miljøstyrelsens referencelaboratorium metodeafprøvning ... · en metode til bod i afløbsvand kan...

Miljøstyrelsen Endelig RapportDecember 2002

Miljøstyrelsens Referencelaboratorium Metodeafprøvning BOD5 i afløbsvand fra renseanlæg Interlaboratorieundersøgelse 2002

i

INDHOLDSFORTEGNELSE

1 INDLEDNING............................................................................................................... 1-1

2 BAGGRUND ................................................................................................................ 2-1 2.1 Datakvalitet ved måling af BOD på lavt niveau............................................................ 2-1 2.2 Metoder til bestemmelse af BOD................................................................................. 2-2 2.2.1 Eksisterende metoder og undersøgelser..................................................................... 2-2 2.2.2 Referencelaboratoriets metodeudvikling ..................................................................... 2-3 2.3 Metodeforskrift for BOD i afløbsvand........................................................................... 2-3 2.4 Validering af DS/EN 1899-2 (NY) ................................................................................ 2-4

3 TILRETTELÆGGELSE AF METODEAFPRØVNINGEN............................................. 3-1 3.1 Forundersøgelse.......................................................................................................... 3-1 3.2 Prøvefremstilling .......................................................................................................... 3-2 3.3 Prøvernes homogenitet og stabilitet ............................................................................ 3-2

4 DATABEHANDLING.................................................................................................... 4-1 4.1 Statistisk bearbejdning................................................................................................. 4-1 4.2 Fastlæggelse af nominel værdi.................................................................................... 4-1

5 RESULTATER ............................................................................................................. 5-1 5.1 Korrekthed ................................................................................................................... 5-2 5.2 Præcision..................................................................................................................... 5-4 5.3 Detektionsgrænse........................................................................................................ 5-5

6 KONKLUSIONER OG ANBEFALINGER..................................................................... 6-1

7 REFERENCER ............................................................................................................ 7-1 BILAG A Metodeforskrift DS/EN 1899-2 (NY) ............................................................................A-1 B Deltagerliste.................................................................................................................B-1 C Information til deltagerne ............................................................................................ C-1 D Resultater fra test af potentielle referencestoffer........................................................ D-1 E Prøvefremstilling ..........................................................................................................E-1 F Homogenitet og stabilitet .............................................................................................F-1 G Symboler og forkortelser............................................................................................. G-1 H Kontrol af genfinding................................................................................................... H-1 I Resultater fra deltagerne .............................................................................................. I-1 J Metoder........................................................................................................................ J-1 K Grafisk afbilding af deltagernes resultater ...................................................................K-1 L Resultater af supplerende forsøg ................................................................................ L-1 M Endelig metodeforskrift (REFLAB Metode 2:2002)..................................................... M-1

1-1

1 INDLEDNING

Analyser for biokemisk iltforbrug, BOD, anvendes til en vurdering af vandmiljøets be-lastning med uorganiske og/eller organiske stoffer, som ved biologisk oxidation forbru-ger ilt. Analysemetoden er udviklet til analyse af spildevand, men med den stigende an-vendelse af BOD bestemmelsen til analyse af behandlet spildevand har blandt andet Miljøankenævnet til Miljøstyrelsen gjort opmærksom på et behov for en metode, der kan bestemme iltforbruget på lavere niveau, end det er muligt med den traditionelle spildevandsmetode. Miljøstyrelsens Referencelaboratorium for Kemiske Miljøanalyser har derfor af Referencelaboratoriets styringsgruppe fået i opdrag at foretage en vurde-ring af de benyttede analysemetoder til bestemmelse af BOD og har efterfølgende ud-viklet en modifikation af en eksisterende metode: DS/EN 1899-2. Denne rapport be-skriver afprøvningen af den udviklede modifikation ved en interlaboratorieundersøgelse blandt danske laboratorier.

2-1

2 BAGGRUND

Afløbsvand fra danske renseanlæg skal i henhold til Spildevandsbekendtgørelsen /1/ renses til et indhold på højst 15 mg/L O2, og mange renseanlæg opnår bedre rensning. En metode til BOD i afløbsvand kan ligeledes anvendes i forbindelse med kontrol af ferskvandsdambrug /2/, hvor kravet er en maksimal tilvækst i BOD fra indløb til udløb på 1 mg/L O2. Dette betyder, at der er behov for en metode med et måleområde fra min-dre end 1 mg/L O2 til 15 mg/L O2 eller mere. Eksisterende metoder til bestemmelse af BOD (/3/, /4/) har måleområder på henholdsvis 0,5 - 6 mg/L O2 og 3 - 6000 mg/L O2. Ingen af disse kan derfor honorere ønsket om må-leområde, hvilket er baggrunden for det udførte udviklingsarbejde. Udvikling af en metode egnet til bestemmelse af BOD i spildevand med lavt indhold af BOD er gennemført i flere trin, som løbende er rapporteret. Nedenfor er givet et resumé af de udførte undersøgelser og vurderinger.

2.1 Datakvalitet ved måling af BOD på lavt niveau

I rapport til Miljøstyrelsen /5/ er udarbejdet en oversigt over de gældende krav til analy-sekvalitet baseret på Miljøstyrelsens bekendtgørelse nr. 637 /7/ og udledt af krav til vandkvalitet. Tabel 1 Samlet vurdering af krav til analysekvalitet for BOD /5/.

Medium Maksimal total stan-dardafvigelse sT max

i måleområdet (3 - 15) * sT max /7/

mg/L O2

Maksimal relativ standardafvigelse

i måleområdet >15 * sT max /7/

%

Genfinding af nominel værdi ved præsta-

tionsprøvning % /7/

Krav til detektionsgrænse

mg/L O2 Ferskvand 0,15 5 100 ± 20 0,5 helst 0,1 Spildevand 1 5 100 ± 20 1,5 helst 0,5

Muligheden for overholdelse af kravene til analysekvalitet er vurderet i /5/ og /6/ på ba-sis af den generelle analysekvalitet i præstationsprøvninger afholdt mellem 1992 og 2000. Resultaterne i præstationsprøvningerne viste forholdsvis stor spredning mellem laboratorierne, samt at der ofte var vanskelighed med overholdelse af kravet til detek-tionsgrænse. Desuden antydede materialet vanskelighed med overholdelse af kravet til sT max i ferskvand. Sammenligneligheden øges hvis metoder med fortynding /3/ og uden fortynding /4/ separeres, men ikke i alle tilfælde tilstrækkeligt. Materialet viser en ten-dens til højere gennemsnit ved anvendelse af metode med fortynding i forhold til meto-de uden fortynding. Alene af den grund vil ensartethed i metodevalget forventes at for-bedre sammenligneligheden. Referencelaboratoriet har desuden undersøgt kilderne til usikkerhed på BOD-metoden ved opstilling af et usikkerhedsbudget /9/. Undersøgelsen viser, at oxygenmålingen er den overvejende kilde til repeterbarhedsvariation ved måling af BOD uden fortynding og dermed styrende for den opnåelige detektionsgrænse. Den beregnede andel af repe-

2-2

terbarhedsvariationen, som stammer fra oxygenmåling, er en standardafvigelse af stør-relsesorden 0,1 mg/L O2. Repeterbarheden indeholder alene variationer indenfor en dag. Kravet til standardafvi-gelse ved lave koncentrationer, sT max, er den totale standardafvigelse og indeholder der-for også bidrag fra variation fra dag til dag. sT max må derfor forventes at være større end repeterbarheds-standardafvigelsen. Den beregnede repeterbarhedsvariation forårsaget af oxygenmåling (ca. 0,1 mg/L O2) antyder at kravet til sT max i ferskvand (0,15 mg/L O2) vanskeligt kan honoreres med de til rådighed værende metoder til måling af oxygen.

2.2 Metoder til bestemmelse af BOD

2.2.1 Eksisterende metoder og undersøgelser Referencelaboratoriet sammenlignede forskellige metoder og metodevariationer under forarbejdet til udvikling af BOD-metode til afløbsvand /5/. Sammenligningerne er summeret nedenfor. Tabel 2 Hovedtræk af BOD analysemetoder /5/.

DS/EN 1899-1 /3/ DS/EN 1899-2 /4/ DS/R 254 Hovedprincip Fortynding af prøve

med iltmættet, podet vand og måling af ilt-indhold før og efter inkubation

Måling af iltindhold i prøven før og efter inkubation

Fortynding af prøve med iltmættet vand, podning og måling af iltindhold før og efter inkubation

Metodens angivne anven-delsesområde

3-6000 mg/L O2 0,5-6 mg/L O2 2-1000 mg/L O2

Iltmåling Titrering eller elektrode Titrering eller elektrode Titrering pH område 6-8 6-8 6,5-8,5 Iltmætning Indgår Tilladt Indgår Podning Indgår Modifikation Indgår Tilsætning af ATU Indgår Modifikation Modifikation Næringssalttilsætning Indgår Modifikation Indgår Inkubationsperiode -modifikation

5 eller 7 døgn 2+5 døgn

5 eller 7 døgn 2+5 døgn

5 døgn -

Angiven standardafvigelse indenfor laboratorierne (sr)

11 mg/L O2 0,10-0,22 mg/L O2 5-10%

Primær anvendelse Spildevand og losse-plads-perkolat

Overfladevand Overfladevand

Tabellen indeholder dels de to DS/EN-metoder og dels den nu udgåede DS/R 254. DS/R 254 svarer med mindre forskelle, som ikke blev vurderet som betydende /5/, til DS/EN 1899-1 med undtagelse af, at hæmning af nitrifikation i DS/R 254 var en modi-fikation, mens det i DS/EN 1899-1 er foreskrevet. I det følgende koncentreres opsummeringen om DS/EN 1899. Inkubationstid: DS/EN 1899-1 og 1899-2 giver begge mulighed for inkubation i 5 eller 7 døgn, hvor 5 døgn traditionelt benyttes i Danmark. Inkubation i 7 døgn giver højere resultater og det vil derfor være nødvendigt at specificere inkubationstiden ved anven-

2-3

delse i Danmark. Data om præcision ved de to inkubationstider giver ikke mulighed for klart at konkludere om der er forskel. Undertrykkelse af nitrifikation: Tilsætning af ATU til hæmning af nitrifikation giver lavere BOD, særlig i prøver med højt indhold af ammonium, som f.eks. afløbsvand fra renseanlæg. DS/EN 1899-1 forskriver tilsætning af ATU, mens DS/EN 1899-2 angiver det som en mulighed. Det er således nødvendigt at specificere anvendelse af ATU ved analyse af afløbsvand. Tilsætning af ATU giver ikke en entydig effekt på præcisionen. Fortyndingsmetode eller metode uden fortynding: Bestemmelse af BOD med fortyn-ding (DS/EN 1899-1) forventes at give dårligere præcision end bestemmelse uden for-tynding (DS/EN 1899-2), men undersøgelser viser ikke entydig forskel. Oxygenmåling: Oxygenmåling kan efter DS/EN 1899 foregå enten titrimetrisk eller med elektrode. Ældre undersøgelser (1982) tyder ikke på forbedret analysekvalitet ved elektrodemåling, men de opstillede usikkerhedsbudgetter /9/ tyder på, at kvaliteten af elektroder er forbedret, således at elektrodemåling giver lavere spredning end titrering. Forskellen er dog ikke stor. Podemateriale: DS/EN 1899-2 foreskriver ikke podning med mindre prøverne som følge af store geografiske afstande er frosset. Frysning er ikke relevant under danske forhold, hvorfor podning ikke vil finde sted. DS/EN 1899-1 foreskriver podning. Forsøg på standardisering af podemateriale er ikke faldet heldigt ud.

