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Prof. Carlo Cosentino 1 Reti di segnalazione e regolazione, A.A. 2015/16

Prof. Carlo Cosentino Dipartimento di Medicina Sperimentale e Clinica

Università degli Studi Magna Graecia di Catanzaro tel: 0961-3694051

[email protected] http://bioingegneria.unicz.it/~cosentino

http://wpage.unina.it/carcosen

Biologia dei Sistemi A.A. 2015/16

Modelli di reti biologiche di regolazione


CellDesigner

Principalmente usato per la descrizione grafica di sistemi biochimici

Adotta lo standard SBGN ] notazione standardardizzata, non ambigua, che può essere esportata in altri software per analisi e simulazione

Systems Biology Graphical Notation include tre tipologie di diagrammi

Process Descriptions (SBGN-PD)

Entity Relationships (SBGN-ER)

Activity Flows (AF)

E’ possibile includere metadati, incluso link a database su proteine, reazioni, etc.


SBGN-PD reference card


SBGN-ER reference card


SBGN-AF reference card


CellDesigner: componenti


CellDesigner: macro


COPASI

CellDesigner è molto ricco dal punto di vista grafico, ma carente nella parte di costruzione del modello matematico, di simulazione e di strumenti per l’analisi del modello

Per questi compiti, conviene utilizzare altri software, come il COPASI (free), che permette di

Costruire modelli secondo lo standard SBML

Effettuare simulazioni sia deterministiche che stocastiche

Effettuare molti tipi di analisidel modello, quali

Analisi della matrice stechiometrica

Calcolo dei punti di equilibrio e relative proprietà di stabilità

Simulazioni al variare dei parametri

Identificazione dei parametri a partire da dati sperimentali

…


Systems Biology Markup Language

Il Systems Biology Markup Language (SBML) è il più diffuso formato di rappresentazione dei modelli biologici

La sua creazione è stata necessaria per favorire lo scambio di modelli tra utilizzatori di software diversi (attualmente circa 280)

La sintassi è analoga a quella di una pagina XML, basata su dei tag che marcano i vari tipi di informazione in una struttura gerarchica


Esempio di SBML

…


Ulteriori Standards per la rappresentazione dei dati/modelli

BioPAX, per la descrizione di sistemi di reazioni biologiche

MIAME (Minimum Information About a Microarray Experiment)

MIAPE (Minimum Information About a Proteomics Experiment)

MIRIAM (Minimum Information Requested in the Annotation of biochemical Models)


Risorse dati

Lo sviluppo di modelli biologici richiede diversi tipi di dati

Componenti (metaboliti, proteine, geni,…)

Funzioni dei singoli componenti

Interazioni tra i componenti

Oltre alla letteratura scientifica, questi dati sono ormai disponibili in forma più accessibile e organizzata in numerosi database, ad es.

KEGG: geni, proteine, enzimi, pathwyas

Reactome: processi biologici, pathways

BRENDA, SABIO-RK: dati cinetici

BioModels: 610 modelli curati + 866 modelli non curati


Caso-studio 1: analisi di reti di segnalazione coinvolte nella tumorigenesi


Crosstalk tra i pathway di Wnt e ERK

I pathway di Wnt e ERK sono entrambi coinvolti nella patogenesi di vari tipi di cancro, in particolare quelli del colon-retto

In seguito alla scoperta di meccanismi di crosstalk tra questi due pathway, Kim et al hanno sviluppato un modello matematico per studiare gli effetti sistemici di questi meccanismi

Kim D., Rath O., Kolch W., Cho K.-H., A hidden oncogenic positive feedback loop caused by crosstalk between Wnt and ERK Pathways. Oncogene (2007) 26, 4571-4579

Il modello è stato creato integrando ed estendendo modelli preesistenti dei due pathway

https://www.researchgate.net/profile/Dongsan_Kim/publication/6564866_A_hidden_oncogenic_positive_feedback_loop_caused_by_crosstalk_between_Wnt_and_ERK_Pathways/links/09e4151124c9fa416d000000.pdf

























