative (streptomicina, neomicina, kanamicina, gentamicina, polimixina B, colistina etc.);

-antibiotice cu spectru larg, active faţă de bacteriile Gram pozitive, dar şi faţă de bacteriile Gram negative (tetraciclinele, cloramfenicolul).

După structura şi asemănările chimice, antibioticele se pot constitui în mai multe familii:

-betalactamine (penicilinele şi cefalosporinele);-macrolide (eritromicina, spiromicina);-oligozaharide (streptomicina);-aminoglicozide (neomicina, kanamicina etc.);-polipeptide ciclice (polimixina B, colistina, colimicina);-tetracicline.Antibioticele mai pot fi împărţite, după mecanismele de acţiune şi “situsul”

celular la care acţionează. Din acest punct de vedere se disting antibiotice care acţionează la nivelul peretelui bacterian, a membranei citoplasmatice, a genomului celular, a organitelor şi mecanismelor de biosinteză a proteinelor etc. Diversitatea mare a antibioticelor, cât şi spectrul foarte diferit de acţiune, sugerează că fiecare antibiotic acţionează pe căi şi prin mecanisme proprii, fie ca inhibitor competitiv capabil să blocheze anumite căi metabolice esenţiale, fie prin lezările morfostructurale sau funcţionale pe care le pot produce la nivelul unor structuri sau organite celulare. La scurt timp după introducerea în practică a antibioticelor a fost semnalată apariţia unor variante penicilino-rezistente şi streptomicino-rezistente. Cercetările au precizat că asemenea stări de antibiorezistenţă pot să apară faţă de oricare antibiotic. Mai mult, în ultima perioadă s-a constatat o creştere îngrijorătoare a frecvenţei populaţiilor bacteriene cu stări de RMA (rezistenţă multiplă la antibiotice). Variantele antibiorezistente apar frecvent ca urmare a unor mutaţii naturale, antibioticul acţionând în selectarea acestora ca un puternic factor “presor”, la fel cum se întâmplă şi în cazul chimioterapicelor. Unele stări de rezistenţă la antibiotice pot fi câştigate foarte rapid de anumite specii bacteriene (rezistenţa la streptomicină în cazul bacilului antraxului). În schimb, penicilino-rezistenţa se câştigă mai lent, în trepte, fiind implicate mai multe evenimente mutaţionale, care survin succesiv la nivelul tuturor determinanţilor genetici implicaţi în conferirea rezistenţei (mutaţii multigenice). S-a precizat că unele specii bacteriene sunt frecvent purtătoare de factor “R”, o plasmidă care poate să conţină “markeri” de rezistenţă la antibiotice şi care conferă germenilor caracterele de RMA. Portajul de factor “R” este deosebit de frecvent la bacteriile intestinale, colibacilii fiind în prezent un rezervor imens în natură de factor “R” transferabil prin conjugare la alte specii. Mecanismele prin care bacteriile pot “evita” acţiunea nocivă a antibioticelor sunt, la fel, deosebit de complexe şi variate. De exemplu, penicilino-rezistenţa unor bacterii este conferită de proprietatea de a secreta penicilinază. Antibiorezistenţa poate fi conferită apoi de descreşterea permeabilităţii celulare faţă de antibiotic, de producerea unor restructurări la nivelul organitelor de biosinteză a proteinelor care le fac insensibile la antibiotic, de sintetizarea în cantităţi excesive a metabolitului competiţionat de

42

antibiotic sau, din contră, de descreşterea cerinţelor bacteriei faţă de metabolitul competiţionat.

Microorganisme cu structură particulară

Micoplasmele. Reprezintă un grup care încadrează organisme procariote de dimensiuni foarte mici (diametru = 0,3-0,8m), lipsite de perete celular (mollis = moale, elastic; cutis = piele, înveliş), prevăzute cu membrană citoplasmatică dar incapabile de sinteză de peptidoglican şi precursorii săi. Datorită acestei structuri morfologice sunt rezistenţi la penicilină şi omologii acesteia, dar sensibili la şocul osmotic, detergenţi, alcooli şi anticorpi specifici. Sunt microorganisme Gram negative parazite, comensale sau saprofite, unele patogene pentru om, animale, plante şi insecte. Se găsesc ca bacterii epifite pe mucoase, dar au fost izolate şi din apă. Sunt sensibile la razele ultraviolete, uscăciune, detergenţi şi dezinfectante uzuale. Sunt sensibile la streptomicină, tetraciclină, dar rezistente la penicilină, bacitracină, precum şi la sulfamide.

Rickettsiile. Mult timp au fost considerate ca un grup de microorganisme intermediare între bacterii şi virusuri. În prezent sunt încadrate în grupa bacteriilor pe baza caracterelor morfochimice, enzimatice şi fiziologice. Se pot întâlni forme cocoide, bacilare şi chiar filamentoase de dimensiuni mari. Celula tipică are formă de bastonaş, cu dimensiuni de 0,3-o,7x1,5-2m. Sunt Gram negative colorându-se greu prin această metodă, motiv pentru care se folosesc alte metode de colorare, cum ar fi metoda Machiavello-Stamp-Giemsa. Sunt bacterii epifite indiferente sau patogene, prezente în organismul unor insecte hematofage. Insectele artropode ocupă un loc important în ciclul de viaţă al rickettsiilor, reprezentând un vector de transmitere al infecţiei de la o gazdă la alta, cât şi un rezervor natural de germeni. Rezistă la uscăciune, supravieţuiesc câteva luni în dejecţiile artropodelor, pe blana animalelor, pe lână, piei etc. Sunt sensibile la antisepticele uzuale şi la antibiotice, dar se dovedesc rezistente faţă de sulfamide.

Chlamidiile. Sunt microorganisme obligatoriu parazite intracelular, capabile să producă o mulţime de infecţii la om şi animale. Sunt considerate bacterii Gram negative, de dimensiuni reduse, deficitare din punct de vedere energetic, ceea ce le obligă la o existenţă strict intracelulară. Se cultivă numai pe celule vii (ouă embrionate, culturi tisulare, animale de laborator). În mediul extern rezistă multă vreme în stare uscată şi îşi păstrează infectivitatea în timpul congelării. Sunt distruse în 10 minute la 60C şi sunt foarte sensibile la acţiunea detergenţilor şi a dezinfectanţilor uzuali. Antibioticele şi chimioterapicele sunt active faţă de chlamidii. Produc boli cu localizări variate la om şi animale, manifestate prin pneumonii, enterite, avort, encefalite etc.

Bacteriofagii. Sunt virusuri parazite pentru bacterii. Sunt foarte răspândiţi în natură, găsindu-se obişnuit în toate mediile naturale în care trăiesc bacteriile: ape, sol, conţinut intestinal la om şi animale. Pătrunderea şi multiplicarea lor în celula bacteriană sunt procese complexe care decurg rapid şi se finalizează prin liza (dezintegrarea) bacteriilor. Cei mai mulţi fagi au formă spermatozoidală caracteristică. În structura lor se distinge o formaţiune mai voluminoasă, poliedrică, cu contur hexagonal, numită “capul fagului”, care conţine genomul viral. La acesta se găseşte ataşată o formaţiune cilindrică numită “apendice caudal” cu ajutorul căruia

43

fagul se fixează pe bacterie. Există şi fagi de formă icosaedrică, fără apendice caudal, de formă filamentoasă, fără cap. În baza caracteristicilor morfo-structurale, fagii se pot constitui în 17 grupuri. Fixarea fagilor la suprafaţa bacteriei este urmată de inocularea acidului lor nucleic în celulă. În interiorul acesteia genomul fagic acţionează ca material autonom, subordonând şi deviind metabolismul celulei gazdă spre sinteza componentelor virale, din asamblarea cărora rezultă în final noi fagi.

Noţiuni de micologie

Cuvinte cheie: ciuperci microscopice, levuri, ciuperci filamentoase, fungi, micotoxine.

Ciupercile microscopice sunt componente ale încrengăturii Thallophyta, subîncrengătura fungi ( micete) şi sunt microorganisme heterogene, foarte răspândite în natură. Până în prezent, în natură se cunosc aproximativ 200 000 specii de micete, din care un număr relativ redus prezintă proprietăţi patogene, afectând omul, animalele şi plantele la care produce infecţii locale sau generale, cu evoluţii uneori foarte grave.

Ciupercile microscopice pot fi definite prin câteva caracteristici generale care prin care pot fi apreciate ca un grup distinct de vieţuitoare:

• din punct de vedere al ecologiei lor, ciupercile microscopice reprezintă un grup de vieţuitoare heteromorfe cu mare răspândire în natură, unde sunt întâlnite diverse substraturi organice vegetale şi animale;

• ciupercile microscopice, din punct de vedere morfologic au o mare diversitate. În alcătuirea lor intră în general două componente de bază şi anume thalul şi aparatul sporifer. Există specii de ciuperci la care thalul se poate confunda uşor cu sporii (ciupercile holocarpice), în timp ce la alte specii acesta este bine diferenţiat de spori (ciupercile eucarpice). La levuri thalul este alcătuit din celule de formă globuloasă, alungite sau ovale, cu dimensiuni cuprinse între 3 şi 5 micrometri în diametru, iar la fungii filamentoşi thalul este compus din filamente lungi (câţiva milimetri), cu diametre cuprinse între 1 şi 10 micrometri. Aceste filamente poartă denumirea de hife şi alcătuiesc împreună un miceliu;

• din punct de vedere al structurii şi organizării endocelulare, ciupercile sunt mai complexe decât bacteriile, fiind vieţuitoare eucariote. Aparatul nuclear al ciupercilor microscopice este alcătuit din înveliş nuclear, carioplasmă şi nucleol, iar citoplasma conţine, printre altele, mitocondrii, aparat Golgi, reticul endoplasmatic şi un echipament enzimatic bine structurat;

• ciupercile microscopice se înmulţesc atât pe cale sexuată, prin intermediul sporilor sexuaţi, cât şi pe cale asexuată, prin spori asexuaţi, înmugurire şi sciziparitate. Având în vedere tipul lor de înmulţire, pot fi ciuperci microscopice holocarpice, la care funcţiile vegetative şi cele de înmulţire sunt îndeplinite succesiv de cître aceeaşi celulă micotică, iar înmulţirea se face doar pe cale asexuată şi ciuperci eucarpice, la care funcţiile respective se desfăşoară pe structuri separate, iar înmulţirea se poate realiza atât pe cale sexuată cât şi asexuată.

Morfologia ciupercilor microscopice

44

Ciupercile microscopice sunt organisme heteromorfe la care nu se poate realiza procesul de fotosinteză, trăiesc pe cele mai variate medii bogate în substanţe organice, în marea lor majoritate sunt aerobe, având necesităţi ridicate în oxigen în vederea satisfacerii proceselor vitale. Datorită însuşirilor lor morfologice şi fiziologice, ciupercile microscopice se împart în două mari grupe: levuri (drojdii) şi ciuperci filamentoase (mucegaiuri). Deşi această clasificare este de obicei constantă în lumea ciupercilor, au fost semnalate situaţii când, în anumite faze de dezvoltare, unele specii şi genuri prezintă manifestări ale dimorfismului, având capacitatea de a prezenta o fază levuliformă sau o fază filamentoasă.

Levurile reprezintă un grup taxonomic heterogen de ciuperci microscopice cu structură obişnuit unicelulară şi o organizare internă de tip eucariot. Au capacitatea de a fermenta mediile cu conţinut de substanţe hidrocarbonate, motiv pentru care au fost denumite drojdii.

Levurile prezintă în mod obişnuit formă sferică, ovalară sau alungită. Au fost identificate unele tulpini monomorfe, adică acele levuri care se prezintă sub o singură formă, sau dimorfe şi chiar polimorfe. Dimensiunile levurilor au limite largi de variaţie, începând cu 1-3 micrometri până la 14-20 micrometri. Există specii de levuri care în unele din etapele lor de dezvoltare pot atinge dimensiuni de 70, chiar 80 de micrometri. Pentru că fac parte dintre eucariote, levurile sunt prevăzute cu perete celular, membrană citoplasmatică, citoplasmă şi nucleu.

Peretele celular al levurilor are o grosime de 150-250 nanometri, fiind mai subţire şi cu o flexibilitate mai pronunţată la celulele tinere, La celulele bătrâne peretele celular devine mai gros şi mai rigid. La exterior peretele celular are o suprafaţă netedă, iar la interior prezintă numeroase cutări ale suprafeţei, ca o consecinţă a invaginărilor membranei citoplasmatice, cu atât mai dezvoltate cu cât stadiul de maturare al celulei este mai avansat. Structura chimică a peretelui celular este caracteristică, fiind reprezentată de glucan, manan, chitină, polimerii glucidici fiind concentraţi într-o componentă fibrilară şi amorfă. Această componentă fibrilară are aspectul unei reţele dense, alcătuită din filamente intersectate, fiind compusă în principal din glucanproteină, care se orientează spre interior şi formează scheletul rigid al peretelui celular. Manoproteina reprezintă componenta amorfă a peretelui celular fiind dispusă la periferia acestuia. Levurile îşi datorează forma peretelui celular, care prin morfostructura densă şi relativ rigidă conferă acestora aspecte caracteristice. Peretele celular al levurilor prin structura sa poroasă are rol de membrană semipermeabilă, prin intermediul său realizându-se schimburi de substanţe între acestea şi mediul înconjurător.

Un alt rol al peretelui celular este participarea sa în cadrul proceselor de diviziune celulară şi de înmugurire. Separarea celulei levurilor debutează cu o îngroşare a peretelui celular la nivelul conexiunii dintre celula mamă cu mugurele şi se finalizează când mugurele a atins dimensiunea şi forma celulei mamă. Datorită structurii chimice a peretelui celular al levurilor, acestea manifestă un comportament diferit faţă de acţiunea agenţilor chimici, fizici şi biologici.

Membrana citoplasmatică (plasmalema) prezintă o structură trilamelară, foarte cutată şi cu o grosime de aproximativ 8 nanometri. În compoziţia ei intră lipide şi proteine, enzime specifice (ATP-aze, adenilatciclaza, fosfokinaze, fosforohidrolaze etc).

Funcţiile membranei citoplasmatice sunt următoarele:

45

• este implicată activ în schimbul permanent de materii şi energie dintre celulele levurilor şi mediul înconjurător;

• are un rol important în desfăşurarea reacţiilor imunologice de suprafaţă;• reglează procesele de creştere celulară;• intervine în sinteza unor componenţi chimici ai peretelui celular al levurilor.Toate aceste funcţii sunt într-o oarecare măsură datorate şi peretelui celular,

de care membrana citoplasmatică este strâns legată.Citoplasma levurilor conţine componente chimice anorganice şi organice,

precum şi organite, cum ar fi mitocondriile, reticulul endoplasmatic, aparatul Golgi şi o serie de alte componente cu structuri granulare. Structura sa este în aparenţă omogenă, cu un aspect granular, mai fluidă la celulele tinere, care pe măsura îmbătrânirii celulelor devine vâscoasă şi refringentă. La microscopul electronic s-a evidenţiat în structura citoplasmei existenţa unei reţele tridimensionale neregulate, care ulterior a fost denumită reţeaua microtrabeculară, Aceasta, în urma contracţiilor locale sau generale determină modificări de volum ale spaţiilor intratrabeculare, acţionând în acest mod ca o adevărată musculatură a celulei, care facilitează orientarea constantă a organitelor şi fibrelor citoscheletice, fără să influenţeze procesele ce se desfăşoară în cadrul lor. Ribozomii conferă aspectul granular citoplasmei. În strânsă dependenţă cu anumite proprietăţi fizico-chimice (constanta de sedimentare, greutatea moleculară) şi fiziologice, ribozomii din componenţa levurilor pot fi împărţiţi în ribozomi componenţi ai citoplasmei şi cei din componenţa mitocondriilor.

Mitocondriile se găsesc mai frecvent în zona periferică a citoplasmei levurilor, în preajma membranei citoplasmatice, iar numărul şi modul de dispunere sunt în strânsă dependenţă cu intensificarea proceselor respiratorii din cursul fazelor de dezvoltare a celulelor.

Reticulul endoplasmatic este componenta de bază din cadrul sistemului de endomembrane, fiind în strânsă conexiune cu membrana nucleară, citoplasmatică sau cu mitocondriile. Are rol deosebit în transportul intra şi extracelular al metaboliţilor şi enzimelor , de asemenea intervine în multiplicarea celulelor levurilor, declanşând prin intermediul mecanismelor enzimatice formarea mugurilor.

Aparatul Golgi este un complex enzimatic situat în imediata apropiere a locului de emergenţă a mugurilor. Cu toate că funcţiile sale nu sunt încă bine stabilite, se presupune că este implicat în procesele de biosinteză a peretelui celular şi în unele activităţi metabolice. Citoplasma levurilor mai are în componenţa sa vacuole, granule de lipide şi glicogen.