2.2.2 Referencelaboratoriets metodeudvikling Referencelaboratoriet foretog forsøg med henblik på at udvikle / modificere en metode med et måleområde og en analysekvalitet, som er hensigtsmæssig til bestemmelse af BOD i afløbsvand fra renseanlæg. Effekten af tilsætning af ATU til hæmning af nitrifikation i prøver med et lavt indhold af BOD blev undersøgt. Undersøgelsen omfattede prøver med højt og lavt indhold af ammonium. For prøver med højt indhold af ammonium sås det forventede fald i BOD ved tilsætning af ATU op til 1 mg/L, og antydningsvis yderligere til 2 mg ATU/L, mens der for prøver med lavt indhold af ammonium ikke sås effekt. Den modificerede metode indeholder derfor bestemmelse om tilsætning af ATU til 2 mg/L. Tilsætning af næringssalte gav ingen effekt på hverken niveau af BOD eller præcision, hvorfor den modificerede metode ikke indeholder tilsætning af næringssalte. Referencelaboratoriet udførte en række forsøg med fortynding af prøven med iltmættet vand men uden podning. Forsøgene blev udført med op til 3,5 gange fortynding. Den undersøgte fortynding påvirkede ikke genfinding for BOD.

2.3 Metodeforskrift for BOD i afløbsvand

Baseret på de foretagne undersøgelser af eksisterende materiale og i Referencelaborato-riets laboratorium blev en metodeforskrift udarbejdet (bilag A). Den benævnes herefter DS/EN 1899-2 (NY).

2-4

Forskriften tager udgangspunkt i DS/EN 1899-2, hvorfra den afviger på følgende punk-ter:

DS/EN 1899-2 (NY) DS/EN 1899-2 1. Omfang og

anvendelsesområde 0,5 - 15 mg/L O2 0,5 - 6 mg/L O2

2. Princip Der tilsættes ATU for at undertrykke nitrifikation

Tilsætning af ATU er en modifikation

6. Fremgangsmåde Analyse uden fortynding og med en eller flere fortyndinger, op til 3,5 gan-ge fortynding. Til fortynding anvendes iltet, renset (destilleret eller deminera-liseret) vand.

Ingen fortynding

6.5 Bestemmelse af opløst oxygen

Oxygen bestemmes med elektrode Bestemmelse af oxygen er valgfri mellem iodometrisk titrering og elek-trodemåling

6.6 Kontrolanalyse Kontrol ved dobbeltbestemmelse på naturlig prøve og ved spiking af natur-lig prøve.

Kontrol ved dobbeltbestemmelse på naturlig prøve.

Desuden er foretaget de nødvendige justering for Reagenser, Udstyr, Fremgangsmåde og Beregning af resultat for at beskrive tilsætning af ATU og fortynding af prøven.

2.4 Validering af DS/EN 1899-2 (NY)

Referencelaboratoriet gennemførte en validering af den udviklede metode, DS/EN 1899-2 (NY). Metoden blev sammenlignet med DS/EN 1899-1. DS/EN 1899-1 gav på enkelte prøver signifikant højere resultat end DS/EN 1899-2 (NY), mens der for andre prøver ikke var forskel. Detektionsgrænse og præcision for de to metoder var sammen-lignelige. Kvalitetsparametre fra metodevalideringen er vist i tabel 3. Tabel 3 Nøgletal fra validering af DS/EN 1899-2 (NY) /5/.

Kvalitetsparameter DS/EN 1899-2 (NY) Detektionsgrænse 0,3 - 0,5 mg/L O2 Repeterbarhed (sr) ved koncentration ≤ 2,25 mg/L O2 0,07 - 0,11 mg/L O2 Repeterbarhed (CVr) ved koncentration > 2,25 mg/L O2 3,7 - 6,4 % Reproducerbarhed (sT) ved koncentration ≤ 2,25 mg/L O2 0,07 - 0,18 mg/L O2 Reproducerbarhed (CVT) ved koncentration > 2,25 mg/L O2 4,1 - 6,4 % Genfinding på enkeltværdier 94 - 125 % Genfinding, gennemsnit for hver prøve 100 - 113 %

Valideringen viser, at metoden kan tilfredsstille et krav til detektionsgrænse på 0,5 mg/L O2. Krav til sT max i spildevand overholdes let, mens kravet i ferskvand på 0,15 mg/L O2 ikke kan overholdes generelt. Metoden kan for en enkelt måling ikke overhol-de kravet til genfinding ved præstationsprøvninger (100 ± 20 %). Kravet til gennemsnit-lig genfinding ved intern kvalitetskontrol (100 ± 2 %) overholdes ikke, men datamateri-alet er begrænset.

3-1

3 TILRETTELÆGGELSE AF METODEAFPRØVNINGEN

Totalt blev 20 danske laboratorier tilbudt at deltage i metodeafprøvningen, i en indby-delse som blev sendt ud den 19. juni 2002, med svarfrist den 9. august. Sammen med indbydelsen blev en oversigt over forsøgsdesign og en kopi af den ny BOD metode sendt ud (DS/EN 1899-2 (NY), version rev. 18. juni 2002). Af de indbudte laboratorier gav 8 en positiv tilbagemelding, men ét meldte efterfølgende afbud. Sammen med Euro-fins A/S, Hørsholm, var der altså 8 deltagende laboratorier, alle fra Danmark. En liste over de deltagende laboratorier findes i Bilag B. Prøverne blev sendt ud til laboratorierne den 3. september, helt ifølge plan. Sammen med prøverne blev udsendt et brev med instruks for prøvefremstilling og analyse, et rapporteringsskema og en liste over metodekoder (se Bilag C). Desuden blev der ud-sendt en revideret udgave af metodeforskriften, da et af de tilmeldte laboratorierne op-dagede en fejl i en blindkorrektion i den oprindelige metode. Den udgave, som blev sendt ud sammen med prøverne, er den som findes i Bilag A (rev. 2. september 2002). Deltagerne indsendte resultater til KPMG, et uafhængigt revisionsfirma, som foretog kodning af resultaterne inden aflevering til Referencelaboratoriet. Afleveringsfrist for resultater til KPMG var den 27. september.

3.1 Forundersøgelse

Tidligere erfaring viser, at en glukose-glutaminsyre blanding giver stabile og homogene opløsninger med kendt indhold af BOD. Den slags opløsninger bruges normalt til spike-opløsninger for BOD og af mange laboratorier til referencemateriale i intern kvalitets-kontrol. Et problem er dog, at indholdet af organisk materiale bliver omsat meget hurti-gere end hvad det normalt bliver i en naturlig afløbsprøve. Før spike-opløsningerne til metodeafprøvningen blev fremstillet, blev derfor testet nogle alternative stoffer i et for-forsøg. De udvalgte stoffer var lactose, phenylalanin og natriumbenzoat. Lactose og phenylalanin blev udvalgt, fordi de er større varianter af molekylerne glukose og gluta-minsyre. Forhåbningen var derfor, at omsætningshastigheden ville være lidt lavere. Na-triumbenzoat er blevet brugt som referencestof i forbindelse med økotoksikologiske tests af bionedbrydelighed, og der var derfor en mulighed for at det kunne bruges også i dette sammenhæng. Prøverne blev fremstillet fra iltmættet podevand (fremstillet ifølge DS/EN 1899-1), hvor en spike af de tre kandidatsstoffer blev tilsat, se tabel. Stof Koncentration,

mg/L Forventet BOD, ca., mg/L O2

Lactose 5 8,2 Phenylalanin 14 10 Natriumbenzoat 14 10

Iltindholdet i prøverne var planlagt til at blive målt efter henholdsvis 4, 5, 6, 7 og 8 da-ge. Resultaterne viste desværre, at også disse stoffer blev meget hurtigt omsat, og at al

3-2

ilt var forbrugt allerede efter 4 dage, uanset hvilket stof der blev undersøgt. BOD blev derfor kun målt efter 4 og 5 dage. Resultater fra forforsøget findes i Bilag D. Konklusionen var derfor, at referencestof til metodeafprøvningen var en blanding af lige dele glukose og glutaminsyre.

3.2 Prøvefremstilling

Til fremstilling af prøver blev brugt renset spildevand fra Nivå renseanlæg (hovedsage-ligt husholdningsspildevand, spildevand 1) og fra Lundtofte renseanlæg (bidrag fra in-dustrispildevand, spildevand 2). Til kontrolprøve blev brugt ampuller med 25 mL af en koncentreret glukose-glutaminsyre opløsning, der var blevet fremstillet og tjekket i forbindelse med en tidli-gere præstationsprøvning. Desuden blev fremstillet ampuller med koncentreret spike-opløsning til brug ved spi-king af spildevandet. Disse opløsninger blev fremstillet ved brug af en glukose-glutaminsyre blanding. Beskrivelse af prøvefremstilling findes i Bilag E. Følgende prøver blev sendt ud til laboratorierne: Prøve Beholdere Volumen Spildevand 1 Plastikdunk >10 L Spildevand 2 Plastikdunk 5 L Kontrol Ampul ca. 25 mL Spike 1 Ampul ca. 20 mL Spike 2 Ampul ca. 20 mL Spike 3 Ampul ca. 20 mL

3.3 Prøvernes homogenitet og stabilitet

Tidligere erfaring viser, at spildevandsprøver som stabiliseres ved beluftning og hen-stand, vil være stabile nok til at bruges som BOD-prøver, inklusive som basisvand for fremstilling af spikede BOD-prøver. De to spildevandsprøver, Spildevand 1 og Spilde-vand 2, blev derfor ikke testet for homogenitet. Spikeopløsning 3 blev testet for homogenitet ved måling af NVOC. Resultaterne viser, at spike 3 var homogen (se Bilag F). Da spike 1 og 2 blev fremstillet på samme måde, og på samme tidspunkt, kan de med meget stor sikkerhed også antages at være homoge-ne. Kontrolampullerne er blevet testet i forbindelse med en tidligere præstationsprøv-ning.

4-1

4 DATABEHANDLING

4.1 Statistisk bearbejdning

Metodeafprøvningen er gennemført med uniform-level design, hvilket vil sige at de del-tagende laboratorier er anmodet om at analysere de udsendte prøver flere gange. I dette tilfælde er laboratorierne anmodet om at foretage dobbeltbestemmelse for hver prøve. Databehandlingen er foretaget i henhold til ISO 5725: "Accuracy (trueness and preci-sion) of measurement methods and results" /10/. De anvendte symboler og forkortelser er beskrevet i bilag G. Datamaterialet er for lille til at foretage test af normalfordeling. En visuel inspektion af normalfordelingsplot af residualer giver generelt ikke grund til at tvivle på datamateria-lets normalfordelingsegenskaber. I betragtning af det begrænsede antal deltagere er databehandling foretaget med robust statistik, som er en alternativ metode i henhold til ISO 5725 /11/. Deltagerne modtog en foreløbig rapport med anmodning om at meddele eventuelle kommentarer senest den 6. december 2002. Referencelaboratoriet modtog dog ikke in-formation om fejlbehæftede resultater, hvorfor alle data indgik i databehandlingen.

4.2 Fastlæggelse af nominel værdi

Hver prøve er tildelt en nominel værdi, som er Referencelaboratoriets bedste estimat af den sande koncentration i prøven. I fremstilling er prøve 1, 4 og 6 sammenhørende, idet prøve 4 og 6 fremkom ud fra prø-ve 1 ved tilsætning af en kendt mængde af en referenceopløsning (spiking). På tilsva-rende måde er prøve 2 og 5 sammenhørende. Den nominelle værdi for prøve 1 er fastlagt ud fra medianværdierne af deltagernes re-sultater for prøve 1 og 4 efter at medianværdien for prøve 4 er fratrukket den tilsatte koncentration. Prøve 6 indgik ikke i beregning af nominel værdi, da det af deltagerne fundne gennemsnit var mindre end den beregnede tilsætning. Tilsvarende er den nominelle værdi for prøve 2 fastlagt ud fra medianværdierne for prø-ve 2 og 5 efter subtraktion af den tilsatte koncentration fra prøve 5. Den nominelle værdi for prøve 4, 5 og 6 er fremkommet ved addition af den tilsatte koncentration til basisprøven, dvs. prøve 1 eller 2. Prøve 3 er en kvalitetskontrolprøve, hvor en kendt koncentration er tilsat laboratoriets fortyndingsvand og resultatet korrigeret for fortyndingsvandets bidrag til BOD. Den nominelle værdi for prøve 3 fremkommer ved beregning ud fra prøvefremstillingen.