Wnt-ERK crosstalk


Crosstalk tra i pathway di Wnt e ERK

La costruzione e l’analisi del modello hanno permesso di identificare un ciclo di feedback positivo realizzato proprio attraverso il crosstalk

L’analisi mostra che questo feedback positivo può generare un comportamento bistabile in entrambi i pathway, come confermato dagli esperimenti

Tramite il modello sono state identificate due mutazioni, che portano a condizioni tumorigeniche, ossia ad una anomala attivazione persistente dei due pathway in assenza di stimoli extracellulari:

Produzione aumentata di 𝛽-catenina

Riduzione della velocità delle fosfatasi nella cascata delle MAP chinasi.


Wnt-ERK positive feedback

L’attivazione di ERK induce l’inibizione di GSK-3𝛽 e quindi fa diminuire la degradazione di 𝛽-catenina, che si accumula nel nucleo


Attivazione costitutiva dei pathway

Segnali di attivazione dei due pathway: concentrazioni di 𝛽-catenina e di ERKpp

L’attivazione costitutiva dei due pathway è ottenuta mediante

a) Incremento della sintesi di 𝛽-catenina

attivazione del pathway di Wnt

b) Uso di OA (Okadaic acid), inibitore delle fosfatasi di ERK

attivazione del pathway di ERK

c) Uso di SB (SB216763), inibitore di GSK-3𝛽

attivazione del pathway di Wnt

d) Uso combinato di OA + SB

attivazione di entrambi i pathway Wnt e ERK


Attivazione costitutiva dei pathway

Vediamo come possiamo simulare queste condizioni in COPASI

a) Incremento della sintesi di 𝛽-catenina

parametro 𝑉12 moltiplicato per 20

b) Uso di OA (Okadaic acid), inibitore delle fosfatasi di ERK

dimezzare le velocità della MEK fosfatasi (𝑉max4) e della ERK fosfatasi (𝑉max5)

c) Uso di SB (SB216763), inibitore di GSK-3𝛽

dividere per 100 la velocità della GSK-3𝛽 fosfatasi (𝑉max7)

d) Uso combinato di OA + SB

attivazione di entrambi i pathway Wnt e ERK


Simulazioni vs esperimenti

Durata stimolazione in esperimenti: 240 min

La stimolazione con OA porta subito a saturazione l’attività di ERKpp

UO, inibitore di MEK, è stato usato per determinare se l’attivazione di ERKpp avveniva a monte di MEK


Risposta a stimoli esterni

Studiamo ora come può cambiare la risposta del sistema Wnt/ERK a fronte di uno stimolo esterno

Normalmente, un pathway di segnalazione si attiva solo in presenza di un segnale esterno (come un fattore di crescita) e si spegne quando lo stimolo cessa

Simulazione 1:

forniamo uno stimolo transitorio mediante il segnale di attivazione del pathway di Wnt

verifichiamo che i livelli di 𝛽-catenina e ERKpp ritornano ai livelli originali dopo che il segnale esterno si spegne


Risposta a stimoli esterni

Simulazione 2:

Raddoppiare la velocità di sintesi di 𝛽-catenina (𝑉12)

In alternativa, ridurre di 3/4 le velocità di MEK e ERK fosfatasi (𝑉max4, 𝑉max5)

Si vede che, pur in presenza moderate modifiche, i due pathway possono rimanere costitutivamente attivati anche in assenza di stimolo esterno


Caveat #1: valori dei parametri

Tan et al. Wnt signalling pathway parameters for mammalian cells. (2012) PLoS ONE 7(2):e31882.

Kim et al usano parametri presi da un modello precedentemente sviluppato sulla base di esperimenti su Xenopus.