Nucleul, ca la toate celulele eucariote prezintă membrană şi conţine cromozomi, nucleol, carioplasmă şi unele structuri caracteristice (granul lateral, fus intranuclear). În timpul diviziunii nucleul nu se modifică din punct de vedere al formei, cromozomii nu se modifică evident iar învelişul nuclear rămâne aproximativ cu acelaşi aspect, deoarece separarea nucleului nou de cel matern se va produce printr-o strangulare mediană sau submediană.

Levurile sunt microorganisme heterotrofe iar metabolismul lor este oxidativ şi fermentativ. Speciile de levuri care au metabolism fermentativ nu pot fi strict anaerobe, ele necesitând prezenţa acidului oleic sau a ergosterolului. Atunci când asimilarea se face pe cale oxidativă, levurile pot prelua cu uşurinţă substanţele cu conţinut de carbon, rezultând dioxidul de carbon şi apă. În cazul asimilării pe cale fermentativă preluarea carbonaţilor duce la eliberarea de etanol şi dioxid de carbon. Ca urmare a proceselor catabolice fermentative rezultă o mare cantitate de energie, din care o parte este utilizată în reacţii de biosinteză, restul transformându-se în

46

căldură. Levurile se dezvoltă corespunzător în mediile acide sau neutre, la un pH de 3-7,5 şi o temperatură optimă de 25-28 ˚C. Levurile nu necesită prezenţa vitaminelor pentru creştere şi dezvoltare, doar un număr relativ redus de specii având nevoie de factori de creştere cum ar fi biotina (vitamina H), tiamina (vitamina B1), piridoxina (vitamina B6), inozitolul (factor de creştere inclus în grupul vitaminelor B) şi acidul pantotenic (vitamina B3).

Multiplicarea levurilor se face fie pe cale asexuată (înmugurire, sciziparitate, spori asexuaţi), fie pe cale sexuată.

Sciziparitatea sau diviziunea directă este iniţiată prin creşterea în lungime şi îngustarea celulei mame, după care are loc diviziunea nucleului, finalizându-se cu formarea septului transversal, ce separă celula mamă în două celule fiice, care fie se separă, fie rămân ataşate, formând pseudomicelii.

În mod obişnuit la levuri, reproducerea asexuată se realizează prin înmugurire, când au loc restructurări la nivelul formaţiunilor parietale şi citoplasmei. Într-o anumită regiune a peretelui celular structura devine mai laxă şi acesta va fi împins spre exterior de către citoplasma care este în plin proces de vacuolizare. Prin acest procedeu apare o invaginaţie ce va creşte proporţional cu evoluţia diviziunii celulare. În acelaşi timp cromatina devine mai deschisă la culoare şi nucleul se va deplasa spre mugure. În momentul în care jumătate din volumul nucleului a trecut în mugurele nou-format se va produce o ştrangulare a istmului de unde acesta a apărut. Astfel rezultă doi nuclei, câte unul pentru fiecare celulă formată. Când dimensiunile atinse sunt apropriate de cele ale celulei mame, mugurele se va separa complet sau rămâne în continuare ataşat, luând naştere în acest mod lanţuri celulare sau pseudomicelii. Există unele specii de levuri (de exemplu Schizosaccharomyces) la care diviziunea celulelor se realizează prin fenomene de clivare uni sau bidirecţională. Acest tip de diviziune este iniţiată de alungirea celulei, cu apariţia la polii opuşi a unui sept ale cărui capete se vor uni, împărţind celula în două jumătăţi egale, fiecare cu câte un nucleu.

Diviziunea asexuată prin spori debutează cu formarea la suprafaţa celulelor a unor muguri care cresc progresiv până ajung la maturitate, fiind separaţi de celulele mame prin un înveliş propriu. Rezultă în acest mod sporul, ce în acest caz poartă denumirea de blastospor. Alt tip de spor asexuat poartă denumirea de clamidiospor şi apare ca urmare a creşterii în volum a unei celule din cadrul miceliului, al cărei perete devine gros şi foarte rezistent.

Înmulţirea sexuată are loc prin conjugarea unor celule haploide, astfel încât faza diploidă din cadrul ciclului să aibă o durată scurtă, redusă doar la stadiul de zigot. Atunci când condiţiile de mediu sunt favorabile, zigoţii, ca şi în cazul celulelor diploide derivate prin înmugurire, se divid mitotic, dând naştere generaţiilor de celule diploide, ce ulterior se vor transforma în formaţiuni ce conţin doi (sau un multiplu de doi) spori. Această formaţiune sporală poartă denumire diferită, în funcţie de grupa de ciuperci de care aparţine, la levuri se numeşte ască, iar sporii ascospori.

Fungii filamentoşi Ciupercile filamentoase sau mucegaiurile aparţin unui grup taxonomic alcătuit

din vieţuitoare pluricelulare de tip eucariot, ale căror funcţii vegetative şi de reproducţie sunt realizate pe structuri celulare bine definite.

Fungii sau mucegaiurile sunt alcătuite dintr-un aparat vegetativ numit thal, de la care pornesc o multitudine de filamente lungi şi subţiri care poartă numele de hife. Ansamblul alcătuit de acestea se numeşte miceliu şi are o creştere rapidă. Miceliul poate fi format din hife care au la bază o celulă unică, de formă alungită şi cu multe

47

ramificaţii, sub forma unui tub continuu, nedivizat (hifă neseptată) sau mai multe celule alungite despărţite prin pereţi transversali (hifă septată). Fungii care sunt alcătuiţi din micelii neseptate sunt mai puţin evoluaţi, spre deosebire de cei cu miceliu septat.

Hifele sunt alcătuite din celule cu dimensiuni diferite, în general se poate afirma că o celulă de formă cilindrică poate atinge dimensiuni de 2-5 nanometri diametru şi o lungime care o depăşeşte pe cea a diametrului de circa 2-4 ori. Ca orice celulă eucariotă şi cele care intră în structura hifelor sunt alcătuite din perete celular, membrană citoplasmatică, citoplasmă, organite celulare şi unul sau mai mulţi nuclei.

Peretele celular al hifelor are o consistenţă relativ rigidă şi este format din polizaharide, acizi graşi, chitină şi substanţe care îi conferă caracterul de membrană impermeabilă. Peretele celular diferă în ceea ce priveşte structura şi grosimea de la o specie la alta de fungi, precum şi cu vârsta celulelor şi condiţiile de cultivare ale acestora.

Membrana citoplasmatică este strâns legată de citoplasmă iar între ea şi peretele celular există un spaţiu în care se găseşte o substanţă lichidă. Are o structură granulară, fină şi conţine numeroşi compuşi chimici. La faţa internă a membranei citoplasmatice se găsesc granule suspendate, incluzii şi vacuole.

Citoplasma este omogenă, însă atunci când celula îmbătrâneşte devine granulară. În masa citoplasmei au fost puse în evidenţă mitocondrii, vacuole, reticul endoplasmatic şi aparat Golgi.

Nucleul are un diametru de 1-3 nanometri şi la exterior este delimitat de o membrană nucleară dublă, care este prevăzută cu numeroşi pori.Carioplasma conţine unul sau mai mulţi nucleoli, granule şi are o densitate optică redusă. În structura genomului nuclear se găsesc 2-4 cromozomi. Există variaţii în ceea ce priveşte numărul nucleilor din hife şi al cromozomilor din nuclei, în funcţie de specia de levuri.

La hifele septate, celulele care le alcătuiesc sunt separate prin membranele lor citoplasmatice, între care se găseşte un spaţiu septal plin cu un lichid, la fel ca între membrana citoplasmatică şi peretele celular de la nivelul hifelor. Septurile transversale sunt străbătute de pori care facilitează o conexiune protoplasmatică intercelulară dintre celulele învecinate care alcătuiesc hifele septate. În funcţie de poziţia fungilor pe treptele de evoluţie filogenetică, structura hifelor şi a miceliului este mai mult sau mai puţin dezvoltată. Speciile mai puţin evoluate au o membrană celulară rudimentară, şi un aparat vegetativ alcătuit din un gimnoplast, cu citoplasmă şi nuclei sau dintr-un complex de gimnoplaşti. Alte specii de fungi aparatul vegetativ este alcătuit din hife neseptate, cu mai mulţi nuclei, denumit sifonoplast sau din hife septate, denumit thal. Miceliul sau aparatul vegetativ în cele mai multe cazuri este aderent la mediul pe care se dezvoltă.

Fungii sau ciupercile filamentoase sunt prevăzute cu aparat de reproducere reprezentat de hife aeriene pe care se găsesc structuri caracteristice denumite corpi fructificanţi, fiecare specie având aceste structuri adaptate modului lor de reproducere.

Ciupercile filamentoase sunt prevăzute cu un echipament enzimatic bogat, având astfel posibilitatea de a metaboliza o gamă diversă de substanţe. Acestea folosesc ca şi sursă de carbon glucide, acizi graşi, alcooli. Ca sursă de azot utilizează aminoacizii, sărurile de amoniu şi nitraţii. Din punct de vedere al metabolismului lor, fungii se caracterizează printr-o mare capacitate de biosinteză, în urma proceselor lor anabolice rezultând poliglucide, acizi organici şi lipide. Există

48

specii de fungi capabile să elaboreze pigmenţi, miceliile acestora fiind colorate în mod caracteristic, acest lucru având o însemnătate deosebită în lucrările de identificare.

Pentru a se dezvolta în condiţii optime fungii necesită un mediu cu o umiditate de peste 14-16%, sub această valoare dezvoltarea lor îşi încetineşte ritmul sau chiar se opreşte. Fungii se multiplică la temperaturi de 22-32 ˚C, cu limite cuprinse între 5 ˚C şi 45 ˚C. Mediile optime pentru fungi, spre deosebire de alte microorganisme, trebuie să aibă un pH slab acid, cu valori cuprinse între 5 şi 6. De obicei fungii necesită condiţii de aerobioză, de gradul de aeraţie influenţând în mod hotărâtor procesul de sporulare.

Fungii au caractere de patogenitate care diferă cu specia. Anumite specii de fungi sunt capabile să producă îmbolnăviri prin dezvoltarea miceliului în diverse ţesuturi şi organe, altele sunt capabile să secrete toxine (toxigene) şi produc toxiinfecţii sau intoxicaţii. Elaborarea de toxine diferă chiar de la o tulpină la alta de fungi şi este în strânsă dependenţă cu condiţiile de mediu. Iniţial toxinele elaborate de ciupercile microscopice au fost denumite aflatoxine, însă în prezent denumirea acestora este dată în funcţie de tipul de toxină şi de specia de fungi la care a fost elaborată.

Multiplicare la ciupecile filamentoase se realizează prin mai multe căi şi anume reproducere vegetative (asexuată) şi reproducere prin spori (asexuată, sexuată).

Reproducerea vegetativă se poate realiza pe cale asexuată prin diviziune directă (sciziparitate), înmugurire sau prin creşterea hifelor în lungime.

Diviziunea directă şi înmugurirea se realizează asemănător cu reproducerea la levuri. Fungii prezintă în mod obişnuit o creştere a hifelor în timpul dezvoltării miceliului, precum şi în procesul de germinare a sporilor. Hifele se dezvoltă printr-o creştere apicală (de tip celular) sau intercalară (înmugurire). Germinarea sporilor şi formarea hifelor au loc doar în condiţii optime de mediu. Din membrana sporului, la nivelul unei zone bine delimitate denumită por germinativ apare o formaţiune cilindrică ce se va dezvolta în lungime, alcătuind hifa primară, care se ramifică şi dă naştere apoi miceliului ciupercii.

Spre deosebire de bacterii, la ciuperci sporul reprezintă nu doar o formă de rezistenţă ci şi o structură cu rol în multiplicare. După modul lor de formare sporii sunt împărţiţi în două categorii:

• spori imperfecţi, care apar în urma unor procese asexuate (spori asexuaţi);• spori perfecţi, apăruţi ca urmarea unor procese sexuate (spori sexuaţi):Sporii asexuaţi sunt la majoritatea ciupercilor filamentoase principalul mijloc

de multiplicare. Din punct de vedere complexităţii proceselor de restructurare morfofiziologică în urma cărora apar se deosebesc două tipuri de spori asexuaţi:

◦ thalosporii sau sporii asexuaţi la care morfogeneza se realizează în mod direct, pe baza celulelor ce alcătuiesc miceliul ciupercii:

◦ acei spori a căror formare are loc în interiorul sau pe suprafaţa corpilor fructificanţi, denumiţi în mod diferit, în funcţie de morfostructura lor.

Există mai multe tipuri de spori asexuaţi (imperfecţi):− clamidisporul, care se formează în urma creşterii volumului unei celule din

cadrul miceliului, cu îngroşarea peretelui exterior. Poate avea o formă globuloasă sau ovală, având fie o poziţie intercalară, de-a lungul tijei, sau putând fi situat terminal. Reprezintă o formă de rezistenţă a ciupercii la condiţiile mediului extern şi se întâlneşte frecvent la ciupercile dermatofite (genul Tricophyton) şi la câteva specii de levuri (Candida albicans):

49

− artrosporul (oidia) întâlnit la fungii septaţi, format în urma fragmentării unei hife vegetative terminale în celulele componente. Formarea sa este iniţiată de îngroşarea hifei, apariţia mai multor septuri şi fragmentarea aceseia. Structurile rezultate sunt ortrosporii şi se dispun sub formă de lanţuri. Acest tip de spor este întâlnit la ciupercile dermatofite:

− blastosporul apare ca urmare a unui proces de înmugurire al unei celule din cadrul thalului. Mugurele creşte progresiv şi apare o nouă celulă care se separă de celula mamă după ce s-a maturizat:

− zoosporul (planosporul) este cel mai simplu tip de spor şi se formează la nivelul unor componente caracteristice denumite sporangiofori, la nivelul unei hife specializate desprinse din miceliu, la a cărei extremitate apare o formaţiune cu aspect globulos denumită sporangie, în care se găsesc o mulţime de spori uninucleaţi:

− sporangiosporul (aplanosporul) rezultă dintr-o formaţiune globuloasă de la capătul rotunjit al unei hife fertile, numită sporangiofor. Are formă ovală, conţine mai mulţi nuclei şi citoplasmă. Este întâlnit la ciupercile cu miceliu neseptat (genul Mucor, Absidia, Rhisopus)

− conidiosporul (conidia) apare la ciupercile cu miceliu septat, pe structuri specializate de fructificare, denumite conidiofori, alcătuite dintr-o hifă fertilă la care, la una din extremităţi apare o formaţiune globuloasă (columelă) ce are dispuse pe suprafaţa ei celule fertile (sterigme) din care se vor dezvolta sporii (conidiile). Aceşti spori au forme ovale, aproape translucizi, coloraţi sau necoloraţi, uni sau pluricelulari, aşezaţi sub formă de lanţuri scurte sau lungi, caracteristic genului sau speciei din care fac parte. După forma şi modul de dispunere, conidioforii se împart în următoarele categorii:

◦ coremie, atunci când conidioforii sunt dispuşi în mănunchiiuri,◦ acervul, când se aşează sub formă de grămezi pe o împletitură de hife,◦ picnidie, când se găsesc aşezaţi pe un miceliu de formă rotundă.Forma şi structura conidioforilor reprezintă un important criteriu de identificare,

deoarece acestea sunt caracteristice fiecărui gen sau specie de fungi;− aleurosporul (sporul lateral) apare frecvent la fungii dermatofiţi, este situat

pe lungimea hifelor pe care s-a format şi prezintă o formă ovală sau rotundă. Deoarece se dispun pe partea laterală determină apariţia unei formaţiuni caracteristice, ca un spic sau un ciorchine.

Sporii sexuaţi (perfecţi) apar ca urmare a proceselor de conjugare, când citoplasma a două celule se contopeşte (plasmogamie), nucleii fuzionează, dând naştere unui zigot care poartă denumiri diferite, în funcţie de complexitatea proceselor de morfogeneză tipice anumitor clase de ciuperci. Fungii, în toate cazurile, trec de la o fază haploidă, cu un număr (n) de cromozomi, la o fază diploidă, cu un număr dublu de cromozomi (2n), după care, în urma reducerii cromatice, revin la faza haploidă. Există mai multe tipuri de spori sexuaţi:

− zigosporul , apărut în urma conjugării a doi gameţi identici din punct de vedere morfofiziologic (izogameţi) proveniţi de la două celule vecine, de pe acelaşi miceliu sau de pe micelii alăturate. Are o formă sferică, fiind prevăzut cu un perete celular gros şi rezistent;

− oosporul rezultă ca urmare a conjugării a doi gameţi diferiţi morfofiziologic (heterogameţi), din care unul este mascul, numit anteridium şi celălalt femel, numit oogonium. Ca urmare a unei reorganizări interne zigotul apărut devine oospor;

− ascosporul rezultă în urma unui proces de fuzionare a unor celule învecinate, de pe acelaşi miceliu sau depe micelii alăturate ) gametangie totală).