4-2

Prøve 7 var laboratoriernes fortyndingsvand og den nominelle værdi for denne prøve er fastsat til medianværdien for deltagernes resultater. Usikkerheden for de nominelle værdier er estimeret. Dog har det ikke været muligt at inddrage usikkerhedsbidrag stammende fra eventuel bias på de nominelle værdier. Usikkerheden for tilsatte koncentrationer (spike1, spike2, spike3 og kvalitetskontrol) er estimeret ud fra fabrikanternes tolerance på de anvendte vægte og volumetrisk udstyr. Da slutfortynding er foretaget på deltagernes laboratorier, og der af den grund ikke fin-des viden om kvalitetsklasse for det volumetriske udstyr, er det valgt at fastlægge usik-kerheden ud fra tolerancerne for klasse B udstyr i et ”worst case scenario”. Usikkerheden på de nominelle værdier, der er baseret på medianværdier, er estimeret ud fra robust standardafvigelse for de indgående medianværdier. Hertil er adderet usikker-heden på spikeopløsninger i det omfang koncentrationen af disse indgår i fastlæggelsen af den nominelle værdi. Usikkerheden er angivet som ekspanderet usikkerhed med dækningsfaktoren 2. De nominelle værdier og dertil hørende usikkerheder er vist i oversigt i tabel 4. Tabel 4 Nominelle værdier og tilhørende usikkerheder.

Nominel værdi ± ekspanderet usikkerhed Prøve Prøvebeskrivelse DS/EN 1899-1 og DS/R 254 DS/EN 1899-2(NY)

1 Spildevand 1 0,95 ± 0,16 1,05 ± 0,13 2 Spildevand 2 - 0,95 ± 0,15 3 Kvalitetskontrol 4,19 ± 0,034 4,19 ± 0,034 4 Spildevand 1 + spike 1 5,93 ± 0,17 6,03 ± 0,13 5 Spildevand 2 + spike 2 - 9,95 ± 0,17 6 Spildevand 1 + spike 3 14,9 ± 0,2 15,0 ± 0,2 7 Laboratoriernes fortyn-

dingsvand 0,60 ± 0,31 0,21 ± 0,09

Som det fremgår er der for prøve 7, der ligger tæt på eller under metodens forventede detektionsgrænse, en meget stor usikkerhed på omkring 50% af den nominelle værdi. I prøve 1 og 2, som ligger på ca. det dobbelte af detektionsgrænsen er usikkerheden sta-dig betydelig, men dog reduceret til 10 - 20%. For de øvrige prøver er usikkerheden un-der 3%. Tabel 4 viser, at de udsendte prøver dækker hele metodens måleområde med to prøver tæt på den nedre ende af måleområdet (0,5 mg/L O2) og en prøve herunder samt yderli-gere 4 prøver fordelt over den resterende del af måleområdet op til den øvre grænse (15 mg/L O2). Overensstemmelsen for de nominelle værdier med deltagernes data er testet ved sam-menligning af den nominelle værdi i hver prøve med gennemsnittet af deltagernes resul-tater efter udelukkelse af eventuelle outliere. Sammenligningen er foretaget ved en t-test på 95% konfidensniveau. Testen viser ingen forskel mellem middelværdier og nominel-le værdier med undtagelse af prøve 6 målt med DS/EN 1899-2 (NY). I Referencelabora-toriets homogenitetstest for den ampul, der er anvendt til fremstilling af prøven hos de deltagende laboratorier, er den forventede værdi fundet med 101% genfinding målt ved

4-3

NVOC. Der er således intet der tyder på, at den fremstillede ampul ikke indeholder den forventede mængde organisk stof. Gennemsnit fundet med den ny metode stemmer overens med gennemsnit fundet med laboratoriernes egen metode. Forskellen mellem nominel værdi og deltagernes gennemsnit er ikke statistisk signifikant ved anvendelse af egen metode som følge af større spredning på resultaterne. Den nominelle værdi fast-holdes derfor.

5-1

5 RESULTATER

Metodeafprøvningen havde i alt 8 deltagere, Referencelaboratoriet inkluderet. Alle 8 la-boratorier havde imidlertid ikke ressourcer til analyse af alle prøver. For den enkelte prøver er antallet af deltagere derfor mellem 5 og 8. Resultater fra alle deltagere er vist i bilag I og afbildet grafisk i bilag K. I oversigten er de metoder, deltagerne har anvendt som egen rutinemetode, angivet med et metodenummer. En forklaring til metodenum-rene er vist i bilag J. Alle prøver med undtagelse af prøve 2 og 5, prøve fra Lundtofte renseanlæg uden og med spiking, blev analyseret med to metoder, hvoraf den ene var metoden til afprøv-ning, DS/EN 1899-2 (NY). Den anden metode var enten DS/EN 1899-1, som er fortyn-dingsmetoden for BOD, eller egen metode. Som egen metode har de fleste laboratorier valgt enten DS/EN 1899-1 eller den nært beslægtede DS/R 254. Ét laboratorium anven-der imidlertid DS/EN 1899-2 modificeret ved tilsætning af ATU som egen metode for prøve 1. Dette laboratrium analyserer således prøverne uden fortynding. En oversigt over kvalitetsparametre estimeret ud fra de modtagne resultater er vist i ta-bel 5. Tabel 5 Generel analysekvalitet for BOD (mg/L O2) bestemt med DS/EN 1899-2 (NY).

Prøve 1 2 3 4 5 6 7 p, antal laboratorier 8 8 5 7 7 7 7 n, antal replikater 2 2 2 2 2 2 1 µ, nominel værdi 1,05 0,95 4,19 6,03 9,95 15,0 0,21 m, middelværdi 1,212 0,926 3,612 5,836 9,926 13,51 0,216 M, median 1,185 0,900 3,950 5,920 10,00 13,40 0,210 genfinding*, % 113 95 94 98 101 90 100 sr 0,089 0,047 0,356 0,136 0,409 0,21 - sL 0,221 0,201 0,177 0,396 0,450 1,01 0,098 sR 0,238 0,207 0,375 0,419 0,608 1,03 0,098 CVr, % 8,5 5,0 8,5 2,3 4,1 1,4 -CVL, % 21 21 4,2 6,6 4,5 6,7 47 CVR, % 23 22 9,0 6,9 6,1 6,9 47

*: genfinding er beregnet som medianværdi i procent af nominel værdi. Til sammenligning ses i tabel 6 kvalitetsparametre bestemt på de samme prøver ved an-vendelse af fortyndingsmetoden, enten i henhold til DS/EN 1899-1 eller DS/R 254. For prøve 1 har ét laboratorium dog anvendt DS/EN 1899-2 modificeret ved tilsætning af ATU.

5-2

Tabel 6 Generel analysekvalitet for BOD (mg/L O2) bestemt ved egen metode (prøve 1, 4

og 6) og fortyndingsmetoder (prøve 3 og 7).

Prøve 1 2 3 4 5 6 7 p, antal laboratorier 8 6 6 6 7 n, antal replikater 2 2 2 2 1 µ, nominel værdi 0,95 4,19 5,93 14,9 0,60m, middelværdi 1,260 4,347 5,864 13,34 0,734 M, median 1,100 4,31 5,790 14,02 0,600 genfinding*, % 116 103 98 94 100 sr 0,105 0,126 0,147 0,23 - sL 0,359 0,478 0,790 2,54 0,392sR 0,374 0,494 0,804 2,55 0,392 CVr, % 11,0 3,0 2,5 1,5 - CVL, % 38 11,4 13,3 17,0 65CVR, % 39 11,8 13,6 17,1 65

*: genfinding er beregnet som medianværdi i procent af nominel værdi.

Både repeterbarhed og reproducerbarhed ved egen metode/fortyndingsmetoden som fremgår af tabel 6 er bedre end det normalt ses for afløbsvand ved præstationsprøvnin-ger /12/.

5.1 Korrekthed

Det giver ikke mening at tale om korrekthed som sådan for en metode som BOD, hvor resultatet er afhængigt af den anvendte procedure. Imidlertid er det vigtigt at kende BOD-bidraget for standardstoffer med henblik på anvendelse i kvalitetskontrol og som tilsætning ved præstationsprøvninger. Det forventes som udgangspunkt, at omsætningen med den ny metode vil være lige så stor som omsætningen med fortyndingsmetoden, f.eks. DS/EN 1899-1. I DS/EN 1899-1 angives en kontrolopløsning, hvoraf det kan udledes, at en blanding af 1 g glukose og 1 g glutaminsyre vil svare til 1,40 ± 0,13 g O2 målt som BOD5. Koncentrationen i de an-vendte spike og kvalitetskontrolopløsninger er beregnet ud fra denne faktor. Genfindingen af de tilsatte spike-opløsninger og i kontrolopløsningen er vist nedenfor i tabel 7 for den ny metode og for fortyndingsmetoderne. Tabel 7 Genfinding af tilsatte spikeopløsninger og af kvalitetskontrolopløsning.

DS/EN 1899-2 (NY) Fortyndingsmetoder/egen metode

Prøve

Teoretisk værdi

mg/L O2 Fundet værdi

mg/L O2 Genfinding

% Fundet værdi

mg/L O2 Genfinding

% 4 minus 1 4,98 4,735 95 4,69 94 6 minus 1 13,95 12,215 88 12,92 93 5 minus 2 9,00 9,10 101 3 4,19 3,950 94 4,31 103 Middelgenfinding, % 95 97

Genfinding ved den ny metode er mindre end ved fortyndingsmetoderne, men forskel-len er ikke stor. Imidlertid er det erfaringen fra præstationsprøvninger på ferskvand hvor både metode med og uden fortynding har været anvendt, at metode uden fortynding gi-

5-3

ver lidt lavere gennemsnit end fortyndingsmetoder. Spildevand anvendt som basis i denne metodeafprøvning er lige som det er tilfældet ved præstationsprøvninger stabili-seret inden udsendelse for at undgå ændring af indhold mens analysearbejdet pågår. En mulighed er derfor, at den biologiske aktivitet i de stabiliserede prøver derved er blevet så lav, at det påvirker det biokemiske oxygenforbrug for de metoder, der ikke anvender fortynding. Ved fortyndingsmetoder indgår normalt podning, hvorfor disse ikke forven-tes at være påvirket af lavere biologisk aktivitet i samme grad. Genfinding (88-101%) er lavere end ved Referencelaboratoriets metodevalidering (100-113%). Sammenhængen mellem nominel værdi og laboratoriernes måleværdier er vist i figur 1.

Regressionslinie

-10 -5 0 5 10 15 20-10

-5

0

5

10

15

20 y=x

Nominelt indhold, µ, af BOD5 (DS/EN 1899-2(NY))

MåleværdiRegressionsanalyse af samtlige laboratorier

Figur 1 Sammenhæng mellem nominel værdi og målt værdi for DS/EN 1899-2 (NY).

Referencelaboratoriet har derfor efter afholdelse af metodeafprøvningen foretaget en undersøgelse af BOD ved den ny metode, DS/EN 1899-2 (NY), parallelt med fortyn-dingsmetoden, DS/EN 1899-1. Ved undersøgelsen er anvendt frisk spildevand, afhentet umiddelbart inden start af måleprogrammet. Herudfra er fremstillet prøver svarende til de, der blev anvendt ved metodeafprøvningen. Programmet er suppleret med spildevand fra to renseanlæg ud over de to, der blev anvendt ved metodeafprøvningen og desuden er prøven til kvalitetskontrol, som ved metodeafprøvningen blev fortyndet med de del-

5-4

tagende laboratoriers eget podevand, yderligere undersøgt fortyndet med to forskellige spildevandsprøver. Resultaterne af de supplerende undersøgelser findes i bilag L og de bearbejdede data ses i tabel 8. Tabel 8 Genfinding målt ved supplerende forsøg på Referencelaboratoriet.