In questo articolo, usando esperimenti al confocale, vengono misurate le concentrazioni di varie specie (𝛽-catenina, Axina, APC, GSK-3𝛽)in cellule umane di cancro del colon-retto

I valori dei parametri e delle concentrazioni possono essere molto differenti da specie a specie!

https://www.scopus.com/record/display.uri?eid=2-s2.0-84857405506&origin=resultslist&sort=plf-f&cite=2-s2.0-34447122100&src=s&nlo=&nlr=&nls=&imp=t&sid=D915B3116BEED21CBF110D3889EF553D.I0QkgbIjGqqLQ4Nw7dqZ4A:190&sot=cite&sdt=a&sl=0&relpos=40&citeCnt=42&searchTerm=

























Caveat #2: molteplici meccanismi di crosstalking

Zeller et al. Mechanisms of RAS/𝛽-catenin interactions. Archives of Toxicology (2013) 87:611-632.

http://link.springer.com/article/10.1007/s00204-013-1035-3

http://download.springer.com/static/pdf/771/art:10.1007/s00204-013-1035-3.pdf?originUrl=http://link.springer.com/article/10.1007/s00204-013-1035-3&token2=exp=1462791032~acl=/static/pdf/771/art:10.1007/s00204-013-1035-3.pdf?originUrl%3Dhttp://link.springer.com/article/10.1007/s00204-013-1035-3*~hmac=084c7b47602289bbe53f6e6be4e804072f2c60e0bf5fe9e0efb66ca69fed009b












Letture ulteriori su modelli di pathway crosstalk

Nguyen L.K., Kholodenko B.N. Feedback regulation in cell signalling: Lessons for cancer therapeutics. Seminars in Cell & Developmental Biology (2016) 50:85-94.

Effetti dei feeback positivi e negativi nei pathway di segnalazione

Ruolo dei modelli computazionali per l’analisi e la progettazione di strategie terapeutiche basate su combinazione di farmaci

Analisi del crosstalk tra i pathway di Akt/mTOR e RTK/MAPK

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1084952115001846
































Analisi parametrica dei modelli biologici


Analisi di sensitività

Variazioni dei parametri possono influenzare in maniera più o meno significativa il comportamento del sistema

Un’analisi di tipo visivo può essere fatta visualizzando l’uscita del sistema al variare del parametro (parameter sweep)

La Sensitivity Analysis (SA) mira a fornire una misura quantitativa dell’effetto di queste variazioni


Utilizzi della analisi di sensitività

Calibrazione del modello

Quali parametri è più importante tarare con cura?

Riduzione del modello

Quali sono i parametri meno significativi, che possono essere

eliminati?

Analisi di Robustezza

Le predizioni del modello sono robuste a fronte della fisiologica

variabilità dei parametri?

Controllo del sistema

Quali sono i parametri che hanno maggiore effetto sulla variabile da

controllare?


Tipologie di analisi di sensitività

Sensitivity analysis

One parameter at a time (OAT)

Local Global

Multi-parametric

Local Global


Analisi one-parameter-at-a-time

Vantaggi

Semplicità

Computazionalmente efficace

Svantaggi

Non esplora tutto lo spazio dei parametri (ma solo lungo gli assi)

Non è possibile identificare effetti di interazione tra parametri

Il risultato dipende dal punto nominale intorno a cui vado a fare l’analisi


Analisi multi-parametrica

Vantaggi

Esplora in maniera più approfondita lo spazio dei parametri

Mette in evidenza possibili effetti di interazione tra parametri

Se globale, non dipende dalla scelta del punto nominale

Svantaggi

Metodi di esplorazione più sofisticati

Costo computazionale elevato se #parametri maggiore di qualche unità (ad es., 10 parametri, 10 valori ciascuno 1010 simulazioni!)


Coefficienti di sensitività

Derivata parziale dell’output 𝑌 rispetto al parametro 𝑋𝑖

𝑆𝑋𝑖,𝑌 =𝜕𝑌

𝜕𝑋𝑖 𝑋0

dove 𝑋0 è il valore nominale del vettore dei parametri, nell’intorno del quale si calcola la sensitività per piccole variazioni (metodo OAT locale)

Se vogliamo normalizzare rispetto ai valori di 𝑌 e di 𝑋, possiamo calcolare

𝑆𝑋𝑖,𝑌 =𝜕𝑌/𝑌

𝜕𝑋𝑖/𝑋𝑖 𝑋0

=𝜕ln𝑌

𝜕ln𝑋𝑖 𝑋0


Scansione e campionamento dei parametri

La scansione parametrica consiste nel simulare il modello per una serie assegnata di valori e può fornire diverse informazioni utili

Come varia il comportamento del sistema al variare dei parametri?