50

Apare o formaţiune care poartă denumirea de ască, ce conţine maximum opt spori, ca urmare a diviziunii zigotului. În interiorul ascei, ascosporii se maturează şi în final sunt eliberaţi din această formaţiune;

− bazidiosporul se întâlneşte la fungii care aparţin clasei Bazydimiocestes, fiind situat în porţiunea externă a unui organ specializat ce poartă denumirea de bazidie. Aceştia se formează la extremitatea unei hife fertile, într-o celulă ce conţine doi nuclei. Cei doi nuclei vor fuziona formând zigotul, ce se va divide de două ori, rezultând în final patru nuclei. În acelaşi timp, la suprafaţa celulei apar patru proeminenţe, în urma invaginării peretelui celular şi a citoplasmei, unde migrează nucleii formaţi în urma diviziunii. Aceste formaţiuni cu nucleii în interiorul lor rămân ataşate de suprafaţa celulei prin intermediul unui pedicul, formând blastosporii.

Sporii, fie perfecţi sau imperfecţi, reprezintă un important mijloc de răspândire şi supravieţuire în natură a fungilor, datorită următoarelor caracteristici adaptative:

• greutatea relativ redusă şi numărul mare de spori pe care îi elaborează un miceliu facilitează răspândirea lor, mai ales prin plutirea în aerul atmosferic;

• rezistenţa mare la factorii fizico-chimici de mediu permite supravieţuirea fungilor timp îndelungat la condiţii în care, sub formă vegetativă acest lucru nu ar fi fost posibil;

Ciupercile microscopice în marea lor majoritate posedă atât spori asexuaţi cât şi sexuaţi. Formarea ambelor categorii de spori depinde de cele mai multe ori de condiţiile de mediu pe care fungii respectivi se dezvoltă, cu excepţia fungilor imperfecţi, ce dispun doar de spori asexuaţi, indiferent de condiţiile de mediu.

Principalele micete patogene care contaminează furajele.Fungii sau miceţii reprezintă grupul cel mai mare de microorganisme din

sistemul biologic (aproximativ 250 000 de specii), fiind larg răspândite în natură. Doar 30-40% din numărul total de specii de fungi sunt capabile să producă metaboliţi toxici, iar dintre acestea doar 60 de specii s-au dovedit dăunătoare la om şi animale. Micetele fac parte din încrengătura THALLOPHYTA, care cuprinde plante inferioare fără rădăcini, tulpini şi frunze. Unele acestea au clorofilă (algele şi lichenii) iar altele nu prezintă clorofilă, cum ar fi bacteriile, mixomicetele şi micetele. Micetele constituie subîncrengătura FUNGI ce se împarte în arhimicete (Archymicetes) şi eumicete (Eumycetes). Arhimicetele sunt holocarpice, de formă ameboidă şi nu prezintă interes medical. Eumicetele sunt eucarpice, prezintă importanţă pentru patologia medicală şi se împart în ficomicete, ascomicete, basidiomicete şi fungii imperfecţi.

Clasa PHYCOMYCETES, cuprinde micete ale căror forme vegetative pot avea o structură unicelulară (dermatoplast) sau una filamentoasă ramificată dar neseptată (sifonoplast). Ficomicetele se înmulţesc prin spori asexuaţi, dispuşi în sporangii sau prin spori sexuaţi (zigospori). Din ordinul Zygomycetes al acestei clase fac parte miceţii ce se caracterizează printr-un aparat vegetativ filamentos, ramificat şi bine dezvoltat. Familia MUCORACEAE încadrată în acest ordin cuprinde cu un aparat vegetativ expansiv, care contaminează furajele frecvent, fiind agenţi cauzali ai unor micoze.

Clasa ASCOMYCETES se împarte în două subclase: Prototunicate şi Eutunicate. Prototunicatele au proprietatea de a pune în libertate ascosporii, în urma dezintegrării ascei. Din această subclasă, de interes medical sunt genurile Aspergillus şi Pencilium. Eutunicatele se împart la rândul lor în unitunicate şi bitunicate. Din grupa unitunicatelor fac parte genurile Giberella, cu forme imperfecte ce produc fusariotoxicoza la animale şi genul Claviceps, ai cărui reprezentanţi produc de asemenea îmbolnăviri la animale.

51

Clasa BASIDIOMYCETES este alcătuită din miceţi ai căror spori externi (basidiosporii) se localizează pe formaţiuni numite bazidii. Cele două ordine de miceţi ai acestei clase, Ustilaginales (cu genurile Ustilago şi Tilletia) şi Uredinales (cu genurile Puccinia şi Uromyces) contaminează plantele de nutreţ, producând micotoxicoze la animale.

Fungii imperfecţi sunt o grupare provizorie în care sunt încadraţi fungi la care lipsesc stadiile de dezvoltare perfecte, reprezentate prin organele de înmulţire sexuată. Se înmulţesc, ca atare, doar pe cale asexuată, prin micelii şi conidii. Acest tip de fungi se clasifică în funcţie de caracterele morfologice ale fructificaţiilor conidiene. Astfel, ordinul Monihales include micete imperfecte cu conidii libere pe hife, la nivelul unor formaţiuni numite sporodohii sau preconidiofori grupaţi în fascicule (coromii). Cele două familii, Dematiceae şi Tuberculariaceae cuprind specii toxigene care produc îmbolnăviri la animale.

În funcţie de substratul pe care se dezvoltă, micetele se pot clasifica în micete parazite sau micete de păşune, ce parazitează plantele în perioada de vegetaţie şi în micete saprofite, ce se dezvoltă pe substraturi aflate în descompunere (furaje conservate în mod defectuos).

Dintre micetele saprofite fac parte următoarele genuri:◦ genul Aspergillus, cu speciile cele mai cunoscute A. flavus, a. fumigatus, A.

giganteus, A. melless, A. nidulans, A. niger, A. nigeus, A. ochraceus, A. orizae, A. osteanus, A. parasiticus, A. restrictus, A. terreus, A. versicolor, acesta fiind genul cu cea mai pronunţată toxicitate;

◦ genul Penicillium, cu spaeciile cele mai cunoscute P. griseofulvum, P. islandicus, P. notatum, P. oxalicum, P. rubrum, P. terestre, P. variabile, P. viridicatum, P. glaucum;

◦ genul Mucor încadrează specii cu potenţial toxigen, care produc la mamifere mucor-micoze (la suine tulburări digestive) şi la păsări tulburări digestive şi respiratorii. Specii mai importante sunt M. javanicus, M. mucedo, M. corymbifer, M. candidus;

◦ genul Rhisopus (speciile R. Nigricans, R. Orrhisus, R. Cohnii, R. Microsporus) şi genul Absidia (A. corymbifera, A. ramosa) produc afecţiuni similare cu cele produse de speciile genului Mucor. Există situaţii în care speciile genului Rhisopus pot produce aflatoxine:

◦ genul Giberella (speciile G. fujikuroi, G. zeae, G. roseum) contaminează spicele şi grăunţele de cereale, producând îmbolnăvirea acestora.

Micetele parazite sunt reprezentate de:• genul Claviceps, cu specia Claviceps purpurea (cornul secarei) ce

contaminează spicele gramineelor anuale (mai ales secara) şi celor perene;• genul Ustilago cu speciile U. tritici, U. avenae, U. nuda, cunoscute şi sub

denumirea de tăciuni, care distrug spicul plantelor pe care le atacă;• genul Tilletia cu speciile T. tritici, T. trichoides, T. foetida, T. intermedia, care

produc mălura, contaminând spicele şi boabele de cereale;• genul Puccinia cu speciile P. graminis, P. tritici, P. coronifera, P. graminis, P.

sorghi, care produc rugina cerealelor la grâu, ovăz, secară porumb;• genul Uromyces, cu speciile U. pisi, U. trifoli, care produc rugina

leguminoaselor, parazitând mazărea şi trifoiul;• genul Stahhybotris, cu speciile S. alternans, S. atra, S. lobulata,ce

contaminează grosierele, având aspectul petelor de funingine în apropierea nodurilor la paie şi coceni, fiind puternic toxigene, elaborând stahibotriotoxina;

52

• genul Fusarium cu speciile F. graminearum, F. tricinctum, F. roseum, F. nivale, F. sporotrichoides, F. moniliforme, larg răspândite pe sol, pe plante din familia graminee, leguminoase şi pe rădăcinoase.

MicotoxineÎn substraturile alimentare sau furajere, precum şi în mediile de cultură, miceţii

pot elabora metaboliţi toxici denumiţi micotoxine. Termenul de micotoxină derivă de la cuvântul grecesc mycos, care înseamnă ciupercă, fung şi de la cuvântul toxicum, care în limba latină înseamnă otravă. Micotoxină înseamnă de fapt principii toxici elaboraţi de toţi fungii, inclusiv cei macroscopici, însă în mod obişnuit acest cuvânt este folosit pentru a desemna metaboliţii toxici ai micetelor microscopice. Micotoxicozele sunt entităţi morbide produse de micotoxine care pătrund în organism împreună cu furajele în care au fost elaborate de fungii toxici. Acestea nu implică prezenţa micetului şi uneori nici chiar a substratului în care a fost elaborată micotoxina, în vederea declanşării bolii.

Caracteristici generale ale micotoxinelor. Tipuri de micotoxineAstăzi sunt cunoscute cel puţin 200 de metaboliţi fungici secundari care

posedă suficientă toxicitate pentru a fi consideraţi micotoxine. Înafară de entităţile morbide cunoscute ca fiind determinate de anumite micotoxine există şi unele micotoxine al căror rol în etiologia micotoxicozelor la animale nu este încă pe deplin clarificat. Acestea sunt elaborate de ciuperci care se găsesc în mod obişnuit în furajele grosiere, cereale sau în nutreţurile combinate. Cercetările privind rolul acestor în etiologia proceselor morbide la animale este încă la nivelul cercetărilor experimentale, cu toate că unele dintre efectele acestora sunt dovedite a fi nocive. Printre acestea pot fi amintite citreoviridina, luteoschirina, rugulosina etc.

Este foarte important să se cunoască faptul că aceeaşi micotoxină poate fi sintetizată de mai multe specii ale aceluiaşi gen sau din genuri diferite de miceţi. De asemenea, anumite specii de miceţi pot sintetiza mai multe tipuri de micotoxine în mod simultan.

Până în prezent se cunosc următoarele tipuri de micotoxine: aflatoxina, ce poate fi sintetizată de specii de Aspergillus, Penicillium şi

Rhisopus; ochratoxina, sintetizată de Aspergillus ochraceus şi de anumite specii de

Penicillium; toxina T-2, sintetizată de Fusarium spp., Trichoderma viridae şi Trichoderma

lingorum.În organismul animalelor micotoxinele exercită acţiuni nocive, manifestate din

punct de vedere clinic sub cel puţin trei forme:a) micotoxicoze acute primare, determinate de consumul de

cantităţi mari sau moderate de micotoxine aflate în substraturile furajere;b) micotoxicoze cronice primare, produse ca urmare a consumului

de cantităţi moderate sau mici de micotoxine, care au drept urmare scăderea productivităţii şi fertilităţii animalelor, fără a fi însoţite de simptome evidente de boală;

c) micotoxicoze secundare, ce apar în urma consumului timp îndelungat de cantităţi foarte mici de micotoxine, care produc o creştere a sensibilităţii animalelor la infecţii microbiene şi infestaţii parazitare, deoarece micotoxinele au afectat semnificativ sistemul imun de apărare al acestora.

Aflatoxinele au fost izolate iniţial sub forma a patru compuşi chimici denumiţi aflatoxinele B1, B2, G1, G2, în funcţie de culoarea fluorescenţei pe care o exercitau în lumina ultravioletă şi de poziţia lor pe placa cromatografică (structurile I-IV). Ulterior

53

au fost izolate alte două aflatoxine şi anume M1 şi M2 (structurile V şi VI), fiind identificate ca metaboliţi ai aflatoxinelor B1 şi B2, produşi în organismul animalelor. S-a mai identificat structura VII- parasiticolul, apoi aflatoxine cu acţiune similară aflatoxinelor B1, B2 (structurile VIII şi IX), aflatoxicolul (structura X ), aflatoxicolul H (structura XI), aflatoxina P1 (structura XII) şi aflatoxina Q1 (structura XIII).

Aflatoxinele sunt compuşi cu stabilitate mare la substraturile alimentare şi furajere, care reacţionează faţă de extremele valorice de pH (10<pH<3) în lumină ultravioletă şi în prezenţa oxigenului, datorită ciclului furanic nesaturat şi structurii lactonice. Sunt termostabile, fiind degradate de acizi şi baze tari şi distruse de agenţii oxidanţi.Sunt sensibile la lumina ultravioletă, deci produţii rezultaţi în urma iradierii lor prezintă toxicitate mai redusă faţă de organismul animal.

Citrinina este o substanţă cristalină, cu o greutate moleculară de 250 şi un punct de topire de 170-171 ˚C. Cristalizată prin alcool formează cristale aciforme de culoare galben-citrin. În apă este puţin solubil, dar este solubil în soluţii diluate de NaOH şi Na2CO3, precum şi în majoritatea solvenţilor organici.

Ergotoxinele sunt substanţe toxice localizate în ergotul produs de fungii din specia Claviceps. Din ergot au fost extraşi şi caracterizaţi peste 100 de compuşi, care au fost încadraţi în aproximativ 10 clase diferite; alcaloizi, amine, aminoacizi, pigmenţi, acizi graşi etc. Dintre aceştia, cei mai importanţi sunt alcaloizii derivaţi ai acidului lisergic şi aminele. Alcaliozii acidului lisergic sunt compuşi în perechi izomere, din care unul este activ iar celălalt inactiv. Cei mai importanţi sunt ergotamina şi ergometrina. Ergotoxina este, se pare, un amestec de ergocornină, ergocistină şi ergocriptină.

Luteoskyrina este un metabolit toxic elaborat de Penicillium islandicum, care produce intoxicaţii acute la om şi animale, având efecte hepatocarcinogene la animalele de experienţă. Penicillium islandicum elaborează în culturi şapte pigmenţi. Din punct de vedere toxicologic cei mai importanţi sunt luteoskyrina şi cicloclorotina. Chiar dacă experimentele evidenţiază efectele hepatotoxice şi carcinogenetice ale acestor două substanţe, în condiţii naturale nu au fost evidenţiate cu certitudine, probabil din cauza lipsei metodelor analitice adecvate.

Ochratoxinele sunt un grup de compuşi, cu o structură chimică asemănătoare, în moleculele cărora L fenilalanina este cuplată prin intermediul unei legături amidice cu un derivat izocumarinic. Au fost diferenţiate trei tipuri de ochratoxine majore:

− ochratoxina A, sub forma unei substanţe cristaline, incoloră, optic activă în cloroform şi fluorescentă în lumina ultravioletă, având o greutate moleculară de 403, un punct de topire de 90 ˚C, când este cristalizată în benzen şi la 169 ˚C, când este cristalizată în xilen. În urma hidrolizei acide se eliberează L-beta-fenilalanina şi acid lactonic (ochratoxina). Manifestă în apă o solubilitate redusă, dar este foarte solubil în solvenţi organici şi în soluţia aposă de bicarbonat de sodiu. La căldură este relativ stabilă, însă prin autoclavare prelungită este distrusă în proporţie 100%;

− ochratoxina B este analogul declorurat al ochratoxinei A. Este cristalină, incoloră, are o greutate moleculară de 369 şi este rar întâlnită în condiţii naturale de mediu;

− ochratoxina C este un ester etilit amorf al ochratoxinei A.Patulina este un antibiotic toxic produs de mai multe specii de fungi din genul

Penicillium (P. urticae, P. expansum, P. griseofulvum, P. cyclopum, P. divergens, P. roqueforti), Aspergillus (A. clavatus, A. giganteus, A. terreus) şi specia Byssochlamys niveae. În stare pură, patulina este o substanţă cristalină, cu greutate moleculară 154 şi punct de topire de 110˚ C. Este solubilă în apă, alcool, cloroform, acetat de etil,

54

mai puţin solubilă în eter, benzen şi insolubilă în pertol. Este instabilă în soluţii alcaline şi în apa distilată, este bine conservată în cloroform şi benzen. În prezenţa glutationului, patulina se descompune, În sucul de mere fermentat cu Sacharomyces sp. s-a constatat că aceasta dispare în totalitate. Nu este cunoscut pe deplin mecanismul de acţiune al patulinei, însă a fost dovedit faptul că aceasta inhibă sinteza proteinelor, a acizilor nucleici (ARN şi ADN) şi a unor sisteme enzimatice.