DS/EN 1899-2 (NY) DS/EN 1899-1

Teoretisk værdi Fundet vær-

di Genfinding Fundet vær-

di Genfinding

Prøve mg/L O2 mg/L O2 % mg/L O2 % A 2,65 2,93 B 3,03 2,82 H 1,01 1,22 I 1,37 1,35 Spiket prøve E minus A 4,98 4,89 98 4,87 98 G minus A 13,95 15,69 112 14,59 105 F minus B 9,00 8,27 92 8,49 94 Kontrol Tilsat prøve A 4,19 3,67 88 3,73 89 Tilsat prøve B 4,19 3,43 82 3,77 90 Tilsat podevand 4,19 2,95 70 2,91 69 Middelgenfinding, % 90 91 Resultaterne af de supplerende forsøg viser, at genfindingen ved anvendelse af frisk spildevand fortsat er forholdsvis lav, af samme størrelsesorden som ved det stabiliserede spildevand, der blev anvendt ved metodeafprøvningen. Resultaterne viser også (parret t-test) at der ikke er forskel på genfinding ved anvendelse af fortyndingsmetoden (DS/EN 1899-1) og den ny metode, DS/EN 1899-2 (NY). Genfindingen ligger i gennemsnit in-den for tolerancen på det empiriske indhold af en glukose/glutaminsyreblanding, som er angivet i DS/EN 1899-1.

5.2 Præcision

Præcisionen opnået ved DS/EN 1899-2 (NY) er vist i tabel 5 og præcision ved fortyn-dingsmetode og egen metode i tabel 6. Disse data er summeret nedenfor i tabel 9. Tabel 9 Præcision opnået ved DS/EN 1899-2 (NY) sammenlignet med præcision ved for-

tyndingsmetoden eller egen metode.

Prøve Koncentra-tionsniveau

sr (mg/L O2) sR (mg/L O2)

mg/L O2 DS/EN 1899-2 (NY)

Fortyndingsmeto-der/egen metode

DS/EN 1899-2 (NY)

Fortyndingsmeto-der/egen metode

7 0,2 - 0,6 - - 0,098 0,392 2 1 0,047 0,207 1 1 0,089 0,105 0,238 0,374 3 4 0,356 0,126 0,375 0,494 4 6 0,136 0,147 0,419 0,804 5 10 0,409 0,608 6 15 0,21 0,23 1,03 2,55

5-5

Tabel 9 viser for repeterbarhedsstandardafvigelseen (sr) dels, at der ikke sker en entydig stigning af sr med stigende koncentration, og dels at sr for den ny metode er sammenlig-nelig med sr for de hidtil anvendte metoder (egen metode og fortyndingsmetoder). I modsætning hertil viser reproducerbarhedsstandardafvigelsen (sR) klar stigning med sti-gende koncentration og mindre spredning for den ny metode sammenlignet med de hid-til anvendte. Dette er illustreret i figur 2.

Figur 2 Reproducerbarhedsstandardafvigelse (sR) for DS/EN 1899-2 (NY) sammenlignet med fortyndingsmetoder, herunder egne metoder.

Præcisionen bestemt ved metodeafprøvningen bekræfter de præcisionsmål, som blev bestemt ved Referencelaboratoriets metodevalidering.

5.3 Detektionsgrænse

Repeterbarhedsstandardafvigelsen er for begge metoder af størrelsesorden 0,1 mg/L O2, hvilket betyder, at en detektionsgrænse på 0,5 mg/L O2 burde være mulig uanset valg af metode. Resultaterne for prøve 1 og 2 for DS/EN 1899-2 (NY) antyder dog, at denne metode muligvis kan give en lavere detektionsgrænse, af størrelsesorden 0,2 - 0,3 mg/L O2. Datamaterialet er dog for spinkelt til at konkludere om en lavere detektionsgrænse er mulig, men det kan med sikkerhed siges, at detektionsgrænsen 0,5 mg/L O2 er opnåe-lig. Detektionsgrænsen bekræfter de bestemmelser af detektionsgrænse, som blev foretaget ved Referencelaboratoriets metodevalidering.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Koncentrationsniveau (mg/L O2)

sR (m

g/L

O2)

DS/EN 1899-2 (NY)

Fortyndingsmetoder/egen metode

6-1

6 KONKLUSIONER OG ANBEFALINGER

Metodeafprøvningen viser, at den udviklede metode til bestemmelse af BOD5 på lavt niveau i afløbsvand fra renseanlæg er egnet til formålet. Metodeafprøvningen viser kva-litetsparametre for metoden som anført nedenfor. Korrekthed bestemt under forudsætning af, at den empiriske værdi for BOD5 i en blanding af lige dele glukose og glutaminsyre, som er gældende i henhold til DS/EN 1998-1:1998, er gældende. Herved giver en blanding af 1 g af hvert stof en BOD5 på 1,40 g/L O2: Middelgenfinding 95% varierende fra 88 til 101% (4 prøver). Repeterbarhedsstandardafvigelse: 0,05 – 0,09 mg/L O2 ved koncentration 1 mg/L O2 (2 prøver). 1 – 9% i koncentrationsområdet fra 4 til 15 mg/L O2 (4 prøver). Reproducerbarhedsstandardafvigelse: 0,1 - 0,2 mg/L O2 i koncentrationsområdet 0,2 - 1 mg/L O2 (3 prøver). 6 – 9% i koncentrationsområdet fra 4 til 15 mg/L O2 (4 prøver). Detektionsgrænse: Ud fra standardafvigelsen for repeterbarhed ved lav koncentration (0,05 – 0,09 mg/L O2) findes, at en detektionsgrænse på 0,5 mg/L O2 med sikkerhed kan overholdes. Detektionsgrænsen er her defineret som

rsdftDL ⋅= )(995,0 hvor sr er standardafvigelse for repeterbarhed for prøver med koncentration tæt på den forventede detektionsgrænse, t0,995 er Student's t-værdi på 99,5% konfidensniveau og df er antallet af frihedsgrader for sr. Det anbefales at udgive metoden, der er anført i bilag M, som metode fra Referencela-boratoriet. Middelgenfindingen (95%) er forholdsvis lav, men ikke forskellig fra genfinding ved anvendelse af fortyndingsmetoden på de samme prøver. Det anbefales at opsamle yder-ligere data om genfinding ved metodens anvendelse i kommende præstationsprøvninger til belysning af metodens korrekthed. Såfremt disse data giver grundlag herfor, revide-res metodens angivelse af korrekthed.

7-1

7 REFERENCER

/1/ Miljøstyrelsens bekendtgørelse nr. 501, Bekendtgørelse om spildevandstilladelser m.v. efter miljøbeskyttelseslovens kapitel 3 og 4, 21. juni 1999.

/2/ Miljøstyrelsens bekendtgørelse nr. 204, Bekendtgørelse om ferskvandsdambrug, 31. marts 1998.

/3/ DS/EN 1899-1, Vandundersøgelse, Biokemisk iltforbrug over n døgn (BODn), Del 1: Fortyndingsmetode med podning og tilsætning af N-allylthiourinstof, 1999.

/4/ DS/EN 1899-2, Vandundersøgelse, Biokemisk iltforbrug over n døgn (BODn), Del 2: Metode uden fortynding, 1999.

/5/ Miljøstyrelsens Referencelaboratorium, DHI Institut for Vand og Miljø, BOD5 på lavt niveau, Udvikling og validering af metode til bestemmelse af BOD5 på lavt niveau ud fra DS/EN 1899-2, Rapport til Miljøstyrelsen, Juni 2000.

/6/ Miljøstyrelsens Referencelaboratorium, DHI Institut for Vand og Miljø, BOD5 på lavt niveau, Evaluering af BOD5 metoder til anvendelse på detektionsgrænseni-veau i spildevand, Rapport til Miljøstyrelsen, December 2000.

/7/ Miljøstyrelsens bekendtgørelse nr. 637, Bekendtgørelse om kvalitetskrav til mil-jømålinger udført af akkrediterede laboratorier, certificerede personer m.v., 30. juni 1997.

/8/ Miljøstyrelsen, Nationalt program for overvågning af vandmiljøet 1998 - 2003 "NOVA 2003", Programbeskrivelse, 1999.

/9/ Miljøstyrelsens Referencelaboratorium, DHI Institut for Vand og Miljø, Usikker-hed for oxygenmålinger i forbindelse med BOD analyse, Notat til Miljøstyrelsen, December 2001.

/10/ DS/ISO 5725-2, Nøjagtighed (korrekthed og præcision) af målemetoder og resul-tater – Del 2: Grundlæggende metode til bestemmelse af repeterbarhed og repro-ducerbarhed for en standardiseret målemetode, 1995.

/11/ DS/ISO 5725-5, Nøjagtighed (korrekthed og præcision) af målemetoder og resul-tater – Del 5: Alternative metoder til bestemmelse af præcisionen af en standardi-seret målemetode, 2000.

/12/ Miljøstyrelsens Referencelaboratorium, DHI Institut for Vand og Miljø, Rådgiv-ning ved revision af Bekendtgørelse nr. 637 - Sammenstilling af analysekvalitet fra præstationsprøvninger 1990 - 2001, Rapport til Miljøstyrelsen, Marts 2002.

B I L A G

B I L A G A

Metodeforskrift DS/EN 1899-2 (NY)

A-1

Udkast til metodeforskrift for BOD5 analyser på lavt niveau. 1. Omfang og anvendelsesområde Denne metode beskriver måling af biokemisk oxygenforbrug med en inkubationstid på 5 dage (BOD5) i spildevand fra udløb af rensningsanlæg. Metoden er anvendelig for måling af BOD5 fra 0,5-15 mg/L O2. 1.1 Detektionsgrænse Detektionsgrænsen er 0,5 mg/L O2 1.2 Interferenser Interferenser i forbindelse med iltmålingen er beskrevet i DS/EN 25814, mens interferenser for BOD bestemmelsen er beskrevet i DS/EN 1899-1. 2. Princip Prøven tempereres til 20ºC og iltes til mætning. Prøven anbringes mørkt i fyldte, hermetisk luk-kede glasflasker ved 20ºC i en periode på 5 dage. Indholdet af opløst ilt bestemmes før og efter inkubationen. Det biokemiske iltforbrug beregnes ud fra forskellen i koncentrationen af opløst ilt. Prøven kan fortyndes inden inkubation. Der tilsættes N-allylthiourea (ATU) for at undertrykke nitrifikation. 3. Reagenser Der skal benyttes kemikalier af analysekvalitet, med mindre andet er specificeret. Reagensvand til fremstilling af opløsninger og til fortynding skal have et BOD5 mindre end 0,2 mg/L O2 og kan være fra et Milli-Q anlæg fra Millipore eller tilsvarende kvalitet. 3.1 Allylthiourea (ATU) opløsning, 1 g/L Opløs 200 mg allylthiourea (C4H8N2S) i 200 ml vand og bland grundigt. Opbevar opløsningen ved 4ºC. Opløsningen er stabil i mindst 2 uger. Allylthiourea (ATU) er giftigt og skal derfor an-vendes efter producentens anvisninger. 3.2 Iltet fortyndingsvand. Vand iltes til mætning med udstyret beskrevet i 4.6. 3.3 Kontrolstamopløsning Certificeret referencemateriale QC WW5 (stamopløsning 2060 mg/L O2 i batch VKI-21-2-0897) eller tilsvarende, alternativt stamopløsning fremstillet af en blanding af glukose og glutaminsyre.

