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LABORATORIO DE SALUD AMBIENTAL

INSTRUCTIVO DE PREPARACION Y DILUCIN DE MUESTRAS DE ALIMENTOS

PARA ANLISIS MICROBIOLGICO

LSA I5.4 -ML00 INDICE

1. OBJETIVO ................................................................................................ 2 2. ALCANCE ..................................................................... ......................... 2 3. DOCUMENTOS RELACIONADOS ... .. 2

4. DEFINICIONES...... 2 5. RESUMEN .. 2

6. DESARROLLO..... 2 7. FORMULARIOS Y REGISTROS . 4

8. REFERENCIAS .. 4 9. ANEXOS .... 5

FECHA DE APROBACION: 25 de agosto de 2008

FECHA DE REVISION: 25 de agosto de 2008

REVISION: 02

NOMBRE CARGO FIRMA

APROBO Blga. Soledad Osorio Alva.

Directora del Laboratorio de Salud Ambiental - DIGESA

REVISO

Blga. Edith Villanueva Huamn

Aseguramiento de calidad. Laboratorio de Salud Ambiental DIGESA.

Blga. Aydee Valenzuela Warthon.

Jefa del rea de Microbiologa de Alimentos - Laboratorio de Salud Ambiental DIGESA.

ELABORO Blga. Patricia Nez Ramos. Analista de rea de Microbiologa de Alimentos- Laboratorio de Salud Ambiental DIGESA.


INSTRUCTIVO DE PREPARACIN Y DILUCIN DE MUESTRAS DE ALIMENTOS PARA ANLISIS

MICROBIOLGICO

Cdigo: LSA I5.4 -ML00 Pgina : 2 de 6 Fecha : 25/08/2008 Revisin: 02


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I OBJETIVO

Describir el procedimiento para la preparacin de las muestras y de las diluciones decimales para el anlisis microbiolgico de muestras de alimentos de acuerdo a lo indicado en la norma ISO 6887-1:1999.

II ALCANCE

Este mtodo se aplica a todo tipo de muestras de alimentos.

III DOCUMENTOS RELACIONADOS

Instructivo de preparacin y esterilizacin de medios de cultivo. IV DEFINICIONES

a) Dilucin primaria: es la solucin, suspensin o emulsin obtenida despus de pesar o medir una cantidad del producto bajo examen y mezclarla con una cantidad de nueve veces en proporcin de diluyente. Tiene por objeto obtener una distribucin lo ms uniforme posible de los microorganismos contenidos en la muestra destinada para el anlisis.

b) Diluciones decimales adicionales: son las suspensiones o soluciones obtenidas al mezclar un

determinado volumen de la dilucin primaria con un volumen de 9 veces un diluyente y que por repeticin de esta operacin con cada dilucin as preparada, se obtiene la serie de diluciones decimales adecuadas para la inoculacin en los medios de cultivo. La preparacin de diluciones decimales adicionales, si son necesarias, tiene como objetivo reducir el nmero de microorganismos por unidad de volumen, para permitir, despus de la incubacin, la observacin de la prueba en el caso de tubos o el recuento de colonias en el caso de placas.

V RESUMEN

Se basa en la preparacin de diluciones primarias, para obtener una distribucin lo ms uniforme posible de los microorganismos presentes en la porcin de prueba.

VI DESARROLLO 6.1 Diluyente 6.1.1 Solucin peptona salina. 6.1.2 Agua de peptona buferada. 6.2 Equipos y materiales.

6.2.1 Balanzas, con una sensibilidad de 0,01g. 6.2.2 pH-metro, exactitud + 0,1 unidad de pH a 25 C. 6.2.3 Stomaccher Licuadora. 6.2.4 Homogenizador tipo vortex, 6.2.5 Refrigeradora. 6.2.6 Frascos de dilucin, capacidad de 100 mL, autoclavables. 6.2.7 Pipetas graduadas serolgicas, vaciado total, de capacidad de 1 y 10 mL, graduado en

divisiones de 0,1 y 0,5 mL respectivamente. 6.2.8 Tubos con tapa rosca de 16 x 160 mm de dimetro. 6.2.9 Probetas, matraces, esptulas. 6.2.10 Instrumentos utilizados para abrir los envases de la muestras (abridores de lata, tijeras, etc.)

deben estar estriles.



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6.2.11 Instrumentos utilizados para tomar las muestras (cucharas, tenedores, pinzas) deben estar estriles.

6.2.12 Material diverso como alcohol 70%, algodn, plumn indeleble.

6.3 Preparacin de las muestra 6.3.1 Manipular la muestra de tal manera que se evite todo riesgo de contaminacin, tomar las

siguientes precauciones: - Cuando no se trabaje en una cabina de bioseguridad, trabajar siempre cerca de la flama del

mechero. - Limpiar la superficie del envase de la muestra que ser abierta con 70% de etanol. - Todos los instrumentos utilizados para abrir la muestra (abridores de lata, tijeras etc.), deben

ser estriles. - Todos los instrumentos utilizados para pesar o medir la muestra (cucharas, tenedores,

pipetas etc.) deben ser estriles. - Marcar cuidadosamente el cdigo de laboratorio de la muestra, en los frascos, recipientes

que sern utilizados para analizar las muestras.