Rubratoxinele A şi B sunt elaborate de speciile de fungi Penicillium rubrum şi Penicillium purogenum. În stare pură sunt solubile în acetonă, moderat solubile în alcool, puţin solubile în apă şi insolubile în solvenţi nepolari. Ingerate de animale au acţiuni hepatotoxice şi hemoragipare, însă acţiunea lor în infecţiile naturale nu este pe deplin lămurită, dar există suspiciunea că ele ar contribui la agravarea sindroamelor asociate altor micotoxine, cum ar fi aflatoxinele.

Sterigmatocistina şi derivaţii săi, au fost izolaţi iniţial din sorokiniana-Drechalera. Sterigmatocistina este o substanţă labilă, uşor degradabilă, cu greutate moleculară 344 şi punct de topire 24 ˚C. Derivaţii sterigmatocisteinei sunt metaboliţi fungici furo-furanici cu greutate moleculară între 312-334 şi punct de topire între 203-327 ˚C. Toxicitatea sterigmatocistinei depinde de structura sa chimică,în care sistemul nesaturat D 1,2-furobenzofuran şi poziţia grupărilor metoxi şi hidroxi pe inelul xantonei joacă rolul dominant.

Stahibotriotoxinele sunt metaboliţi toxici produşi de specie de fungi Stachybotris alternans. Primul dintre metaboliţii toxici care a fost extras din cultura de miceţi a fost stahibotriotoxina A, ce are un nucleu steroid, cel puţin patru grupări OH şi un inel lactonic nesaturat, a cărui lungime nu este nici acum determinată. Apoi a fost extrasă stahibotriotoxina B, strâns înrudită cu prima dar mai puţin solubilă în solvenţi organici şi cu potenţial toxic mai redus. Ulterior au fost descoperiţi şi alţi metaboliţi toxici extraşi din Stachybotris atra. Este posibil ca stahibotriotoxina A să fie un amestec de substanţe chimice, în care predomină ergosterolul, descoperit şi în extractele de Stahybotris atra.

Zearalenona sau toxina F2 este o lactonă a acidului rezorcilic, cu structură asempnătoare hormonilor steroizi, produsă de miceţi din genul Fusarium, cu proprietăţi estrogenice şi anabolice.Au fost puşi în evidenţă 16 derivaţi ai zearalenonei, din care cei mai importanţi sunt 1şi 2, cu proprietăţi estrogenice, compusul 3 are doi izomeri mai activi decât zearalenona, iar derivatul 4 are acelaşi efect cu cel al zearalenonei. Din punct de vedere fizico-chimic toxina F2 este relativ stabilă în medii neutre şi la temperaturi de 80-120 ˚C, fiind distrusă în medii alcaline, prin tratament termic şi cu ajutorul soluţiilor apoase de amoniac.

Trichotecenele sunt un grup de micotoxine cu structuri înrudite, elaborate de miceţi din genurile Trichotecum,Trichoderma, Cephalosporium, Dermaticeae, Stachybotris, Myrothecium, Fusarium şi mai rar Nigrospora, Epicoccum şi Cladosporum. Până în prezent au fost identificate peste 60 de trichotecene al căror component chimic de bază este scirpena, din care, în urma substituţiei cu grupările hidroxi, epoxi, ceto, acilo în poziţiile 3, 4, 7 8 şi 15 se obţin compuşi chimici înrudiţi, însă cu proprietăţi fizico-chimice şi biologice proprii. Cel mai frecvent au fost izolate trichotecenele : vomitoxina (deoxinivalenolul), nivalenolul, Toxina T2 şi diacetoxiscirpenolul. În urma experimentelor s-a constatat că formele acute de intoxicaţie cu trichotecenele acţionează asupra celulelor aflate în curs de diviziune din măduva osoasă, limfonoduli, splină şi mucoasa intestinală. În doze reduse însă, aceşti compuşi pot fi utilizaţi ca imunomodulatori sau imunostimulatori. Expunerea repetată la trichotecene ca toxina T2 şi diacetoxiscirpenol induce creţterea sensibilităţii la infecţii cu germeni din genul Mycobacterium, Listeria, Salmonella, cu

55

miceţi din genul Candida şi cu virusul Herpes semiplex tip I. Trichotecenele tolerează în general variaţiile moderate de de temperatură şi pH, iar oxigenul şi lumina nu le influenţează în vreun mod capacitatea toxică. Acesta este motivul pentru care acestea nu sunt distruse pe durata preparării şi stocării furajelor. Substanţele alcaline şi acizii acţionează asupra trichotecenelor modificându-le structura şi însuşirile.

Biosinteza micotoxinelor este în strânsă dependenţă de prezenţa şi dezvoltarea micetului pe un anumit substrat şi de natura substratului, care în general trebuie să conţină carbon, azot şi săruri minerale.

Reacţiile de biosinteză au la bază reacţii catalizate de enzime asupra intermediarilor metabolici simpli, ai metabolismului primar, includ condensare, oxigenarea, reducerea, alchilarea, halogenarea, în urma cărora se pot produce o mare varietate de produşi secundari. Principalele căi implicate în formarea micotoxinelor sunt: calea policetonelor (aflatoxina), calea aminoacizilor (glicotoxina) şi calea acizilor tricarboxilici (rubratoxina). Alte micotoxine sunt sintetizate prin combinarea a două sau mai multe căi principale.

Noţiuni de Virusologie şi Imunologie

Cuvinte cheie: virus, prion, imunitate, self, non-self, antigene, anticorpi.

Virusul este o particulă submicroscopică, care este formată dintr-o teacă, sau înveliş cu rol de protecţie de natură proteică, numită capsidă şi un material genetic. Materialul genetic poate să fieADN, fie ARN.

Existenţa unor microorganisme invizibile la microscop a fost intuită de Pasteur după ce toate încercările de a pune în evidenţă agentul turbării au părut a fi zadarnice.

După unii precursori geniali (Eduard Jenner, Pasteur), progresele în domeniul virologiei au rămas neînsemnate şi până la începutul secolului al XX-lea, s-a vorbit în continuare de acele "fiinţe imaginare", fără ca ele să fie cunoscute.

Cu ajutorul microscopului optic cu lumină ultravioletă ("ultramicroscopul"), se pot distinge obiecte până la o fineţe dimensională de 0,15 μm, la măriri de 6.000-7.000 ori. Cu toate acestea, virusurile ( inframicrobii), nu se pot observa cu aceste microscoape. Observarea lor cere o mărire de ordinul 10.000-15.000 ori, ceea ce nu se poate obţine cu microscopul optic, deoarece astfel de măriri necesită puteri separatoare de 0,2 μm.

La sfârşitul secolului al XIX-lea, s-a reuşit detectarea lor printr-o metodă indirectă; după triturarea ţesuturilor care le conţin, virusurile traversează filtrele şi prin injectare transmit o anumităboală, astfel că li s-a atribuit denumirea de virusuri filtrante.

Lucrările lui R. Degkwitz (1927) şi T. Taniguchi (1935) au demonstrat că rujeola este cauzată de un virus. La fel şi rrubeola. Aceste două virusuri vor fi cultivate ulterior de Enders (1962).

În 1935, W. M. Stanley izolează o „proteină” şi demonstrează că inocularea acesteia unor plante provoacă boala numită mozaicul tutunului; de asemenea, arată că „proteina” păstrează această proprietate şi după cristalizare;

56

Bowden şi Pirie îi confirmă descoperirile în 1937. Ulterior s-a văzut că de fapt era de vorba de un acid nucleic cu un înveliş de natură proteică; în cazul virusurilor patogene pentru animale, aceste două componente pot, în anumite condiţii, să se separe.

În 1939, G. Kausche, E. Pfankuch şi E. Ruska au început să studieze virusurile la microscopul electronic. În 1943, Goodpasture este iniţiatorul infectării membranei alantoidiene a oului embrionat de pui (variola aviară, herpesul), care va fi dezvoltată de F. M. Burnet şi colaboratorii săi, iar apoi de mulţi alţii (Levaditi, Myakawa, etc).

După ce demonstrează că la baza reproducerii virusului mozaicului tutunului stă ARN-ul, Heinz Fraenkel-Conrat arată în 1955 împreună cu Robley Williams că un virus funcţional poate fi obţinut din ARN purificat şi o proteină, acestea două unindu-se spontan (proteina înveleşte materialul genetic), - deci aceasta este cea mai stabilă structură (cu energia cea mai mica) -, şi este foarte probabil ca acesta să fie şi mecanismul de formare a virusului în celula gazdă.

În 1958, Stanley a stabilit că ceea ce credea a fi „proteina” virusului mozaicului tutunului are proprietăţile moleculelor chimice dar dispune şi de capacitatea de a se reproduce şi de a se transforma.

Din punct de vedere chimic, virusurile sunt constituite din nucleoproteide. La un înalt grad de puritate ele pot cristaliza.

La virusul herpesului capsida este prevăzută cu prelungiri proteinice (capsomeri) care acoperă toată suprafaţa virionului.

Deosebiri faţă de bacterii:o Virusurile au dimensiuni foarte mici (de la 8 nm până la 500 nm, astfel

că pot traversa filtrele poroase ce reţin bacteriile.o Reproducerea virusurilor este posibilă numai în interiorul celulelor vii, în

organisme sau în medii de cultură care conţin astfel de celule.

◦ Au rezistenţă mare la glicerină şi la solvenţii lipoidelor, faţă de care sunt sensibili majoritatea microbilor.

Virusurile sunt agenţi patogeni ai unor boli denumite generic viroze. În general, virusurile dau imunitate, dar infecţia poate fi determinată şi

de acizii nucleici extraşi din virusuri; în acest caz nu se obţine imunizare, datorită lipsei proteinei.

Exemple: virusul variolei, virusul turbării, virusul encefalitei, HIV, virusul gripal, etc.

Exista si viroze ale plantelor, cel mai cunoscut fiind Virusul mozaicului tutunului.

După gazda care îi primeşte, se împart în patru grupe:

o virusuri patogene pentru bacterii: bacteriofagi:o virusuri patogene pentru vegetalele superioare: virusurile plantelor;o virusuri patogene pentru nevertebrate: virusurile insectelor;o virusuri patogene pentru vertebrate, cuprinzând cinci grupe:

57

virusuri al căror tropism este marcat pentru ectoderm (vaccin, variolă),

virusuri neurotrope pure (turbare), virusuri endoteliomezodermice (limfogranulomatoză venerică la

om), virusuri septicemice (rujeolă, rubeolă), virusuri proliferative (sarcomul lui Roux, leucoze şi leucemii

transmisibile).

După proprietăţile fizico-chimice:

După tipul de acid nucleic pe care îl conţin (clasificarea actuală uzuală).

Virusurile sunt descendenţi ai unor structuri subcelulare, devenite parazite ale celulelor evoluate, cu care s-au dezvoltat, stabilindu-se relaţii virus – gazdă, variabile cu natura virusului şi a celulei infectate. Virusurile sunt componente celulare devenite autonome, capabile să inducă replicarea lor fără control celular. Unele virusuri pot exista integrate în genomul celulei gazdă, fiind replicate cu acizii nucleici ai acesteia. Se pare că virusurile provin din bacterii patogene degradate de către celulele parazite. Indiferent de natura virusurilor, între acestea şi gazdele pe care le parazitează se stab ilesc relaţii care se exprimă diferenţiat, în funcţie de nivelul luat în considerare, cum ar fi:

relaţia dintre virus şi celula care îl replică se traduce prin morfogeneza virală;

relaţia dintre cele două entităţi se traduce prin modificări funcţionale şi morfologice care reprezintă starea de boală;

relaţia dintre cele două se traduce prin aspecte epidemiologice şi epizootologice variate, dependente de natura virusului, agresivitatea, căile de contaminare, receptivitatea gazdei.

În funcţie de dimensiunile pe care le pot avea virusurile se împart în: virusuri mari, cu dimensiuni cuprinse între 150 - 500 nm; virusuri mijlocii, cu dimensiuni de 50 - 150 nm; virusuri mici, cu dimensiuni de 10 - 15 nm.Virusurile au o specificitate patogenă strictă de regn, distingându-se din acest

punct de vedere: virusuri fitotrope, parazite la plante; virusuri bacteriotrope (bacteriofage), parazite la bacterii; virusuri zootrope, parazite la diferite specii de animale.Din punct de vedere al formei virusurile sunt foarte diversificate, în strânsă

dependenţă cu configuraţia acidului nucleic, cu simetria de organizare a capsidei şi cu complexitatea structurală a acestora.

Se disting virusuri cu următoarele forme: cilindrică, de bastonaş sau foarte alungită, cu aspect fibrilar sau

filamentos, caracteristică virusurilor cu capsidă organizată după o simetrie helicoidală;

izodiametrică, care poate fi icosaedrală, caracteristică virusurilor “nude”, cu capsida organizată după o simetrie cubică şi sferoidală, la virusurile care posedă pericapsidă;

spermatozoidală, caracteristică virusurilor bacteriofage;

58

formă de ghiulea (sau glonţ), caracteristică unei anumite grupe de virusuri, cum ar fi virusul rabic, al stomatitei veziculoase şi altele;

paralelipipedică, asemănătoare cu o cărămidă (virusurile variolice).Corpusculul sau particula virală, denumită virion, are o structură şi o

organizare subcelulară, de tipul unui “agregat” macromolecular nucleoproteinic.Toate virusurile conţin un singur tip de acid nucleic, de regulă o

macromoleculă unică, fie de ADN, fie de ARN, în structura căreia se găseşte codificată întreaga informaţie genetică a virusului şi care constituie genomul viral.

În funcţie de natura genomului, virusurile se împart în două categorii: dezoxiribovirusuri, cu genom ADN; ribovirusuri, cu genom ARN. Acidul nucleic viral ocupă zona centrală a

virionului. Virusul este înconjurat de un înveliş proteic numit capsidă, alcătuit din

subunităţi proteice numite capsomere, dispuse în jurul acidului nucleic după o simetrie helicoidală sau cubică. La unele virusuri, capsida este înconjurată şi protejată de un înveliş pericapsidal (gluco – lipo - proteic) denumit peplos sau anvelopă.

În raport cu aceste caracteristici structurale, virusurile se diferenţiază în: virusuri nucleo - proteinice sau nude, lipsite de pericapsidă; virusuri lipo – nucleo - proteinice, care posedă înveliş pericapsidal. Pe suprafaţa învelişului extern sau peplosului sunt implantate monomere glico

- proteice virus - specifice codificate de genomul viral, care au aspectul unor fire distribuite regulat, ca nişte spini sau ace cu gămălie, denumite peplomere şi care reprezintă aşa - numiţii “antigeni de suprafaţă”.

Incluziile virale sunt formaţiuni omogene sau granulare, de forme şi dimensiuni variate ce apar în citoplasma sau nucleul celulelor infectate cu anumite virusuri şi reprezintă conglomerate virale, rezultate din cristale virale (virusurile au capacitatea de cristalizare). Acestea pot fi situate intranuclear, intracitoplasmatic sau atât intranuclear cât şi intracitoplasmatic.

Virusurile se multiplică numai în celulele parazitate, prin procese şi mecanisme care nu se mai întâlnesc la alte vieţuitoare. Fazele replicării (multiplicării) virale sunt următoarele:

Adsorbţia, sau momentul ajungerii particulelor virale în preajma celulei receptive.

Penetraţia, reprezintă pătrunderea în celulă fie numai a acidului nucleic, fie a virionului în întregime. Este un proces activ propriu nu numai virusurilor ci şi oricăror altor particule care sunt fagocitate. Acest fenomen, în cazul de faţă este denumit viropexie.

Eclipsa, intervine în cursul replicării tuturor virusurilor şi constă în asimilarea sau recepţionarea mesajului genetic viral, urmată de sintezele menite să asigure replicarea.

Maturarea, reprezintă asamblarea componentelor virale sintetizate de celula gazdă în vederea eliberării virionului complet. De obicei acest proces are loc în citoplasma celulei gazdă.

Eliberarea virusului are loc după ce acesta a fost dotat cu toate componentele sale morfofuncţionale.

La unele virusuri eliberarea se produce spontan, periodic sau continuu, fără distrugerea celulei gazdă, în timp ce la alte virusuri are loc liza celulară cu punerea în libertate, în mediul extracelular, a întregii cantităţi de material viral dintr-o dată.

59

Prionii

Termenul de "prion" (semnificând o "proteină infecţioasă") a fost introdus în biologia moleculară de Stanley Prusiner de la Universitatea din San Francisco, în 1982. Prionii (cunoscuţi anterior sub numele de protovirine, virinos, virusuri latente) reprezintă o clasă de agenţi infecţioşi subvirali, cu greutatea moleculară de 27.000-30.000, unici în felul lor, fiind rezistenţi la toate procesele de inactivare care degradează acizii nucleici (căldura, razele UV, radiaţiile ionizante).