A-2

4. Udstyr Der skal anvendes almindeligt laboratorieudstyr samt: 4.1 Inkubationsflasker, BOD flasker Glasflasker med tætsluttende, indsleben glasprop på 250-300 mL, der er grundigt rengjorte in-den brug for at undgå kontaminering eller inhibering. 4.2 Beholder til fortyndingsvand, glas eller plast Denne skal være ren og fri for mikroorganismer, der kan medføre en forhøjning af blindværdien. 4.3 Inkubator Klimarum eller thermostateret skab med temperatur på 20±1ºC. 4.4 Apparatur til at bestemmelse af opløst ilt Der benyttes udstyr til elektrodebestemmelse af opløst ilt som beskrevet i DS/EN 25814. 4.5 Fortyndingsflaske 1,0 liter bægerglas eller tilsvarende. 4.6 Beluftningsudstyr Gasflaske med trykluft, kompressor eller peristaltisk pumpe, hvor luftkvaliteten må ikke give an-ledning til kontaminering ved f.eks. at tilføre organisk materiale eller ved oxidation af reduceren-de forbindelser eller metaller. 5. Opbevaring af prøve Prøver skal opbevares mørkt ved 4ºC i en fyldt, hermetisk lukket beholder efter prøvetagningen. Analyserne skal påbegyndes umiddelbart efter prøvetagningen, eller højest 24 timer herefter. 6. Fremgangsmetode For ukendte prøver skal der altid udføres en analyse uden fortynding (6.2) og to analyser med forskellige fortyndinger (6.3). For prøver med kendt indhold udføres altid analyse af 2 fortyndin-ger, som begge falder indenfor det tilladte iltforbrug (7.1). 6.1 Forbehandling Metoden er beregnet til prøver af spildevand fra udløb fra renseanlæg, hvor forbehandling ikke skønnes nødvendig. Er forbehandling nødvendig, benyttes i stedet fortyndingsmetoden DS/EN 1899-1. 6.1.1 Iltmætning af prøven inden analyse Bring prøven til en temperatur på 20±1ºC og beluft med udstyret beskrevet i 4.6 indtil mætning. Ryst prøven og lad den stå i 15 minutter for at undgå overmætning med ilt.

A-3

6.2 Fremstilling af testopløsning (uden fortynding) Fyld fortyndingsflasken (4.6) halvt med prøve og tilsæt 2 mL allylthiourea (3.1). Fyld op til 1,0 L med prøve. 6.3 Fremstilling af testopløsning (med fortynding) Afmål prøve i fortyndingsflasken (4.6) svarende til den ønskede fortynding. (X ml prøve). Tilsæt 2*X/1000 mL allylthiourea (3.1). Fyld op til 1,0 L med iltet fortyndingsvand (3.2) 6.4 Blank test Udfør en kontrol af blankværdien parallelt med analyserne af prøverne. Følg fremgangsmeto-den beskrevet i 6.2, Fortyndingsvandet (3.2) anvendes i stedet for prøve. Tilsæt 2 mL allylthiou-rea (3.1) per liter. 6.5 Bestemmelse af opløst oxygen For hver testopløsning (6.2; 6.3) og blank test (6.4) fyldes to inkubationsflasker (4.1) til overløb. Lad eventuelle luftbobler på glassiderne forsvinde ud af inkubationsflaskerne. Mål indholdet af opløst ilt i hver inkubationsflaske (4.4). Denne måling giver iltindholdet til tiden 0. Anbring alle inkubationsflaskerne mørkt i inkubator (4.3) i 5 dage ± 4 timer. Mål indholdet af opløst ilt i hver inkubationsflaske efter de 5 dage (4.4). Denne måling giver ilt-indholdet til tiden 5 dage. 6.6 Kontrolanalyse I hver serie udføres for mindst én prøve dobbeltbestemmelse, hvorefter udregnes den relative variationsbredde ri, jf. beskrivelse i 7.2.3 i DS/EN 1899-2: ri = (BOD51-BOD52)*100/(½*(BOD51+BOD52)) I hver analyseserie udføres tillige mindst en kontrolanalyse, hvor 2 mL af en kontrol opløsning med cirka 2000 mg/L O2 som BOD5 (3.3) fortyndes til 1 L testopløsning med prøve og analyse-res som angivet i 6.3 og 6.5. Genfindingen af tilsætning Di beregnes som forskellen imellem resultatet xs for prøven tilsat kontrolopløsning og resultatet x for prøven selv.: Di = xs-x ri indsættes i r-kort til kontrol af analysens statistiske stabilitet, og repeterbarheden estimeres som den relative standardafvigelse CV udfra den gennemsnitlige, relative variationsbredde r: CV = r/1,128 % Di indsættes i D kort, og metodens relative genfinding P estimeres udfra den gennemsnitlige genfinding D og den beregnede værdi af tilsætningen, d: P = D/d*100%

A-4

7. Beregning af resultat 7.1 Bestemmelse af fortynding Til udregning af BOD5 benyttes de testopløsninger, der opfylder kravet: 0,05*C1 < (C1-C2) < 0,95*C1 , hvor C1 er opløst ilt ved tiden 0 i mg O2/L, og C2 er opløst ilt ved tiden 5 dage i mg O2/L Der kan uden at påvirke analysen benyttes fortynding op til 3,5 gange. 7.2 Beregning af BOD5 uden fortynding Det biokemiske oxygenforbrug efter 5 dage beregnes i mg O2/L ved BOD5= (C1-C2) C1 og C2 er beskrevet i 7.1 7.3 Beregning af BOD5 med fortynding Det biokemiske oxygenforbrug efter 5 dage beregnes i mg O2/L ved BOD5= [(C1-C2) – (Vt-Ve)/Vt*(C3-C4)]*Vt/Ve C1 og C2 er beskrevet i 7.1. C3 er koncentrationen af opløst ilt fundet i blank testen (6.4) ved tiden 0 i mg O2/L. C4 er koncentrationen af opløst ilt fundet i blank testen (6.4) ved tiden 5 dage i mg O2/L Ve er volumen af prøve benyttet til fremstilling af testopløsningen (se 6.3) i mL. Vt er det totale volumen til fremstilling af testopløsningen (se 6.3) i mL. 7.4 Beregning af endeligt resultat Gennemsnittet af de udregnede BOD5 resultater for mindst 2 fortyndinger (inkl. ufortyndet), der opfylder kravet i 7.1, benyttes som analyseresultat. Resultatet angives med 2 betydende cifre. 8. Rigtighed og præcision Ved valideringen af analysemetoden er det fundet, at den kan benyttes med en total standard-afvigelse på 0,15-0,30 mg/L O2 under 7,5 mg/L O2 BOD og med en relativ standardafvigelse på 3-5% over denne værdi. Genfindingen af tilsat BOD var i gennemsnit 100-113%. 9. Rapport Rapporten skal indeholde: 1. Reference til denne metode 2. Angivelse af, at nitrifikation var undertrykt

A-5

3. Resultatet i mg/L O2 4. Bemærkninger om eventuelle modifikation i metoden eller andre supplerende oplysning om

analysens gennemførelse Det skal endvidere anføres, om BOD5 resultater er fundet med eller uden fortynding.

B I L A G B

Deltagerliste

B-1

NAVN

A/S AnalyCen

Eurofins A/S, Hørsholm

Eurofins Danmark A/S, Odense

Jysk Miljølaboratorium A/S

MILANA Miljølaboratoriet

Miljøcenter Vestjylland I/S

Mølleåværkets Driftslaboratorium

ROVESTA Miljø I/S

Steins Laboratorium A/S

B I L A G C

Information til deltagerne

C-1

Til deltagere i BOD metodeafprøvning

Vedr.: Metodeafprøvning af modificeret metode til BOD i udløbsvand frarenseanlæg

Tak for tilmeldingen til afprøvningen af den ny metode til BOD i udløbsvand frarenseanlæg (DS/EN 1899-2 (NY)).

Følgende prøvevand og ampuller er udsendt sammen med dette brev: Spildevand 1: Dunk med 10 liter Spildevand 2: Dunk med 5 liter Kontrolampul: 1 stk. ampul med 25 mL indhold Spike-ampuller: 3 stk. brune ampuller om ca. 22 mL

Resultatskemaet bedes returneret til KPMG, senest den 27. september 2002.

De modtagne resultater vil indgå anonymt i datatilbagemelding og i rapport. Navne på de laboratoriersom har deltaget i metodeafprøvningen vil indgå i rapporten.

De bearbejdede resultater vil blive udsendt til korrekturlæsning og information i tabel- ogdiagramform.

Såfremt der er problemer med de modtagne prøver eller spørgsmål i øvrigt i forbindelse med dennemetodeafprøvning, er De naturligvis velkommen til at kontakte os.

Med venlig hilsenEurofins A/S

Mikael Krysell Ulla O. Lund

Eurofins A/SAgern Allé 112970 Hørsholm

Tlf.: +45 70 22 42 30Fax: +45 70 22 42 55E-mail: [email protected]: www.eurofins.dk

Dato: 3. sep 2002Init.: MIKSag: 20038-13

C-2

VEJLEDNING

Fremgangsmåde for analyse:

En oversigt over de analyser som bedes udført findes i følgende tabel:

Prøve-nummer

Prøvebeskrivelse ForventetBOD5

DS/EN 1899-1

(antal analyser)

Laboratorietsnormalemetode

(antal analyser)

DS/EN 1899-2(NY)

(antal analyser)1 Spildevand 1 ca. 1 mg/L O2 2 22 Spildevand 2 ca. 3 mg/L O2 23 Kvalitetskontrol ca. 4 mg/L O2 2 24 Spildevand 1 + spike 1 ca. 6 mg/L O2 2 25 Spildevand 2 + spike 2 ca. 12 mg/L O2 26 Spildevand 1 + spike 3 ca. 15 mg/L O2 2 27 Laboratoriets

fortyndingsvand<1 mg/L O2 1 1-3

(gennemsnitrapporteres)

3. Spildevand 1: Afløbsvand fra renseanlæg med hovedsageligt husholdningsspildevand4. Spildevand 2: Afløbsvand fra renseanlæg belastet med industri-spildevand5. Kvalitetskontrol: En ampul med et kendt indhold fortyndet med laboratoriernes eget

podemateriale og efterkorrigeret med podematerialets bidrag.6. Spike 1, 2 og 3: Ampuller med spike-materiale7. Fortyndingsvand: For 1899-1 podevandet, for 1899-2 (NY) rent fortyndingsvand

(millipore eller tilsv.)

Instruks til fremstilling af prøverne:

Fremstilling af prøve 1 og 2:

Spildevand 1 og 2 er færdige til analyse. Laboratoriet bedes udføre dobbeltbestemmelse af beggeprøver ifølge DS/EN 1899-2 (ny), og desuden en dobbeltanalyse af Spildevand 1 ifølge denmetode laboratoriet normalt bruger.

Da den forventede koncentration er rimlig godt kendt, regner vi med at det vil være nok med 2fortyndinger (i praksis måske kun uden fortynding, da BOD er lav i begge prøver).

Fremstilling af prøve 3:

Ampul mærket ”Prøve 3, Kontrol” stabiliseres ved stuetemperatur, og knækkes på en sådanmåde at glasdele ikke falder ned i den. Indholdet fortyndes 100 gange med laboratoriets egetpodevand, f.eks. fortyndes 20 mL til 2000 mL.

C-3

Fremstilling af prøve 4-6

Ampullerne stabiliseres ved stuetemperatur, og knækkes på en sådan måde at glasdele ikke falderned i dem. Spikemateriale udtages med pipette ifølge tabel neden:

Prøve mL spikemateriale Fortyndes med spildevand op til(mL):

Spildevand 1 + spike 1 10,00 5000Spildevand 2 + spike 2 10,00 2000Spildevand 1 + spike 3 10,00 2000

Analyserne bedes udført i tilfældig rækkefølge for hver metode.

Rapportering af resultater:

Resultatskemaet bedes brugt til rapportering af resultaterne.

NB! Hvis flere end én fortynding overholder kravet til iltforbrug, bedes laboratoriet rapportere etgennemsnit for det to fortyndinger (ifølge afsnit 7.3 i 1899-2 (NY)). Eksempel: For en prøvefremstilles dobbeltprøve i to fortyndinger, altså totalt 4 prøver. Hvis alle 4 overholder kravet tililtforbrug, bliver Resultat 1 gennemsnittet af resultaterne af den første flaske i hver fortynding,og Resultat 2 gennemsnittet af resultaterne for den anden flaske i hver fortynding, således at bådeResultat 1 og 2 er beregnet som et gennemsnit af de to fortyndinger.