Quali sono i parametri che devono essere tarati con maggiore cura e quelli che possono essere trascurati

Quali proprietà del sistema sono più robuste/fragili a variazioni parametriche?


Analisi di sensitività: esempio

Vediamo come si può eseguire un scansione parametrica, utilizzando come caso-studio il modello di crosstalk Wnt-ERK

Task 1: analisi della sensitività delle concentrazioni steady-state rispetto a variazioni di tutti i parametri

Task 2: analisi della sensitività della concentrazione steady-state di 𝛽-Catenina/TCF rispetto a variazioni di tutti i parametri

Si vede che tra i parametri che influenzano maggiormente questo complesso c’è il rate di sintesi (𝑉12)

Task 2: analisi della sensitività della concentrazione steady-state di ERK* rispetto a variazioni di tutti i parametri

Si vede che ERK* è influenzato significativamente, oltre alle reazioni della cascata delle MAPK, anche da molte reazioni del pathway di Wnt

Task 3: analisi della sensitività di ERK* e di 𝛽-Catenin/TCF alle concentrazioni iniziali

Si vede che sono molto sensibili alle conc. iniz. delle stesse specie


Scansione dei parametri

Per valutare l’effetto delle concentrazioni iniziali e la presenza di possibili fenomeni di bistabilità, effettuiamo delle scansioni

rispetto alla conc. iniz. di 𝛽-Catenina/TCF, GSK-3𝛽, APC, TCF

Per velocizzare i calcoli è possibile effettuare un sampling del sottospazio dei parametri

La scansione rispetto ad ogni parametro fa esplodere il numero di simulazioni all’aumentare dei parametri

Il sampling, invece, prende 𝑁𝑠 punti casuali nello spazio dei parametri, facendo variare simultaneamente tutti i parametri scelti

Dai grafici delle concentrazioni steady-state di ERK* e 𝛽-Catenin/TCF si evince che il sistema presenta più punti di equilibrio stabile


Sistemi multistabili


Esempio di sistema di regolazione genica bistabile

Due geni, G1 e G2, producono due proteine P1 e P2, che promuovo la propria trascrizione e si inibiscono a vicenda

Come possiamo studiare il comportamento di questo sistema?

Dobbiamo costruire un modello matematico della rete di regolazione


Modelli di reti geniche

Il modello base di regolazione trascrizionale è composto da due variabili per ogni gene: espressione del gene (xi) e conc. della proteina (yi)

Ipotesi semplificativa: una sola proteina per ogni gene!

La funzione di ingresso 𝑓𝑖 𝐲 calcola l’attivazione relativa del gene 𝑖 in funzione delle proteine fattori di trascrizione

In un tipico esperimento di trascrittomica vengono misurati solo i valori a regime delle variabili 𝑥𝑖

Parameter Description

𝑚𝑖 Max transcription rate

𝜆𝑖RNA mRNA degradation rate

𝑟𝑖 Translation rate

𝜆𝑖Prot Protein degradation

rate

𝑘𝑖𝑗 Dissociation constant

𝑛𝑖𝑗 Hill coefficient

iiiii

iiiii

yxry

xfmx

Prot

RNA

y

𝑖 = 1,… , 𝑛


Modelli di reti geniche

La topologia della rete è implicatemente definita dalle funzioni 𝑓𝑖(𝒚)

Le proteine che appaiono in 𝑓𝑖(𝒚) definiscono le relazioni di regolazione per il gene 𝑖-esimo