Prionii rămân o enigmă, "o perplexitate" a biologiei moleculare, deoarece admiterea existenţei lor drept agenţi infecţioşi, lipsiţi de acid nucleic şi formaţi exclusiv din proteine, ar pleda pentru dărâmarea dogmei centrale a biologiei moleculare, prin acceptarea unei codificări şi multiplicări a acestei proteine prionice infecţioase, nu prin intermediul acidului nucleic din structura agentului prionic respectiv, ci prin intermediul acidului nucleic al celulei-gazdă. Proteinele prionice există, în mod normal, în absolut toate celulele mamiferelor, participând la structura membranelor celulare.

Forma normală a proteinelor prionice este cunoscută în literatură sub denumirea PrPc (proteina prionică celulară), dar rolul său fiziologic nu este, încă, bine stabilit. Forma infecţioasă a acestei structuri este notată PrPsc (prescurtarea sc provine de la termenul scrapie, aceasta fiind boala prionică a oilor). Din motive mai mult sau mai puţin cunoscute, se pare ca moleculele proteice prionice normale (PrPc) au capacitatea de a se plia şi de a polimeriza (sub acţiunea foldazelor celulare), generând structuri anormale, amiloidice care se acumulează masiv în sistemul nervos central. Bolile prionice sunt considerate astăzi "pseudoinfectioase" în comparaţie cu bolile infecţioase clasice, ai căror agenţi etiologici sunt microorganismele (virusuri, bacterii) care conţin în structura lor acid nucleic. Caracteristicile principale ale bolilor prionice sunt următoarele: - afectează sistemul nervos central, producând encefalopatii spongiforme; - au o perioadă foarte lungă de incubaţie: de la câteva luni până la 37-40 de ani; -au o evoluţie lentă, progresivă, totdeauna letală. Până astăzi au fost descrise 12 boli prionice: şase la animale şi şase la om. Dintre acestea, cel mai bine studiate sunt scrapia la animale şi boala Creutzfeldt-Jakob (CJD) la om. Celelalte zece boli prezintă similarităţi de ordin clinic, anatomopatologic şi histochimic cu aspectele din scrapie.În prezent, se admit trei posibilităţi de producere a bolilor prionice:infecţia lentă, infecţia sporadică şi alterarea genetică.

Caracteristicile prionilor. Absenţa ADN-ului în structura prionilor.În încercările de purificare a prionilor, prin electroforeză în gel-sarcosil şi sedimentare în gradient discontinuu de sucroză, s-a obţinut numai izolarea unei proteine (sialoglicoproteina) cu greutatea moleculară de 27.000-30.000 D, dar nici un acid nucleic.De asemenea, investigaţiile radiobiologice au arătat ca agentul scrapiei nu posedă acid nucleic şi este foarte rezistent la toţi factorii fizico-chimici şi la toate procedurile de inactivare eficiente pe acizi nucleici. Această extremă rezistenţă a agentului scrapie la procedurile de inactivare a acizilor nucleici reprezintă un argument în plus

60

pentru faptul ca structura prionilor este diferită de cea a virusurilor şi viroizilor (ARN gol, fără manta proteică) sau pentru posibilitatea că genomul presupus al agentului scrapiei să fie un acid nucleic criptic (neobişnuit), aflat într-un înveliş gros de proteină care ar impiedica penetrarea acţiunii nucleazelor până la acidul nucleic. În 1991, s-a arătat că, dacă acest acid nucleic există, el este foarte mic şi conţine mai puţin de 100 de nucleotide. Deci, dacă în agentul scrapie şi agentii prionici înrudiţi există totuşi un acid nucleic, acesta este foarte mic şi foarte bine protejat de o carcasă proteică împotriva razelor UV; acest acid nucleic nu este implicat în infectivitate, ci doar proteina s-a dovedit a fi asociată cu infectivitatea.

Structura exclusivproteică a prionilor După cum s-a arătat, în ţesutul cerebral al animalelor cu infecţie prionică apar plăci de amiloid şi fibrile amiloide. Amiloidul reprezintă un derivat dintr-o glicoproteină celulară normală (PrP°), care se gaseşte în mod normal pe membrana celulei neuronale. Se ştie astăzi că în cursul infecţiei prionice se produce conversia unei cantităţi mari de proteină PrPc (prin modificări posttranslaţionale) în PrPsc (izoforma anormală a PrPc). Aceasta PrPsc reprezintă tocmai SAF (proteina înalt infecţioasă). PrPc si PrPsc au aceeaşi greutate moleculară (33-35 kDa), dar Prpc poate fi complet catabolizata in vitro de proteinaza K, în timp ce PrPsc este rezistentă (este doar parţial catabolizată), lăsând un miez rezistent la proteinaza K; acest miez este reprezentat de PrP 27-30kDa (greutate moleculară de 30 kDa). PrPsc are o abilitate foarte mare de a determina modificări posttranslaţionale ale propriei molecule şi de a forma amiloid, fapt ce are consecinţe asupra replicării, transmisibilităţii şi neuropatogeniei bolii. Fibrilele de amiloid reprezintă produse de degradare (de rupere) a PrPsc infecţioase. Modificările post-translaţionale care contribuie la transformarea PrPc în PrPsc au fost considerate un timp a fi doar modificări conformaţionale de împăturire. PrPsc este derivată din PrPc în urma unor procese post-translaţionale Proteina normală PrPc are o structură primară formată din 254 aminoacizi; în condiţii normale, devine funcţională abia după un număr de modificări post-translaţionale de ordin chimic şi conformaţional.

Modificări chimice ale proteinei PrPc În literatura de specialitate au fost descrise câteva modificări, şi anume: - clivarea peptidului semnal N-terminal (cu 22 de aminoacizi); - modificarea reziduului de arginina la nivelul codonului 25; - glicozilarea oligozaharidelor linkate de asparagina la nivelul codonilor 181 si 198; - formarea unui inel cu o legatură disulfidică prin care se unesc două re ziduuri de cisteina de la nivelul codonilor 179 şi respectiv 214;- îndepărtarea peptidului hidrofob C-terminal (cu 20 de aminoacizi) şi fixarea, în schimb, a unui glicozilfosfatidilinozitol.

Noţiuni de Imunologie

Imunitatea naturală

61

Reprezintă starea de rezistenţă faţă de diferiţi factori nocivi “non self” de natură infecţioasă realizată de organism prin structurile şi funcţiile lui normale. În coferirea acestui tip de imunitate intervin mijloace şi mecanisme diferite, unele opunându-se pasiv penetraţiei germenilor (pielea, mucoasele), altele activ (factorii umorali).

Factorii pasivi ai imunităţii naturale includ barierele naturale de protecţie ale organismului, şi anume:

-barierele morfo-structurale reprezentate de piele şi mucoase;

-barierele funcţionale, reprezentate de traiectul sinuos al căilor respiratorii anterioare, mucusul care acoperă epiteliile căilor respiratorii, cilii celulelor traheo-bronhice. În această categorie de bariere care se opun pătrunderii diferiţilor factori străini de organism, se mai încadrează şi debarasarea mecanică, prin secreţii, ale epiteliilor uretrei, ureterelor, conjunctivei, canaliculelor biliare şi altele;

- barierele acide, reprezentate de aciditatea sucului gastric, aciditatea pielii, a mucusului vaginal, aciditatea urinei etc.

Factorii activi ai imunităţii naturale sunt reprezentaţi de:

- factorii umorali, care includ alexina (complementul), properdina, lizozimul, leukinele, plakinele, spermina, beta-lizina, opsonina, anticorpii naturali diverşi;

- factorii celulari, din care fac parte microfagele (leucocitele polimorfonucleare, mai ales cele neutrofile), macrofagele mobile (histiocitul, monocitul) şi macrofagele fixe (celulele Kuppfer, macrofagele, osteoclastele,celulele nevroglice).

Eficienţa factorilor de apărare naturală este dependentă de integritatea anatomică şi funcţională a organismului, mai ales a unor sisteme şi organe cu rol important în procesele de apărare (SRH, SNC, glande endocrine). Integritatea acestora este dependentă de unele condiţii de viaţă şi de mediu (alimentaţie, igienă,condiţii climatice).

Imunitatea genetică este conferită de anumite caracteristici morfo-funcţionale ale organismului, fiind asigurată de factorii naturali de apărare, ca şi imunitatea naturală. Aceasta conferă rezistenţă la un anumit germen patogen şi îmbracă forme de manifestare caracteristice unei imunităţi specifice.

Imunitatea dobândităReprezintă o stare de rezistenţă şi apărare strict specifică, pe care

organismele o câştigă fie în urma unui conflict direct cu germenii sau cu toxinele lor, fie ca urmare a transferului de anticorpi (imunoglobuline) de la un organism imun. Conflictele organismului cu antigenii induc restructurări imunologice exprimate prin:

-sinteză de anticorpi;-activarea şi formarea unor populaţii de limfocite “competente” să respingă

“non self-ul”.

În raport cu natura acestor factori de apărare imunologică, imunitatea dobândită are un caracter de imunitate umorală şi celulară. Competenţa de a dezvolta un răspuns imun se manifestă cel mai devreme la câteva zile după naştere, însă la cele mai multe specii, la câteva săptămâni. Organele şi celulele imunocompetente, precum şi mecanismele imunitare se dezvoltă în ultima perioadă

62

a embriogenezei, desăvârşindu-se la scurt timp după naştere, când organismele ating pragul maturităţii lor imunologice. Antigenele sunt complexe macromoleculare capabile să inducă în organism restructurări imunologice şi sinteza de anticorpi. Au două componente în structura lor, şi anume o componentă cu moleculă mare, de natură proteică, relativ stabilă, cu rol de suport coloidal şi una sau mai multe componente, cu greutate moleculară mică, de natură proteică sau polizaharidică, legate la suprafaţă de suportul coloidal, cu rol de grupări determinante, care asigură valenţele şi specificitatea funcţională.

Anticorpii aparţin grupei gamaglobulinelor serice, au o configuraţie spaţială cilindrică, cu patru lanţuri polipeptidice pliate şi legate prin punţi disulfidice cu două lanţuri cu greutate moleculară mare şi două cu greutate moleculară mică. Există mai multe clase de imunoglobuline (Ig): IgG (are concentraţii ridicate în serul sangvin la mamifere şi păsări), IgM (o moleculă gigant care participă la răspunsul imun primar), IgA (secretată la nivelul unor suprafeţe ale mucoaselor), IgD (sintetizată în tonsile, unii ganglioni limfatici, mai rar în splină şi mucoasa intestinală), IgE (reprezintă anticorpii reaginici ,aglutinează globulele roşii învelite cu antigen, sunt implicate în realizarea fenomenului de anafilaxie pasivă cutanată, creşte semnificativ în infestaţiile parazitare).

Apărarea de tip celular

Factorii celulari sunt deosebit de importanţi în procesele de apărare ale organismului împotriva infecţiilor. Aceştia intervin în procesele de apărare prin fagocitoză şi pinocitoză, după care are loc eliberarea de enzime litice, care vor contribui la distrugerea microorganismelor. În realizarea fagocitozei intervin celule cu proprietăţi de captare, înglobare şi digerare a germenilor. Acestea sunt reprezentate mai ales de granulocite neutrofile, macrofage şi mastocite.

Neutrofilele. Sunt celule fagocitare care devin active în timpul unei infecţii, de regulă bacteriene. Mobilizarea neutrofilelor (chemotaxisul) este iniţiată de substanţe cu proprietăţi chemotactice (C5a, IL-8). Iniţial, netrofilele aderă la nivelul celulelor endoteliale vasculare, de unde, prin diapedeză, ajung în focarul infecţios şi emit pseudopode în direcţia concentraţiei maxime a agenţilor chemotactici. După aceasta bacteria va fi înconjurată, fiind închisă în fagozomul intracelular. Fagozomul va fuziona cu lizozomii, care conţin enzime proteolitice multiple, formând fagolizozomul. În fagolizozom bacteria va fi omorâtă. Neutrofilele rămân în circulaţie, în mod normal, aproximativ 12 ore, după care trec în ţesuturi, unde stau cantonate timp de două, până la patru zile, fiind apoi înlocuite. Această populaţie de celule se caracterizează printr-o capacitate deosebită de a se deplasa, o aderenţă la suprafaţă şi un bogat echipament enzimatic lizozomal.

Macofagele. Sunt celule mononucleare mari (50-200 μ), cu nucleu reniform, cu 1-2 nucleoli şi cu cromatina dispusă sub formă de aglomerări periferice. Citoplasma este de culoare cenuşie, cu granule mari, numeroşi lizozomi şi vezicule endocitare. Macrofagele au un rol hotărâtor în procesul de eliminare a germenilor din circulaţie.

Din sângele care trece prin ficat sunt filtrate şi eliminate (“immune - clearance”) particulele încărcate cu anticorpi şi complement. Înafară de fagocitoză, macrofagele au o funcţie hotărâtoare în derularea răspunsului imun, prin prezentarea antigenului celulelor imunocompetente şi producerea de mediatori imuni, mai ales de interleukină-1.

63

Macrofagele sintetizează o serie de proteine, metaboliţi ai acidului arahidonic şi radicali de oxigen. Sunt capabile şi de fenomene de distrugere extracelulară, care se realizează în dependenţă cu anticorpii şi care poartă denumirea de ADCC (antibody - dependent cellular citotoxicity). Această distrugere are loc, probabil prin eliberarea de substanţe litice, fără ca mecanismul să fie pe deplin lămurit. După rolul pe care îl au în procesul de apărare imună, macrofagele se grupează în două categorii: mobile şi fixe.

Macrofagele mobile (libere) au suprafaţa membranei ondulată, cu microvili, capacitate de aderenţă la sticlă şi posibilitate de a realiza funcţia de pinocitoză şi fagocitoză imună.

Macrofagele fixe sunt reprezentate de histiocitele ţesutului conjunctiv, celulele sinusoidale din splină, măduvă osoasă, limfonoduri, ficat, celulele adventiţiale ale capilarelor sanguine. Suprafaţa membranei prezintă microvili, nu posedă capacitate de aderenţă la sticlă, sunt capabile de fagocitoză şi pinocitoză. Pot emite nişte prelungiri citoplasmatice, care ajung la distanţe foarte mari faţă de corpul celular. Prin tehnici de microscopie electronică s-au putut evidenţia aceste prelungiri, aflate în continuă mişcare, care se întindeau până ajungeau în contact cu o particulă de fagocitat.Macrofagele au o durată de viaţă de câteva luni sau ani, spre deosebire de neutrofile, care trăiesc în ţesuturi numai câteva zile. Macrofagele ajung la focarul inflamator mai târziu, pot fagocita atât microorganisme rezistente la fagocitoză prin neutrofile, cât şi resturile celulare distruse. Funcţia lor majoră este fagocitoza, digestia şi omorârea microorganismelor, proces care se desfăşoară cu păstrarea determinanţilor antigenici.

Mastocitele. Sunt celule mononucleare ovoide sau alungite, cu un diametru de 20 – 40 μm , cu granule mari care maschează nucleul şi cu un reticul endoplasmatic rugos, cu numeroase mitocondrii, filamente submembranare şi granule metacromatice dense. Fiecare celulă are între 100000 şi 500000 receptori de membrană pentru moleculele de IgE de natură glicoproteică. Acestea se găsesc din abundenţă la nivelul pielii (10000 / mm3 de ţesut), în timus, ţesut limfoid, vezica urinară, dar şi pe traiectul căilor respiratorii şi digestive.

Mastocitele participă la o serie întreagă de procese patologice, mai ales la cele alergice. Deşi sunt capabile de mişcări ameboidale şi de fagocitoză, funcţia lor esenţială este aceea de eliberare de mediatori chimici, cu rol în declanşarea unor procese inflamatorii sau de hipersensibilitate. Mastocitele sunt primele celule care stimulează afluxul polimorfonuclearelor şi monocitelor la locul inflamaţiei. Consecutiv diverşilor stimuli, ele eliberează o serie de mediatori solubili, care intervin mai ales în şocul anafilactic. Un component important al granulelor secretorii ale acestor celule este reprezentat de “proteoglicani”, responsabili de colorarea metacromatică a acestor celule.

Apărarea de tip umoral

Factorii umorali care au rol important în imunitatea naturală se găsesc în sânge, limfă, lichid articular, lichid meningeal şi în diferite secreţii (lapte, salivă, lacrimi etc).

Complementul sau alexina este un sistem de factori cu funcţii biologice complexe, care se găsesc în concentraţie relativ constantă în serul normal al tuturor speciilor de mamifere. Serul de cobai are un conţinut foarte ridicat de complement,

64

motiv pentru care, această specie reprezintă pentru multe laboratoare, sursa principală de complement.