Venligst husk at angive metodekode for den metode laboratoriet har brugt som sin normalemetode.

Resultaterne bedes sendt til:KPMGAtt.: Gitte GoldschmidtBorups Allé 1772000 Frederiksberg

fax 3818 3882

således at de er KPMG i hænde senest 27. september 2002

Analyseresultater for metodeafprøvning af ny BOD-metode (DS/EN 1899-2 (NY)

DS/EN 1899-1

BOD5 (mg/L O2)

Laboratoriets normale metode

BOD5 (mg/L O2)

DS/EN 1899-2 (NY)

BOD5 (mg/L O2)

Prøve-nummer

Prøvebeskrivelse

Resultat 1* Resultat 2* antal# Resultat 1* Resultat 2* antal# Resultat 1* Resultat 2* antal#

1a Spildevand 1

2a Spildevand 2

3a Kvalitetskontrol

4a Spildevand 1 + spike 1



7 Laboratoriets fortyn-dingsvand

*: Resultaterne bedes angivet med tre betydende cifre. #: Antal fortyndinger som brugtes ved beregning af resultaterne Kodenr: Metodekode for laboratoriets normale metode: __________ (se tabel næste side) Udfyldes af KPMG Denne del opbevares af KPMG Kodenr: Udfyldes af KPMG Laboratorium: ____________________________________________ Underskrift: ______________________________ Dato: _________________ Resultatskemaet bedes returneret til: KPMG, att: Gitte Goldschmidt (Fax nr. 3818 3882), senest 27. september 2002

C-4

C-5

Metodekoder for ”laboratoriets normale metode”

Den metode som er brugt bedes anført på resultatskemaet

Metode-nummer

Princip Reference

Standardmetoder

1 Prøven fortyndes med oxygenholdigt vand, podevand, salte ogA.T.U (2 mg/L). Prøven inkuberes i helt fyldte, lukkede flaskeri mørke i 5 døgn ved 20°C. Oxygenindholdet bestemmes før ogefter inkubation.

DS/EN 1899-1:1999;EN 1899-1:1998

2A

2B

Prøven fortyndes med oxygenholdigt vand, podevand og salte.Prøven tilsættes A.T.U. Inkubationsperioden er som vedmetode 1.Tilsat mængde A.T.U.:

2 mg/L.

Andet mg/L – specificer venligst mængde under kommentarer iresultatskema.

DS 254/R, 1. udg.:1977

3 Prøven tempereres og beluftes om nødvendigt. Prøveninkuberes i helt fyldte, lukkede flasker i mørke i 5 døgn ved20°C. Oxygenindholdet bestemmes før og efter inkubation.

DS/EN 1899-2:1999;EN 1899-2:1998

4 Prøven fortyndes med oxygenholdigt vand, podevand og salte.Prøven tilsættes stof til hæmning af nitrifikation.Inkubationsperioden er som ved metode 1.

SM 19.-20. udg. metode5210 B

Hurtigmetoder

51 Dr. Lange 4-1650 mg/L Dr. Lange LCK 555

52 Dr. Lange 0,5 – 12 mg/L. Dr. Lange LCK 554

Andre metoder

99 Anden metode (venligst anfør):

Hvis reference er anført under ”Anden metode”, bedes også denne side returneret sammen med resultatskemaet.

Kodenr:Udfyldes af KPMG

B I L A G D

Resultater fra test af potentielle referencestoffer

D-1

Forforsøg 1 (lactose og phenylalanin) Prøve Startværdi Slutværdi Blind – 4 dage 8.21 8.09 Blind – 4 dage 8.21 9.07 Blind – 5 dage 8.19 8.24 Blind – 5 dage 8.18 8.07 Lactos – 4 dage 8.20 0.07 Lactos – 4 dage 8.19 0.05 Lactos – 5 dage 8.24 0.06 Lactos – 5 dage 8.23 0.05 Phenylalanin – 4 dage 8.32 0.08 Phenylalanin – 4 dage 8.32 0.05 Phenylalanin – 5 dage 8.26 0.07 Phenylalanin – 5 dage 8.26 0.05

Forforsøg 2 (natriumbenzoat) Prøve Startværdi Slutværdi Blind – 4 dage 7.60 6.74 Blind – 4 dage 7.57 6.55 Blind – 5 dage 7.57 6.95 Blind – 5 dage - 6.88 Na-benzoat – 4 dage 7.63 0.97 Na-benzoat – 4 dage 0.84 Na-benzoat – 5 dage 7.61 1.09 Na-benzoat – 5 dage 2.05

B I L A G E

Prøvefremstilling

E-1

Spildevand 1 Renset spildevand fra fra Nivå renseanlæg (hovedsageligt hus-holdningsspildevand). Vandet blev hentet fredag den 30. august og stabiliseret ved beluftning ved brug af peristaltisk pumpe weekenden over. Mandag den 2. september blev prøven fordelt på 10 L dunke og udsendt til laboratorierne

Spildevand 2 Renset spildevand fra fra Lundtofte renseanlæg (bidrag fra indu-strispildevand). Vandet blev hentet fredag den 30. august og sta-biliseret ved beluftning ved brug af peristaltisk pumpe weekenden over. Mandag den 2. september blev prøven fordelt på 5 L dunke og udsendt til laboratorierne

Ampulopløsninger Fremstilles i glasbeholder. Glasset renses ved vask og glødning. Kemikalierne tørres i varmeskab ved 105 grader i to timer Ampul Spike 1

Stof Stofmængde Færdig koncentration D-Glucose 8,9276 g L-glutaminsyre 8,9278 g Milli-q vand op til 5000 mL

2500 mg/L O2 som BOD5

Opløsningen fyldes på 150 stk 25 mL brune ampuller mærket A1, hvor der fyldes min. 20 mL i hver ampul. Ampullerne autoklaveres. Ampul Spike 2

Stof Stofmængde Færdig koncentration D-Glucose 3,8586 g L-glutaminsyre 3,8560 g Milli-q vand op til 3000 g


Opløsningen fyldes på 50 stk 25 mL brune ampuller mærket A2, hvor der fyldes ca. 20 mL i hver ampul. Ampullerne autoklaveres. Ampul Spike 3

Stof Stofmængde Færdig koncentration D-Glucose 9,9970 g L-glutaminsyre 9,9944 g Milli-q vand op til 5000 mL


Opløsningen fyldes på 150 stk 25 mL brune ampuller mærket A3, hvor der fyldes ca. 20 mL i hver ampul. Ampullerne autoklaveres.

E-2

Kvalitetskontrol Standardampul til interlaboratorieundersøgelse, PP4, etiketteres "Prøve 3, kontrol". Fremstilling af PP4:

Stof Stofmængde Færdig koncentration

D-Glucose 2,99 g L-glutaminsyre 2,99 g Milli-q vand op til 10000 g


Opløsningen fyldes på 360 stk 25 ml brune ampuller, hvor der fyldes 25 ml i hver am-pul. Ampullerne autoklaveres.

B I L A G F

Homogenitet og stabilitet

F-1

Homogeneity test

Sample Parameter

Date Sample I II M. bottle Var.replicate Day mean Day var.

11-16-02 Ampul 1 1633 1647 1640.0 98Ampul 2 1647 1640 1643.5 25Ampul 3 1682 1645 1663.5 685Ampul 4 1639 1655 1647.0 128Ampul 5 1654 1655 1654.5 1Ampul 6 1629 1641 1635.0 72Ampul 7 1639 1572 1605.5 2245Ampul 8 1595 1670 1632.5 2813Ampul 9 1639 1659 1649.0 200Ampul 10 1649 1630 1639.5 181Ampul 11 1644 1548 1596.0 4608Ampul 12 1635 1653 1644.0 162 1637.5 369

Homogeneity s var. fF test value = var.bottle/var.rep. 0.394 Replicate 30.571 934.58 12F critical value = inv. 95%(f bottle,f rep) 2.717 Bottle 19.196 368.50 11F critical value = inv.99%(f bottle,f rep) 4.220

14.40

Conclusion

Ampul spike 3NVOC, mg/L

BOD metodeafprøvning

Eurofins' standard deviation from internal quality control s(w) =

Rep. = Replicate = within the bottleBottle = between bottlesf = number of degrees of freedom

s = standard deviationM. = meanVar. = variance

Homogeneity: The standard deviation between bottles was tested against the standard deviation within a bottle. As the F-test value is less than 1 in the homogeneity test, the samples are considered homogeneous.

B I L A G G

Symboler og forkortelser

G-1

Tabeller < "Mindre end" er ikke medtaget i beregningerne U, UL, ** Manuelt udelukkede resultater UC, C** Cochran outlier. Resultaterne er ikke medtaget i den statistiske be-

handling UG, G** Grubbs outlier. Resultaterne er ikke medtaget i den statistiske

behandling

Plots < "Mindre end" er ikke medtaget i plots U, UL, ** Manuelt udelukkede resultater, ikke medtaget i plots • Nominel værdi (= ”sand” værdi)

Statistiske symboler µ Nominel værdi p Antal laboratorier der indgår i beregningerne. Dette svarer til antal

rapporterede resultater minus eventuelle udelukkelser efter sagkyndig vurdering (**) minus Cochran outliers (UC) og minus Grubbs out-liers (UG)

n Antal resultater medtaget i beregningerne m Middelværdi af alle ikke-udelukkede resultater M Median d Den gennemsnitlige differens mellem resultater fra et prøvepar, kor-

rigeret for split t Test størrelse ved Student's t-test p Et sandsynlighedsniveau for en statistisk test s Standardafvigelse F Test størrelse for F-test si Den enkelte deltagers standardafvigelse, svarende til variationen ved

gentagene bestemmelser af en prøve sr Standardafvigelse inden for ét laboratorium sr

2 Repeterbarhed sL Standardafvigelse mellem laboratorierne sL

2 Laboratorievarians sR Standardafvigelse på reproducerbarheden sR

2 Reproducerbarhed sR

2 = sr2 + sL

2 CVr Variationskoefficient inden for ét laboratorium

(sr . 100)/µ CVR Total variationskoefficient

(sR . 100)/µ

B I L A G H

Kontrol af genfinding

BOD5 (DS/EN 1899-2(NY)), mg/L O2 Kontrol af genfinding, gennemsnit af resultater

Laboratorium Niveau 1

Niveau 2

Niveau 3

Niveau 4

Niveau 5

Niveau 6

Niveau 7

1 1.175 0.865 3.860 5.920 9.840 13.40 0.210 2 1.005 0.600 - 5.465 8.735 12.30 0.180 3 1.180 0.765 3.740 5.530 9.575 12.90 -0.020 4 1.370 1.175 4.040 6.045 10.100 14.70 0.325 5 1.335 1.005 2.360 6.375 10.430 14.24 0.160 6 0.850 1.105 UC - - 10.600 - - 7 1.250 0.847 4.060 5.440 10.200 12.75 0.317 8 1.535 1.050 - 6.075 - 14.25 0.240

Antal lab., p 8 7 5 7 7 7 7 Antal repl., n 2 2 2 2 2 2 2 m 1.212 0.901 3.612 5.836 9.926 13.51 0.202 s² 0.046 0.037 0.507 0.131 0.394 0.82 0.014 s 0.215 0.192 0.712 0.362 0.628 0.91 0.116 Nominel værdi, µ 1.05 0.95 4.19 6.03 9.95 15.0 0.21 Genfinding, % 115.5 94.8 86.2 96.8 99.8 90.0 96.1 t = √p · (m-µ)/s 2.1425 -0.6758 -1.8146 -1.4198 -0.1024 -4.3649 -0.1882 Sign. niveau, p(t) 0.0694 0.5244 0.1438 0.2055 0.9218 0.0047 ** 0.8569

* markerer, at t-testet er signifikant på et 5%-niveau ** markerer, at t-testet er signifikant på et 1%-niveau *** markerer, at t-testet er signifikant på et 0,1%-niveau UC markerer en Cochran outlier