Tipicamente 𝑓𝑖 𝐲 viene scelta come una funzione razionale

1 fattore di trascrizione

2 fattori di trascrizione

j

j

ji yf

1

10

ijn

ij

j

jk

y

kjkj

kjkj

kji yyf

3

33210

1,


Funzione di attivazione di tipo Hill

ni

Ky

yf

1

1

n

n

i

Ky

Ky

yf

1


F. di attivazione con 2 fattori di trascrizione

𝑎1 = 0

𝑎2 = 0

Funzione

tipo AND


F. di attivazione con 2 fattori di trascrizione

𝑎1 ≠ 0

𝑎2 ≠ 0

Funzione

tipo OR


Esempio di sistema di regolazione genica bistabile

𝛼0𝜇1 e 𝛽0𝜇2 livelli di espressione basale

𝜆𝑑1 e 𝜆𝑑2 coefficienti di degradazione (cinetica del primo ordine)


Regioni di attrazione dei p. di equilibrio

Il sistema ha 3 punti di equilibrio

Nel diagramma possiamo identificare le 3 regioni di attrazione

Quando la traiettoria del sistema oltrepassa il confine tratteggiato, cambia la condizione operativa


Studio delle biforcazioni


Biforcazione

Si consideri un generico sistema dinamico nonlineare, dipendente da un parametro 𝛼

𝑥 = 𝑓 𝑥, 𝛼 , 𝑥 ∈ ℝ𝑛

Al variare di 𝛼 ∈ ℝ, l’equazione

𝑓 𝑥, 𝛼 = 0

può ammettere una, nessuna o molteplici soluzioni (ossia p. di equilibrio) 𝑥

Si ha una biforcazione (locale) quando una piccola variazione di un parametro modifica il numero ed il tipo dei p. di equilibrio

Una biforcazione determina una brusca variazione del comportamento del sistema

𝑥 = 𝛼 − 𝑥2

𝑦 = −𝑦


Tipi di biforcazione: Saddle-node

Due punti di equilibrio, uno asint. stabile e l’altro instabile, si avvicinano all’aumentare del parametro, fino a collidere e scomparire

Esempio (da fare in MatCont):

𝑥 = 𝑟 − 𝑥2


Tipi di biforcazione: Transcritical

Due p. di eq., uno stabile e l’altro instabile, che si avvicinano fino a collidere, poi si separano scambiandosi di ruolo


𝑥 = 𝑟𝑥 − 𝑥2


Tipi di biforcazione: Supercritical pitchfork

L’origine è inizialmente l’unico p. di eq. stabile, poi diventa instabile e compaiono altri due p. di eq. Stabili


𝑥 = 𝑟𝑥 − 𝑥3


Caso-studio 2: Studio della regolazione della differenziazione in cellule B


Differenziazione di cellule ematopoietiche


Rete di regolazione della differenziazione da LMPP a pro-B

Salerno L., Cosentino C., Morrone G., Amato F. Computational Modeling of a Transcriptional Switch Underlying B-Lymphocyte Lineage Commitment of Hematopoietic Multipotent Cells. (2015) PLoS ONE 10(7):e0132208.

Il modello è stato ricavato dall’analisi della letteratura; la regolazione negativa di ZNF521 da parte di PAX5 è una delle ipotesi testate utilizzando il modello

http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0132208































Studio delle biforcazioni


Test di altre interazioni possibili

Model B

Model C


Effetto della ZNF521 sulla differenziazione e possibili strategie di riprogrammazione

Quando ZNF521 è spento, lo switch è irreversibile

Per valori intermedi di attivazione di ZNF521 si ha uno switch reversibile

La differenziazione è comunque persistente

Quando i livelli di attivazione di ZNF521 diventano molto elevati, la differenziazione non è più persistente

In quest’ultimo caso, le cellule dovrebbero tornare allo stato indifferenziato al cessare dello stimolo che attiva EBF1

𝑇𝑍𝑁𝐹521 = 0

𝑇𝑍𝑁𝐹521 = 0.12

𝑇𝑍𝑁𝐹521 = 3

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