Complementul se mai găseşte, în proporţii reduse, şi în alte umori, ca lichidul pleural şi cel peritoneal. Complementul este sintetizat încă din timpul dezvoltării embrionare, de diverse celule şi ţesuturi din organism. Organismul conţine la naştere aproximativ jumătate din concentraţia serică de complement a individului adult. După primele trei luni de viaţă, concentraţia serică de complement atinge nivelurile întâlnite la adultul normal. Componentele complementului se găsesc în ser în stare inactivă, fiind activate secvenţial, pe cale enzimatică, printr-o reacţie în cascadă. Complementul apare în umori la scurt timp după fătare (5-7 săptămâni la şobolan, 3-4 săptămâni la porc). Titrul substanţei se va dubla în cursul primelor trei săptămâni de la fătare, apoi se menţine relativ constant tot timpul vieţii. Imunizarea sau hiperimunizarea nu afectează în nici un fel titrul complementului. Stimulii antigenici şi gradul de activare a componentelor celulare ale sistemului imun nu influenţează nivelul seric al componentelor complementului. Acesta poate fi influenţat de carenţele alimentare, mai ales de cele proteice şi de specia animalului.

Sistemul complement reprezintă mediatorul umoral principal în cadrul procesului inflamator, cu efect de opsonizare a microorganismelor şi complexelor imune, de activare a fagocitelor (macrofage, neutrofile) şi de liză a celulelor ţintă.

Lizozimul (N – acetil – muramil - hidrolaza) este o carbohidrază care desface legăturile glicozidice (1 - 4) dintre acidul N – acetil - muramic şi N – acetil - glucozamină, elemente care intră în componenţa peptidoglicanului din structura peretelui bacterian. Distrugerea mureinei produce dezechilibre ale presiunii osmotice dintre interiorul şi exteriorul celulei, care în acest mod va fi distrusă. La valoarea 7 a pH-ului exercită o acţiune litică asupra unor bacterii saprofite şi patogene, mai ales asupra celor Gram pozitive. Contribuie la fixarea complementului şi facilitează fagocitoza.

Lizozimul este produs de către macrofage şi este prezent în aproape toate ţesuturile şi fluidele organismului (lacrimi, salivă, secreţia nazală, lapte, ser, lichid peritoneal, leucocite). Nu se găseşte în urină, lichid cefalorahidian, transpiraţie, umoare apoasă, fecale.

Datorită acţiunii sale litice, lizozimul protejează mucoasele (nazală, bucală, conjunctivală) şi corneea împotriva acţiunii bacteriilor. Lizozimul acţionează mai eficient asupra bacteriilor din următoarele genuri: Micrococcus, Bacillus, precum şi formele R ale bacteriilor. Specia Micrococcus lysodeicticus este utilizată în laboratoare ca germen test pentru determinarea concentraţiei lizozimului, fiind foarte sensibil la acţiunea enzimei (indicator de liză). Faţă de această bacterie s-au stabilit următoarele valori ale concentraţiei lizozimului: lichid ascitic 1 / 8, mucus nazal 1 / 13000, lacrimi 1 / 40000, albuş de ou 1 / 80000. Lizozimul nu se găseşte în laptele de vacă, ceea ce explică rezistenţa mai scăzută la diferite infecţii a copiilor sugari hrăniţi numai cu lapte de vacă.

Properdina este o gamaglobulină bazică, cu o greutate moleculară de 184000 daltoni şi migrare electroforetică asemănătoare cu α2 - macroglobulina. În structura sa are cinci subunităţi identice (A, B, D, E şi P) legate necovalent.

Subunităţile se recombină pentru a forma dimeri care păstrează în parte proprietăţile antigenice şi biologice ale moleculei native.Concentraţia properdinei în ser este foarte mică (15 - 20 mg / ml) şi diferă cu specia. În ser, properdina se găseşte sub formă inactivă, iar trecerea la forma activă se face printr-o modificare conformaţională. Acţionează sinergic cu complementul, în prezenţa ionilor de Mg++. Properdina are unele asemănări cu polizaharidele bacteriene, cu inulina şi cu

65

zimozanul (polizaharid extras din drojdia de bere). Se poate combina cu zimozanul, sau cu inulina la 37oC, formând un complex numit properdină B, care are rol în activarea componentei C3 a complementului. În organism, activitatea properdinei este dificil de separat de aceea a complementului.

Properdina are efect antibacterian faţă de numeroşi germeni, mai ales faţă de cei Gram negativi, are o anumită activitate antivirală (bacteriofagi), acţiune anticanceroasă, intervenind şi în liza eritrocitelor în cazul anumitor stări patologice. Cantitatea de properdină, sau titrul properdinic, creşte în urma administrării de doze mici de endotoxine sau de zimozan şi scade în formele avansate ale bolii canceroase. Concentraţia properdinei poate reprezenta, ca şi în cazul lizozimului, un parametru care oglindeşte nivelul reactivităţii imunologice naturale.

Betalizina este o proteină cationică, termostabilă, cu o capacitate deosebită de reacţie împotriva bacteriilor Gram pozitive, cu excepţia streptococilor. Se găseşte în cantitate redusă în serul uman normal. Se înregistrează creşteri cantitative ale betalizinei pe perioada fazelor acute ale infecţiilor şi altor boli inflamatorii. În concentraţie mai mare se găseşte la şobolani, iepuri, cai şi bovine. Se eliberează din trombocite în timpul coagulării sângelui şi are efect distructiv asupra membranelor celulare. În prezenţa anticorpilor, a complementului şi a lizozimului, betalizina s-a dovedit activă şi asupra bacteriilor Gram negative. A fost demonstrat efectul litic intens al betalizinei faţă de Bacillus anthracis, B. subtilis, Staphylococcus sp. şi faţă de alţi germeni.

Interferonii reprezintă un grup de proteine (glicoproteine) heterogene, cu greutate moleculară mică, neînrudite între ele, cu efecte antivirale recunoscute, acţiune antitumorală şi acţiune imunoreglatoare. Se cunosc cinci tipuri de interferon (IFN), dintre care interferonul alfa şi beta sunt citokine produse de monocite, celule natural ucigaşe şi unele populaţii de leucocite (IFN-α), respectiv de fibroblaste (IFN-β). Interferonul gamma este o limfokină, fiind elaborată de limfocitele T în urma acţiunii unor mutagene sau antigene diverse.

Cel mai important efect cunoscut al interferonului, activitatea antivirală, este exprimat prin blocarea transmiterii infecţiei virale la celulele care au ataşată de membrana lor, molecula de interferon. Activitatea antitumorală a interferonilor se realizează prin activarea celulelor care intervin în răspunsul imun, precum şi prin inhibarea procesului de diviziune celulară şi implicit a proliferării celulelor. Procesul de reglare a răspunsului imun se realizează pe parcursul a diferite etape, sub influenţa mai multor factori, atât in vivo, cât şi in vitro.

Proteinele de fază acută se găsesc în circulaţia sangvină, fiind secretate în urma acţiunii unor factori patogeni care sunt implicaţi în infecţii, neoplazii şi diverse traumatisme urmate de procese inflamatorii şi necroze. Dintre aceste tipuri de proteine cele mai importante sunt: proteina C-reactivă, α2 macroglobulina, antiproteinaze, amiloidul A. Acestea sunt elaborate de hepatocite, în urma unor modificări ale transcripţiei genelor induse de citokine (factorul de necroză tumorală-TNF-α, IL-1). Funcţiile acestor proteine sunt insuficient cunoscute, însă se admite faptul că ele acţionează diferenţiat în cadrul mecanismelor de imunităţii înnăscute. Se cunoaşte faptul că aceste proteine asigură protecţia tisulară în traumatisme, amplifică procesul de coagulare şi stimulează fagocitarea bacteriilor.

Opsonina este un component seric capabil să se lege specific de suprafaţa moleculelor sau celulelor care urmează să fie captate prin endocitoză. Factorii termolabili (complementul) sau relativ termostabili (IgG) pot fi prezenţi în mod natural în ser, ca “anticorpi naturali”, cu rol opsonizant. Procesul de legare a opsoninei de

66

antigenele solubile sau de particule poartă denumirea de opsonizare. Fagocitoza majorităţii tipurilor de particule necesită opsonizarea lor prealabilă.

Spermina este un factor bactericid prezent în lichidul seminal şi în ţesutul renal. Din punct de vedere chimic este o poliamină cu efect inhibant asupra diferitelor specii de stafilococi, neisserii, bacili ai tuberculozei. Prezenţa moleculelor de zinc îi sporeşte activitatea.

Răspunsul imun adaptativ (dobândit, specific, artificial)

Răspunsul imun adaptativ reprezintă componenta sistemului imun capabilă să recunoască specific şi să elimine selectiv macromoleculele şi microorganismele străine. Această specificitate este rezultatul diversităţii înscrise în programul genetic, care echipează sistemul imun cu o varietate mare de molecule receptoare şi efectoare, capabile să recunoască “self-ul”.

Răspunsul imun dobândit se adaptează în funcţie de caracterele agentului etiologic şi este specific, adică mecanismele de apărare acţionează în mod diferit, cu mare exactitate, în funcţie de fiecare agent etiologic. Acest tip de imunitate este exprimată la intensitate maximă în cazul animalelor adulte şi este parţial deficitară, în mod fiziologic, la animalele tinere şi bătrâne. Reacţia imună este concentrată împotriva structurilor străine, care poartă denumirea de antigene. Acestea pot fi exogene sau endogene, pot avea structuri moleculare diferite, însă au o caracteristică fundamentală şi anume, capacitatea de a activa sistemul imun şi de a interacţiona specific cu acesta.

Mecanismele acestui tip de imunitate se amplifică în urma unui prim contact cu un agent etiologic, astfel încât, la contactul ulterior, mecanismele specifice sunt mult eficiente. Acest lucru se datorează faptului că, în urma primului contact se formează celule care deţin “memorie imunologică”. În dinamica proceselor imune intervin fenomene de activare complexă a unei serii de mecanisme de recunoaştere, de iniţiere a proceselor intrare în acţiune şi a celor efectoare, foarte bine reglate, în vederea anihilării acţiunii antigenului, fără a periclita structurile organice proprii.

La realizarea acestui tip de răspuns imun participă celule imune specializate, limfocitele B, T şi NK, împreună cu celulele prezentatoare de antigen, profesionale sau ocazionale. În acest caz pot fi amintite structurile macromoleculare implicate în recunoaştere (receptorii limfocitelor B şi T, macromoleculele CMH), în activare (diferiţi markeri de suprafaţă şi molecule de adeziune) şi în eliminarea antigenelor (imunoglobuline, perforine).

Organele limfoide primare

La mamifere, sunt reprezentate de măduva osoasă, timusul, ficatul embrionar şi la păsări de bursa lui Fabricius. În aceste organe se formează celulele implicate în formarea răspunsului imun, se dezvoltă şi ajung la maturitate, când îşi câştigă competenţa imunologică.

Măduva osoasă este un organ central (primar) implicat în ontogeneza celulelor care participă la formarea răspunsului imun, precum şi a altor celule. Este

67

prezentă şi funcţională din punct de vedere anatomic la nivelul oaselor animalelor tinere (hematoformatoare) şi numai la nivelul oaselor plate (stern, vertebre, osul iliac, coaste) la animalele adulte. Este dispusă în spaţiile oaselor spongioase, fiind formată din ţesut conjunctiv reticular, bogat vascularizat. În măduva osoasă se găsesc celule reticulare, macrofage şi celule adipoase. Principala funcţie a sa constă în formarea şi maturarea celulelor aparţinând mai multor linii, având ca punct de plecare celula suşă pluripotentă. Aceste linii celulare sunt reprezentate de:

linia granulocitară (leucocitele polimorfonucleare); linia eritroidă (din care derivă eritrocitele); linia megakariocitară (trombocitele); linia monocitară (monocitele, macrofagele); linia limfoidă (limfocitele).

O clasificare alternativă include o linie comună mieloidă, din care se formează atât granulocitele, cât şi monocitele - macrofagele. Limfocitele T îşi definitivează procesul de maturare în timus. Limfocitele B se maturează la mamifere în măduva osoasă, iar la păsări în bursa lui Fabricius. Procesul de diferenţiere şi maturare a celulelor în măduva osoasă este stimulat de unele citokine (CSF-factori de stimulare a coloniilor celulare, interleukina-3, interleukina-7, interleukina-9, interleukina-11 etc). Principalele imunodeficite primare implică disfuncţii ale diferenţierii celulare la nivelul măduvei osoase.

Timusul este un organ central (primar), în care are loc formarea limfocitelor T, este alcătuit din lobuli, despărţiţi prin septuri de ţesut conjunctiv, constituiţi la rândul lor dintr-o zonă corticală exterioară şi o zonă medulară interioară. Zona corticală este bogată în celule limfoide tinere (timocite), iar zona medulară în celule epiteliale, cu rol în procesul de diferenţiere şi evoluţie a timocitelor spre celule funcţionale. În reţeaua epitelială din zona medulară se găsesc celule bogate în antigene de clasa II MCH (limfocite B, limfocite T activate, macrofage - monocite, celulele epiteliului timic, celule dendritice, celule Langerhans) care “învaţă” precursorii limfocitari să deosebească “propriu” şi “străin”. Tot aici există şi corpusculii Hassal, bogaţi în celule epiteliale degenerate. Limfocitele “educate” în timus reprezintă clasa celulelor T-dependente sau limfocitele T, care au un rol major în procesul de apărare imună. Din punct de vedere al poziţiei anatomice, timusul se găseşte în porţiunea anterioară a cavităţii toracice, în apropierea sternului, fiind primul organ limfoid care apare în embriogeneză. Există trei tipuri de timus:

toracal, la carnivore şi om; cervico-toracal, la suine, rumegătoare, ecvine; cervical la cobai şi păsări.

Timusul creşte la om până la vârsta de 15 ani, la şoarece până la 2 luni, iar la bovine până la pubertate, după care involuează însă nu dispare complet, menţinându-şi funcţiile secretorii. Timectomia neonatală alterează răspunsul faţă de antigenele timodependente, dar nu şi faţă de cele timoindependente. Atimia congenitală se soldează cu grave alterări imune, incompatibile cu viaţa. Animalele atimice postnatal nu pot dezvolta reacţii de rejecţie de grefă, nu pot forma anticorpi faţă de antigenele timodependente, scad în greutate, prezintă diaree profuză şi fac infecţii severe cu germeni condiţionat patogeni. Sub influenţa hormonilor de creştere şi a celor tiroidieni timusul creşte în greutate, iar sub influenţa vârstei, hormonilor sexuali, a glucocorticoizilor etc timusul scade în greutate. Timusul este implicat în desfăşurarea unor fenomene patologice ale sistemului imun, mai ales în imunodeficitele celulare primare şi secundare, caracterizate prin perturbarea sau chiar anularea mecanismelor răspunsului imun mediat celular.

68

Bursa lui Fabricius este un organ central (primar) care se găseşte la păsări şi se dezvoltă atât în timpul perioadei embrionare, cât şi după ecloziune, după care involuează. Reprezintă o piesă modificată a intestinului, se află lângă cloacă şi este alcătuit din pliuri, direcţionate spre lumenul intestinal. Apare la embrioni de găină, în ziua 20 de incubaţie. În structura sa se evidenţiază o zonă corticală şi o zonă medulară. În bursă are loc procesul de instruire a unei clase de limfocite, care vor răspunde la stimuli antigenici prin sinteza de anticorpi, clasă denumită “B”. Bursectomia atrage după sine incapacitatea organismului de a sintetiza anticorpi (imunitate mediată umoral). La mamifere echivalentul bursal este reprezentat de măduva osoasă (adulţi) şi ficatul embrionar (fetus). În cadrul patologiei sistemului imun bursa Fabricius este implicată în imunodeficitele caracterizate prin disfuncţii ale limfocitelor B. În bursita infecţioasă aviară, produsă de un Birnavirus, se înregistrează modificări morfologice ale bursei şi reducerea semnificativă a mecanismelor răspunsului imun mediat prin anticorpi.

Ficatul embrionar este, în etapele timpurii ale dezvoltării embriofetale, furnizor de celule suşă multipotente pentru toate elementele figurate ale sângelui. Unii autori consideră că ficatul embrionar ar juca rol în ontogeneza limfocitelor B. Rolul ficatului embrionar este ulterior preluat de măduva osoasă.

Organele limfoide secundare

Splina este un organ periferic (secundar) în care se desfăşoară procese majore ale răspunsului imun mediat celular şi prin anticorpi, împreună cu alte funcţii importante, cum ar fi fagocitoza unor structuri străine, eliminarea celulelor sanguine îmbătrânite şi depozitarea trombocitelor. Se găseşte în porţiunea laterală a abdomenului, lângă stomac şi diafragmă. Are o capsulă de colagen, cu fibre de muşchi netezi şi ţesut conjunctiv care pătrund în parenchim ca nişte travee, rezultând o reţea reticulară ce formează suportul pentru celulele care o populează.