H-1

BOD5 (Laboratoriets normale metode), mg/L O2 Kontrol af genfinding, gennemsnit af resultater


Niveau 2

Niveau 3

Niveau 4

Niveau 5

Niveau 6

Niveau 7

1 1.070 - - 5.625 - 11.45 - 2 1.100 - - 5.700 - - - 3 1.070 - - 5.800 - 14.95 - 4 1.380 - - 4.760 - 9.87 - 5 1.450 - - 6.450 - 15.80 - 6 0.915 - - - - - - 7 0.513 - - 5.290 UC - 14.40 - 8 2.585 - - 7.425 - 13.59 -

Antal lab., p 8 0 0 6 0 6 0 Antal repl., n 2 2 2 2 2 2 2 m 1.260 - - 5.960 - 13.34 - s² 0.369 - - 0.806 - 5.10 - s 0.607 - - 0.898 - 2.26 - Nominel værdi, µ 0.95 - - 5.93 - 14.9 - Genfinding, % 132.7 - - 100.5 - 89.5 - t = √p · (m-µ)/s 1.4457 - - 0.0818 - -1.6901 - Sign. niveau, p(t) 0.1915 - - 0.9380 - 0.1518 -

Ingen teststørrelser blev fundet signifikante. UC markerer en Cochran outlier

H-2

BOD5 (DS/EN 1899-1), mg/L O2 Kontrol af genfinding, gennemsnit af resultater


Niveau 2

Niveau 3

Niveau 4

Niveau 5

Niveau 6

Niveau 7

1 - - 3.960 - - - 1.290 2 - - - - - - 0.900 3 - - 4.210 - - - 0.600 4 - - 4.390 - - - 0.270 5 - - 4.750 - - - 0.600 6 - - - - - - - 7 - - 3.840 - - - 0.470 8 - - 4.930 - - - 1.020

Antal lab., p 0 0 6 0 0 0 7 Antal repl., n 2 2 2 2 2 2 2 m - - 4.347 - - - 0.736 s² - - 0.186 - - - 0.123 s - - 0.431 - - - 0.351 Nominel værdi, µ - - 4.19 - - - 0.60 Genfinding, % - - 103.7 - - - 122.6 t = √p · (m-µ)/s - - 0.8899 - - - 1.0229 Sign. niveau, p(t) - - 0.4143 - - - 0.3458

Ingen teststørrelser blev fundet signifikante.

H-3

B I L A G I

Resultater fra deltagerne

I-1

BOD5 DS/EN 1899-2 (NY), mg/L O2

Prøve 1 2 3 4 Nominel værdi Nominel værdi Nominel værdi Nominel værdi 1,05 0,95 4,19 6,03 Laboratorium

1 1,18 1,17 0,89 0,84 4,10 3,62 5,93 5,91 2 1,04 0,97 0,61 0,59 - - 5,53 5,40 3 1,19 1,17 0,71 0,82 3,91 3,57 5,37 5,69 4 1,42 1,32 1,19 1,16 3,99 4,09 5,95 6,14 5 1,28 1,39 0,97 1,04 2,72 2,00 6,38 6,37 6 0,94 0,76 1,30 0,91 - - - - 7 1,32 1,18 0,830 0,863 4,06 4,06 5,00 5,88 8 1,56 1,51 1,07 1,03 - - 6,12 6,03

BOD5 egen metode,

mg/L O2 BOD5 DS/EN 1899-1,

mg/L O2 BOD5 egen metode,

mg/L O2 Prøve 1 3 4

Nominel værdi Nominel værdi Nominel værdi 0,95 4,19 5,93 Laboratorium

1 1,08 1,06 4,29 3,63 5,63 5,62 2 1,0 1,2 - - 5,6 5,8 3 1,12 1,02 4,18 4,24 5,78 5,82 4 1,43 1,33 4,45 4,33 4,69 4,83 5 1,4 1,5 4,8 4,7 6,6 6,3 6 0,95 0,88 - - - - 7 0,513 0,513 4,12 3,56 5,82 4,76 8 2,71 2,46 4,99 4,87 7,46 7,39

I-2

BOD5 DS/EN 1899-2 (NY), mg/L O2

Prøve 5 6 7 Nominel værdi Nominel værdi Nominel værdi 9,95 15,0 0,21 Laboratorium

1 9,86 9,82 13,4 13,4 0,21 - 2 8,54 8,93 12,4 12,2 0,18 - 3 9,52 9,63 12,8 13,0 -0,02 - 4 10,0 10,2 14,8 14,6 0,325 - 5 10,74 10,12 14,44 14,04 0,16 - 6 10,3 10,9 - - - - 7 10,0 10,4 13,3 12,2 0,317 - 8 - - 14,6 13,9 0,24 -

BOD5 egen metode,

mg/L O2 BOD5 DS/EN 1899-1,

mg/L O2

Prøve 6 7 Nominel værdi Nominel værdi 14,9 0,60 Laboratorium

Metode nr. for

egen metode 1 11,4 11,5 1,29 - 1 2 - - 0,90 - 2A 3 14,9 15,0 0,60 - 3/2A 4 9,98 9,75 0,270 - 1 5 16,0 15,6 0,6 - 2A 6 - - - - 2A 7 14,5 14,3 0,470 - 1 8 13,44 13,74 1,02 - 1

B I L A G J

Metoder

J-1

Metode-nummer

Princip Reference

Standardmetoder

1 Prøven fortyndes med oxygenholdigt vand, podevand, salte og A.T.U (2 mg/L). Prøven inkuberes i helt fyldte, lukkede flasker i mørke i 5 døgn ved 20°C. Oxygenindholdet bestemmes før og efter inkubation.

DS/EN 1899-1:1999; EN 1899-1:1998

2A

Prøven fortyndes med oxygenholdigt vand, podevand og salte. Prøven tilsættes A.T.U. Inkubationsperioden er som ved meto-de 1.

Tilsat mængde A.T.U.:

2 mg/L.

DS 254/R, 1. udg.:1977

3 Prøven tempereres og beluftes om nødvendigt. Prøven inkube-res i helt fyldte, lukkede flasker i mørke i 5 døgn ved 20°C. Oxygenindholdet bestemmes før og efter inkubation.

Tilsat mængde A.T.U.:

2 mg/L.

DS/EN 1899-2:1999, modificeret; EN 1899-2:1998-modificeret

B I L A G K

Grafisk afbilding af deltagernes resultater

K-1

0.7 1.0 1.3 1.6

1

2

3

4

5

6

7

8

Niveau 1

BOD5 (DS/EN 1899-2(NY)), mg/L O2

m

µ µ = Nominel værdi

Alle resultater inklusive outliers: n = 16 Middelværdi = 1.20Std.afv = 0.21Alle resultater eksklusive outliers: n = 16 Middelværdi = 1.20Std.afv = 0.21

K-2

0.5 0.8 1.1 1.4

1

2

3

4

5

6

7

8

Niveau 2


m



K-3

2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0

1

2

3

4

5

6

7

8

Niveau 3


m



Resultater der ikke er medtaget i ovenstående diagram: Laboratorium 5, resultat=2.00

K-4

5.0 5.5 6.0 6.5 7.0

1

2

3

4

5

6

7

8

Niveau 4


m



Resultater der ikke er medtaget i ovenstående diagram: Laboratorium 7, resultat=5.00

K-5

8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0

1

2

3

4

5

6

7

8

Niveau 5


m



K-6

12.0 12.5 13.0 13.5 14.0 14.5 15.0

1

2

3

4

5

6

7

8

Niveau 6


m



K-7

-0.10 0 0.10 0.20 0.30 0.40

1

2

3

4

5

6

7

8

Niveau 7


m



K-8

0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

1

2

3

4

5

6

7

8

Niveau 1

BOD5 (Laboratoriets normale metode), mg/L O2

m



K-9

4.0 5.0 6.0 7.0 8.0

1

2

3

4

5

6

7

8

Niveau 4


m



K-10

9 10 11 12 13 14 15 16

1

2

3

4

5

6

7

8

Niveau 6


m



K-11

3.0 3.5 4.0 4.5 5.0

1

2

3

4

5

6

7

8

Niveau 3

BOD5 (DS/EN 1899-1), mg/L O2

m



K-12

0 0.5 1.0 1.5 2.0

1

2

3

4

5

6

7

8

Niveau 7

BOD5 (DS/EN 1899-1), mg/L O2

m



B I L A G L

Resultater af supplerende forsøg

L-1

Prøver Prøve Prøvebeskrivelse Forventet BOD5 DS/EN 1899-1

(antal analy-ser)

DS/EN 1899-2 (NY) (antal analyser)

A Spildevand 1 a = ca. 1 mg/L O2 2 2 B Spildevand 2 b = ca. 3 mg/L O2 2 2 C Spildevand 1 +

Kvalitetskontrol a + 4,19 mg/L O2 2 2

D Spildevand 2 + Kvalitetskontrol

b + 4,19 mg/L O2 2 2

E Spildevand 1 + spi-ke 1

a + 5 mg/L O2 2 2

F Spildevand 2 + spi-ke 2

b + 9 mg/L O2 2 2

G Spildevand 1 + spi-ke 3

a + 14 mg/L O2 2 2

H Spildevand 3 c 2 2 I Spildevand 4 d 2 2 K Kvalitetskontrol for-

tyndet med podet fortyndingsvand

e + 4,19 mg/L O2 2 2

Spildevand 1 Renset spildevand fra fra Nivå renseanlæg (hovedsageligt hus-holdningsspildevand). Vandet blev hentet om morgenen samme dag som BOD-analyserne blev startet.

Spildevand 2 Renset spildevand fra fra Lundtofte renseanlæg (bidrag fra indu-strispildevand). Vandet blev hentet om morgenen samme dag som BOD-analyserne blev startet.

Spildevand 3 Renset spildevand fra fra Usserød renseanlæg (hovedsageligt husholdningsspildevand). Vandet blev hentet om morgenen samme dag som BOD-analyserne blev startet.

Spildevand 4 Renset spildevand fra fra Måløv renseanlæg (hovedsageligt hus-holdningsspildevand). Vandet blev hentet om morgenen samme dag som BOD-analyserne blev startet.

L-2

Resultater BOD5 (mg/L O2)

Prøve DS/EN 1899-2 (NY) DS/EN 1899-1 A 2,40 2,89 2,89 2,96 B 2,88 3,17 2,66 2,97 C 6,33 6,30 6,69 6,61 D 6,27 6,64 6,43 6,74 E 7,46 7,61 7,66 7,92 F 11,40 11,18 11,06 11,55 G 18,95 17,72 17,99 17,04 H 0,92 1,10 1,16 1,27 I 1,42 1,31 1,40 1,29 K 2,76* 3,13* 3,03* 2,78*

*: Referencelaboratoriets kontrol var usædvanligt lav ved pågældende analyseserie. Målingen vil blive gentaget.

B I L A G M

Endelig metodeforskrift (REFLAB Metode 2:2002)

M-1

Biokemisk oxygenforbrug over 5 døgn (BOD5) på lavt niveau med tilsætning af N-allylthiourea.