6.3.2 Si la muestra esta congelada descongelarla en su envase original (o en el recipiente que llego al laboratorio) durante un mximo de 18 horas en un frigorfico a 2 -5 C. Si la muestra congelada puede ser fcilmente triturada (como sucede con los helados), no es necesario descongelarla.

6.4 Preparacin de la suspensin inicial (primera dilucin).

6.4.1 Pesar en un recipiente estril o en una bolsa de plstico, previamente tarado, 10 g o 10 mL de la muestra con una incertidumbre de 5%.

6.4.2 Adicionar 90 mL del diluyente. Esta cantidad debe ser medida preferiblemente por masa con una incertidumbre de 5% o por volumen con una incertidumbre de 5%.

6.4.3 Para evitar daar los microorganismos, por un cambio de temperatura; la temperatura del diluyente durante el anlisis debe ser aproximadamente el mismo de la temperatura ambiente.

6.4.4 Homogenizar la muestra, ya sea en la licuadora con el tiempo suficiente para conseguir un total de 15,000 a 20,000 revoluciones por no mas 2,5 minutos haciendo uso del homogenizador tipo stomaccher durante 60 segundos.

6.4.5 Si es necesario, dejar que las partculas grandes sedimenten, durante 15 minutos. 6.5 Preparacin de las diluciones decimales adicionales 6.5.1 Transferir, por medio de una pipeta, 1 mL de la suspensin inicial (primera dilucin), con una

incertidumbre de 5%. a un tubo conteniendo 9 mL de diluyente estril a la temperatura apropiada. Para una ptima precisin no introducir la pipeta ms de 1 cm dentro de la dilucin inicial.

6.5.2 Mezclar cuidadosamente con un homogenizador durante 5 a 10 segundos, para obtener la

dilucin 10-2. 6.5.3 Repetir esta operacin tomando 1 mL de la dilucin 10-2. Se debe utilizar una pipeta estril

diferente para cada una de las diluciones 10-2, 10-3, 10-4, etc., hasta que se obtenga el numero apropiado de microorganismos. La seleccin de las diluciones que se vayan a preparar depende del nmero esperado de microorganismos en la muestra, con base a los resultados de anlisis previos y de la informacin que se obtenga del personal de inspeccin que la haya colectado.



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6.6 Duracin del procedimiento

En general el tiempo entre el termino de la preparacin de la suspensin inicial y la inoculacin en los medios de cultivo no debe exceder 45 minutos, tener en cuenta que no debe pasar mas de 30 minutos entre la preparacin de la suspensin inicial y el comienzo de la preparacin de las siguientes diluciones decimales.

6.7 Control de calidad

6.7.1 Se lleva un control del diluyente inoculando 1 mL en un tubo o placas con el medio respectivo y se incuban.

VII FORMULARIOS Y REGISTROS 7.1 Se anota en el Registro de resultados.

VIII REFERENCIAS 8.1 ISO 6887-1: 1999. Microbiology of food and animal feeding stuffs Preparation of test simples,

initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination Part 1: General rules for the preparation of the initial suspension and decimal dilutions.

8.2 ISO 7218-1996. Microbiology of food and animal feeding stuffs General rules for microbiological

examinations.

IX ANEXOS

N ANEXO TITULO 1 Diagrama de flujo del procedimiento (muestra slida) 2 Diagrama de flujo del procedimiento (muestra lquida) 3 Preparacin del diluyente 4 Distribucin y esterilizacin de los diluyentes.



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ANEXO 1: Diagrama de flujo del procedimiento (muestra slida) 10 g de muestra

ANEXO 2: Diagrama de flujo del Procedimiento (muestra lquida)

90 mL APS

9 mL APS

10-1 10-2 10-3

1 mL 1 mL

....

Muestra Original (lquido)

10 mL de muestra

90 mL APS 9 mL

APS 10-1

10-2 10-3

1 mL 1 mL

....



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ANEXO 3: Preparacin del diluyente 3.1 Solucin peptona salina Composicin: Peptona (Digerido enzimtico de caseina) 1,0 g Cloruro de sodio 8,5 g Agua 1000,0 mL Preparacin: Disolver los componentes en el agua, calentar si es necesario. Si es necesario, ajustar el pH, despus de la esterilizacin, este debe ser 7,0 + 0,2 a 25C. 3.2 Agua de peptona buferada Composicin: Peptona (Digerido enzimtico de tejido animal) 10,0 g Cloruro de sodio 5,0 g Disodium hidrogeno fosfato dodecahidrato (Na2HPO4.12H2O) 9,0 g Potasio di hidrogeno fosfato (KH2PO4) 1,5 g Agua 1000 mL. Preparacin: Disolver los componentes en el agua, calentar si es necesario. Si es necesario, ajustar el pH, despus de la esterilizacin, este debe ser 7,0 + 0,2 a 25C. ANEXO 4: Distribucin y esterilizacin de los diluyentes. Dispensar los diluyentes en los volmenes necesarios para la preparacin de la suspensin inicial en frascos de capacidad apropiada. Dispensar los diluyentes en los volmenes necesarios para la preparacin de las diluciones decimales en tubos de ensayo, en cantidad tal que despus de la esterilizacin, cada tubo contenga 9 mL. La incertidumbre de la medicin de este volumen final, despus de la esterilizacin, no debe exceder del 2%. Esterilizar en autoclave a 121 C por 15 minutos.

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