Parenchimul splenic este alcătuit din pulpa roşie, cu corzi mărginite de macrofage, unde sunt distruse eritrocitele şi pulpa albă, bogată în ţesut limfoid, dispuse ca nişte manşoane în jurul unei arteriole centrale, cu macrofage şi limfocite T periarteriolar (aria timodependentă) şi limfocite B, dispuse periferic, formând nodulii limfatici (foliculii splenici sau corpusculii Malpighi). În pulpa albă se găsesc centrii germinativi, bogaţi în macrofage şi celule dendritice, cu zone periferice B dependente. În ariile T şi B, sunt “zone marginale”, la nivelul cărora se găsesc macrofage specializate, care împreună cu celulele dendritice prezintă antigenul limfocitelor B, precum şi plasmoblaşti şi plasmocite. Plasmocitele trec în pulpa roşie fornată din sinusuri tapetate de macrofage, din limfocite plasmocite etc.

Splina este organul major implicat în răspunsul imun faţă de antigenele transportate prin circulaţia sangvină. Mecanismele răspunsului imun care evoluează în acest organ sunt afectate în imunodeficite şi unele boli microbiene.

Limfonodurile reprezintă un sistem de formaţiuni anatomice periferice (secundare) în care se realizează principalele mecanisme ale răspunsului imun. Sunt situate în cadrul sistemului limfatic şi constituie situsurile în care se acumulează antigenele transportate de la locurile de intrare ale acestora, prin vasele limfatice.

La exterior, limfonodurile prezintă o capsulă fibroasă prin care pătrund vasele limfatice, de unde limfa ajunge în sinusul subcapsular. În alcătuirea lor intră: corticala, la exterior, în care se află foliculii limfoizi, cu centri germinativi în porţiunea centrală şi zone manta, la periferie (foliculii lipsiţi de centri germinativi se numesc

69

primari, iar cei cu centri germinativi se numesc secundari); medulara, în interior, conţine un număr mai mic de limfocite şi macrofage. Limfa care pătrunde în sinusul subcapsular circulă prin corticală şi medulară, părăsind limfonodurile printr-un vas eferent situat în hil.

Limfonodurile au o circulaţie sangvină constituită din vase aferente şi eferente. Foliculii sunt formaţiuni care conţin celule B. În centrii germinativi, celulele B stimulate proliferează şi se diferenţiază în plasmocite care sintetizează anticorpi. La nivelul acestor centri se găsesc celule prezentatoare de antigen – celule dendritice foliculare. Plasmocitele mature migrează în afara limfonodurilor, populând diverse ţesuturi.

Limfocitele T se găsesc mai ales în ariile parafoliculare din structura corticalei. Celulele T nestimulate (virgine) pătrund în limfonoduri prin vasele limfatice sau prin venule cu endoteliu înalt. Celulele dendritice interdigitate şi alte celule accesorii din aceste zone prezintă antigenele limfocitelor T. În limfonoduri se desfăşoară procesele de apărare faţă de antigene exogene, de diverse origini. În imunodeficite sunt afectate mecanismele răspunsului imun care se desfăşoară în aceste organe.

Sistemul imun al mucoaselor

Epiteliul mucos reprezintă o barieră care delimitează mediul intern de cel extern şi este o primă linie importantă de apărare. Este denumit şi ţesut limfoid asociat la mucoase (MALT – mucosal associated lymphoid tissue), fiind reprezentat de totalitatea celulelor care participă la realizarea răspunsului imun faţă de diverse antigene. Se găseşte la nivelul unor mucoase: digestivă, respiratorie, genitală etc. Sistemul de tip MALT cel mai important se găseşte la nivelul mucoasei digestive şi este bine reprezentat în lamina propria (stratul mucos situat sub membrana bazală a epiteliului digestiv), plăcile Peyer (plăcile limfoide din ileon) şi în stratul epitelial.

Limfocitele sunt celulele implicate în răspunsul imun din tractul gastrointestinal. Limfocitele intraepiteliale sunt mai ales celule T, predominând cele citotoxice-supresoare (CD8+), care sunt specializate în recunoaşterea antigenelor prezente în tractusul gastrointestinal.

Limfocitele din lamina propria sunt majoritatea celule Th (CD4+), fiind dominante cele activate. Se mai găsesc limfocite B, plasmocite, macrofage, eozinofile şi mastocite. Formaţiuni similare plăcilor Peyer din intestinul subţire sunt prezente în apendice, în alte segmente ale tractusului gastrointestinal şi aparatul respirator. În centrul plăcilor sunt foliculi şi centri germinativi, cu numeroase limfocite B. Regiunile interfoliculare conţin celule Th. La suprafaţă se găsesc celule M (membranare), cu proprietăţi pinocitare şi cu rolul de transportori ai moleculelor antigenice din lumenul intestinal în ţesuturile subepiteliale.

Toate componentele MALT sunt conectate între ele, cu limfonodurile regionale şi cu circulaţia sistemică. Un rol important în apărarea mucoaselor împotriva unor agenţi patogeni îl au anticorpii din cadrul izotipului IgA. În intestin aceştia sunt secretaţi de către plasmocitele din plăcile Peyer, sau sunt transferaţi pasiv, prin colostru şi lapte. Imunoglobulina A (IgA) din cadrul sistemului imun al mucoaselor este o moleculă dimerică , alcătuită dintr-un lanţ de legătură (j=joining) precum şi dintr-o componentă secretorie, o proteină cu funcţie de transport a IgA în lumenul intestinal.

Sistemul imun cutanat

70

Pielea, având suprafaţa cea mai mare, reprezintă principala barieră fizică dintre organism şi mediul înconjurător. Este un participant activ în procesele de apărare, cu capacitatea de a genera şi susţine mecanisme de apărare specifice şi nespecifice (inflamatorii). Mulţi antigeni, reprezentaţi de bacterii, virusuri, fungi, ectoparaziţi, sau alergeni, substanţe iritante de contact, reagenţi de diagnostic şi vaccinuri pătrund în organism prin piele, determinând o mulţime de răspunsuri imune iniţiate la acest nivel. Componenţii principali ai sistemului imun cutanat sunt reprezentaţi de:

keratinocite (celulele epiteliale ale epidermei), care sintetizează şi eliberează citokine (molecule sintetizate şi eliberate de celule ale sistemului imun şi de alte celule, cu funcţii de mediatori implicaţi în numeroase mecanisme ale răspunsului imun natural şi adaptativ) active reprezentate de interleukine, factorii de necroză tumorală, factori de stimulare a hematopoezei, dar şi de molecule cu acţiune chemotactică şi activatoare asupra leucocitelor. Ca urmare a activării keratinocitelor de către interferonul (IFN)-gamma, acestea vor expune la suprafaţa lor molecule CMH (ale complexului major de histocompatibilitate) - clasa a II-a;

celule Langerhans, derivate din celulele măduvei osoase şi localizate în porţiunea suprabazală a epidermei, cu funcţia de celule prezentatoare de antigen;

limfocite intraepidermice, prezente în piele sub forma unei populaţii mici, în majoritate sub forma limfocitelor T(CD8+), care pot exprima un set mult mai restrâns de receptori pentru antigen;

limfocitele dermice, ajutătoare şi supresoare, localizate îndeosebi în jurul vaselor sangvine. În majoritatea lor sunt celule activate, efectoare sau de memorie. Limfocitele T cutanate sunt reprezentate de două populaţii şi anume cele care exprimă receptori celulari de tip α, β, T (TCR) fiind supuse circulaţiei şi cele recent identificate, γ, δ, T (care exprimă receptori γ, δ, TCR ), care deşi sunt considerate mai primitive, situate periferic, fac parte din prima linie de apărare şi sunt din abundenţă în situsurile cutanate şi mucoase;

macrofagele dermice, puţine la număr, cu rol în captarea antigenelor străine.

Atunci când în ţesutul cutanat pătrund antigene străine, intervin trei populaţii de celule prezentatoare de antigen, şi anume:

celulele Langerhans, principalele participante la faza de recunoaştere a antigenelor. Acestea leagă antigenul la suprafaţa lor şi îl prelucrează, după care îl transportă, migrând din epiderm în vasele limfatice, iar de aici în limfonodulii regionali. Aceste celule Langerhans, care acum sunt denumite celule dendritice interdigitate, prezintă antigenul celulelor T (CD4+).În starea lor de repaus, fără stimulare extrinsecă, celulele dendritice sunt cele mai puternice celule prezentatoare de antigen din organism. Celulele Langerhans diferenţiate în celule prezentatoare de antigen pe parcursul acestei migrări, dovedesc faptul că limfocitele T sunt activate în limfonoduli şi nu în piele, pe unde antigenul pătrunde;

macrofagele dermice, care prezintă antigenele prelucrate limfocitelor T la nivelul dermului;

celulele endoteliale din venule, care prezintă antigenele limfocitelor T, tot la nivelul dermului.

Unele din aceste celule circulă libere de la piele la sistemul vascular (sânge sau limfă) prin intermediul unor mecanisme asemănătoare cu recircularea limfocitelor, contribuind la finalizarea reacţiei cutanate.

71

Celulele şi organele imunocompetenteSRH (sistemul reticulo-histiocitar) are rol esenţial în toate procesele

imunitare, blocarea sa funcţională sau distrugerea sa prin iradiere duce la scăderea şi chiar prăbuşirea capacităţii de apărare a organismului, deci şi a sintezei de anticorpi.

Timusul (mamifere) şi bursa lui Fabricius (păsări) sunt organe limfoide primare, cu funcţii esenţiale în imunogeneză. Se dezvoltă timpuriu şi au rol în perioada embriogenezei, în formarea şi popularea cu limfocite a celorlalte organe şi structuri limfoide. Extirparea lor are urmări grave, mai ales asupra capacităţii de a sintetiza imunoglobuline.

Imunoglobulinele (anticorpii)

Imunoglobulinele sunt substanţe de natură proteică, a căror elaborare în organism este indusă de un antigen (imunogen) sau de o haptenă combinată şi care reacţionează specific cu elementul care i-a indus formarea. Anticorpii prezintă o mare diversitate structurală, comparabilă cu diversitatea antigenelor pe care sunt solicitaţi să le elimine din organism.

Fenomenul de formare a anticorpilor şi capacitatea acestora de a reacţiona cu antigenele in vivo sau in vitro reprezintă componente esenţiale ale răspunsului imunitar umoral, care se află la baza fenomenului de apărare imună.

Anticorpii sunt sintetizaţi de către limfocitele B mature, care se diferenţiază ca urmare a primirii unui stimul antigenic în plasmocite. În genomul plasmocitelor activate se realizează restructurări încadrate în ciclul celular, având drept urmare proliferarea (diviziunea intensă) şi sinteza acestor proteine specifice denumite anticorpi.În funcţie de efectul asupra anitigenului, denumirea anticorpilor poate varia şi anume, se numesc aglutinine acei anticorpi care aglutinează antigenul corpuscular, precipitine cei care prezintă antigenul solubil, lizine (hemolizine) cei care produc liză, opsonine care facilitează fagocitoza, reagine cei ce determină reacţii de hipersensibilitate de tip I, şi sensibilizine, acei anticorpi care sensibilizează suprafaţa unor celule făcând posibilă liza dependentă de complement. Anticorpii pot fi distribuiţi în mod diferit, putând fi găsiţi:

în citoplasma celulelor secretoare de anticorpi; pe membrana celulelor secretoare de anticorpi, unde îndeplinesc rolul de receptori pentru antigen;

în organele limfoide secundare şi în ţesuturi din cadrul sistemului imunitar al mucoaselor la mamifere;

în măduva osoasă, unde diferenţierea limfocitelor B ajunge până la stadiul de plasmocit;

la suprafaţa celulelor care prezintă la nivelul membranei receptori pentru fragmentul Fc al imunoglobulinelor.

Clasele de imunoglobuline

O clasă de imunoglobuline este definită în funcţie de determinanţii izotopici situaţi la nivelul regiunii constante a lanţurilor grele. În baza unor diferenţe minore în ceea ce priveşte structura primară a regiunii constante, se deosebesc subclase de imunoglobuline.

Spre exemplu, IgG cuprinde patru subclase şi anume: IgG1, IgG2, IgG3 şi IgG4, în timp ce IgA cuprinde doar două subclase, IgA1 şi IgA2.

72

Imunoglobulinele se mai împart în tipuri şi subtipuri, în funcţie de structura lanţului uşor şi în grupe şi subgrupe, în funcţie de structura regiunii variabile din lanţurile uşor şi greu.În funcţie de principalele lor proprietăţi fizico - chimice (greutate moleculară, constanta de sedimentare, mobilitatea electroforetică, conţinutul în anumite componente organice etc.), de rolul îndeplinit şi de concentraţia normală, imunoglobulinele se clasifică în cinci clase, notate în ordinea concentraţiei lor astfel: IgG, IgA, IgM, IgD şi IgE.

Cu toate că sunt proteine înrudite, aceste imunoglobuline prezintă o mare heterogenitate. Îndeplinesc în organism funcţia de anticorpi şi se pot întâlni sub formă de molecule libere care circulăîn sânge, sau sub formă de receptori legaţi la suprafaţa anumitor tipuri de celule implicate în recunoaşterea antigenelor (receptori pentru antigen).

Imunoglobulina G (IgG) reprezintă 70 - 80% din imunoglobulinele serice, atât la mamifere cât şi la păsări. Este clasa cel mai bine reprezentată, având o concentraţie de 20 mg / ml. Mai poate fi întâlnită şi în limfă, lichidul ascitic, lapte şi este singura imunoglobulină capabilă să traverseze placenta. Greutatea sa moleculară este de 150kDa, iar constanta de sedimentare 7S. În funcţie de specia de animale se diferenţiază 1 - 4 subclase de IgG notate IgG1, IgG2, IgG3 şi IgG4. La şoarece, spre exemplu, există ca şi la om, patru subclase, la cobai numai două, iar la iepure şi capră una singură. Reptilele şi păsările au o imunoglobulină IgG - like, numită frecvent “imunoglobulina non - IgM”, funcţia defensivă primară revenind imunoglobulinei M. Molecula IgG - like de la aceste animale prezintă dimensiuni mari (greutate moleculară 180 kDa) şi se pare că este un precursor direct al IgG3 de la mamifere. Moleculele de IgG apar în organism în urma stimulului antigenic secundar şi sunt anticorpii principali care acţionează în direcţia neutralizării toxinelor, virusurilor, bacteriilor şi au rol în procesele de fagocitoză opsonică, în citotoxicitatea anticorp-dependentă, precum şi în activarea complementului.

Producţia de IgG creşte în răspunsul imun umoral secundar, realizat sau declanşat în cazul repetării unei vaccinări, sau ca urmare a repetării contactului dintre sistemul imunitar şi imunogen.

Protecţia de lungă durată în urma trecerii printr-o infecţie sau ca urmare a vaccinării este asigurată de anticorpii din clasa IgG.

Cantitativ diferă cu specia de animale şi anume: în sângele taurinelor se găseşte în doze ce variază între 7 - 22 mg/ml, iar la suine 5 - 22 mg/ml. Dozarea concentraţiei de IgG din ser se realizează prin tehnici care utilizează anticorpi anti-IgG (tehnica Mancini) sau prin tehnici imunoenzimatice, care utilizează anticorpii monoclonali. Dozare cantitativă a IgG este frecvent lipsită de importanţă pentru că, în unele afecţiuni se produc modificări la nivelul subclaselor, aşa cum s-a demonstrat, în infecţii acute ale căilor respiratorii, când sunt modificate subclasele IgG2 şi IgG4, fără să se modifice valoarea globală a IgG.

Imunoglobulina M (IgM) este cea mai răspândită, fiind prezentă la toate vertebratele, inclusiv în serul peştilor cartilaginoşi. Este alcătuită dintr-o moleculă gigantă, pentameră, alcătuită din 5 subunităţi de tip Ig, cu 10 lanţuri H şi 10 lanţuri L şi formula (L2H2)5. Cele 5 subunităţi componente sunt legate între ele printr-un lanţ suplimentar, numit lanţul J (join=a uni) şi o enzimă care catalizează o reacţie de schimb disulfidic. Moleculele de IgM au greutate moleculară foarte mare, de 950 - 1000 kDa şi o constantă de sedimentare de 19S. Rezistă la 56oC şi au o perioadă de înjumătăţire de 5,1 zile. La om, concentraţia serică de IgM este de 1,5 mg/ml, la bovine de 2,5 - 2,8 mg/ml şi la suine de 1 - 1,3 mg/ml.