1. Omfang og anvendelsesområde Denne metode beskriver måling af biokemisk oxygenforbrug med en inkubationstid på 5 dage (BOD5) i spildevand fra udløb af rensningsanlæg. Metoden omfatter bestemmelse i ufortyndede og svagt fortyndede prøver, uden podning og med hæmning af nitrifikation. Metoden er anvendelig for måling af BOD5 fra 0,5-15 mg/L O2. Resultaterne fremkommer ved en kombination af biokemiske og kemiske reaktioner. De er der-for ikke så éntydige som resultater der baseres på f.eks. veldefinerede kemiske processer, men de giver en indikation af vandkvaliteten. 1.1 Interferenser Målingen kan påvirkes af stoffer, som er toksiske overfor mikroorganismer, f.eks. baktericider, toksiske metaller eller frit chlor, som vil hæmme den biokemiske oxidation. Tilstedeværelse af sådanne stoffer kan afsløres ved måling i flere forskellige fortyndinger som beskrevet i DS/EN 1899-1:1998, Annex B. Interferenser i forbindelse med oxygenmålingen er beskrevet i DS/EN 25814. 2. Princip Prøven tempereres til 20ºC og iltes til mætning. Prøven anbringes mørkt i fyldte, hermetisk luk-kede glasflasker ved 20ºC i en periode på 5 dage. Indholdet af opløst oxygen bestemmes før og efter inkubationen. Det biokemiske oxygenforbrug beregnes ud fra forskellen i koncentration af opløst oxygen. Prøven kan fortyndes indtil 3,5 gange inden inkubation. Der tilsættes N-allylthiourea (ATU) for at undertrykke nitrifikation. 3. Reagenser Der skal benyttes kemikalier af analysekvalitet, med mindre andet er specificeret. Reagensvand til fremstilling af opløsninger og til fortynding skal have et BOD5 mindre end 0,2 mg/L O2 og skal være grade 3 kvalitet (DS/EN ISO 3696:1995). Vandet må dog ikke indeholde mere end 0,01 mg/L kobber og skal være fri for chlor og chloraminer. 3.1 Allylthiourea (ATU) opløsning, 1 g/L Opløs 200 mg allylthiourea (C4H8N2S) i vand, fyld op til 200 mL og bland grundigt. Opbevar op-løsningen ved 4ºC. Opløsningen er stabil i mindst 2 uger. Allylthiourea (ATU) er giftigt og skal derfor anvendes efter producentens anvisninger. 3.2 Iltet fortyndingsvand. Vand iltes til mætning med udstyret beskrevet i 4.6. Vandet må ikke være overmættet med oxy-gen. Det skal derfor inden brug henstå 1 time i en beholder uden prop. 3.3 Kontrolstamopløsning Certificeret referencemateriale QC WW5 (stamopløsning 2060 mg/L O2 i batch VKI-21-2-0897) eller en blanding af glukose og glutaminsyre. En blanding bestående af 1500 ± 10 mg af hver

M-2

opløst i vand til 1000 mL har et empirisk BOD5 på 2100 ± 200 mg/L O2. Ved denne metode for-ventes en genfinding på ca. 95%. 4. Udstyr Der skal anvendes almindeligt laboratorieudstyr samt: 4.1 Inkubationsflasker, BOD flasker Glasflasker med tætsluttende, indsleben glasprop på 250-300 mL, der er grundigt rengjorte in-den brug for at undgå kontaminering eller inhibering. For eksempel kan anvendes vaskeproce-dure beskrevet i DS/EN 1899-2:1998. 4.2 Beholder til fortyndingsvand, glas eller plast Denne skal være ren og fri for mikroorganismer. Plastbeholdere skal kontrolleres for eventuelt bidrag til forhøjet blindværdi. 4.3 Inkubator Klimarum eller termostateret skab med temperatur på 20±1ºC. 4.4 Apparatur til at bestemmelse af opløst oxygen Der benyttes udstyr til elektrodebestemmelse af opløst oxygen som beskrevet i DS/EN 25814. 4.5 Fortyndingsflaske 1,0 liter bægerglas eller tilsvarende. 4.6 Beluftningsudstyr Gasflaske med trykluft, kompressor eller peristaltisk pumpe, hvor luftkvaliteten ikke må give an-ledning til kontaminering ved f.eks. at tilføre organisk materiale eller ved oxidation af reduceren-de forbindelser eller metaller. 5. Prøvetagning Ved prøvetagning skal der drages omsorg for at delprøver under prøvetagning holdes ved en temperatur mellem 0 og 4ºC. Det skal kontrolleres, at beholdere i prøvetager ikke giver anled-ning til forhøjet blindværdi. 6. Opbevaring af prøve Prøven skal efter prøvetagningen opbevares mørkt ved 4ºC i en fyldt, hermetisk lukket beholder af polyethylen eller glas. Analyserne skal påbegyndes umiddelbart efter prøvetagningen, eller højest 24 timer herefter. Prøven må ikke fryses. Det skal kontrolleres, at prøvebeholdere ikke giver anledning til forhøjet blindværdi. 7. Fremgangsmetode For ukendte prøver skal der altid udføres en bestemelse uden fortynding (7.2) og to bestemmel-ser med forskellige fortyndinger (7.3). For prøver med kendt indhold udføres altid 2 bestemmel-ser, som begge forventes at falde indenfor det tilladte oxygenforbrug (8.1).

M-3

7.1 Forbehandling Metoden er beregnet til prøver af spildevand fra udløb fra renseanlæg, hvor forbehandling (neu-tralisering, fjernelse af chlor, fjernelse af alger) ikke skønnes nødvendig. Er forbehandling nød-vendig, benyttes i stedet fortyndingsmetoden DS/EN 1899-1. 7.1.1 Iltmætning af prøven inden analyse Bring prøven til en temperatur på 20±1ºC og beluft med udstyret beskrevet i 4.6 indtil mætning. Ryst prøven og lad den stå i 15 minutter for at undgå overmætning med oxygen. 7.2 Fremstilling af testopløsning (uden fortynding) Fyld fortyndingsflasken (4.5) halvt med prøve og tilsæt 2 mL allylthiourea opløsning (3.1). Fyld op til 1,0 L med prøve. 7.3 Fremstilling af testopløsning (med fortynding) Afmål prøve i fortyndingsflasken (4.5) svarende til den ønskede fortynding. Prøvevolumen skal mindst være 285 mL, svarende til 3,5 gange fortynding. Tilsæt 2 mL allylthiourea opløsning (3.1). Fyld op til 1,0 L med iltet fortyndingsvand (3.2) 7.4 Blind test Udfør en kontrol af blindværdien parallelt med analyserne af prøverne. Følg fremgangsmetoden beskrevet i 7.2, Fortyndingsvandet (3.2) anvendes i stedet for prøve. Tilsæt 2 mL allylthiourea opløsning (3.1) per liter. 7.5 Bestemmelse af opløst oxygen For hver testopløsning (7.2; 7.3) og blind test (7.4) fyldes to inkubationsflasker (4.1) til overløb. Lad eventuelle luftbobler på glassiderne forsvinde ud af inkubationsflaskerne. Mål indholdet af opløst oxygen i hver inkubationsflaske med udstyret beskrevet i 4.4. Denne måling giver oxygenindholdet til tiden 0. Luk flaskerne omhyggeligt og sørg for, at der ikke indelukkes luftbobler på glasproppens under-side. Anbring alle inkubationsflaskerne mørkt i inkubator (4.3) i 5 dage ± 4 timer. Mål indholdet af opløst oxygen i hver inkubationsflaske efter de 5 dage med udstyret beskrevet i 4.4. Denne måling giver oxygenindholdet til tiden 5 dage. 7.6 Kontrolanalyse 7.6.1 Dobbeltbestemmelse på naturlig prøve I hver serie udføres for mindst én prøve dobbelt analyse, herunder det nødvendige antal fortyn-dinger for hver analyse. Derefter udregnes den relative variationsbredde ri:

M-4

%)(½

100)(

5251

5251

BODBODBODBOD

ri +⋅⋅−

=

ri indsættes i r-kort til kontrol af analysens statistiske stabilitet, og repeterbarheden estimeres som den relative standardafvigelse CV udfra den gennemsnitlige, relative variationsbredde, r :

%128,1rCV =

7.6.2 Tilsætning til naturlig prøve I hver analyseserie udføres tillige mindst en kontrolanalyse, hvor 2 mL af en kontrol opløsning med cirka 2000 mg/L O2 som BOD5 (3.3) fortyndes til 1 L testopløsning med prøve og analyse-res som angivet i 7.2/7.3 og 7.5. Genfindingen af tilsætning Di beregnes som forskellen imellem resultatet xs for prøven tilsat kontrolopløsning og resultatet x for prøven selv: Di = xs-x Di indsættes i D kort, og metodens relative genfinding P estimeres udfra den gennemsnitlige genfinding D og den beregnede værdi af tilsætningen, d:

%100d

DP ⋅=

8. Beregning af resultat 8.1 Krav til oxygenforbrug under testforløbet Til udregning af BOD5 benyttes de testopløsninger, der opfylder kravet: 0,05*C1 < (C1-C2) < 0,95*C1 , hvor C1 er opløst oxygen ved tiden 0 i mg/L O2, og C2 er opløst oxygen ved tiden 5 dage i mg/L O2. 8.2 Beregning af BOD5 uden fortynding Det biokemiske oxygenforbrug efter 5 dage beregnes i mg/L O2 ved BOD5= (C1-C2) C1 og C2 er beskrevet i 8.1. 8.3 Beregning af BOD5 med fortynding Det biokemiske oxygenforbrug efter 5 dage beregnes i mg/L O2 ved BOD5= [(C1-C2) – (Vt-Ve)/Vt*(C3-C4)]*Vt/Ve C1 og C2 er beskrevet i 8.1. C3 er koncentrationen af opløst oxygen fundet i blind testen (7.4) ved tiden 0 i mg/L O2.

M-5

C4 er koncentrationen af opløst oxygen fundet i blind testen (7.4) ved tiden 5 dage i mg/L O2. Ve er volumen af prøve benyttet til fremstilling af testopløsningen (se 7.3) i mL. Vt er det totale volumen til fremstilling af testopløsningen (se 7.3) i mL. 8.4 Beregning af endeligt resultat Gennemsnittet af de udregnede BOD5 resultater for alle fortyndinger (inkl. ufortyndet), der op-fylder kravet i 8.1, benyttes som analyseresultat. Resultatet angives med 2 betydende cifre. 9. Korrekthed, præcision og detektionsgrænse Ved en interlaboratorieundersøgelse i 2002 blev korrekthed, standardafvigelse for repeterbar-hed og reproducerbarhed, samt opnåelig detektionsgrænse bestemt. Interlaboratorieundersø-gelsen omfattede 7 prøver, som blev analyseret med dobbeltbestemmelse. I undersøgelsen del-tog 8 danske laboratorier. Ved bestemmelse af korrekthed er antaget, at den empiriske værdi i henhold til DS/EN 1899-1:1998 for BOD5 i en blanding af lige dele glukose og glutaminsyre er gældende. Herved giver en blanding af 1 g af hvert stof en BOD5 på 1,40 mg/L O2. Korrekthed: Middelgenfinding 95% varierende fra 88 til 101% (4 prøver). Repeterbarhedsstandardafvigelse: 0,05 – 0,09 mg/L O2 ved koncentration 1 mg/L O2 (2 prøver). 1 – 9% i koncentrationsområdet fra 4 til 15 mg/L O2 (4 prøver). Reproducerbarhedsstandardafvigelse: 0,1 - 0,2 mg/L O2 i koncentrationsområdet 0,2 - 1 mg/L O2 (3 prøver). 6 – 9% i koncentrationsområdet fra 4 til 15 mg/L O2 (4 prøver). Detektionsgrænse: Ud fra standardafvigelsen for repeterbarhed ved lav koncentration (0,05 – 0,09 mg/L O2) findes, at en detektionsgrænse på 0,5 mg/L O2 med sikkerhed kan overholdes. Detektionsgrænsen er i denne metode defineret som

rsdftDL ⋅= )(995,0 hvor sr er standardafvigelse for repeterbarhed for prøver med koncentration tæt på den forven-tede detektionsgrænse, t0,995 er Student’s t-værdi på 99,5% konfidensniveau og df er antallet af frihedsgrader for sr. 10. Rapport Rapporten skal indeholde: 5. Reference til denne metode 6. Angivelse af, at nitrifikation var undertrykt 7. Resultatet i mg/L O2 8. Bemærkninger om eventuelle modifikationer i metoden eller andre supplerende oplysninger

om analysens gennemførelse Det skal endvidere anføres, om BOD5 resultater er fundet med eller uden fortynding.

miljøstyrelsens referencelaboratorium metodeafprøvning ... · en metode til bod i afløbsvand kan...

Documents