Funcţiile IgM sunt următoarele :

73

reprezintă prima clasă de imunoglobuline produsă de limfocitele B imature şi clasa principală secretată în cadrul răspunsului imun umoral primar;

este prima clasă de imunoglobuline care se formează în cazul unei infecţii, sau în urma unei infecţii, precum şi după prima vaccinare, deci are un rol foarte important în procesele de apărare;

s-a dovedit a fi cea mai eficientă imunoglobulină în procesul de activare a complementului;

cu ajutorul lanţului J IgM se leagă de receptorii celulelor secretorii, putând fi transportată în secreţiile mucoase, asigurând alături de IgA protecţia mucoaselor şi având un rol secundar de imunoglobulină secretorie;

are o mare capacitate de aglutinare, de opsonizare şi de liză.Structura de tip pentamer a IgM circulante nu-i permite să difuzeze spre spaţiile intercelulare tisulare şi nu poate să străbată placenta la om, dar la unele specii de animale are posibilitatea să o traverseze.

Imunoglobulina A (IgA). Din totalul imunoglobulinelor serice IgA reprezintă 10 - 15% şi este principala clasă de imunoglobuline prezentă în secreţii (lapte, salivă, lacrimi, secreţii intestinale şi respiratorii). Această clasă de imunoglobuline se găseşte în sistemul imunitar sub două forme şi anume: IgA serică şi IgA secretorie.IgA serică se găseşte în ser , având o concentraţie de 1 - 2 mg/ml, o greutate moleculară de 160 kDa şi o constantă de sedimentare de 7S. Funcţiile efectoare ale acestei imunoglobuline nu sunt pe deplin cunoscute. Se ştie că prezintă o slabă activitate ca şi anticorpi faţă de antigenele induse în urma imunizării sistemice, un slab efect opsonizant şi nu prezintă capacitatea de a fixa complementul. Rolul său principal se consideră a fi acela de a îndepărta cantităţi mici de antigene proveeenite din alimente sau din microorganismele adsorbite în circulaţia generală, având o mare importanţă în procesul de apărare a organismului.

În acest mod este oprit accesul acestor antigene la celulele sistemului imun şi stimularea unui răspuns mai extins care ar devia resursele de apărare de la funcţia lor normală şi anume de protecţie antiinfecţioasă.

IgA secretorie se găseşte în cantităţi mici în salivă, secreţii traheo-bronhice, lacrimale, genito-urinare în colostru şi lapte. Este sintetizată de celulele epiteliale din acinii şi glandele salivare, din mucoasa căilor respiratorii, digestive, biliare, glandei mamare, uretrei, trompelor uterine etc.

Reprezintă principala clasă de imunoglobuline implicată în procesul de apărare imună a mucoaselor, previne fixarea agenţilor patogeni. Se pare că aceasta împiedică pătrunderea bacteriilor în celulele epiteliale ale mucoaselor şi nu le permite fixarea pe suprafaţa acestor celule. Produce liza celulelor microbiene ţintă prin enzime lizozomale. I se atribuie rol şi în apărarea antivirală, realizând complexe antigen-anticorp şi blocând legarea virusurilor la nivelul receptorilor.

IgA apar în secreţii ca urmare a administrării antigenilor pe cale locală. Sunt mai puţin specifice, fiind capabile să reacţioneze cu o mare varietate de antigene înrudite cu cea care a determinat imunizarea. IgA sunt secretate în colostru şi în laptele matern protejând nou-născutul, însă nu pot fi transferate prin intermediul placentei. S-a demonstrat că IgA prezintă o activitate bactericidă foarte eficientă, fiind de 8 ori mai active faţă de unele bacterii ( Escherichia coli) comparativ cu IgM şi de 25 de ori mai active comparativ cu IgG.

Imunoglobulina D (IgD) a fost caracterizată pentru prima oară în anul 1965 ca o proteină neobişnuită, observată la un pacient cu mielom multiplu. Este greu de depistat în serul indivizilor sănătoşi din cauza concentraţiei scăzute şi sensibilităţii ridicate faţă de enzimele proteolitice. Reprezintă 0,2% din totalul imunoglobulinelor,

74

având o concentraţie serică de doar 0,03 mg/ml. Este sub forma unui monomer, cu constantă de sedimentare de 6,6S şi o greutate moleculară de 170 - 180 kDa. Se găseşte în organism sub formă de molecule solubile, care circulă în plasma sanguină precum şi sub formă de receptori pentru antigen, pe suprafaţa limfocitelor B, alături de IgM.

Se presupune că IgD ar avea rol important doar la nivel celular, ca receptor pentru antigen, intervenind în procesul de diferenţiere celulară şi instalarea memoriei imunologice. S-au evidenţiat anticorpi din această clasă faţă de penicilină, insulină, toxina difterică, lactoproteine etc. Prezintă sensibilitate mare faţă de acţiunea enzimelor proteolitice.

Imunoglobulina E (IgE) există sub formă circulantă, de monomer, având o greutate moleculară de 180 kDa, timp de înjumătăţire de 3 zile şi o concentraţie serică foarte redusă şi anume mai puţin de 0,001 mg/ml. Anticorpii acestei clase sunt cunoscuţi de mult timp (din 1965, identificată în benzile de electroforeză) sub denumirea de anticorpi reaginici sau homocitotropici, sau anticorpi sensibilizanţi ai pielii.

Din punct de vedere structural, molecula de IgE este alcătuită din două lanţuri grele şi două lanţuri uşoare, fiind foarte sensibilă la acţiunea temperaturii (se denaturează la 56oC după 30 de minute). Se sintetizează în ţesutul limfoid intestinal şi în căile respiratorii, nu se transmite transplacentar şi nu activează complementul.

Prezintă un rol important în medierea reacţiei de hipersensibilitate imediată (astm, şoc anafilactic) şi în infestaţiile parazitare cu helminţi. În cazul pătrunderii în organism a unui alergen care este recunoscut specific de anticorpii IgE fixaţi pe mastocite şi bazofile, se transmit semnale la acestea, care în urma degranulării eliberează imediat şi în cantităţi apreciabile, amine vasoactive de tipul histaminei, serotoninei etc. Aceste substanţe vor determina contracţia muşchilor netezi şi vor mări permeabilitatea vasculară generând simptomele tipice hipersensibilităţii de tip I (imediată). Acest mecanism se produce datorită afinităţii deosebite a IgE faţă de receptorul Fc de pe suprafaţa mastocitelor tisulare şi a bazofilelor circulante.

Imunoglobulinele E se pot lega şi de receptorii limfocitelor şi monocitelor, însă afinitatea de legare este mult mai redusă. Răspunsul imun prin anticorpi aparţinând clasei E este precoce, instalându-se imediat după IgM şi înainte de IgG, producerea lor putându-se prelungi luni sau chiar ani de zile.

Această producere prelungită a IgE poate explica persistenţa riscului anafilactic şi durata lungă a manifestărilor alergice.Fiecare moleculă de imunoglobulină are capacitatea de a reacţiona specific cu un anumit antigen, faţă de care posedă o structură complementară, numită situs de combinare.

Locusurile de cuplare cu antigenul au o structură complementară cu aceea a determinantului antigenic sau a grupării active şi se mai poate denumi paratop . Prin valenţa anticorpilor se înţelege numărul de situsuri de combinare existente în moleculă.

Afinitatea anticorpilor măsoară puterea forţelor de legătură care se stabilesc între situsul de combinare al anticorpilor (paratop) şi epitopul corespunzător de pe suprafaţa moleculei de antigen.

Afinitatea evaluează compatibilitatea stereochimică dintre cele două situsuri (epitop şi paratop). Această afinitate poate fi de două tipuri : intrinsecă şi funcţională. Afinitatea anticorpilor este determinată de doza de antigen folosită în procesul de imunizare şi de intervalul de timp scurs de la declanşarea acestui proces.

La administrarea dozelor mari de antigen sunt stimulate celulele antigen-reactive, care posedă receptori pentru antigen cu afinitate mică. Este stimulată în

75

acest caz sinteza de anticorpi cu afinitate scăzută. În cazul administrărilor de doze mici de antigen se produc anticorpi cu afinitate mare, deoarece sunt stimulate celulele antigen - reactive, cu afinitate mare pentru antigen.

Apariţia anticorpilor cu afinitate mare în cursul imunizării cu o doză unică de antigen se explică prin scăderea cantităţii de antigen din organism şi prin activarea celulelor cu receptori pentru antigen cu afinitate mare.

Antigenele

Antigenele reprezintă structuri chimice care reacţionează cu receptorii specifici ai limfocitelor T (TCR) şi cu receptorii specifici ai limfocitelor B (BCR), sau cu imunoglobulinele secretate.

Proprietatea antigenelor de a se combina specific cu receptorii de suprafaţă ai limfocitelor T sau B poartă denumirea de antigenitate. Imunogenele reprezintă structuri chimice care după recunoaşterea lor de către sistemul imun, pot induce declanşarea unui răspuns imun specific detectabil. Această proprietate poartă denumirea de imunogenitate. Toate imunogenele, de altfel, au proprietatea de antigenitate, însă nu toate antigenele sunt şi imunogene.

Noţiuni de imunoprofilaxie

Imunoprofilaxia, sau profilaxia specifică, reprezintă fenomenul de inducere a unei protecţii faţă de unul sau mai mulţi agenţi etiologici, ai căror determinanţi antigenici sunt înglobaţi în produsele biologice.

Modificările induse de produsele biologice sunt reflectate de profilul imunologic şi sunt diferite, în funcţie de structurile active pe care le au în componenţă. Apar răspunsuri imune complexe, cu participarea efectorilor celulari şi moleculari.

Metodele imunoprofilactice şi produsele biologice utilizate în imunoprofilaxie se pot clasifica în două mari grupe:

metode şi produse convenţionale reprezentate prin seruri şi vaccinuri; metode şi mijloace neconvenţionale, reprezentate prin obţinerea de vaccinuri prin recombinare genetică, sinteză chimică, utilizarea anticorpilor antiidiotipici.

Imunizarea activă se realizează prin folosirea unor produse cu proprietăţi imunogene (vaccinuri), care determină în organism un răspuns imun activ.

Au loc mecanisme similare celor din infecţia naturală sau experimentală, când în urma administrării unui preparat imunogen apar restructurări celulare şi umorale.Aceasta reprezintă consecinţa recunoaşterii determinanţilor antigenici conţinuţi în preparatul imunogen, cu declanşarea mecanismelor răspunsului imun, instalându-se starea de protecţie specifică faţă de o eventuală agresiune microbiană. Datorită faptului că sunt foarte diverse, s-a procedat la o clasificare a vaccinurilor în funcţie de mai multe criterii, cum ar fi:

după natura agentului etiologic conţinut vaccinurile sunt bacteriene, virale, parazitare şi micotice;

după starea biologică a microorganismelor care intră în compoziţia lor, vaccinurile pot fi obţinute din germeni vii şi virulenţi, vaccinuri obţinute din germeni atenuaţi, obţinute din germeni inactivaţi şi obţinute din toxine detoxifiate;

76

în funcţie de numărul de agenţi etiologici conţinuţi, vaccinurile pot fi monovalente, bivalente, trivalente şi polivalente;

după originea agentului etiologic din componenţa lor sunt vaccinuri homoloage, heteroloage şi heterospecifice;

în funcţie de modul de prezentare, vaccinurile sunt lichide şi liofilizate; după substanţele folosite la prepararea lor ca suport coloidal, vaccinurile

sunt cu adjuvanţi (adică adsorbite) şi vaccinuri fără adjuvanţi (neadsorbite); în funcţie de vechimea utilizării lor în profilaxie, vaccinurile se clasifică în

clasice şi moderne. Imunitatea activă Apare în organism în urma unui conflict direct cu componentele antigenice.

Se realizează fie în condiţii naturale ,când organismele trec prin boală (imunitate postinfecţioasă), fie în condiţii artificiale, prin vaccinare (imunitate postvaccinală). O bună imunitate activă conferă rezistenţă la doze de germeni destul de ridicate. Durează de la 3-4 luni până la 1 an. Imunitatea postinfecţioasă durează 1 an sau mai mulţi, chiar toată viaţa. Vaccinurile vii conferă o imunitate cu durata de 1 an sau mai mult (anatoxinele), în timp ce vaccinurile inactivate conferă o imunitate care durează 3-6 luni. Imunitatea postvaccinală are o durată mai scurtă la tineret.

Imunitatea pasivăÎn acest caz organismul nu vine în contact cu antigenul, nu-şi produce singur

efectorii imuni, primindu-i, prin transfer, de la un organism donator cu o stare de imunitate activă. Imunitatea pasivă poate fi dobândită fie pe căi artificiale, prin serumizare sau transfer de celule active ( are o durată scurtă, de 2-3 săptămâni), fie pe căi naturale, prin transfer de la mamă la făt, adică pe cale maternală.

Imunitatea pasivă maternală conferă rezistenţă la doze moderate de germeni. Eficacitatea ei în epizootii grave este foarte limitată. Este condiţionată de experienţa imunologică a mamei. Durata ei nu depăşeşte 2-3 săptămâni, rar o lună. În funcţie de calea pe care se face transferul de anticorpi, imunitatea pasivă maternală poate fi : transplacentară, transcolostrală şi transvitelină.

- Imunitatea transplacentară se întâlneşte la mamiferele cu tip de placentaţie incompletă şi mai puţin complexă, care permite traversarea imunoglobulinelor în ultima perioadă a gestaţiei. Animalele la care se poate observa acest tip de imunitate pasivă sunt : iepurii, cobaii, şobolanii şi câinii. Trecerea imunoglobulinelor prin bariera placentară este practic imposibilă la rumegătoare, porc, cabaline şi altele, datorită structurii complexe a placentei. Cantităţi reduse de imunoglobuline pot totuşi traversa placenta şi la acestea, în timpul parturiţiei, prin leziunile care se produc. Din această cauză la unele animale (catâri, mânji nou-născuţi) apar ictere hemolitice, în primele 12 ore, determinate de imunoglobulinele care traversează placenta în timpul parturiţiei. Icterele hemolitice apărute mai târziu sunt determinate de imunoglobulinele transferate prin colostru sau lapte.

- Imunitatea transcolostrală se întâlneşte la mamiferele cu placentaţie completă, cum ar fi rumegătoarele, suinele, cabalinele. În glanda mamară se concentrează în perioada premergătoare parturiţiei, cantităţi mari de imunoglobuline care sunt transmise fătului la primul supt de colostru. O parte din imunoglobulinele colostrale poate fi sintetizată chiar în glanda mamară, dar cea mai mare parte

77

provine din sânge. Acumularea începe în a doua jumătate a perioadei de gestaţie, se intensifică în faza de secreţie colostrală, când bariera hemato-mamară devine foarte penetrabilă pentru imunoglobuline. Se acumulează cantităţi mari de IgG, mai reduse de IgA şi IgM. În secreţia colostrală există cele mai mari cantităţi de IgA din organism, care au un rol foarte important în protecţia antimicrobiană la nivelul barierelor mucoase (intestin). Concentraţia de imunoglobuline scade rapid în secreţia colostrală după 1-3 zile de la parturiţie. Resorbţia lor se realizează la nou-născuţi pe cale intestinală, în primele 24-48 ore, apoi survine un blocaj al barierei intestinale care face imposibilă resorbţia de imunoglobuline. Sucul gastric şi enzimele devin active, alterând structura imunoglobulinelor.

Imunoglobulinele lipsesc din serul nou-născuţilor înainte de primul supt, dar apar imediat după primul supt de colostru şi cresc 24-48 ore. Nou-născuţii privaţi de colostru sintetizează imunoglobuline abia la vârsta de 3-8 săptămâni.

- Imunitatea transvitelină se întâneşte la păsări, la care imunoglobulinele se pot încorpora în vitelus, asigurând astfel imunitatea embrionilor şi a puilor. Transferul imunităţii este mai intens la găinile vaccinate antipestos înainte cu 1-2 luni de perioada de ecloziune.

Cantitatea de imunoglobuline din vitelus egalează sau întrece pe cea existentă în sângele păsărilor de la care provin ouăle.

Bibliografie

Buhăţel Teodor, Popan O. - Compendiu de Microbiologie aplicată, Editura Argonaut, Cluj-Napoca, 1997.

Moţ Daniela – Noţiuni de Microbiologie şi Imunologie, Editura Mirton, Timişoara, 2004.

Nichita Ileana – Micologie, Editura Mirton, Timişoara, 2007.Trif Radu, Popa Octavian- Bacteriologie generală, Editura Brumar,

Timişoara, 1996. Popa O., Trif Radu- Microbiologie şi Imunologie. Lito U.S.A.B. Timişoara, 1992. Vior C., Trif R.- Patologia sistemului imunitar, Editura Brumar, Timişoara, 1996. Răpuntean Gh., Marica D.,

78

Vior C.- Curs de Bacteriologie şi Imunologie generală, Tipo Agronomia, Cluj-Napoca, 1992.

Vior C., Târziu E., Răducănescu H., Trif R. – Imunopatologie, Editura Brumar, Timişoara, 2005.

79